CN101921827B - 幽门螺杆菌诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种幽门螺杆菌诊断试剂盒，它包括：特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的引物对；幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。本发明还公开了应用上述幽门螺杆菌诊断试剂盒的检测方法。本发明将焦磷酸技术应用于HP 23S的2142和2143位点SNP检测，能在5分钟内检测96个样品，具有结果准确，耗时短，高通量的诸多优点。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种幽门螺杆菌诊断试剂盒及其检测方法，属于细菌的检测技术领域。
背景技术
自从澳大利亚学者Marshall等1983年首次从胃炎患者的胃黏膜中分离到幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)后，经过20多年的发展，有关幽门螺杆菌临床检测的研究取得了长足进步。截止目前为止，主要有快速尿素酶试验，细菌培养，活检标本切片染色，直接图片染色和聚合酶链反应(PCR)，碳13，碳14呼吸试验，血清免疫学检测，尿素排泄试验等，各种方法各有优缺点。焦磷酸测序是近年来发展起来的一种快速，简便，高通量的短序列测序方法，本试验将其应用于幽门杆菌的鉴定及耐药性分析，具有准确，特异，快速及高通量的优点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的不足，提供一种幽门螺杆菌诊断试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种幽门螺杆菌诊断试剂盒，它包括：
(1)特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；
(2)幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(3)特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQID NO：5所示的引物对；
(4)幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3均在5’端标记生物素；
上述引物在一次检测中共同使用。
上述幽门螺杆菌诊断试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：裂解液，生理盐水，PBS；
其中，裂解液具体包括：Chelex(g/mL)5％，Tricine 30mM，辛酸钠150mM，盐酸胍150mM，Triton 0.1％(v/v)；生理盐水具体为：0.9％(g/mL)氯化钠溶液；PBS具体包括：NaCl1.37M，KCl 27mM，Na2HPO4100mM，KH2PO420mM。
(2)PCR反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：1～610uM，MgCl225mM，dNTPs 10mM，Taq DNA聚合酶5U/uL；
其中，PCR Buffer包括0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(g/mL)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；
其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。
一种幽门螺杆菌诊断试剂盒，它包括上述所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：
(1)特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物对；
(2)幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
(3)特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示引物对；
(4)幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
其中，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9均在5’端标记生物素；
上述引物在一次检测中共同使用。
上述幽门螺杆菌诊断试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：裂解液，生理盐水，PBS；
其中，裂解液具体包括：Chelex(g/mL)5％，Tricine 30mM，辛酸钠150mM，盐酸胍150mM，Triton 0.1％(v/v)；生理盐水具体为：0.9％(g/mL)氯化钠溶液；PBS具体包括：NaCl1.37M，KCl27mM，Na2HPO4100mM，KH2PO420mM。
(2)PCR反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：7～1210uM，MgCl225mM，dNTPs 10mM，Taq DNA聚合酶5U/uL；
其中，PCR Buffer包括0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(g/mL)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，0.06M pH8.9Tricine。
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；
