CN1061245A - 用于检测博氏疏螺旋体的生物测定 - Google Patents

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Abstract

一些核酸引物，具有互补于博氏疏螺旋体鞭毛蛋 白的一个半保存区的编码基因的若干部分的顺序，被 用来扩增由莱姆疏螺旋体属的传染部位提取的核酸 靶顺序，于是，用与产生信号的分子相连接的一种核 酸示踪物探测这些核酸引物，这种核酸示踪物对于检 测博氏疏螺旋体具有很强的专用性。

Description

本发明是我的申请日为1990年6月15日、申请号为7/538，957的在先的悬而未决的申请的后续申请。
本发明涉及一些用于检测一些传染物的核酸探针测定，这些传染物存在于一些生物样品中，含量极少。
莱姆（Lyme）病是一种由壁虱传播的螺旋体属博氏疏螺旋体（Borrelia  burgdorferi）引起的一些临床病症的综合症。它是在北美和欧洲由节肢动物传播的最常见的疾病。这种传染的特殊形式包括慢性游走性红斑、慢性萎缩性皮炎、淋巴细胞脑膜神经根炎及莱姆关节炎。在这种病的第二和第三阶段可观察到严重危及神经系统和心脏的情况。各种临床表现的变化类型以及该病症与其他神经性和风湿性病症的显著类似造成了诊断的困难。关于莱姆病的临床的及病原学的一般评论见Steere等人文章“N.Engl.J.Med.308：733”和“Duray，Rev.Infeet.Dis.112：S1487”。莱姆病除去严重的临床病状外，它对抗菌治疗反应极好，若能早期进行诊断及适当治疗的话。然而，由于在感染后的最初的几天或几周内没有可用来进行可靠的区别诊断的试验，这使得早期诊断无法实现。目前所用的一些诊断试验全是血清学方面的，包括间接免疫荧光法（IFA）、酶连接免疫吸收剂测定法（ELISA）及免疫吸印法（immunoblotting）。这些免疫学试验不可靠，因为早期病人只有50%至60%在感染后最初3至6个星期内具有可利用IFA或ELISA测量的诊断滴度。
此外，在带有由苍白密螺旋体（T.pallidum）引起的梅毒的一些病人中以及在带有由赫氏疏螺旋体（BOrrelia  hermsii）引起的复发性发热的一些病人中已报导过在IFA及ELISA法中出现假阳性反应。在以血清学为基础的那些博氏疏螺旋体测定中普遍出现假阳性反应是由于导致大多数结构性决定因素的血清学交叉反应性的很高程度的致病螺旋体之中的基因内部关系。例如，可参见Magnarelli等人文章“J.Infeet.Dis.，156：183（1987）”。
对于血清学测定法的一种替代方法是这样一种试验，该试验是基于所要连接的一些极特殊的靶顺序的核酸探针的性质。由于在莱姆病感染期间这种有机体本身数量极少，因此，必须首先扩增所述靶核酸顺序，使得产生信号的分子所附着的那些探针能以足够的数量杂交，以产生能够检测的信号。基于这样的探针的测定法的策略在于该靶顺序是专门针对试图检测的那些种类的有机物，并且这些靶顺序包括这些种类的每一个成员品系。
用于博氏疏螺旋体的核酸探针测定法必须能将这种有机体与那些密切相关的种类区分开，尤其是复发性发热的各种变种、赫氏疏螺旋体、扁虱疏螺旋体（B.parkeri）、特氏疏螺旋体（B.teri-cate）、西班牙疏螺旋体（B.hispanica）、以及回归热疏螺旋体（B.recurrentis）。对各种疏螺旋体属的DNA同系性的研究表明同系性的变化程度，赫氏疏螺旋体显示了最大同系性，从58%到63%，如Hyde及Johnson所报导的那样[Zbl.Bakt.Hyg.A，263：119（1988）]。三个北美种类，赫氏疏螺旋体、特氏疏螺旋体及扁虱疏螺旋体，分别具有77%到100%的同系性，但欧洲品系与北美品系的比较显示出基本上是种类内部的变化。
在借助于核酸探针测定法检测博氏疏螺旋体时，注意力集中在一些用于OspA和OspB表面蛋白质抗原的探针。Nielsen等在“Mol.Cel.Probes，4：73（1990）”中报导了成功地探测了OspA的一个被扩增的145个碱基对区段，以检测相应50个螺旋体的少至50fg博氏疏螺旋体DNA。人们发现该探针是专用于博氏疏螺旋体的，在这种情况下，对赫氏疏螺旋体、苍白密螺旋体、齿垢密螺旋体（T.denticola）或S.aureus未观察到交叉反应性。然而，Persing等人在“J.Clin.Micro.，28：566（1990）”中报导了探测到大量真实的博氏疏螺旋体的隔离体的OspA区，并发现所述探针不能肯定地鉴别所有隔离体。这个结果的分子学基础就是发现某些博氏疏螺旋体品系具有完全不同的OspA蛋白质，或者根本没有OspA蛋白质，并且代之以一个被称为PC的较小的蛋白质。因此，目前尚没有针对博氏疏螺旋体的权威性测定。
更新的研究表明，博氏疏螺旋体可以包括多于一组的有机体。Postic等人在“Res.Microbiol.141：465（1990）”中报导了借助于DNA/DNA杂交分析了来自一些不同源的13个品系，并发现包括四个品系的一个亚组能与9个参考品系区分开。Rosa等人在“J.Clin.Microbiol.，29：524（1991）”中还发现博氏疏螺旋体的两个亚组能够借助于一些DNA扩增图形来鉴别，该DNA扩增图形利用了来自该基因组的未知部分的博氏疏螺旋体的特定的靶顺序。应该注意，在这两组结果之间存在较大差异，这表明这些系统可能没有令人满意的专用诊断价值。
