JP2019536472A - ヒト起源または動物起源の試料中に存在するボレリア種の検出、識別、および同定するための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
本願発明は、ヒト起源または動物起源の組織または体液などの試料中に存在するボレリア種を検出、識別、および同定するための方法、ならびにそのような方法を実行するためのキットに関する。本発明による方法は、（ａ）試料中のボレリアの存在を検出し、ライム病を引き起こすグループのボレリアと回帰熱を引き起こすボレリアとを区別するステップと；次いで、ステップ（ａ）で、ライム病を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、（ｂ）試料中の、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種、およびＢ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種の存在を検出および区別するステップ；またはステップ（ａ）で、回帰熱を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、ステップ（ｃ）試料中で、熱を引き起こすグループのＢ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種、ならびにＢ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種の存在を検出および区別すること；ならびにステップ（ｄ）増幅の結果を解析すること；を含む、定量的マルチプレックスＰＣＲによって実行されるステップを含み、この方法はさらに、配列番号１から３７の配列を用いて実行される。【選択図】なし
Description
本願発明は、ヒト起源または動物起源の組織または体液などの試料中に存在するボレリア種の検出、識別、および同定するための方法、ならびにそのような方法を実行するためのキットに関する。
ボレリア（Borrelia）は、スピロヘータ門の細菌の１属であり、いくつかの種を含んでおり、それらは病状に応じて、ライム病を引き起こす１グループと回帰熱を引き起こす１グループとに因る２つのグループに分類することができる。
ライム病は、特にヒトまたは動物へ、ボレリアに感染したダニ咬傷ののち伝染する。すると、この細菌は、ダニの唾液中に見出されるものであり、血流に到達するものと思われる。ライム病の症状は、咬傷の場所での発疹であり、いかなる治療を行っても、感冒様の状態、神経学的状態、強度の疲労、または不規則な心拍などの症状に進行する。ライム病の原因となるボレリアとしては、以下の種：狭義のＢ．ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）、Ｂ．ガリニ（B. garinii）、Ｂ．アフゼリ（B. afzelii）、Ｂ．スピールマニ（B. spielmanii）、Ｂ．バレイシアナ（B. valaisiana）、Ｂ．ビセッティ（B. bissettii）、Ｂ．アメリカーナ（B. americana）、Ｂ．アンダーソニ（B. andersonii）、Ｂ．カロリネンシス（B. carolinensis）、Ｂ．ジャポニカ（B. japonica）、Ｂ．ルシタニエ（B. lusitaniae）、Ｂ．シニカ（B. sinica）、Ｂ．タヌキ（B. tanukii）、およびＢ．タルジ（B. turdi）が挙げられる。
回帰熱は、シラミおよびダニの咬傷によって伝染する細菌感染である。発熱は、極めて強く、重度の症状を引き起こすことがあり、そのようなものとしては、悪寒、痛み、肺の合併症などがあり、脳出血さえある。回帰熱の原因となるボレリアとしては、以下の種：Ｂ．アンセリナ（B. anserina）、Ｂ．クロシジュラエ（B. crocidurae）、Ｂ．ダットナイ（B. duttonii）、Ｂ．ハーマシー（B. hermsii）、Ｂ．ヒスパニカ（B. hispanica）、Ｂ．ミヤモトイ（B. miyamotoi）、Ｂ．パルケリ（B. parkeri）、Ｂ．ペルシカ（B. persica）、Ｂ．レカレンティス（B. recurrentis）、Ｂ．チュリケータ（B. turicatae）、Ｂ．ローンスターリ（B. lonestari）、Ｂ．ミクロティ（B. microti）およびＢ．テイレリ（B. theileri）が挙げられる。
ボレリアに起因する病状のための治療は、本質的には、適切な抗生物質の摂取に基づく。
ボレリアを検出するための数多くの試験が文献に記載されているが、多くが「制限酵素断片長多型」手法、ウェスタンブロットによって一般に確認されるＥＬＩＳＡ試験を用いた抗体検出、またはＤＮＡ標的配列増幅法に基づく。しかし、現在利用可能な試験は、夥しい数の偽陰性を伴うあまり信頼性のないものであり、ある特定の種を検出するに過ぎないか、または密接に関連する細菌を区別するのに充分な識別力がない。さらに、ＩｇＧは回復後、何年にもわたって存続することができるため、抗体検出は、時間の経った汚染と進行中の汚染とを区別することを可能にはしない。
最後に、現在提供されている試験は、あまり感度の良いものではなく、それゆえに偽陰性の結果の元となっている。さらに、ボレリアを検出し、汚染された試料中に存在する種を同定するための方法の有効性、ならびにその方法の感度は、治療の開始されるスピードと、同定された種に応じた治療の特異性とに依存するものとなる。
それゆえに本願発明の目標は、感度が良く、実効があり、再現性があり、ボレリアに特異的である上に、ボレリアの種間の識別を可能にする、ヒト起源または動物起源の試料中のボレリアを検出するための方法を提案することであり、この方法は、実行が容易である。
その目的のために、本発明は、定量的マルチプレックスＰＣＲによって、ヒト起源または動物起源の試料中のボレリアの存在を検出し、ボレリア種を識別および同定するための方法に関し、本方法は、
（ａ）試料中のボレリアの存在を検出し、ライム病を引き起こすグループのボレリアと回帰熱を引き起こすボレリアとを区別するステップであって、
−前記試料からＤＮＡを抽出すること、
−配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号３および配列番号４の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、ライム病を引き起こすグループまたは回帰熱を引き起こすグループに由来するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップと；次いで、
ステップ（ａ）で、ライム病を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、
（ｂ）試料中の、狭義のＢ．ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）種、Ｂ．ガリニ（B. garinii）種、またはＢ．アフゼリ（B. afzelii）種、およびＢ．バレイシアナ（B. valaisiana）種またはＢ．ビセッティ（B. bissettii）種の存在を、検出および区別するためのステップであって、
−前記試料から抽出されたＤＮＡから、
−（ｂ１）配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマー対と、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の配列からなる３つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｂ２）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−（ｂ３）配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対と、配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｂ４）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップ；
または、ステップ（ａ）で、再帰熱を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、
（ｃ）試料中の、回帰熱を引き起こすグループに由来するＢ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種、ならびにＢ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種の存在を検出および区別するためのステップであって、
