CN102277439B - 一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法，建立在分子生物学基础上，包括2×LAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及ddH2O，所述引物混合物包括：上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比为FIP∶BIP∶F3∶B3=8∶8∶1∶1。本发明的试剂盒具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点，不需要特殊的仪器设备，解决了山羊传染性胸膜肺炎病原分离时间长、工作量大及检测方法繁琐操作复杂等缺陷。可以用于检测临床样本是感染山羊肺炎支原体山羊肺炎亚种，以及山羊传染性胸膜肺炎的早期诊断和分子流行病学调查。

Description

一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及检测山羊支原体山羊肺炎亚种基因组DNA的环介导等温扩增技术，具体说是一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，本发明还包括该试剂盒的制备方法。
背景技术
目前常用的诊断山羊传染性胸膜肺炎的方法包括凝集和PCR，这些方法都有一定的缺点。凝集试验主要是间接血凝法，该方法的缺点是检测灵敏度低，会出现漏检的情况；而且这种方法是针对山羊传染性胸膜肺炎抗体检测，检测为阳性的动物可能是接种支原体疫苗引起的。PCR和LAMP方法都是基于分子生物学基础上的灵敏、特异、高效新型诊断技术。但山羊传染性胸膜肺炎PCR过程比较复杂，在扩增以后要进行酶切鉴定才能确定是否为阳性，并且该方法需要昂贵的PCR仪来配合使用，反应的时间长，反应后需要进行琼脂糖凝胶电泳用凝胶呈像仪观察结果，且在动物基因组DNA提取过程中，可能会有一些遗留的PCR反应的抑制因子影响其特异性和敏感性。
发明内容
本发明的目的是为了克服当前山羊传染性胸膜肺炎诊断技术中的不足，提供一种基于分子生物学领域的的高敏感性、高特异性、高效性、操作简单的山羊传染性胸膜肺炎快速检测试剂盒，同时提供该试剂盒的制备方法。
一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，包括2×LAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H2O，所述引物混合物包括：上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比为FIP：BIP：F3：B3=8：8：1：1。
所述引物针对山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 H2基因设计，引物序列为：
上游内部引物FIP（F1c+F2）:
5＇-TGCTGGTGAATATTTTGTAGCAGGT-TTTT-AAGCCCAAAGTTAATATACCTTGA -3＇
下游外部引物BIP（B1c+B2）:
5＇-CAACACCAGATTCAAAGAAAGGTTT-TTTT-GAGTTGAAAGCTTTTTAGATTGT -3＇
上游外部引物F3: 5＇-ACAACCTAAAGAGATTATTCACTC-3＇
下游外部引物B3: 5＇-AACTTGACTTCCAACAACAA-3＇
所述2×LAMP反应液包括4% pH8.8的三羟甲基氨基乙烷(Tris-HCl )、20mM氯化钾(KCl)、16mM硫酸镁(MgSO4)、20mM硫酸铵(（NH4）2SO4)、0.2%吐温20(Tween 20)、2.8mM脱氧核苷酸混合物(dNTPs)和1.6M甜菜碱。
所述山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒的制备方法如下：
Figure 669005DEST_PATH_IMAGE001
 制备2×LAMP反应液：
Figure 702820DEST_PATH_IMAGE002
配置Tris-HCl： 配置浓度为12.11% Tris，并用HCl调节pH8.8，备用；
Figure 148845DEST_PATH_IMAGE003
配置含有终浓度为22.2mM的KCl 、17.8mM的MgSO4、22.2mM的（NH4）2SO4和1.78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0.22% Tween 20和4.4%的Tris-HCl，备用；
Figure 279612DEST_PATH_IMAGE004
将
Figure 356152DEST_PATH_IMAGE003
中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9：1的比例混合；
a、 制备2×LAMP反应液：
Figure 939581DEST_PATH_IMAGE002
配置Tris-HCl： 配置浓度为12.11% Tris，并用HCl调节pH8.8，备用；
Figure 189296DEST_PATH_IMAGE003
配置含有终浓度为22.2mM的KCl 、17.8mM的MgSO4、22.2mM的（NH4）2SO4和1.78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0.22% Tween 20和4.4%的Tris-HCl，备用；
Figure 112253DEST_PATH_IMAGE004
将
Figure 422011DEST_PATH_IMAGE003
中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9：1的比例混合；
Figure 492736DEST_PATH_IMAGE005
 制备引物混合物：
Figure 480896DEST_PATH_IMAGE002
 针对山羊支原体山羊肺炎亚种H2基因的一段高度保守的区域设计引物；
Figure 320676DEST_PATH_IMAGE003
 混合引物中FIP：BIP：F3：B3为8：8：1：1，按照如上体积比例混匀。
Figure 801336DEST_PATH_IMAGE006
 制备标准阳性模板：
Figure 31460DEST_PATH_IMAGE002
 将山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38接种于改良KM2液体试管培养基，置37℃培养箱培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后进行扩大培养接种于30ml液体培养基中，置37℃培养箱中进行培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后收集菌体；
Figure 888557DEST_PATH_IMAGE003
 将培养物置4℃离心机12000rpm离心30min，弃上清，用PH7.2PBS 缓冲液以同样条件离洗3次； 
Figure 520527DEST_PATH_IMAGE004
提取F38基因组DNA，此为标准阳性模板。
反应体系为50% 2×LAMP反应液、3.6%引物混合物、0.4% BstDNA聚合酶、8%标准阳性模板以及34.4% dd H2O。反应条件为65℃，2h；80℃，5min；4℃，永久保存。反应后按体积比为25：1将LAMP产物与显色剂混合，观察颜色变化，判断结果。
本发明是建立在分子生物学基础上，基于山羊支原体山羊肺炎亚种H2基因，应用环介导等温扩增（LAMP）的方法快速检测山羊传染性胸膜肺炎的试剂盒，具有敏感性高、特异性强、反应迅速、操作简单等特点，不需要特殊的仪器设备，解决了山羊传染性胸膜肺炎检测时间长、 工作量大、操作复杂等缺陷，可以用于检测临床样本是否感染山羊支原体山羊肺炎亚种，以及山羊传染性胸膜肺炎的早期诊断和分子流行病学调查。
具体实施方式
一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，包括： 2×LAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂以及标准阳性模板。
2×LAMP反应液包括：4% Tris-HCl（pH8.8）、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM（NH4）2SO4、0.2% Tween 20、2.8mM dNTPs和1.6M甜菜碱。
引物混合物包括：
40pmol上游内部引物FIP、40pmol下游内部引物BIP、5pmol上游外部引物F3、5pmol下游外部引物B3。
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
实施例1
 