比较取自博氏疏螺旋体和赫氏疏螺旋体的高度保存的鞭毛蛋白基因，这显示出相对非同系性的小区域，该区域含有50%至70%的错配碱基，这些错配基包括一些短缺失。人们曾发现：从这个区选出的引物引导中间引物顺序的博氏疏螺旋体特殊的扩增。为该中间引物区构造的探针专门用来鉴别博氏疏螺旋体。
根据本发明，采用这样一些专门检测生物样品中博氏疏螺旋体的引物及探针的生物测定法包括：
从所述样品中提取核酸部分;
将具有互补链特异性的引物加到一些顺序中，这些顺序接在鞭毛蛋白转录密码编码核酸的一个半保存区的侧面;
使该引物与该互补链顺序杂交;
借助核酸扩增技术扩增该半保存区;
使被扩增的半保存区与一用所述中间引物顺序构成的产生信号的探针杂交;
检测由所述杂交探针所发出的信号。
在本发明的另一方面，选择一些在所述鞭毛蛋白转录密码区具有对博氏疏螺旋体的特异性的低聚核苷酸引物对，第一个这样的引物包括一个大约8至32个连续碱基的顺序，其鞭毛蛋白转录密码的核苷酸数从390至712;第二种这样的低聚核苷酸引物包括在所述互补链上的一个顺序，该互补链位于距第一引物的5’端隔开至少50个核苷酸处，该第二引物包括8至32个基本连续的碱基，相对于赫氏疏螺旋体的相应顺序具有不大于70%的同系性。
本发明的另一面还进一步涉及选择用于专门检测从所述鞭毛蛋白基因转录密码的非同系区扩增的核酸的探针。这些探针包括产生信号的低聚核苷酸示踪物，这些示踪物基本上与所述博氏疏螺旋体的鞭毛蛋白转录密码的一个顺序同系，但相对于赫氏疏螺旋体的相应顺序同系度仅为约70%。与所述示踪物相配合的产生信号的物质可以是放射性标记、荧光标记或biotiny-late标记。
用一种含有一种低聚核苷酸的探针来筛选大量博氏疏螺旋体品系，所述低聚核苷酸具有顺序CTC  TGG  TGA  GGG  AGC  TCA  AAC  TGC  TCA  GGC  TGC  ACC  GGT  TCA  AGA  GGG  T，已经由上述博氏疏螺旋体品系进行过所述中间引物顺序的扩增。该探针检测被扩增的核酸，但不检测其他核酸。因此，本发明的另一方面是进一步利用中间引物区的顺序作为靶，用于检测博氏疏螺旋体的一些亚组。核酸数从517延伸到742的所述博氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因转录密码异常变异区域的一种变种顺序包括在位置531，549，552，612，613，684，693的鸟苷的、在位置539、591、603、622、639、651、666的腺苷的、在位置540、573、630、696的胸苷的以及在位置735的野靛碱的一些碱基取代。核酸数从517延伸到724的所述博氏疏螺旋体的鞭毛蛋白基因转录密码的异常变异区域的另一变种顺序包括在位置531、595、612、649和663的鸟苷的、在位置539、552、651、666、670和688的腺苷的、在位置540、571、594、630和690的胸苷的、在位置644和726的野靛碱的一些碱基取代。最后，一组与所述靶顺序的一部分互补的探针包括用于检测博氏疏螺旋体的一些亚组的一种低聚核苷酸示踪物，这组探针包括一个低聚核苷酸探针，该探针具有选自以下一组的顺序，这组包括：CTC  TGG  TGA  GGG  AGC  TCA  AAC  TGC  TCA  GGC  TGC  ACC  GGT  TCA  AGA  GGG  T，CTC  TGG  TGA  AGG  AGC  TCA  GGC  TGC  TCA  GAC
TGC  ACC  TGT  TCA  AGA  AGG和TGC  TGG  TGA  GGG  AGC  TCA  AGC  TGC  TCA  GGC  TGC  ACC  TGT  TCA  AGA  GGG  TGC以及与所述探针相配合的信号物质。
在先前进行研制一种基于博氏疏螺旋体的靶顺序测定的探针的若干尝试时，选择了那些由OspA及OspB基因表达的主表面抗原蛋白。由于发现了并非所有真实的博氏疏螺旋体都给这些抗原编码，显然必须选择一种不同的顺序。
在一些螺旋体中，内鞭毛（endoflagallum）是由含有一种单一亚组的集合构成。Wilske等人在“Zbl.Bakt.Hyg.A263：92（1986）”中报导了一些与博氏疏螺旋体鞭毛蛋白蛋白质分离的单克隆抗体也与赫氏疏螺旋体、达氏疏螺旋体（B.duttonii）、特氏疏螺旋体及扁虱疏螺旋体反应。由于它的单一亚组结构，即抗原同系性的证据，以及在同一分子中的结构上和生理上的限制，所述鞭毛蛋白基因是被高度保存的，因此，极可能在一种基于探针的测定中作为一个靶，以鉴别所述种类的每一个成员。然而，几个种类对同一抗血清的交叉反应还暗示了这些基因在同一属的那些种类之间可以被高度保存。
在对赫氏疏螺旋体的鞭毛蛋白基因进行分离和编序时，与博氏疏螺旋体最密切相关的那些种类事实上显示了具有与博氏疏螺旋体同系性的一些大的区域。然而，在所述包含若干相对非同系性的顺序的鞭毛蛋白基因转录密码之中出人意料地还有一个近似480个碱基对的区域。在本发明中，这些相对非同系性的顺序为构成一些专用于扩增和检测博氏疏螺旋体、但与其他的密切相关的种类有区别的引物和探针提供了基础。