−前記試料から抽出されたＤＮＡから、
−（ｃ１）配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｃ２）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−（ｃ３）配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２７の配列からなるプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｃ４）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップと；
（ｄ）前記方法が配列番号１から４および８から２７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列を含むものと解釈して、増幅の結果を解析することと
を含む。
（ａ）試料中のボレリアの存在を検出し、ライム病を引き起こすグループのボレリアと回帰熱を引き起こすボレリアとを区別するステップであって、
−前記試料からＤＮＡを抽出すること、
−配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号３および配列番号４の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、ライム病を引き起こすグループまたは回帰熱を引き起こすグループに由来するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップと；次いで、
ステップ（ａ）で、ライム病を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、
（ｂ）試料中の、狭義のＢ．ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）種、Ｂ．ガリニ（B. garinii）種、またはＢ．アフゼリ（B. afzelii）種、およびＢ．バレイシアナ（B. valaisiana）種またはＢ．ビセッティ（B. bissettii）種の存在を、検出および区別するためのステップであって、
−前記試料から抽出されたＤＮＡから、
−（ｂ１）配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマー対と、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の配列からなる３つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｂ２）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−（ｂ３）配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対と、配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｂ４）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップ；
または、ステップ（ａ）で、再帰熱を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、
（ｃ）試料中の、回帰熱を引き起こすグループに由来するＢ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種、ならびにＢ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種の存在を検出および区別するためのステップであって、
−前記試料から抽出されたＤＮＡから、
−（ｃ１）配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｃ２）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−（ｃ３）配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２７の配列からなるプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｃ４）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップと；
（ｄ）前記方法が配列番号１から４および８から２７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列を含むものと解釈して、増幅の結果を解析することと
を含む。
本発明による方法は、リアルタイムマルチプレックス定量的ＰＣＲによって、試料中に存在するボレリアを検出し、それらを、回帰熱を引き起こすグループ（Ｂ．アンセリナ、Ｂ．クロシジュラエ、Ｂ．ダットナイ、Ｂ．ハーマシー、Ｂ．ヒスパニカ、Ｂ．ミヤモトイ、Ｂ．パルケリ、Ｂ．ペルシカ、Ｂ．レカレンティス、Ｂ．チュリケータ、Ｂ．ローンスターリ、Ｂ．ミクロティ、およびＢ．テイレリ）またはライム病を引き起こすグループ（狭義のＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニ、Ｂ．アフゼリ、Ｂ．スピールマニ、Ｂ．バレイシアナ、Ｂ．ビセッティ、Ｂ．アメリカーナ、Ｂ．アンダーソニ、Ｂ．カロリネンシス、Ｂ．ジャポニカ、Ｂ．ルシタニエ、Ｂ．シニカ、Ｂ．タヌキ、およびＢ．タルジ）のどちらかに分類することを可能にする。さらに、本方法はまた、存在する細菌の属する種の正確な同定を可能にする。最後に、本方法の感度は、試料中の１コピーから１０コピーの検出を可能にする程にある。
その目的のために、最初のステップ（ａ）の間、全ての種が共有するプライマー対を用いて、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を標的とする。ライム病を引き起こすボレリアおよび回帰熱を引き起こすボレリアのグループそれぞれに特異的なプローブが、試料中に存在するボレリアをこれらのグループの１つに分類するために使用される。
この最初のステップによって、ライム病を引き起こすボレリアの存在が明らかになっている場合に、以下のステップ（ｂ）によって、狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、ガリニ、およびアフゼリ、ならびにバレイシアナおよびビセッティを、これらの種のフラジェリンをコードする遺伝子を標的とすることで区別および同定することが可能になる。狭義のボレリア・ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニ、およびＢ．アフゼリの間で共有されているプライマー対、ならびにＢ．バレイシアナ種およびＢ．ビセッティ種の間で共有されているプライマー対を使用する。検出される１つまたは複数の種を同定するために、各種に特異的なプローブを使用する。
しかし、最初のステップによって、回帰熱を引き起こすボレリアのグループに属するボレリアの存在が明らかになっている場合に、以下のステップ（ｃ）によって、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種由来のボレリアを、フラジェリンおよび１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子をそれぞれ標的とすることで同定するか、またはＢ．ダットナイ種もしくはＢ．クロシジュラエ種を、これらの種のＲｅｃＡタンパク質をコードする遺伝子を標的とすることで同定することが可能になる。ボレリアのＢ．ハーマシーおよびＢ．レカレンティスの間で共有されているプライマー対、ならびにＢ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種の間で共有されているプライマー対を使用する。検出される１つまたは複数の種を同定するために、各種に特異的なプローブを使用する。
本方法はもちろん、配列番号１から４および８から２７の配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列を用いて実行することができる。
有利には、ステップ（ａ）は、配列番号５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号７の配列または配列番号５から７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列からなるプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記宿主のアクチンをコードするヌクレオチド配列を増幅すること、次いで、増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、アクチンをコードする前記ヌクレオチド配列の存在または不在を検出することを含む。