Figure 172088DEST_PATH_IMAGE001
 制备LAMP反应液：
Figure 217405DEST_PATH_IMAGE002
配置Tris-HCl：称取121.1g Tris于800mLddH2O中溶解，用HCl调节pH8.8，定容至1000mL，备用；
Figure 550297DEST_PATH_IMAGE003
 称取1.49g KCl 、3.96g MgSO4·7H2O、2.64g （NH4）2SO4、187.4g甜菜碱，并加入40mL
Figure 99090DEST_PATH_IMAGE002
中配置的Tris-HCl以及2mL Tween 20，加dd H2O定容至900 mL，备用；
Figure 187132DEST_PATH_IMAGE004
 取900μL
Figure 391848DEST_PATH_IMAGE003
中配置的溶液，加入100μL25mM dNTPs，混匀。
Figure 325169DEST_PATH_IMAGE005
 制备引物混合物：
Figure 994048DEST_PATH_IMAGE002
 针对山羊支原体山羊肺炎亚种H2的一段高度保守的区域，利用Primer Expolorer V4在线软件设计引物；
Figure 190674DEST_PATH_IMAGE003
 混合引物包括22.4μL FIP和BIP、2.8μL F3 和B3，混匀。
 制备标准阳性模板：
Figure 682015DEST_PATH_IMAGE002
 将山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38接种于改良KM2液体试管培养基，置37℃培养箱培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后进行扩大培养接种于30ml液体培养基中，置37℃培养箱中进行培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后收集菌体；
Figure 143084DEST_PATH_IMAGE003
 将培养物置4℃离心机12000rpm离心30min，弃上清，用PH7.2PBS 缓冲液以同样条件离洗3次；
Figure 307349DEST_PATH_IMAGE004
提取F38基因组DNA，此为标准阳性模板。
检测时按照如下反应体系                            
LAMP反应液                                 12.5μL
BstDNA聚合酶                               1μL
引物混合物                                    0.9μL
模板DNA                                       2μL
dd H2O                                         8.6μL
Figure 486657DEST_PATH_IMAGE007
 