图1给出了对取自博氏疏螺旋体和赫氏疏螺旋体的鞭毛蛋白基因的核苷酸顺序所进行的同系性比较。所述核苷酸的排列受到UWGCGJ分析程序BESTFIJ辅助，这可参考“Nuc.Acids  Res.，12：126（1988）。”所述博氏疏螺旋体被定位在赫氏疏螺旋体之上。通过这种比较，显然所述非同系性区域借助于核酸被归类在大致的位置390和712。由大致核苷酸位置475到770这一区域对于引物和探针的构成是最好的，因为在该赫氏疏螺体顺序中该区域至少包含两个小缺失。
选择引物顺序时，需要利用低聚核苷酸，最好是具有约8至32个核苷酸的低聚核苷酸。使用少于8个核苷酸减少了特异性并降低了结合的亲合力。使用多于32个核苷酸并不能增强引物功能和提高特异性，然而可以增加在明显错配的区域中连接亲合性。然而，在该非同系区域内将存在若干顺序，在该顺序中，一个6或7个或大于32个核苷酸的引物是可行的，并且被认为等效于最佳顺序长度。
选择引物的策略是识别博氏疏螺旋体原来的短顺序，这些短顺序相对于赫氏疏螺旋体的相应的顺序具有最大同系性。在扩增反应中，所述引物将仅使博氏疏螺旋体模板退火而不使赫氏疏螺旋体DNA退火，以使得不会出现能与产生信号的探针杂交的顺序的专门扩增。此外，还选择若干引物，以便将靶区域连接在相对的链的侧面。所述靶区域至少应和与它杂交的探针一样长，最好是约50个核苷酸长。于是，选择了这样的引物时，这些引物对包含一种第一核苷酸和一种第二核苷酸;所述第一核苷酸选自由以下一种顺序构成的一个组，这种顺序包括鞭毛基因转录密码的核苷酸数从390至712的大约8至32个基本连续的碱基;所述第二核苷酸选自由互补链上的一个顺序构成的一个组，该互补链位于与所述第一引物的5’端隔开大约50个核苷酸处，该顺序包括8至32个基本上连续的碱基，相对于赫氏疏螺旋体的相应顺序具有不大于70%的同系性。
所选择的那些引物被用作在被变性的核酸模板上在互补链上链延伸的起始位置。如美国专利4，683，195和4683202（Mullis）所述，利用聚合酶链反应（PCR）可方便地进行一些核酸的扩增。在该方法中，使靶DNA变性，使引物与互补顺序杂交，而这些互补顺序连接在各个相反的链上打算扩增的靶区域的侧面。DNA聚合酶与核苷酸三磷酸盐一起加入，并由所述引物合成新的DNA。当该反应完成时，所述DNA再次被变性，加入更多的聚合酶，并出现另一轮DNA合成。通过多次重复该过程就能获得数量级为5至6对数的高度扩增。需要在尽可能严格的一组条件，即提高的若干温度，下进行杂交和聚合，在这种条件下，引物的结合甚至要求对该严格的顺序有更高的再现性。最佳温度为65℃。这要求使用热稳定聚合酶，如在美国专利4889818（Gelfand等人）中所说明的那样。
在该技术领域中已知的用于核酸扩增的另一种约定可用来代替PCR。这样一种叫作3SR的方法使用了逆转录酶，以形成一种RNA/DNA杂交物，由这种RNA/DNA杂交物产生了一种含有T7或其他合适的转录启动基因的复式DNA结构，一种依赖于DNA的RNA聚合酶被加入该体系，合成出大量的靶顺序专用转录本。然后，用一适当的产生信号的低聚核苷酸测定这些被扩增的转录本，以检测所述特殊的靶顺序。在构成3SR或一种被称为TAS的相关的扩增方法的引物时，所述启动基因顺序必须与所述引物的5’端相连接。比较好的是T7启动基因，它具有顺序5’-TAATACGACTCACTA TAGGGA。
可以从所述非同系转录密码区域内任意的中间引物顺序中选取探针顺序。最好的探针是那些结合了一个最大错误匹配的顺序的探针。在该区域中，碱基数从约585到约650的顺序特别奏效，因为它覆盖了那些含有缺失的区域并且具有总的近似为50%的错误匹配。在最佳实施例中，从这一区域选择一个探针，而不是一个引物或一些引物，这是基于这样的观察，即一种高度错误匹配的探针将不与低水平扩增的靶杂交，这样就导致了一种基本定性的测定。
所述探针长度可在一潜在的宽范围内变化，从几个到几百个碱基对。然而，必须注意该探针的专用性和稳定性之间的平衡。较短的那些探针，特别是那些选自一些高度非同系性的区域的探针，要比较长的探针具有更高的专用性，但在那些给出很好的杂交严格性的温度下则趋于不稳定。较长的那些探针一般专用性较差，因为它们能允许更大数量的错误匹配。较好的探针是那些选自一些非同系性区域具有相对高的GC含量并且具有35至55个核苷酸的探针。
利用一种选自这样一个区域的低聚核苷酸，构成一种结合32P的探针，所述区域的范围是所述鞭毛蛋白基因转录密码的核苷酸位置从594到642，所述低聚核苷酸具有最高度的错误匹配和非同系性，即CTC  TGG  TGA  GGG  AGC  TCA  AAC  TGC  TCA  GGC  TGC  ACC  GGT  TCA  AGA  GGG  T。大量被公认的博氏疏螺旋体品系首先通过扩增靶区域加以筛选，该靶区域（所述中间引物扩增区域）在所述鞭毛蛋白的基因的空间位置之间延伸，上述引物相对于该靶区退火。
而后，在Southern吸印测定中用所述探针探测那些被扩增的核酸。令人惊奇的是某些真实的博氏疏螺旋体品系显示了对于该探针的杂交作用，而其他的品系不是这样。所述被扩增的区域被排序。这些顺序显示于图6中。