宿主のアクチンの遺伝子を検出することによって、核酸の抽出物の質をチェックすることが可能になる。
本発明の一実施形態によれば、ステップ（ｂ１）および（ｂ２）は、
−配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１２および配列番号１３の２つのプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することからなるステップ（ｂ１ａ）、
−（ｂ２ａ）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ガリニ種またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１１のプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することからなるステップ（ｂ１ｂ）、
−（ｂ２ｂ）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
を含む。
−配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１２および配列番号１３の２つのプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することからなるステップ（ｂ１ａ）、
−（ｂ２ａ）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ガリニ種またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１１のプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することからなるステップ（ｂ１ｂ）、
−（ｂ２ｂ）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
を含む。
この実施形態では、一方でＢ．ガリニ種またはＢ．アフゼリ種の検出を、他方で狭義のＢ．ブルグドルフェリ種の検出を、別々に行う。
有利に本発明によれば、ステップ（ｄ）は、各ステップの終了時に、すなわちステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）で生成する増幅産物をシークエンシングすることを含む。
得られる増幅産物のシークエンシングの情報性により、定量的マルチプレックスＰＣＲによる標的とする種に加えて、別の種を同定することを可能とすることができる。具体的には、シークエンシングによって、以下の種：Ｂ．アンセリナ、Ｂ．コリセア（B.coriceae）、Ｂ．ローンスターリ、Ｂ．スピールマニ、Ｂ．アンダーソニ、Ｂ．ジャポニカ、Ｂ．ルシタニエ、Ｂ．シニカ、およびＢ．タルジを同定することができる。
本発明の一実施形態によれば、ステップ（ａ）ならびにステップ（ｃ１）および（ｃ３）で用いられる増幅条件とは、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回に９４℃での１５秒間の変性と、次いで５８℃での４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することである。
好ましくは、ステップ（ｂ１ａ）で用いられる増幅条件とは、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回に９４℃で１５秒間の変性と、次いで６２℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することである。
好ましくは、ステップ（ｂ１ｂ）で用いられる増幅条件とは、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回９４℃で１５秒間の変性と、次いで６０℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することである。
また好ましくは、ステップ（ｂ３）で用いられる増幅条件とは、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回９４℃で１５秒間の変性と、次いで６４℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することである。
一実施形態によれば、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７の配列を有するプローブは、クエンチャー分子により３’端で、フルオロフォアにより５’端で標識され、蛍光シグナルの検出は、前記フルオロフォアおよび前記クエンチャー分子が分離すると発生する増幅の証拠となり、同じステップ（ａ）、（ｂ１）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ３）の間に使用されるプローブは、異なる蛍光色素によって標識される。
有利には、フルオロフォアは、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、Ｃｙ５、ＨＥＸから選択され、蛍光阻害剤は、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＢＱ）であるか、または非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ、Ｅｃｌｉｐｓｅ）と会合するＭＧＢ（マイナーグルーブバインダー）分子である。
本発明の特長の１つによれば、試料は、血液、尿、唾液、体組織である。
本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号５配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、ならびにそれらのそれぞれの相補的な配列から選択されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、ならびにそれらのそれぞれの相補的な配列から選択されるヌクレオチド配列を含むプローブに関連する。
一実施形態によれば、プローブの５’端は、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＣＹ５、またはＨＥＸによって標識されている。
本発明はさらに、定量的マルチプレックスＰＣＲによって、ヒトまたは動物の試料中のボレリアの存在を検出し、ボレリア種を識別および同定するためのキットであって、
（ｉ）配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号３および配列番号４の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｉ）配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対、ならびに配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の配列からなる３つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｉｉ）配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対、ならびに配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｖ）配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｖ）配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２７の配列からなるプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｖｉ）ならびに定量的マルチプレックスＰＣＲを実施するのに必要な試薬の全て
を含み、
前記プローブが、クエンチャー分子により３’端で、フルオロフォアにより５’端で標識されている、キットに関連する。