总反应体系                                    25μL
 (4) LAMP反应
反应条件为65℃，2h； →  80℃，5min；  →   4℃，永久保存。
反应结果判定：反应后加入1μL的显色剂，肉眼观察阳性结果是染料由橘红色变为绿色，紫外下发绿色荧光；阴性结果染料不变色，仍为橘红色，紫外下无荧光。 
〈110〉中国农业科学院兰州兽医研究所
〈120〉一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒及其制备方法
〈130〉Loop-mediated isothemal amplication of DNA
〈140〉
〈141〉
〈160〉5
〈170〉PatentIn Version 3.3
〈210〉1
〈211〉1063
〈212〉DNA
〈213〉山羊肺炎支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae）
〈220〉
〈221〉gene
〈222〉(1)-(1063)
〈400〉1
gatattgtaaaaatttattaagtatgttatatatgaattataaaagcaatagtgagtgtg 60
aatttaatgatagaatttaagatcttatatgaaaaaaaccatttctttaatatttttttt 120
attaataattaatagtttaattactttatttcatcttactagtgttcaagaattttctat 180
attttatttaaatcaagttgataaaaaaagcgaatatcatcagtataattctgataaaac 240
tgaaataacaaaattaggtttttataagaatgaaaatactcaaaaaattacaataagacc 300
gattccttattttgttaaaaaagtccctgaaacattaccagctgagattcaaagtttgta 360
tcttgcatttgctcatagatatgaacgtcatggagaagttactggttttgaaaaatgaga 420
tactaaaaacatcgaagatatgagttatgcattttttgaaaatcatacagttgattctga 480
tatttcattttgaaatacagataaagtaactaatatgaaaagtatgtttaaaaatgctgt 540
taaatttaacaacaatggaaagtcgttaaaaaactgaaatactaatttagttacttcaat 600
ggagtctatgtttgaaggggcagagaaatttaatcaaaacctaaggagttgaaaagtaga 660
aaaggttaaagataataagaatttttcaagaggaagcggtttttctaatgaccctaacaa 720
aagaccggattggaaaacaccagaagtaaatgatccagtagagaaaaaacctaaagaaat 780
acaacctaaagagattattcactcacctttggttaagcccaaagttaatataccttgaac 840
tagaatagttactcctgctacaaaatattcaccagcattaaaaccaacaccagattcaaa 900
gaaaggtttagaaataccaaaagctaatttgagtacaacaaatcaacaatctaaaaagct 960
ttcaactcctgcaattgttggtattgttgttggaagtcaagttgtgttaacttctttagc 1020
agtgggtacaccttatttgattaaaaaatttaaaaaataattt 1063
〈210〉2
〈211〉53
〈212〉DNA
〈213〉人工合成
〈220〉
〈221〉上游内部引物FIP（F1c+F2）
〈222〉（1）..(53)
〈223〉
〈400〉2
tgctggtgaatattttgtagcaggt-tttt-aagcccaaagttaatataccttga
〈210〉3
〈211〉52
〈212〉DNA
〈213〉人工合成
〈220〉
〈221〉下游外部引物BIP（B1c+B2）
〈222〉（1）..(52)
〈223〉
〈400〉3
caacaccagattcaaagaaaggttt-tttt-gagttgaaagctttttagattgt
〈210〉4
〈211〉24
〈213〉人工合成
〈220〉
〈221〉上游外部引物F3
〈222〉（1）..(24)
〈223〉
〈400〉4
acaacctaaagagattattcactc
〈210〉5
〈211〉20
〈213〉人工合成
〈220〉
〈221〉下游外部引物B3
〈222〉（1）..(20)
〈223〉
〈400〉5
aacttgacttccaacaacaa
 

Claims (3)

1.一种山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，包括2×LAMP反应液、引物混合物、BstDNA聚合酶、显色剂、标准阳性模板以及dd H2O，其特征在于所述引物混合物包括：上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3、下游外部引物B3，各引物的配比为FIP：BIP：F3：B3=8：8：1：1，所述的引物针对山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 H2基因设计，所述引物序列为：
上游内部引物FIP（F1c+F2）:
5＇-TGCTGGTGAATATTTTGTAGCAGGT-TTTT-AAGCCCAAAGTTAATATACCTTGA -3＇
下游外部引物BIP（B1c+B2）:
5＇-CAACACCAGATTCAAAGAAAGGTTT-TTTT-GAGTTGAAAGCTTTTTAGATTGT -3＇
上游外部引物F3: 5＇-ACAACCTAAAGAGATTATTCACTC-3＇
下游外部引物B3: 5＇-AACTTGACTTCCAACAACAA-3＇。
2.根据权利要求1所述的山羊传染性胸膜肺炎的快速检测试剂盒，其特征在于所述2×LAMP反应液包括4% pH8.8的Tris-HCl、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM（NH4）2SO4、0.2% Tween 20、2.8mM dNTPs和1.6M甜菜碱。
3.一种根据权利要求1或2所述山羊传染性胸膜肺炎肺炎的快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于按下述工艺方法制备： 
a、 制备2×LAMP反应液：                                                
Figure 605419DEST_PATH_IMAGE001
配置Tris-HCl： 配置浓度为12.11% Tris，并用HCl调节pH8.8，备用；
Figure 522560DEST_PATH_IMAGE002
配置含有终浓度为22.2mM的KCl 、17.8mM的MgSO4、22.2mM的（NH4）2SO4和1.78M的甜菜碱的混合溶液，并加入0.22% Tween 20和4.4%的Tris-HCl，备用；
Figure 302297DEST_PATH_IMAGE003
将
Figure 510556DEST_PATH_IMAGE002
中配置的溶液与25mM dNTPs按照体积比为9：1的比例混合；
b、 制备引物混合物： 针对山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 H2基因的一段高度保守的区域设计引物；
Figure 147390DEST_PATH_IMAGE002
 混合引物中FIP：BIP：F3：B3为8：8：1：1，按照如上体积比例混匀；
c、 制备标准阳性模板：
Figure 414424DEST_PATH_IMAGE001
 将山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38接种于改良KM2液体试管培养基，置37℃培养箱培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后进行扩大培养接种于30ml液体培养基中，置37℃培养箱中进行培养，待颜色发生变化，由红色变为黄色后收集菌体；
Figure 675641DEST_PATH_IMAGE002
 将培养物置4℃离心机12000rpm离心30min，弃上清，用PH7.2PBS 缓冲液以同样条件离洗3次； 
Figure 344519DEST_PATH_IMAGE003
提取F38基因组DNA，此为标准阳性模板。
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