其中，结合缓冲液具体为：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)Tween20；退火缓冲液具体为：20mM pH 7.6Tris-Acetate，2mM醋酸镁；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，APS，荧光素和dNTP(dNTP即dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)。
一种幽门螺杆菌诊断试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)幽门螺杆菌DNA模板的提取；
(2)以步骤(1)所得的DNA为模板再按特异性扩增幽门螺杆菌引物进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物以标记生物素的引物序列进行单链纯化；
(4)将步骤(3)所得的单链纯化产物进行测序；
(5)结果分析。
步骤(1)中，所述的幽门螺杆菌DNA模板的提取，具体方法是：称取20mg胃黏膜组织，加1mL生理盐水在研钵中研磨成匀浆状，倒入1.5mL离心管中，13000rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤3次后13000rpm离心沉淀，加50μL裂解液，100℃10min，13000rpm离心，上清即为DNA模板。
步骤(2)中所述的PCR扩增具体方法为：
50μL体系：Template 5μL，10×PCR Buffer 5μL，MgCl24μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO：11μL，SEQ ID NO：21μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH2O 32.6μL；或者将SEQID NO：7替换SEQ ID NO：1，同时将SEQ ID NO：8替换SEQ ID NO：1，其它体系不变；
PCR扩增条件：95℃3min；95℃30s，45℃30s，72℃45s，50个循环；72℃3min，16℃30min。
有益效果：本发明方法对幽门螺杆菌16S片段进行特异性测序，把测得的幽门螺杆菌特征性序列5′-CGCGCAATCAGCGTCAGTAA-3′作为鉴定标准，其与常规的鉴定方法相比，敏感度为93.3％，特异性100％。因此，该法在临床上快速，特异，高通量的鉴定幽门螺杆菌具有广阔的应用前景。本发明的试剂盒通过检测23S上的2142和2143位点就可以预测幽门螺杆菌是否耐药，对幽门螺杆菌临床用药具有很好的指导作用。本实验将焦磷酸技术应用于HP 23S的2142和2143位点SNP检测，能在5分钟内检测96个样品，具有结果准确，耗时短，高通量的诸多优点。
附图说明
图1是幽门螺杆菌阳性标本16S rDNA测序结果图。
图2是幽门螺杆菌阳性标本23S rDNA耐药测序结果图，为野生型的非耐药菌株即2142和2143位点均为A。克拉霉素耐药菌23S rDNA 2142及2143位点A突变成G时前三个碱基分别为GAA，(2142位点A→G)，或AGA，(2143位点A→G)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂盒的制备。
(1)DNA提取试剂：
裂解液：Chelex5％(g/mL)(购于Bio-rad公司)，Tricine 30mM(购于Merck公司)，辛酸钠150mM(购于上海西宝生物科技有限公司)，盐酸胍150mM(购于美国Sigma公司)，Triton 0.1％(v/v)(购于美国Sigma公司)；
生理盐水：0.9％(g/mL)氯化钠溶液(氯化钠购于上海试四赫维化工有限公司)；
PBS：NaCl 1.37M(购于上海试四赫维化工有限公司)，KCl 27mM(购于上海试四赫维化工有限公司)，Na2HPO4100mM(购于上海试四赫维化工有限公司)，KH2PO420mM(购于上海试四赫维化工有限公司)。
(2)PCR反应液：
PCR Buffer：0.1％(v/v)NP-40(购于美国Sigma公司)，0.02％(v/v)明胶(购于美国Sigma公司)，0.06％(g/mL)BSA(购于美国Sigma公司)，0.1％(v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，0.06M pH8.9Tricine(购于Merck公司)；
25mM MgCl2：购于美国Sigma公司；
10mM dNTPs：购于上海鼎国生物技术有限公司；
5U/uLTaq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂：
75％(v/v)乙醇溶液：无水乙醇购自安徽安特生物化学有限公司；
0.2M NaOH：购于上海试四赫维化工有限公司；
10mM Tris-Acetate(pH 7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司；
结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mM EDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司)组成。
退火缓冲液：由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成。
(4)测序试剂：
DNA聚合酶：购于德国Qiagen公司；
ATP硫酸化酶：购于德国Qiagen公司；
荧光素酶：购于德国Qiagen公司；
三磷酸腺苷双磷酸酶：购于德国Qiagen公司；
底物APS：购于德国Qiagen公司；
荧光素：购于德国Qiagen公司；