（ｉ）配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号３および配列番号４の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｉ）配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対、ならびに配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の配列からなる３つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｉｉ）配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対、ならびに配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｖ）配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｖ）配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２７の配列からなるプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｖｉ）ならびに定量的マルチプレックスＰＣＲを実施するのに必要な試薬の全て
を含み、
前記プローブが、クエンチャー分子により３’端で、フルオロフォアにより５’端で標識されている、キットに関連する。
本発明は最後に、定量的マルチプレックスＰＣＲによってヒトまたは動物の試料中のボレリアの存在を検出しボレリア種を識別するための、以前に定義されたようなキットの使用に関連する。
本発明によるキットは、ライム病を引き起こすグループ由来のボレリア種の狭義のＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニ、Ｂ．アフゼリ、Ｂ．バレイシアナ、およびＢ．ビセッティ、回帰熱を引き起こすグループ由来の種のＢ．ハーマシー、Ｂ．レカレンティス、Ｂ．ダットナイ、またはＢ．クロシジュラエを検出するために使用される。それは、シークエンシング手法を用いて、Ｂ．アンセリナ種、Ｂ．コリセア種、Ｂ．ローンスターリ種、Ｂ．スピールマニ種、Ｂ．アンダーソニ種、Ｂ．ジャポニカ種、Ｂ．ルシタニエ種、Ｂ．シニカ種、およびＢ．タルジ種を同定することをさらに可能にする。
非限定的な例として、試料は、ヒトまたは動物、例えばペット、家畜または野生動物などに由来することがある。
非限定的な説明として示される本発明の例示的な実施形態を用いて、以下、本発明を説明する。
ステップ（ａ）
ステップ（ａ）によって、試料中のボレリアの存在を検出し、それらが回帰熱を引き起こすグループ（Ｂ．アンセリナ、Ｂ．クロシジュラエ、Ｂ．ダットナイ、Ｂ．ハーマシー、Ｂ．ヒスパニカ、Ｂ．ミヤモトイ、Ｂ．パルケリ、Ｂ．ペルシカ、Ｂ．レカレンティス、Ｂ．チュリケータ、Ｂ．ローンスターリ、Ｂ．ミクロティ、およびＢ．テイレリ）に属するかまたはライム病を引き起こすグループ（狭義のＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニ、Ｂ．アフゼリ、Ｂ．スピールマニ、Ｂ．バレイシアナ、Ｂ．ビセッティ、Ｂ．アメリカーナ、Ｂ．アンダーソニ、Ｂ．カロリネンシス、Ｂ．ジャポニカ、Ｂ．ルシタニエ、Ｂ．シニカ、Ｂ．タヌキ、およびＢ．タルジ）に属するかを決定することが可能になる。ステップ（ａ）は、リアルタイムマルチプレックス定量的ＰＣＲによって実施される。その目的のために、これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を標的とする。宿主のアクチンの遺伝子を内部標準として用いる。
ステップ（ａ）によって、試料中のボレリアの存在を検出し、それらが回帰熱を引き起こすグループ（Ｂ．アンセリナ、Ｂ．クロシジュラエ、Ｂ．ダットナイ、Ｂ．ハーマシー、Ｂ．ヒスパニカ、Ｂ．ミヤモトイ、Ｂ．パルケリ、Ｂ．ペルシカ、Ｂ．レカレンティス、Ｂ．チュリケータ、Ｂ．ローンスターリ、Ｂ．ミクロティ、およびＢ．テイレリ）に属するかまたはライム病を引き起こすグループ（狭義のＢ．ブルグドルフェリ、Ｂ．ガリニ、Ｂ．アフゼリ、Ｂ．スピールマニ、Ｂ．バレイシアナ、Ｂ．ビセッティ、Ｂ．アメリカーナ、Ｂ．アンダーソニ、Ｂ．カロリネンシス、Ｂ．ジャポニカ、Ｂ．ルシタニエ、Ｂ．シニカ、Ｂ．タヌキ、およびＢ．タルジ）に属するかを決定することが可能になる。ステップ（ａ）は、リアルタイムマルチプレックス定量的ＰＣＲによって実施される。その目的のために、これらの細菌の１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子を標的とする。宿主のアクチンの遺伝子を内部標準として用いる。
ボレリア細菌の特異的な検出をもたらしかつ上記に挙げた全ての種の共有するプライマーを決定するために、調査を行ってきた。回帰熱を引き起こすグループ（「熱プローブ」）とライム病を引き起こすグループ（「ライムプローブ」）とを区別することを可能にするプローブを決定してきた。その目的のために、２５種のボレリアの１６Ｓ ＲＮＡをコードする８４個の遺伝子の配列をアラインメントした。１０個のフォワードプライマーと７個のリバースプライマーとを決定し、特異性、プライマーダイマーの形成がないこと、生成される増幅産物のサイズという観点から、最も良い対を選択し、次いで、Ｑ−ＰＣＲによって検証した。２つのボレリアのサブグループに対する２つの特異的なプローブを画定し試験した。
さらに、このステップ（ａ）で産生される１６Ｓ ＲＮＡをコードする遺伝子の増幅産物をシークエンシングすることによって、後のステップで探索されない３つのボレリア種を同定することを可能にすることができる。これらの種は、Ｂ．アンセリナ、Ｂ．コリセア、およびＢ．ローンスターリである。
ステップ（ａ）におけるボレリアに特異的なプライマーおよびプローブの配列：
２つのボレリアのグループに特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表１に示す。
２つのボレリアのグループに特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表１に示す。
表１
材料および方法：
１−試料の調製
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（参照番号５１３０４、Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を用いて、ユーザマニュアルに示されたプロトコールに従って、Ｑ−ＰＣＲに用いるＤＮＡを試料（血液、脳脊髄液、尿、滑液、組織生検など）から抽出する。ＤＮＡを水に溶解し、使用前に分光測定によってアッセイする。Ｄ．Ｏ．２６０／Ｄ．Ｏ．２８０比によって、抽出物の質を確認する。
１−試料の調製
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（参照番号５１３０４、Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を用いて、ユーザマニュアルに示されたプロトコールに従って、Ｑ−ＰＣＲに用いるＤＮＡを試料（血液、脳脊髄液、尿、滑液、組織生検など）から抽出する。ＤＮＡを水に溶解し、使用前に分光測定によってアッセイする。Ｄ．Ｏ．２６０／Ｄ．Ｏ．２８０比によって、抽出物の質を確認する。
２−Ｑ−ＰＣＲの条件：
２つの陽性対照を行ったが、それらは、ここで画定されたプライマーにより増幅される、およびプラスミドベクターＰｅｘＡに含まれる、ボレリアの核酸配列に対応する。それらは、配列をＥｕｒｏｆｉｎｓ社に送付することによって、遺伝子合成により生産された。これらの陽性対照の０．２５ｎｇ（１０８コピー）から０．２５ａｇ（０．１コピー）までの７点の最初の較正範囲によって、試料中に存在するボレリアのコピー数による定量値を得ることが可能である。
２つの陽性対照を行ったが、それらは、ここで画定されたプライマーにより増幅される、およびプラスミドベクターＰｅｘＡに含まれる、ボレリアの核酸配列に対応する。それらは、配列をＥｕｒｏｆｉｎｓ社に送付することによって、遺伝子合成により生産された。これらの陽性対照の０．２５ｎｇ（１０８コピー）から０．２５ａｇ（０．１コピー）までの７点の最初の較正範囲によって、試料中に存在するボレリアのコピー数による定量値を得ることが可能である。
３−ステップ（ａ）のＱ−ＰＣＲ反応に必要な混合物を、表２に示されるように調製する：
表２
反応（範囲点、試料または陰性対照）まで、２０μＬの混合物ならびに５μＬの試料（５０ｎｇから２００ｎｇ）、水（陰性対照用）または範囲点を保管する（最終反応体積２５μＬ）。
増幅条件は以下の通りである：最初に９５℃で５分間変性し、次に、各回に９４℃での１５秒間の変性と、次いで５８℃での４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行する。ＦＡＭ蛍光色素およびＶＩＣ蛍光色素の検出を選択する。