这些顺序包括了错误匹配的碱基的若干位置，通过首先选择一个最少包括5个错误匹配的碱基的区域，得到三个探针，这可以在一次测定中区分博氏疏螺旋体的三个亚组，在该测定中，首先扩增中间引物区域，然后用特定顺序的探针探测那些被扩增的探针。三个探针的顺序如下，探针1：CTC  TGG  TGA  GGG  AGC  TCA  AAC  TGC  TCA  GGC  TGC  ACC  GGT  TCA  AGA  GGG  T;探针2：CTC  TGG  TGA  AGG  AGC  TCA  GGC  TGC  TCA  GAC  TGC  ACC  TGT  TCA  AGA  AGG;以及探针3：TGC  TGG  TGA  GGG  AGC  TCA  AGC  TGC  TCA  GGC  TGC  ACC  TGT  TCA  AGA  GGG  TGC。
表1给出了疏螺旋体品系的一些单一的亚组，所述这些单一的亚组专门用以上这些相应的探针来加以测定。表2给出了上述3个亚组探针的顺序。
表1
被检测的疏螺旋体属的种类和名称
样品  品系  地理
B31亚组  名称  位置  引物  探针1  探针2  探针3
博氏疏螺旋体  B31[ATCC35210]  纽约  +  +  -  -
IRS[ATCC35211]  瑞士  +  +  -  -
毒性MM1  明尼苏达  +  +  -  -
毒性MMT1  明尼苏达  +  +  -  -
毒性I.pacificus  加里福尼亚  +  +  -  -
N40  纽约  +  +  -  -
Son328  加里福尼亚  +  +  -  -
DN-127  加里福尼亚  +  +  -  -
明尼苏达鼠  明尼苏达  +  +  -  -
Lake339  加里福尼亚  +  +  -  -
法兰西2001  法国  +  +  -  -
CD16  明尼苏达  +  +  -  -
VS215  瑞士  +  +  -  -
NE56  瑞士  +  +  -  -
25015  纽约  +  +  -  -
P/Bi  德国  +  -  -  +
P/Sto  德国  +  -  +  -
P/Gu  德国  +  -  +  -
GTI  德国  +  -  -  +
G2  德国  +  -  -  +
VS3  瑞士  +  -  -  +
V185  瑞士  +  -  -  +
赫氏疏螺体  HSl[ATCC35209]
Frogner
YOR-1  加里福尼亚-  -  -  -
CON-1  加里福尼亚-  -  -  -
MAN-1  加里福尼亚-  -  -  -
扁虱疏螺旋体  -  -  -  -
特氏疏螺旋体  -  -  -  -
麝疏螺旋体  -  -  -  -
鹅疏螺旋体  -  -  -  -
柯氏疏螺旋体（B.Coriaceae）  -  -  -  -
C疏螺旋体  Co57[ATCC43381]  -  -  -  -
表2
用于专门检测3组博氏疏螺旋体的探针低聚核苷酸
探针1-博氏疏螺旋体B31组
CTCTGGTGAG  GGAGCTCAAA  CTGCTCAGGC
TGCACCGGTT  CAAGAGGGT
探针2-博氏疏螺旋体P/Sto组
TGCTGGTGAG  GGAGCTCAAG  CTGCTCAGGC
TGCACCTGTT  CAAGAGGGTG  CT
探针3-博氏疏螺旋体P/Bi组
CTCTGGTGAA  GGAGCTCAGG  CTGCTCAGAC
TGCACCTGTT  CAA  GAAGG
申请人业已发现以上特殊的顺序是最好的，这是由于对于所述鞭毛蛋白基因大体相应的区域在错配碱基的范围被增至最大的位置获得了严格的测定。然而，显然可以进行一些不太重要的碱基取代，这将不会对所述测定的专门性产生不利影响。这样一些次要的顺序变种申请人认为相当于这里所公开的那些顺序。
以分子与产生信号的物质相结合的那些探针是可以给它们所连接的靶顺序加标记的或者可以直接或间接地发射信号的低聚核苷酸示踪物。这样一些示踪物可以很方便地成为与放射性分子或酶相配合的探针。一旦示踪物与靶杂交，双链复式结构可以借助于传统的分离技术与未杂交的示踪物相分离，被结合的放射剂量用闪烁法或伽玛计数器测定。可以利用类似的一些传统分离技术来分离与酶连接的被杂交的示踪物。一旦将所述与酶连接的复合物分离就加入比色或荧光测量底物，而信号利用常规的仪器来检测。在该技术领域已知的另外的产生信号的系统包括采用吖啶酯（acridinium  esters）和clioxetanes的化学发光法，如McCapra等人在“Chemilu-minescence  and  Bioluminescen-cl，Plenum  Press，N.Y.（1973）”中所述那样，荧光标记法，例如荧光测定法，以及以及一些与生物素结合的探针。
特别令人感兴趣的是应用荧光偏振法（FP），所述荧光偏振法测量由于加有荧光标记的探针与它的靶的杂交所产生的偏振的增量。这种检测系统的重要性在于一旦示踪物相对于靶退火就可以直接进行检测，而无需首先分离未结合的示踪物。在下面例2中更详细地描述了这种检测方法。
