CN105368825B - 幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒以及利用所述试剂盒进行幽门螺杆菌抗生素耐药性检测的方法，所述试剂盒包括引物，所述引物包括针对幽门螺杆菌抗生素耐药基因以及鉴定基因16S rRNA设计的引物。本发明基于多重基因分析，各诊断基因独立分明，能够实现在同一个反应体系内对幽门螺杆菌的快速鉴定及其多种抗生素耐药性的分析，避免传统培养方法和药敏检测耗时长、阳性率低、费用高等缺点。

Description

幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测分析幽门螺杆菌抗生素耐药性的试剂盒以及耐药性检测方法，尤其涉及一种基于多重基因分析系统的幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及检测方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori，H.pylori)生存于人体胃部，是最常见的细菌病原体之一，世界有多半人口受到过幽门螺杆菌的感染。幽门螺杆菌感染可能引起慢性胃炎、消化性溃疡，严重者则发展为胃癌、胃黏膜相关性淋巴组织淋巴瘤。

随着抗生素的广泛使用，幽门螺杆菌耐药菌株也在日益增多，幽门螺杆菌对抗生素产生耐药已经成为其根除率下降的最主要原因，这不但给临床治疗带来困难，也增加了患者的经济负担，导致医疗资源极大浪费。

耐药性检测是实施个体化治疗的前提，可以避免重复使用已经产生耐药性的抗生素、并根据药敏实验选择有效抗生素。

目前，已有多种检测幽门螺杆菌抗生素耐药性的方法，传统方法检测幽门螺杆菌抗生素耐药性主要局限于药敏试验，但E-test耗材昂贵，纸片扩散法缺乏有效的判断标准，琼脂稀释法对操作技术要求较高；而且药敏试验不能鉴定H.pylori菌株基因突变的位点。另外，幽门螺杆菌对培养要求苛刻，微需氧条件下生长缓慢，不适合临床常规开展。如：①分离培养鉴定：幽门螺杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽门螺杆菌培养需要微需氧条件，对营养条件要求苛刻，所以极易造成假阴性，其灵敏度仅有40％-70％，检出率低。且幽门螺杆菌培养需要一定时间，不利于快速诊断。②UBT：根据标志物不同可分为¹³C-UBT和¹⁴C-UBT，临床应用广泛，技术要求低。缺点是费用高，易受抑酸剂和抑菌药物影响，敏感度低。③免疫学检查：检测粪便中幽门螺杆菌的抗原或血清中幽门螺杆菌抗体。优点是快速、无损伤，缺点是不能判断现症感染还是既往感染。④组织病理切片染色法：该法是把患者胃镜检查活检组织切片,染色后观察组织中的幽门螺杆菌。优点是可同时进行胃黏膜的病理学诊断，且特异性和敏感性均较高。但该方法受幽门螺杆菌载量影响明显，且操作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测。

随着分子生物学技术的发展，PCR、荧光原位杂交、基因芯片、DNA测序等技术已被用于幽门螺杆菌抗生素耐药性的检测，包括：普通PCR、寡核苷酸探针杂交、基因芯片、测序等。但以上检查方法均存在检测位点少、特异性低，通量小等缺点，且不能同步进行耐药性分析。

目前检测幽门螺杆菌抗生素耐药的分子生物学技术还存在费用高、临床难普及等缺点，因此，亟需开发一种快速、准确、便捷、经济的多重基因检测的方法，同步完成幽门螺杆菌鉴定、多位点耐药性分析，从而探索一种新的基于耐药性分析的幽门螺杆菌检测及个体化幽门螺杆菌根除模式，更好地指导临床合理应用抗生素，降低耐药菌株的出现，减少患者经济负担。

发明内容

针对目前幽门螺杆菌对抗生素耐药性检测方法存在的问题，本发明提供了一种基于多基因的幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒及耐药性检测方法。

本发明第一个方面是提供一种幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒，包括引物，所述引物包括针对幽门螺杆菌抗生素耐药相关基因以及鉴定基因16S rRNA设计的引物。