アクチンを検出するためのＱ−ＰＣＲ反応に必要な混合物を、以下のように調製する。
表３
反応（範囲点、試料または陰性対照）まで、２０μＬの混合物ならびに５μＬの試料（５０ｎｇから２００ｎｇ）、水（陰性対照用）または範囲点を保管する（最終反応体積２５μＬ）。
増幅条件は、９５℃で５分、次に各回９４℃で１５秒間の変性と、次いで５８℃で３０秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長を行う４０サイクルである。
Ｃｙ５蛍光色素の検出を選択する。
４−結果
これらの条件下で、ライム病を引き起こすグループのボレリアおよび回帰熱を引き起こすグループのボレリアの検出限界は、１コピー（または２．５ａｇ）である。
これらの条件下で、ライム病を引き起こすグループのボレリアおよび回帰熱を引き起こすグループのボレリアの検出限界は、１コピー（または２．５ａｇ）である。
ライム病を引き起こすグループのボレリアおよび回帰熱を引き起こすグループのボレリアの増幅産物は、１５３塩基対である。これらのＱ−ＰＣＲ産物の配列は以下である（表４）：
表４
ステップ（ｂ）
ステップ（ａ）によってライム病を引き起こすグループ由来のボレリアの存在を決定することが可能であった場合、次いで、ステップ（ｂ）をそれぞれ実施し、リアルタイムマルチプレックス定量的ＰＣＲによって、このグループに属する狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ［ステップ（ｂ１）、（ｂ１ａ）、（ｂ１ｂ）、または（ｂ２）］、およびＢ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種［ステップ（ｂ３）および（ｂ４）］の存在を決定する。その目的のために、これらの細菌のフラジェリンをコードする遺伝子を標的とする。
ステップ（ａ）によってライム病を引き起こすグループ由来のボレリアの存在を決定することが可能であった場合、次いで、ステップ（ｂ）をそれぞれ実施し、リアルタイムマルチプレックス定量的ＰＣＲによって、このグループに属する狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ［ステップ（ｂ１）、（ｂ１ａ）、（ｂ１ｂ）、または（ｂ２）］、およびＢ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種［ステップ（ｂ３）および（ｂ４）］の存在を決定する。その目的のために、これらの細菌のフラジェリンをコードする遺伝子を標的とする。
ステップ（ｂ１）または（ｂ１ａ）および（ｂ１ｂ）を実行するために、調査を行い、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、およびＢ．アフゼリ種を検出することを可能にするプライマーの対、ならびにこれらの種のそれぞれの特異的な認識をもたらす３つのプローブを決定してきた。これらの３つのプローブを、「Ｂｕｒｄｇ ｓｓプローブ」、「ガリニプローブ」、および「アフゼリプローブ」と呼ぶ。この仕事は、最初はフラジェリンをコードする遺伝子におけるこれら３種の配列上の違いに基づいたものであり、それらの違いは、Ｐｉｃｋｅｎ Ｒ．による論文（1992, Journal of Clinical Microbiology, 30:99-114）に記載されている。
その目的のために、１１種のボレリアのフラジェリンをコードする５７個の遺伝子の配列をアラインメントした。特異性、プライマーダイマーの形成がないこと、生成される増幅産物のサイズという観点から、最も良いプライマーおよびプローブの配列を選択し、次いで、Ｑ−ＰＣＲによって検証した。そうしてここで決定されたプローブは、Ｐｉｃｋｅｎ Ｒ．のものと同じ配列中の違いを標的とはしない。Ｐｉｃｋｅｎ Ｒ．によって記載されているプローブは非常に長い（４９塩基対から５２塩基対まで）が、ここに記載されているＢｕｒｄｇ ｓｓプローブおよびアフゼリプローブは、Ｐｉｃｋｅｎ Ｒ．のものと共通する５ヌクレオチドおよび８ヌクレオチドをそれぞれ有する（すなわち、Ｐｉｃｋｅｎ Ｒ．プローブの３’端は、我々の２つのプローブの５’端と共通する５塩基から８塩基を有する）。ガリニ種の認識をもたらすこの２つのプローブは、共通する塩基がない。
ステップ（ｂ１）または（ｂ１ａ）および（ｂ１ｂ）で産生されるフラジェリンの遺伝子の増幅産物をシークエンシングすることによって、以降のステップで探索されない６種のボレリアを認識することを可能にすることができる。これらの種は、Ｂ．スピールマニ、Ｂ．アンダーソニ、Ｂ．ジャポニカ、Ｂ．ルシタニエ、Ｂ．シニカ、およびＢ．タルジである。
並行して、ステップ（ｂ３）および（ｂ４）を実行するために、調査を行い、Ｂ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種を検出することを可能にするプライマーの対、ならびにこれらの種のそれぞれの特異的な認識をもたらす２つのプローブ（「バレイシアナプローブ」および「ビセッティプローブ」）とを決定した。この仕事は、フラジェリンをコードする遺伝子におけるこれらの２つの種の配列上の違いに誘発されたものであり、それらの違いは、Ｊａｕｈｌａｃ Ｂ．による論文（2000, Journal of Clinical Microbiology, 38:1895-1900）に記載されている。その目的のために、１１種のボレリアのフラジェリンをコードする５７個の遺伝子の配列をアラインメントした。特異性、プライマーダイマーの形成がないこと、生成される増幅産物のサイズという観点から、最も良いプライマーおよびプローブの配列を選択し、次いで、Ｑ−ＰＣＲによって検証した。ここで決定されかつバレイシアナ種の認識をもたらすプローブは、２７を形成するＪａｕｈｌａｃ Ｂ．のものと共通する１５塩基を有する。ビセッティ種の認識をもたらすこの２つのプローブは、共通する塩基がない。
ステップ（ｂ１）または（ｂ１ａ）および（ｂ１ｂ）に用いるライム病を引き起こすグループのボレリア種に特異的なプライマーおよびプローブの配列：
狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種に特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表５に示す：
狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種に特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表５に示す：
表５
ステップ（ｂ３）に用いるＢ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種に特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表６に示す：
表６
プロトコール
１−試料の調製：
試料の調製は、ステップ（ａ）で行われるものと同一である。
１−試料の調製：
試料の調製は、ステップ（ａ）で行われるものと同一である。
２−Ｑ−ＰＣＲの条件：
５つの陽性対照を行った。それらは、ここで画定された２対のプライマーにより増幅される、およびプラスミドベクターＰｅｘＡに含まれる、ボレリアの核酸配列に対応する。これらの陽性対照の０．２５ｎｇ（１０８コピー）から０．２５ａｇ（０．１コピー）までの７点の最初の較正範囲によって、試料中に存在するボレリアのコピー数による定量値を得ることが可能である。
５つの陽性対照を行った。それらは、ここで画定された２対のプライマーにより増幅される、およびプラスミドベクターＰｅｘＡに含まれる、ボレリアの核酸配列に対応する。これらの陽性対照の０．２５ｎｇ（１０８コピー）から０．２５ａｇ（０．１コピー）までの７点の最初の較正範囲によって、試料中に存在するボレリアのコピー数による定量値を得ることが可能である。
３−ステップ（ｂ１ａ）および（ｂ１ｂ）：
ステップ（ｂ１ａ）および（ｂ１ｂ）は、増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在または不在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出することを目的とする。
ステップ（ｂ１ａ）および（ｂ１ｂ）は、増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在または不在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出することを目的とする。