利用本发明的引物和探针，构成一些用于诊断检测取自生物样品的博氏疏螺旋体的生物测定法是很方便的。在这样一些生物测定方法中，引物和探针的最好的来源是借助于低聚核苷酸合成的传统的方法，尽管还可以采用适当顺序的提纯克隆基因区段。令人感兴趣的生物学样品包括由皮肤上钻取的活组织、血液和血成分、壁虱携带者和它的身体的一部分、脑脊髓液、滑液和患有莱姆病综合症的人体组织成分。钻取活组织样品的技术在Berger等人的文章“J.Am.Acad.Dermatol，13：444（1980）”中被介绍过。从血液中分离螺旋体在Benach等人的文章”N.Eng.J.Med.，308：740（1983）”中被说明过。从脑脊髓液中分离螺旋体在Karlsson等人的文章“J.clin.Microbiol.，28：473（1990）中被说明过。从其他一些组织中分离螺旋体在上述文献中也有说明。
为了在示踪物杂交之前进行扩增步骤，必须提取一些核酸，以便得到它们。从生物样品中获取核酸的提取方法在本领域中是众所周知的，并且在进行生物测定发明时被认为是常规的。例如Keller和Manak文章“DNA  Probes，Chapter2，Sample  preparation”提出了关于大量标准方法的完整的细节，该文献包括若干原始文献参考资料。进一步的通过变性制备核酸也是常规的，并可以通过PH值或盐浓度控制法或通过加热法来实现。
那些一旦杂交到所述模板顺序上就作为以聚合酶为媒介的链延伸的底物的引物可以在变性前或变性后加到反应混合物中，并一旦变为原来条件就被退火。然后加入所述聚体酶，并且允许出现链延伸连续循环。在PCR中，以DNAtag聚合酶为最好。在3SR中，逆转录酶首先产生，而RNA/DNA杂交物在RNAseH煮解和用DNAtag聚合酶再聚合时可以用依赖于RNA聚合酶的DNA重复转录。检测被探测的被扩增核酸的方法在上面已作过说明。
一种检测被杂交的放射性示踪物的特别有效的方法是对核酸扩增产物进行琼脂糖电泳处理，将核酸谱带转移到一种尼龙膜，例如pall  bioayne  B上，随后按照一种标准的Southern吸印检测法与产生信号的探针杂交[Southern，J.Mol.Biol.，98：503（1975）]。然后，特殊杂交区域借助于被探测核酸的放射性自显术来显形。
这样，在本发明的那些生物测定中，含有预期顺序的博氏疏螺旋体核酸的生物样品是一种在存在具有相对于接在一个鞭毛转录密码编码核酸半保存区域侧面的若干顺序的互补链特异性的一些引物的条件下被提取和被变性的核酸;使所述引物与所述互补链顺序杂交;利用核酸扩散技术扩增所述半保存区域，使被扩增的半保存区域与低聚核苷酸示踪物杂交，该示踪物具有一顺序，该顺序基本上同系于博氏疏螺旋体的鞭毛基因转录密码的一个顺序，但是相对于赫氏疏螺旋体的相应顺序同系性最大为70%;并且检测由所述示踪物的信号产生物质所发出的信号。
本发明进一步的一些优点从以下例子将看得更为清楚。
例1
赫氏疏螺旋体和博氏疏螺旋体是分别从登记号为ATCC35209和ATCC35210的美国型培养液收集物中获取的。使所述细胞生长并加以收获，并且用传统的方法提取DNA。用Sau3A限制酶部分地煮解染色体DNA，碎片用琼脂糖凝胶电泳法表征。在存在dGTp和dATP的情况下部分地填充9至23bp的适当尺寸的碎片。然后，这种材料很容易进行无性繁殖成为入噬菌体GEM11载体，它已经用xhoI限制核酸酶煮解，并且随同dTTp-dCTp一起被填充。
然后，用E.coli  LE392作为宿主涂敷入噬菌体库（Lambda  li-braries）。板用Pall  Biodyne  B膜除去噬菌斑，并且如在Southern吸印分析中那样，通过杂交加以筛选。如Gassman等人在“Nuc.Acid  Res.，17：3590（1989）”中所报导的那样，由已知的博氏疏螺旋体随机制备的合成引物被用来扩增由博氏疏螺旋体和赫氏疏螺旋体衍生出来的模板。在一个例子中，一个被用来由博氏疏螺旋体产生一个3000bp的区段的引物，当用来扩增赫氏疏螺旋体时，相当意外地产生了一条3000pb的漠糊的谱带。所述漠糊谱带扩增，该区域按另外的方式相对非同系于博氏疏螺旋体。利用所述区段作为探针，使得能够鉴别包括上述基因部分的入噬菌体无性繁殖系。根据这些无性繁殖系的限制图的构造及所述构造的顺序排列，给出图1所示的非同系顺序的修正顺序。
在一些典型的试验中，采用图1所示的引物，通过PCR的30个循环完成所述中间引物区的扩增。然后，分析扩增产物，如下所述：在琼脂糖凝胶中电泳，接下去是Southern吸印分析。参考图2，左侧版面表示一个琼脂凝胶电泳图形。在下部中央可以一起看到两条谱带，对应于博氏疏螺旋体的两个单独的品系的扩增产物，包括在利用OspA基因扩增研究中的品系负片。显然，在每一种情况下的分子尺寸对应于用于扩增修正靶区域的预期尺寸。为了证实：因为对照物表示非特异扩增，所述小的谱带可见于该凝胶的其他区段，要对所述凝胶进行Southern吸印分析，如图2右侧版面所示。被转移的核酸用含有图1中所示顺序的示踪物探测。所述结果证实了所述测定的特异性。