其中，所述幽门螺杆菌抗生素耐药相关基因选自：23S rRNA、gyrA、porD中的一种或几种。

在本发明的一种优选实施例中，所述引物包括针对幽门螺杆菌16S rRNA基因、以及抗生素耐药相关基因23S rRNA、gyrA、porD设计的引物。

在本发明的一种优选实施例中，在正向引物5’端连接正向通用Tag序列，反向引物5’端连接反向通用Tag序列。

其中，所述正向通用Tag序列为：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’。

其中，所述反向通用Tag序列为：5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。

在本发明的一种优选实施例中，针对每一抗生素耐药相关基因设计的引物包括至少两条反向引物。

其中，两条反向引物分别针对野生型基因和突变型基因设计。

其中，所述突变优选为：

23S rRNA基因2143位点碱基A发生突变，如突变后碱基为G；

porD基因347位点碱基C发生突变，如突变后为T、G、A中的任意一种；

gyrA基因261位点碱基C/T发生突变，如突变后为G/A。

其中，更优选地，针对23S rRNA基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.1：5’-AACCGCGGCAAGACGGCA-3’；

SEQ ID No.2：5’-GATCTAACCGCGGCAAGACGGTG-3’；

SEQ ID No.3：5’-GGTATCTCAAGGATGGCTCC-3’。

其中，更优选地，针对23S rRNA基因设计的引物序列连接Tag序列后为：

5’-GTACGACTCACTATAGGGAAACCGCGGCAAGACGGCA-3’；

5’-GTACGACTCACTATAGGGAGATCTAACCGCGGCAAGACGGTG-3’；

5’-AGGTGACACTATAGAATAGGTATCTCAAGGATGGCTCC-3’。

其中，更优选地，针对gyrA基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.4：5’-AGACACTAGCGCATCATAAACCGAR-3’；

SEQ ID No.5：5’-CTAGCGCATCATAAACCGTY-3’；

SEQ ID No.6：5’-TAGAAGTGGGGATTGATTCT-3’。

其中，更优选地，针对gyrA基因设计的引物序列连接Tag序列后为：

5’-GTACGACTCACTATAGGGAAGACACTAGCGCATCATAAACCGAR-3’；

5’-GTACGACTCACTATAGGGACTAGCGCATCATAAACCGTY-3’；

5’-AGGTGACACTATAGAATATAGAAGTGGGGATTGATTCT-3’。

其中，更优选地，针对porD基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.7：5’-GAACAAATTGAGCCTGCYGC-3’；

SEQ ID No.8：5’-ACCAAGAACAAATTGAGCCTGCYCD-3’；

SEQ ID No.9：5’-GCGTTGATGGGGTGATAGCA-3’。

其中，更优选地，针对porD基因设计的引物序列连接Tag序列后为：

5’-GTACGACTCACTATAGGGAGAACAAATTGAGCCTGCYGC-3’；

5’-GTACGACTCACTATAGGGAACCAAGAACAAATTGAGCCTGCYCD-3’；

5’-AGGTGACACTATAGAATAGCGTTGATGGGGTGATAGCA-3’。

其中，更优选地，针对16S rRNA基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.10：5’-CTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3’；

SEQ ID No.11：5’-ATTACTGAAGCTGATTGCGC-3’。

其中，更优选地，针对16S rRNA基因设计的引物序列连接Tag序列后为：

5’-GTACGACTCACTATAGGGACTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3’；

5’-AGGTGACACTATAGAATAATTACTGAAGCTGATTGCGC-3’。

在本发明的一种优选实施例中，所述试剂盒还可以包括如下试剂中的任意一种或几种：缓冲液、DNA聚合酶、荧光标记物、dNTPs、DNA聚合酶激活剂。

其中，所述DNA聚合酶可以是大肠杆菌DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶中的任意一种或几种，并优选为Taq DNA聚合酶。