ステップ（ｂ１ａ）は、配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１２および配列番号１３の配列からなる２つのプローブとを用いて、標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｂ１ａ）のＱ−ＰＣＲ反応に必要な混合物を、以下のように調製する。
表７
反応（範囲点、試料または陰性対照）まで、２０μＬの混合物ならびに５μＬの試料、水（陰性対照用）または範囲点を保管する（最終反応体積２５μＬ）。
増幅条件は以下の通りである：最初に９５℃で５分間変性し、次に、各回に９４℃での１５秒間の変性と、次いで６２℃での４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行する。
ステップ（ｂ１ａ）を実施するために、ＦＡＭ蛍光色素およびＶＩＣ蛍光色素の検出を選択する。
ステップ（ｂ１ｂ）は、配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１１の配列からなるプローブとを用いて、標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｂ１ｂ）のＱ−ＰＣＲ反応に必要な混合物を、以下のように調製する。
表８
反応（範囲点、試料または陰性対照）まで、２０μＬの混合物ならびに５μＬの試料、水（陰性対照用）または範囲点を保管する（最終反応体積２５μＬ）。
増幅条件は以下の通りである：最初に９５℃で５分間変性し、次に、各回に９４℃での１５秒間の変性と、次いで６０℃での４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行する。
ステップ（ｂ１ｂ）を実施するために、Ｃｙ５蛍光色素の検出を選択する。
本発明の一変形では、ステップｂ１ａおよびｂ１ｂを、単独のステップｂ１にて同時に実施する。
４−ステップ（ｂ３）および（ｂ４）
ステップ（ｂ３）は、増幅産物の産生を可能にする条件下で、配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｂ３）は、増幅産物の産生を可能にする条件下で、配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｂ３）は、増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在または不在を検出することによって、Ｂ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種に属するボレリアの存在または不在を検出することを目的とする。
ステップ（ｂ３）のＱ−ＰＣＲ反応に必要な混合物を、以下のように調製する。
表９
反応（範囲点、試料または陰性対照）まで、２０μＬの混合物ならびに５μＬの試料、水（陰性対照用）または範囲点を保管する（最終反応体積２５μＬ）。
増幅条件は以下の通りである：最初に９５℃で５分間の変性、次に、各回に９４℃での１５秒間変性し、次いで６４℃での４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行する。
ＦＡＭ蛍光色素およびＶＩＣ蛍光色素の検出を、ステップ（ｂ４）で選択する。
５−結果
これらの条件下で、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、およびＢ．アフゼリ種の検出限界は、１コピー（または２．５ａｇ）であり、Ｂ．バレイシアナおよびＢ．ビセッティの検出限界は、１コピー（または２．５ａｇ）である。
これらの条件下で、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、およびＢ．アフゼリ種の検出限界は、１コピー（または２．５ａｇ）であり、Ｂ．バレイシアナおよびＢ．ビセッティの検出限界は、１コピー（または２．５ａｇ）である。
得られるボレリア種の狭義のブルグドルフェリ、アフゼリ、およびガリニの増幅産物は、１８０塩基対または１８２塩基対である。得られるボレリア種のバレイシアナおよびビセッティの増幅産物は、１３５塩基対および１３８塩基対である。これらのＱ−ＰＣＲ産物の配列は以下である（表１０）：
表１０
ステップ（ｃ）
ステップ（ａ）によって、回帰熱を引き起こすグループ由来のボレリアの存在を決定することが可能であった場合、次いで、ステップ（ｃ）をそれぞれ実施し、リアルタイムマルチプレックス定量的ＰＣＲによって、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種［ステップ（ｃ１）および（ｃ２）］、ならびにＢ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種［ステップ（ｃ３）および（ｃ４）］の存在を決定する。
ステップ（ａ）によって、回帰熱を引き起こすグループ由来のボレリアの存在を決定することが可能であった場合、次いで、ステップ（ｃ）をそれぞれ実施し、リアルタイムマルチプレックス定量的ＰＣＲによって、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種［ステップ（ｃ１）および（ｃ２）］、ならびにＢ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種［ステップ（ｃ３）および（ｃ４）］の存在を決定する。
Ｂ．ハーマシーは、フラジェリンをコードする遺伝子を標的とすることによって区別し、Ｂ．レカレンティスは、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子を標的とすることによって区別する。Ｂ．ダットナイまたはＢ．クロシジュラエは、ＲｅｃＡ遺伝子（ＤＮＡ修復タンパク質）を標的とすることによって同定する。
ステップ（ｃ１）を実施するために、調査を行い、プライマーの対（ボレリアＤ ｆｌａフォワードおよびリバース）と、Ｂ．ハーマシー種を検出することを可能にする特異的なプローブ（「ハーマシープローブ」）とを決定した。その目的のために、１２種のボレリアのフラジェリンをコードする５９個の遺伝子の配列をアラインメントした。さらに、プライマーの対（ボレリアＤ １６Ｓフォワードおよびリバース）と、Ｂ．レカレンティス種を検出することを可能にする特異的なプローブ（「レカレンティスプローブ」）とを決定した。その目的のために、２３種のボレリアの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする６１個の遺伝子の配列をアラインメントした。特異性、プライマーダイマーの形成がないこと、生成される増幅産物のサイズという観点から、最も良いプライマーおよびプローブの配列を選択し、次いで、Ｑ−ＰＣＲによって検証した。
Ｃｕｔｌｅｒ Ｓ．によるＢ．ダットナイのＲｅｃＡ遺伝子に示された多型に基づき、ＲｅｃＡ遺伝子についても調査を行い、Ｂ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種およびステップ（ｃ３）の実行を検出するためのプライマーの対および特異的なプローブ（「Ｄｕｔ／Ｃｒｏｃプローブ」）を決定した。この調査は、１０種のボレリア種由来の６２個のＲｅｃＡ遺伝子の配列のアラインメントに基づく。特異性、プライマーダイマーの形成がないこと、生成される増幅産物のサイズという観点から、最も良いプライマーおよびプローブの配列を選択し、次いで、Ｑ−ＰＣＲによって検証した。
回帰熱を引き起こすグループのボレリア種に特異的なプライマーおよびプローブの配列：
ステップ（ｃ１）に用いるＢ．ハーマシー種、またはＢ．レカレンティス種に特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表１１に示す：
ステップ（ｃ１）に用いるＢ．ハーマシー種、またはＢ．レカレンティス種に特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表１１に示す：
表１１
ステップ（ｃ３）に用いるＢ．ダットナイ種およびＢ．クロシジュラエ種に特異的なプライマーの対およびプローブの配列を表１２に示す：
表１２
プロトコール：
１−試料の調製：
試料の調製は、ステップ（ａ）で行われるものと同一である。
１−試料の調製：
試料の調製は、ステップ（ａ）で行われるものと同一である。
２−Ｑ−ＰＣＲの条件：
３つの陽性対照を行った。それらは、ここに画定された３対のプライマーにより増幅される、およびプラスミドベクターＰｅｘＡに含まれる、ボレリアの核酸配列に対応する。それらは、配列をＥｕｒｏｆｉｎｓ社に送付することによって、遺伝子合成により生産された。これらの陽性対照の０．２５ｎｇ（１０８コピー）から０．２５ａｇ（０．１コピー）までの７点の最初の較正範囲によって、試料中に存在するボレリアのコピー数による定量値を得ることが可能である。