在第二个试验中，被扩增的博氏疏螺旋体和对照物DNA按照均一性测定借助于同探针的杂交来进行分析，所述的探针即结合在它的5’端的荧光素，具有如下顺序：5’GACCTCCCT-CACCAGAGAAA，这种分析是借助于荧光偏振。所述探针混合物含1.4mlSSPE缓冲剂[Sambrook等人文章“Molecular  Cloning：a  laboratory  Manual，2Ed.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，（1989）”]，7μl  3.2M  Tris-HCl.，250fmol探针共轭物，以及200μl甲酸胺。在一个单独的试管中，所述PCR扩增材料的一个样品在55℃、0.1M  NaOH中进行15分钟变性。然后，将该样品加入所述探针混合物，并用一荧光偏振计读数取72分钟时间周期内的荧光偏振读数。
这些结果绘制在图3上，并对一些博氏疏螺旋体（分别命名为ATCC＃35210和ATCC＃35211）进行了特殊的偏振定性检测。所述对照物是阴性的（ATCC＃35209，赫氏疏螺旋体;ATCC＃43381，柯氏疏螺旋体;）。参考图4，该图显示了在72分钟时的值和基本上时间为0时的值之间的差（以MP计，MP为百万分之一偏振单位）的气压自动记录图。很清楚PP可专门鉴别一种同系形式的被扩增的靶顺序。
例2
从表1所列的一系列博氏疏螺旋体品系中提取DNA。如上所述，利用在例1中所提出的那些引物，进行借助于聚合酶链反应（PCR）的扩增。博氏疏螺旋体的亚组1如表1中所示被命名为B31。亚组2被命名为P/Bi，亚组3被命名为P/Sto。具有以上所示顺序的探针1至3分别专用于亚组B31、P/Sto和P/Bi。
根据例1所提出的方法进行杂交，杂交产物利用凝胶电泳法进行分析。图5给出了对应于每一个经过电泳的被扩增的样品的谱带。而后，将这些凝胶谱带进行Southern吸印，转移到一些膜上并用32p标记的探针1至3探测这些凝胶谱带。在2×SSC缓冲液中冲洗两次共30分钟，随后在0.2×SSC缓冲液中冲洗两次共30分钟。冲洗温度是67.3℃（B31组探针）、68.3℃（P/Sto组探针）以及65.8℃（P/Bi组探针）。Picken在“BioTech-nique，9：412（1990）”中提供了关于Southern吸印程序的进一步的细节。列在图5B，5C和5D中的那些结果表明探针对应于在表1中所给出的它的对应的博氏疏螺旋体亚组完全是专用的。
例3
在一系列进一步的试验中，取自一组螺旋体属的DNA用具有互补链特异性的引物扩增，所述引物将赫氏疏螺旋体的一个顺序在相应的位置接到关于博氏疏螺旋体所描述的那些引物的侧面。第一低聚核苷酸引物是选自包括若干顺序的一个组，这些顺序包括鞭毛蛋白基因转录密码的核苷酸数从390至770的大约8至32个基本连续的碱基。第二低聚核酸引物是选自包括在所述互补链上位于第一引物的5’端隔开大约35至55个核苷酸处的若干顺序的一个组，包括相对于赫氏疏螺旋体的相应顺序具有不大于70%的同系性的大约8至32低聚核苷酸。
在这些试验中所利用的引物列在图9中。
人们发现，除扁虱疏螺旋体及特氏疏螺旋体外，这些引物扩增了所有被检测的赫氏疏螺旋体品系。一旦对扁虱疏螺旋体及特氏疏螺旋体的被扩增的DNA编序，对于与赫氏疏螺旋体相比较的这些有机物，人们注意到在中间引物顺序中的差别。这些差别列在图7中。选择图7中以黑体字给出的顺序，构成一个探针。在进行凝胶电泳后，将被扩增的谱带转移到一个膜上，并且利用该探针进行Southern吸印。除去对于赫氏疏螺旋体探针冲洗温度为57.7℃，对于扁虱疏螺旋体/特氏疏螺旋体探针（在图7如赫氏疏螺旋体（HS1）的黑体字那样用核酸位置上的黑体取代表示，在这些核酸位置上那些品系（park和tri）不同于HS1）冲洗温度为62.0℃之外，所有的程序都与前面例子中所给的那样。
所述探针顺序基本上包括核苷酸数从606至633的一个核心顺序，但是一些碱基可以被加到两端之中的一端，以稳定杂交结构，或与水洗程序的强度相匹配。因此，比较可取的探针包括与信号产生物，例如32p相连接的一种低聚核苷酸，具有如下顺序：TGC  AGG  TGA  AGG  CGC  TCA  GGC  TGC  T  CCA  GTG  CAA  GAG  ATA。
由于采用了一个具有图7中黑体字所示赫氏疏螺旋体的核苷酸顺序的探针，使得能够完成赫氏疏螺旋体的区别鉴定。图8所示的Southern吸印分析证实了该探针的高度专用性。这一点的临床意义在于：引起复发性发热的赫氏疏螺旋体可以与莱姆病的起因媒介以及引起动物疾病的疏螺旋体属有机体区分开。
图5的图表符号索引
博氏疏螺旋体
1＊、B31[ATTC＃35210]
2、IRS[ATCC＃35211]
3、有毒的MM1
4、有毒的MMT1
5、有毒的I.Pacificus
6、N40
7、Son  328
8、bN127
9、明尼苏达鼠
10、Lake  339
11、法兰西20001
12、CD16
13、VS215
14、NE56
15、Millbrook  25015
16、p/Sto
17、p/Gu
18、p/Bi
19、德国壁虱隔离体
20、123碱对Ladder  M.Wt.标记物
21、G2
22、VS3
23、VS185
赫氏疏螺旋体
24、HS1[ATCC＃35209]
25、Frogner