其中，所述DNA聚合酶激活剂优选为能够提供Mg²⁺的物质，如氯化镁。

本发明第二个方面是提供一种幽门螺杆菌抗生素耐药性检测方法，包括：

提取幽门螺杆菌核酸；

采用本发明第一个方面所述试剂盒对所提取的核酸中的抗生素耐药相关基因进行多重PCR扩增；

毛细管电泳检测。

其中，所述PCR扩增反应过程中，同时使用所述试剂盒中针对每一种抗生素耐药基因设计的引物。

其中，所述PCR扩增反应过程包括：

105℃热盖预处理；

95℃变性2min；

94℃变性30s，58℃退火30s，70℃延伸1min；该步骤进行33次循环；

反应结束。

本发明所述基于多基因的幽门螺杆菌抗生素耐药性检测方法，优选为非疾病诊断和治疗为目的的方法。

其中，所述基于多基因的幽门螺杆菌抗生素耐药性检测方法，可以应用于药物的研发和/或筛选。

本发明上下文内容中，所述耐药优选为对大环内酯类药物、和/或硝基呋喃类药物、和/或喹诺酮类药物耐药。

其中，所述大环内酯类药物优选为克拉霉素等。

其中，所述硝基呋喃类药物优选为呋喃唑酮等。

其中，所述喹诺酮类药物优选为左氧氟沙星等。

本发明上下文内容中，没有特别说明的情况下，核苷酸序列中R代表核苷酸A或G，Y代表核苷酸C或T/U，D代表核苷酸A或G或T/U。

本发明基于多重基因分析，各诊断基因独立分明，能够实现在同一个反应体系内实现对幽门螺杆菌的快速鉴定及多种抗生素耐药性的分析，灵敏度可达到90％以上，准确率也可以达到90％，避免传统培养方法和药敏检测耗时长、阳性率低、费用高等缺点。

附图说明

图1为采用本发明试剂盒和方法检测标准菌株ATCC26695的毛细管电泳图；

图2为采用本发明试剂盒和方法检测临床H.pylori菌株的毛细管电泳图；

图3为采用本发明试剂盒和方法检测另一种临床H.pylori菌株的毛细管电泳图。

具体实施方式

1.材料

1.1.研究对象

H.pylori标准菌株(ATCC 26695)、两种分离的H.pylori临床菌株。

1.2.材料和试剂

1.3.仪器和设备

CEQ^TM 8000Genetic Analysis System

2.实验方法

2.1.核酸抽提

幽门螺杆菌核酸抽提采用天根DNA抽提试剂盒，方法参照说明书进行，具体步骤如下：

1)样品核酸提取准备：将试剂盒内各试剂平衡至室温，在Buffer GD中加入无水乙醇16ml，充分混合均匀，作好已加入乙醇的标记；在Buffer PW中加入无水乙醇68ml，充分混合均匀，作好已加入乙醇的标记；充分混匀备用；开启恒温浴锅，设定温度至70℃。

2)排列适当数量1.5ml EP管，作好标记，各加入1ml灭菌生理盐水。

3)分别加入适量的幽门螺杆菌，制备成细菌培养液，11000rpm离心1min，尽量吸净上清。

4)向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮。

5)向各管中加入20μl蛋白酶K，混合均匀。

6)加入220μl缓冲液GB，震荡15s，70℃水浴中放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

7)加入220μl无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以除去管盖内壁水珠。

8)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

9)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管内。

10)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管内。

11)重复上一步10)的操作。

12)将吸附柱CB3放回收集管内，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

13)将吸附柱CB3转入一干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μlddH₂O，室温下放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

14)将提取的DNA放入-20℃冰箱备用。

2.2.PCR反应

2.2.1.引物设计

根据3个H.pylori耐药相关基因23S rRNA、gyrA、porD和H.pylori鉴定基因16SrRNA，设计引物。分别在正向引物5’端加上正向通用Tag序列：

5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’，反向引物5’端加上反向通用Tag序列5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。

经过优化后，针对各基因得出的多重PCR引物序列见表1。

表1，多重PCR引物序列

合成相关引物，得到多重PCR引物配方，详见表2。

表2，多重PCR引物配方

2.2.2.PCR反应

多重PCR反应体系为10μl，按照下列比例配置：

多重PCR反应条件为：105℃预处理——95℃预变性2min——(94℃变性30s，58℃退火30s，70℃延伸1min)共33个循环。

反应结束后，4℃保存。

2.2.3.GeXP毛细管电泳

仪器和试剂：

1)GenomeLab GeXP遗传分析系统

2)Sample Microplate,96-Well(96孔样品板)

3)Buffer Microplates,96-Well(96孔分离液板)

4)DNA Size Standard-400with Mineral Oil

5)GenomeLab Sample Loading Solution(SLS上样液)

6)GenomeLab Seperation Buffer(分离缓冲液)

7)GenomeLab Seperation Capillary Array(毛细管)