３つの陽性対照を行った。それらは、ここに画定された３対のプライマーにより増幅される、およびプラスミドベクターＰｅｘＡに含まれる、ボレリアの核酸配列に対応する。それらは、配列をＥｕｒｏｆｉｎｓ社に送付することによって、遺伝子合成により生産された。これらの陽性対照の０．２５ｎｇ（１０８コピー）から０．２５ａｇ（０．１コピー）までの７点の最初の較正範囲によって、試料中に存在するボレリアのコピー数による定量値を得ることが可能である。
３−ステップ（ｃ１）および（ｃ２）：
ステップ（ｃ１）は、配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｃ１）は、配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｃ２）は、増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在または不在を検出することによって、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種に属するボレリアの存在または不在を検出することを目的とする。
ステップ（ｃ１）のＱ−ＰＣＲ反応に必要な混合物を、以下のように調製する。
表１３
反応（範囲点、試料または陰性対照）まで、２０μＬの混合物ならびに５μＬの試料、水（陰性対照用）または範囲点を保管する（最終反応体積２５μＬ）。
増幅条件は、９５℃で５分、次に各回に９４℃で１５秒間の変性と、次いで５８℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルの実行である。
ＦＡＭ蛍光色素およびＨＥＸ蛍光色素の検出をステップ（ｃ２）で選択する。
４−ステップ（ｃ３）および（ｃ４）：
ステップ（ｃ３）は、増幅産物の産生を可能にする条件下で、配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２７の配列からなるプローブとを用いて、標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｃ３）は、増幅産物の産生を可能にする条件下で、配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２７の配列からなるプローブとを用いて、標的ヌクレオチド配列を増幅することを目的とする。
ステップ（ｃ４）は、増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在または不在を検出することによって、Ｂ．クロシジュラエ種に属するボレリアの存在または不在を検出することを目的とする。
ステップ（ｃ３）のＱ−ＰＣＲ反応に必要な混合物を、以下のように調製する。
表１４
反応（範囲点、試料または陰性対照）まで、２０μＬの混合物ならびに５μＬの試料、水（陰性対照用）または範囲点を保管する（最終反応体積２５μＬ）。
増幅条件は、９５℃で５分、次に各回に９４℃で１５秒間の変性と、次いで５８℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルである。
ステップ（ｃ４）で、ＶＩＣ蛍光色素またはＨＥＸ蛍光色素の検出を選択する。
５−結果
これらの条件下で、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種の検出限界は、１０コピー（または２５ａｇ）であり、Ｂ．ダットナイ種およびＢ．クロシジュラエ種の検出限界は、１０コピー（または２５ａｇ）である。
これらの条件下で、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種の検出限界は、１０コピー（または２５ａｇ）であり、Ｂ．ダットナイ種およびＢ．クロシジュラエ種の検出限界は、１０コピー（または２５ａｇ）である。
得られるボレリア・ハーマシー種およびレカレンティス種の増幅産物は、それぞれ１４６塩基対および１８４塩基対である。得られるボレリア・ダットナイ種およびクロシジュラエ種の増幅産物は、１７６塩基対である。
これらのＱ−ＰＣＲ産物の配列は以下である：
表１５
Claims (15)
- 定量的マルチプレックスＰＣＲによって、ヒトまたは動物の試料中のボレリアの存在を検出し、ボレリア種を同定するための方法であって、
（ａ）試料中のボレリアの存在を検出し、ライム病を引き起こすグループのボレリアと回帰熱を引き起こすボレリアとを区別するステップであって、
−前記試料からＤＮＡを抽出すること、
−配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号３および配列番号４の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、ライム病を引き起こすグループまたは回帰熱を引き起こすグループに由来するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップと；次いで、
ステップ（ａ）で、ライム病を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、
（ｂ）試料中の、狭義のＢ．ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）種、Ｂ．ガリニ（B. garinii）種、またはＢ．アフゼリ（B. afzelii）種、およびＢ．バレイシアナ（B. valaisiana）種またはＢ．ビセッティ（B. bissettii）種の存在を、検出および区別するためのステップであって、
−前記試料から抽出されたＤＮＡから、
−（ｂ１）配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマー対と、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の配列からなる３つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｂ２）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種、Ｂ．ガリニ種、またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−（ｂ３）配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対と、配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｂ４）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．バレイシアナ種またはＢ．ビセッティ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップ；
または、ステップ（ａ）で、再帰熱を引き起こすグループのボレリアの存在を標示するシグナルが検出された場合に、
（ｃ）試料中の、回帰熱を引き起こすグループに由来するＢ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種、ならびにＢ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種の存在を検出および区別するためのステップであって、
−前記試料から抽出されたＤＮＡから、
−（ｃ１）配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｃ２）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ハーマシー種およびＢ．レカレンティス種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、ならびに
−（ｃ３）配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対と、配列番号２７の配列からなるプローブとを用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅すること、ならびに
−（ｃ４）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ダットナイ種またはＢ．クロシジュラエ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
からなるステップと；