26、YOR-1
27、CON-1
28、MAN-1
29、扁虱疏螺旋体
30、特氏疏螺旋体
31、麝鼩疏螺旋体
32、鹅疏螺旋体
33、柯氏疏螺旋体
34、苍白密螺旋体
35、Treponema  pectinovorum
36、免梅毒密螺旋体
37、Leptospira  interogans  SV.icterohemorrhagiae
38、Leptospira  inadei  SV.lyme
39、蒸馏水对照物
40、123碱基对M.Wt.标记物
＊  Gel  lam数
图8中的图表符号
图8给出了利用由赫氏疏螺旋体的鞭毛蛋白基因衍生出的顺序由13种不同的疏螺旋体属的品系及5种其他螺旋体的品系扩增的结果。在凝胶图8A至8D的每一个中，由左向右的品系次序在上面/下面。
8A、在用所述赫氏疏螺旋体引物对扩增后，取自18种菌株的PCR产物的琼脂糖凝胶。仅观察到对于赫氏疏螺旋体、扁虱疏螺旋体、特氏疏螺旋体、麝鼩疏螺旋体、鹅疏螺旋体及B.Cori-aceae的扩增。
8B、图8A中所示凝胶的Southern吸印，该凝胶已用一种低聚核苷酸探针探测，该探针是由赫氏疏螺旋体的鞭毛蛋白基因顺序衍生出的。
8C、在图8A中所示凝胶的Southern吸印，该凝胶已用所述低聚核苷酸探针探测过，并且在图8B中只含有两个重复部分。
8D、图8A所示的凝胶的Southern吸印，该凝胶已用一种低聚核苷酸探测过，该探针是由扁虱疏螺旋体及特氏疏螺旋体的鞭毛蛋白基因顺序衍生出的。
图8的图表符号索引
1＊、博氏疏螺旋体 B31
2、博氏疏螺旋体  P/Sto
3、博氏疏螺旋体  P/Bi
4、赫氏疏螺旋体  HS1
5、赫氏疏螺旋体  Frogner
6、赫氏疏螺旋体  Yor-1
7、赫氏疏螺旋体  CON-1
8、赫氏疏螺旋体  MAN-1
9、扁虱疏螺旋体
10、特氏疏螺旋体
11、麝鼩疏螺旋体
12、鹅疏螺旋体
13、B.Coriaceae
14、苍白疏螺旋体
15、免梅毒密螺旋体
16、齿垢密螺旋体
17、L.interogans  SV.icterohemorrhagiae
18、L.inadei  SV.lyme
19、蒸馏水对照物
20、123碱基对M.Wt标记物
＊  Gel  lane数

Claims (9)

1、一些具有互补链特异性的引物，连接在借助于核酸扩增技术所要扩增的博氏疏螺旋体的一个顺序的侧面，所述这些引物包括：
一个选自由若干顺序构成的一个组的第一低聚核苷酸，所述顺序包括约8至32个基本连续的碱基，鞭毛蛋白基因转录密码的核苷酸数从390到770，和
一个选自由若干在互补链上的顺序构成的一个组的第二低聚核苷酸，所述互补链位于与所述第一引物的5′端隔开约35至55个核苷酸处，所述顺序包括约8至32个基本连续的碱基，相对于赫氏疏螺旋体的相应的顺序具有不大于70%的同系性。
2、一种用于检测博氏疏螺旋体靶顺序的低聚核苷酸示踪物，包括：
一个低聚核苷酸探针顺序，基本上同系于博氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因转录密码的一个顺序，但对于赫氏疏螺旋体的相应顺序同系性不大于70%，以及
与所述探针相配合的信号物质。
3、一种用于检测生物样品中的博氏疏螺旋体的生物测定法，包括：
提取核酸成分，
在存在具有对于一些顺序的互补链特异性的引物的情况下使所述核酸变性，所述这些顺序连接在鞭毛蛋白转录密码编码核酸的一个半保存区域的侧面，
使所述引物与所述互补链顺序杂交，
利用核酸扩增技术扩增中间引物顺序，
使被扩增的中间引物顺序与一个低聚核苷酸示踪物杂交，该示踪物包括一个具有基本上同系于博氏疏螺旋体的鞭毛蛋白转录密码的一个相应顺序，但与赫氏疏螺旋体的相应顺序同系性不大于70%的顺序的探针，以及连接于其上的产生信号的物质，和
检测由与所述被杂交的示踪物相配合的所述信号产生物质所发出的信号。
4、一种用于检测博氏疏螺旋体核酸顺序的基本同类的测定法，包括：
在存在具有对于一些顺序的互补链特异性的一些引物的情况下使所述核酸顺序变性，所述这些顺序连接在鞭毛蛋白转录密码编码核酸的一个半保存区域的侧面，
使所述引物与所述互补链顺序杂交，
利用核酸扩增技术扩增中间引物顺序，
使被扩增的中间引物顺序与一个低聚核苷酸示踪物杂交，该示踪物包括一个具有基本上同系于博氏疏螺旋体的鞭毛蛋白转录密码的一个相应顺序，但与赫氏疏螺旋体的相应顺序的同系性不大于70%的一个顺序的探针，以及连接于其上的一荧光标记物，以及
检测荧光偏振增量。
5、核苷酸数从517延伸到742的博氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因转录密码的异常变异区域的一种变种顺序，包括在位置531、549、552、612、613、684、693的鸟苷的、在位置539、591、603、622、639、651、666的腺苷的、在位置540、573、630、696的胸苷的和在位置735的胞嘧啶的一些碱基取代。
6、核苷酸数从517延伸到742的博氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因转录密码异常变异区域的一种变种顺序，包括在位置531、595、612、649、和663的鸟苷的、在位置539、552、651、666、670和688的腺苷的、在位置540、571、594、630和696的胸苷的和在位置644和726的胞嘧啶的一些碱基取代。