四种dNTP(dATPαS，dTTP，dCTP，dGTP)：购于德国Qiagen公司。
实施例2：检测方法。
(1)幽门螺杆菌DNA模板的提取，具体方法是：称取20mg人体胃黏膜组织，加1mL生理盐水在研钵中研磨成匀浆状，倒入1.5mL EP管中，13000rpm离心5min，弃上清，用PBS洗涤3次后13000rpm离心沉淀，加50μL裂解液，100℃10min，13000rpm离心，上清即为DNA模板；
(2)以步骤(1)所得的DNA为模板再按特异性扩增幽门螺杆菌引物在Thermolcycler S1000(美国bio-rad公司)上进行PCR扩增，具体方法如下：
50μL体系：Template 5μL，10×PCRBuffer 5μL，MgCl24μL，dNTP 1μL，SEQ IDNO：11μL，SEQ ID NO：21μL，5U/uL Taq DNA聚合酶0.4μL，ddH2O 32.6μL；或者将SEQID NO：7替换SEQ ID NO：1，同时将SEQ ID NO：8替换SEQ ID NO：1，其它体系不变；
PCR扩增条件：95℃3min；95℃30s，45℃30s，72℃45s，50个循环；72℃3min，16℃30min。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物以标记生物素的引物序列进行单链纯化；即将步骤(2)中得到的50uL PCR扩增产物与3uL sepharoe beads(购于美国GE公司)及47ul结合缓冲液在一个Eppendorf管中震荡混合10min，然后用Vaccuum prepworkstation系统(PyroMark ID，德国Qiagen公司)中的vaccuum prep tool抓取sepharosebeads，将吸附有beads的vaccum prep tool依次在75％乙醇，0.2M NaOH溶液，10mMTris-Acetate溶液中清洗10秒，将vacuum prep tool放入含有1uL测序引物和49uL退火缓冲液的PSQ96(购于德国Qiagen公司)板中，释放sepharose beads，将该PSQ96板放在ThermoPlate(购于德国Qiagen公司)上加热到80℃2mie，再冷却至室温，即得到可进行后续测序反应的单链纯化产物。
(4)将步骤(3)所得的单链纯化产物进行测序，测序按照仪器(PyroMark ID，QIAGEN公司)说明书操作；
(5)结果分析，测序结果与幽门螺杆菌特征性序列“5′-CGCGCAATCAGCGTCAGTAA-3′”或“5′-CGCACAATCAGCGTCAG TAA-3′”(图1)比对鉴定幽门螺杆菌。幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的鉴定，通过对幽门螺杆菌23S rDNA中A2142G及A2143G两个位点的多态性分析来鉴定幽门螺杆菌是否对克拉霉素耐药(图2)，野生型的非耐药菌株2142和2143位点均为A。克拉霉素耐药菌23S rDNA 2142及2143位点A突变成G时前三个碱基分别为GAA，(2142位点A→G)，或AGA，(2143位点A→G)。
以养和生物科技有限公司14C-尿素呼气试验试剂盒为参照，本发明试剂盒能稳定检出的幽门螺杆菌按收集的呼气样品每分钟衰变数(dpm)计算最小量为180dpm；根据14C-尿素呼气试验试剂盒标准，呼气样品的每分钟衰变数(dpm)≥200dpm为幽门螺杆菌阳性；150～200dpm为可疑阳性；＜150rpm为阴性。
本试剂盒检测幽门螺杆菌的特异性达98％以上(每分钟衰变数≥200dpm的50例样品经本试剂盒检测均为阳性，10例其它微生物包括6例其它细菌，4例真菌样品，检测，重复检测结果均为阴性。
Claims (1)
1.一种幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)诊断试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂：裂解液，生理盐水，PBS；
(2)PCR反应液：PCR Buffer，特异引物SEQ ID NO：1～6 10μM，MgCl2 25mM，dNTPs 10mM，Taq DNA聚合酶5U/μL；
(3)单链纯化试剂：体积百分比浓度为75％的乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6Tris-Acetate，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，APS，荧光素和dNTP；
其中，所述的裂解液具体包括：Chelex 50g/L，Tricine 30mM，辛酸钠150mM，盐酸胍150mM，Triton 0.1％(v/v)；
其中，PCR Buffer包括体积百分浓度为0.1％的NP-40，体积百分浓度为0.02％的明胶，0.6g/L BSA，体积百分浓度为0.1％的Tween-20，0.06M pH8.9Tricine；
其中，
(1)特异性扩增幽门螺杆菌引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；
(2)幽门螺杆菌特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(3)特异性扩增幽门螺杆菌耐药基因引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQIDNO：5所示的引物对；
(4)幽门螺杆菌耐药基因特异性测序引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3均在5’端标记生物素；
上述引物在一次检测中共同使用。
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