（ｄ）前記方法が配列番号１から４および８から２７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列を含むものと解釈して、増幅の結果を解析することと
を含む方法。 - ステップ（ａ）が、配列番号５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号７の配列からなるプローブ、または配列番号５から７の配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列を用いて、増幅産物の産生を可能にする条件下で、前記宿主のアクチンをコードするヌクレオチド配列を増幅すること、次いで、増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、アクチンをコードする前記ヌクレオチド配列の存在または不在を検出することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- ステップ（ｂ１）および（ｂ２）が、
−配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１２および配列番号１３の２つのプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することからなるステップ（ｂ１ａ）、
−（ｂ２ａ）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、Ｂ．ガリニ種またはＢ．アフゼリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること、および
−配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマー対と、配列番号１１のプローブとを用いて、前記ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列を増幅することからなるステップ（ｂ１ｂ）、
−（ｂ２ｂ）増幅産物の形成の結果として生じる蛍光シグナルの存在を検出することによって、狭義のＢ．ブルグドルフェリ種に属するボレリアの存在または不在を検出すること
を含むことを特徴とする、請求項１から２のうち１項に記載の方法。 - ステップ（ｄ）が、ステップ（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の終了時に生成する増幅産物をシークエンシングすることを含むことを特徴とする、請求項１から３のうち１項に記載の方法。
- ステップ（ａ）ならびにステップ（ｃ１）および（ｃ３）で用いられる増幅条件が、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回に９４℃での１５秒間の変性と、次いで５８℃での４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することを特徴とする、ステップ１から４のうち１項に記載の方法。
- ステップ（ｂ１ａ）で用いられる増幅条件が、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回に９４℃で１５秒間の変性と、次いで６２℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することを特徴とする、請求項３から５のうち１項に記載の方法。
- ステップ（ｂ１ｂ）で用いられる増幅条件が、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回９４℃で１５秒間の変性と、次いで６０℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することを特徴とする、請求項１から５のうち１項に記載の方法。
- ステップ（ｂ３）で用いられる増幅条件が、最初に９５℃で５分間変性すること、次に、各回９４℃で１５秒間の変性と、次いで６４℃で４５秒間のハイブリダイゼーションおよび伸長とを含む４５サイクルを実行することを特徴とする、請求項１から６のうち１項に記載の方法。
- 配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７の配列を有するプローブが、クエンチャー分子により３’端で、フルオロフォアにより５’端で標識され、蛍光シグナルの検出が、フルオロフォアおよびクエンチャー分子が分離すると発生する増幅の証拠となり、同じステップ（ａ）、（ｂ１）、（ｂ３）、（ｃ１）、（ｃ３）の間に使用されるプローブが、異なる蛍光色素によって標識されることを特徴とする、請求項１から７のうち１項に記載の方法。
- フルオロフォアが、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、Ｃｙ５、ＨＥＸから選択され、蛍光阻害剤が、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＱｕｅｎｃｈｅｒであるかまたはＮＦＱなどの非蛍光クエンチャーと会合するＭＧＢ分子であり得ることを特徴とする、請求項１から８のうち１項に記載の方法。
- 試料が血液、尿、唾液、体組織であることを特徴とする、請求項１から９のうち１項に記載の方法。
- 配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２７、ならびにそれらのそれぞれの相補的な配列から選択されるヌクレオチド配列を含むプローブ。
- 配列の５’端が、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＣＹ５、ＨＥＸによって標識されていることを特徴とする、請求項１２に記載のプローブ。
- 定量的マルチプレックスＰＣＲによって、ヒトまたは動物の試料中のボレリアの存在を検出し、ボレリア種を識別および同定するためのキットであって、
（ｉ）配列番号１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号３および配列番号４の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｉ）配列番号８の配列を有するフォワードプライマーならびに配列番号９および配列番号１０の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対、ならびに配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３の配列からなる３つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｉｉ）配列番号１４の配列を有するフォワードプライマー、配列番号１５の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号１６の配列を有するリバースプライマーによって形成されるプライマーの対、ならびに配列番号１７および配列番号１８の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｉｖ）配列番号１９の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２０の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２１の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２２の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２３および配列番号２４の配列からなる２つのプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｖ）配列番号２５の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号２６の配列を有するリバースプライマーを含むプライマーの対、ならびに配列番号２７の配列からなるプローブ、または前記配列のうち１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する任意の配列、または任意の相補的な配列、
（ｖｉ）ならびに定量的マルチプレックスＰＣＲを実施するのに必要な試薬の全て
を含み、
前記プローブが、クエンチャー分子により３’端で、フルオロフォアにより５’端で標識されている、キット。 - 定量的マルチプレックスＰＣＲによって、ヒトまたは動物の試料中のボレリアの存在を検出し、ボレリア種を同定するための、請求項１５に規定されるようなキットの使用。
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