7、一种用于检测博氏疏螺旋体的一些亚组的低聚核苷酸示踪物，包括
一个具有选自以下组的一个顺序的低聚核苷酸探针，该组顺序包括：
CTC  TGG  TGA  GGG  AGC  TCA  AAC  TGC
TCA  GGC  TGC  ACC  GGT  TCA  AGA  GGG  T，CTC
TGG  TGA  AGG  AGC  TCA  GGC  TGC  TCA  GAC
TGC  ACC  TGT  TCA  AGA  AGG和TGC  TGG  TGA
GGG  AGC  TCA  AGC  TGC  TCA  GGC  TGC  ACC
TGT  TCA  AGA  GGG  TGC，以及
与所述探针相配合的信号物质。
8、一些具有互补链特异性的引物，连接在借助于核酸扩增技术所要扩增的赫氏疏螺旋体的一个顺序的侧面，所述这些引物包括：
一个选自由若干顺序构成的一个组的第一低聚核苷酸，所述顺序包括约8至32个基本连续的碱基，鞭毛蛋白基因转录密码的核苷酸数从390到770，和
一个选自由若干在互补链上的顺序构成的一个组的第二低聚核苷酸，所述互补链位于与所述第一引物的5’端隔开约35至55个核苷酸处，所述顺序包括约8至32个基本连续的碱基，相对于博氏疏螺旋体的相应顺序具有不大于70%的同系性。
9、一种专门用于检测赫氏疏螺旋体的低聚核苷酸示踪物，包括：
一个低聚核苷酸探针，具有赫氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因转录密码的核苷酸数从606延伸到633的一个核心顺序，以及
信号产生物质。
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Cited By (1)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101886113A (zh) * 2009-05-13 2010-11-17 中国农业科学院兰州兽医研究所 蜱体内检测莱姆病病原的检测方法及试剂盒

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2077079A1 (en) * 1990-03-07 1991-09-08 Thomas J. White Method for diagnosis of lyme disease
WO1993003184A1 (en) * 1991-08-09 1993-02-18 Mccann Associates, Inc. Method for detecting lyme disease and composition
US5932220A (en) * 1995-05-08 1999-08-03 Board Of Regents University Of Texas System Diagnostic tests for a new spirochete, Borrelia lonestari sp. nov.
WO2003029450A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Københavns Universitet Nucleic acid sequences encoding lysk from different borrelia strains and uses thereof
FR3056991B1 (fr) * 2016-10-03 2020-11-27 C A L Laboratoire De Biologie Veterinaire Methode et kit de detection, de discrimination et identification d'especes de borrelies presentes dans un echantillon d'origine humaine ou animale

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7058691A (en) * 1989-12-22 1991-07-24 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Immunologically active proteines from borrelia burgdorferi, related test kits and vaccine

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101886113A (zh) * 2009-05-13 2010-11-17 中国农业科学院兰州兽医研究所 蜱体内检测莱姆病病原的检测方法及试剂盒

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