8)GenomeLab Seperation Gel(分离胶)

方法：

1)制备样品处理液(Sample Loading Solution，SLS)及分子量内标(DNA SizeStandard-400，DSS400)的混合液：取DSS400及80倍体积的SLS，用枪头混匀10次备用。

2)在每样本孔中加入40μl配制好的SLS/DSS400混合液，再加入扩增得到的PCR产物1μl至GeXP样品板(不要出现气泡)，加入一滴石蜡油覆盖样品。3)另取缓冲液板，在与样品板对应的孔内加入3/4体积的分离缓冲液(Separation Buffer)。

3.结果

图1给出了上述方法检测H.pylori标准菌株ATCC26695的毛细管电泳图，该菌株含有16S rRNA基因，23S rRNA基因2143位点是碱基A(野生型)，porD基因347位点是碱基C(野生型)，gyrA基因261位点是碱基C/T(野生型)。

图2给出了上述方法检测一种临床H.pylori菌株的毛细管电泳图，该菌株含有16SrRNA基因，23S rRNA基因2143位点是碱基G(突变型)，porD基因347位点是碱基C(野生型)，gyrA基因261位点是碱基G/A(突变型)。该临床菌对克拉霉素、左氧氟沙星耐药。

图3给出了上述方法检测另一种临床H.pylori菌株的毛细管电泳图，该菌株含有16S rRNA基因，23S rRNA基因2143位点是碱基G(突变型)，porD基因347位点是碱基C(野生型)，gyrA基因未检测到。该临床菌对克拉霉素、左氧氟沙星耐药。

本发明试剂盒检测克拉霉素耐药性的灵敏度为94.4％，特异度为92.6％，准确性为93.3％。

本发明试剂盒检测左氧氟沙星耐药性的灵敏度为93.8％，特异度为86.4％，准确性为89.5％。

通过上述实施例以及附图1-3可以看出，四种诊断基因独立分明，相继在目的片段区域出现相应的目的峰，说明引物设计良好，避免了引物之间的相互干扰。多重基因检测的方法能够确认H.pylori现症感染，同时根据耐药位点的表达情况可预测H.pylori抗生素耐药性。由于多重PCR检测结果非常直观，显示了很好的应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (2)

1.一种幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒，其特征在于，采用多重PCR和毛细电泳方法，同步多重检测针对幽门螺杆菌(HP)抗生素耐药相关基因23S rRNA、gyrA、porD以及鉴定基因16S rRNA，可在鉴定HP感染的同时，提供HP菌株对抗生素是否耐药的信息；根据所述检测基因设计的特异性引物；在正向特异性引物5’端连接正向通用Tag序列，反向特异性引物5’端连接反向通用Tag序列；其中，所述正向通用Tag序列为：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’；其中，所述反向通用Tag序列为：5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’；所述特异性引物包括针对幽门螺杆菌鉴定基因16S rRNA基因、以及抗生素耐药相关基因23S rRNA、gyrA、porD设计的引物；

针对23S rRNA基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.1：5’-AACCGCGGCAAGACGGCA-3’；

SEQ ID No.2：5’-GATCTAACCGCGGCAAGACGGTG-3’；

SEQ ID No.3：5’-GGTATCTCAAGGATGGCTCC-3’；

针对gyrA基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.4：5’-AGACACTAGCGCATCATAAACCGAR-3’；

SEQ ID No.5：5’-CTAGCGCATCATAAACCGTY-3’；

SEQ ID No.6：5’-TAGAAGTGGGGATTGATTCT-3’；

针对porD基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.7：5’-GAACAAATTGAGCCTGCYGC-3’；

SEQ ID No.8：5’-ACCAAGAACAAATTGAGCCTGCYCD-3’；

SEQ ID No.9：5’-GCGTTGATGGGGTGATAGCA-3’；

针对16S rRNA基因设计的引物序列为：

SEQ ID No.10：5’-CTGGAGAGACTAAGCCCTCC-3’；

SEQ ID No.11：5’-ATTACTGAAGCTGATTGCGC-3’。

2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌抗生素耐药性分析试剂盒，其特征在于，还包括如下试剂中的任意一种或几种：缓冲液、DNA聚合酶、荧光标记物、dNTPs、DNA聚合酶激活剂。