CN1914334A - 检测结核分枝杆菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于扩增分枝杆菌种早期分泌抗原靶点(EarlySecretory Antigenic Target)(esat)－6－基因((esat)－6－gene)的寡聚核苷酸引物对，其具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列。本发明还提供一种在样品中基于esat－6基因扩增的检测结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的方法，其包括从样品中分离DNA模板，用上述寡核苷酸引物对扩增并将扩增得到的DNA产物分离出来，染色以检测扩增DNA产物的存在以识别样品中的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)。本发明进一步提供一种检测结核分枝杆菌的试剂盒。本发明还提供一种从样品中检测结核分枝杆菌的方法，其通过用常规方法从分离的DNA模板中扩增16s rRNA区域以检测分枝杆菌种，并用检测结核分枝杆菌的ESAT－6区域的阳性引物进一步扩增含有分枝杆菌种的阳性样本。

Description

检测结核分枝杆菌的方法

技术领域

本发明提供用于扩增早期分泌抗原靶点(Early Secretory AntigenicTarget)(ESAT)-6区域以检测分枝杆菌种(Mycobacterium species)的新型寡聚核苷酸引物。所述引物用于区分结核分枝杆菌和其它的分枝杆菌种。本发明进一步提供一种依据ESAT-6区域DNA扩增检测结核分枝杆菌的方法。

背景技术和现有技术

根据世界卫生组织(WHO)，结核病每年仍杀死三百万人，使得其成为首要的感染性死亡原因。据信在地球上每三个人中就有一个人携带这种属于分枝杆菌属的病原微生物(13，24)。该种属表现出复杂的表型和基因型多样性，其中有100多种种类(4，9，10，14，15，17，27，28，30，34)。然而，最重要的人病原物种是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis(M.tb))，其它通常被称为非结核性分枝杆菌(NTM)或不同于结核菌的分枝杆菌(MOTT)的种类也能在多种临床形式尤其在免疫抑制的患者中引起人类传染病，给人类增添发病率和死亡率的折磨。继AIDS流行后，HIV-TB的共感染在发达国家和发展中国家内快速的增长(2，10，13，18-21，24)。许多非结核性分枝杆菌对常规的抗结核治疗不敏感，并被错误地认为是感染了结核分枝杆菌的多药耐药(MDR)菌株(5-7，10，21，26，31，32)。许多MDR标记的感染实际上不是由结核分枝杆菌耐药菌株引起，而是由非结核性分枝杆菌引起。HIV-分枝杆菌共感染是印度AIDS患者最普遍的机会感染杀手(31)，然而在这些严重免疫损害的人群中，NTM感染引起的疾病爆发是不可控制的(19)。因此在种的水平上识别病原体对于正确的治疗是非常重要的。

然而，在印度，分枝杆菌感染的诊断以经验为主地建立在临床-放射线学基础或仅根据痰液涂片检查，并且，由于诊断设备的缺乏，由非结核性分枝杆菌引起的感染是不能诊断的。用常规方法的分枝杆菌物种形成是非常慢、劳动量大、危险的，而且常常不能重复(33)，因此大多数印度实验室不对其进行尝试。

为了克服常规方法对分枝杆菌物种的特异识别的缺点，近年来常常应用分子技术。分子识别方法是快速的、高敏感性的和特异的，而且可以用于大量的样品(1，6，9，16，33，US Patent No.5652106，US Patent No.5731150)。一个已被证实最有前途和广泛应用的分子靶点是16S rRNA基因分析。这一基因在所有的分枝杆菌种属中保守(1，15，16，US Patent No.5811269)。一旦分枝杆菌属得以确定，种的区分可以通过使用种特异性探针进行DNA杂交(southern hybridization)或基因测序(4，11，22，28)实现。然而，所有非结核性分枝杆菌种的鉴定可能需要几种特殊引物和重复实验，并且，在资源匮乏的开始阶段，尤其是新病例，这种鉴定并不必要，在上述情况下，一些物种可以很容易地根据表型特征鉴定。因此，本发明目的是应用一种快速PCR扩增方法从非结核性分枝杆菌种区分结核分枝杆菌。为此，已经开发出了一种新型的、简单而快速的区分MTB和NTM的方法，其使用一对针对esat-6和16S rRNA基因的寡聚核苷酸引物。

16S rRNA基因扩增方法是一种用于鉴定所有分枝杆菌的良好的工具。然而，它的进一步用途局限于仅仅在对扩增基因产物测序之后的分类学目的。因此，单独的PCR方法不能解答最重要的临床问题，即，分枝杆菌是结核分枝杆菌还是结核分枝杆菌以外的菌。因此，从临床观点来看，非常重要的是，临床微生物学家不但要诊断出其患者是分枝杆菌感染，而且提供病原体鉴定，即是结核分枝杆菌还是其它的分枝杆菌种，原因在于对其它分枝杆菌的治疗方案是完全不同于结核分枝杆菌的治疗方案的。另一方面，本发明中设计的新型寡聚核苷酸引物靶向esat-6基因，其为结核分枝杆菌的特有基因，编码6kDa大小的早期抗原(3，8，23，25)。虽然所述抗原已经用于体液免疫诊断和用于评估细胞调节的针对结核分枝杆菌的免疫应答，在皮试中用该抗原取代结核菌素(PPD)(3，8)。最近，所述抗原还用于对结核病的接种疫苗(23，25，US Patent No.6649170)，但是，所述基因从未用作结核病的分子诊断靶点。在除结核菌复合体以外的分枝杆菌物种中缺失所述基因(4)。

这种基于抗原-抗体的检测方法已经成为研究主题，然而却没有找到满意的抗原。大多数属特异性抗原由于它们与环境的分枝杆菌和用作疫苗的卡介苗(BCG)有交叉反应而没有成功。即使结核分枝杆菌特异抗原(该情况下为ESAT-6抗原)具有对器官特异性疾病诊断的低预见性价值的基本缺陷。已经发现抗ESAT-6蛋白抗体的检测在结核病非流行国家有些作用，其在结核病流行国家如亚洲非洲的所有国家、俄罗斯和其它南美国家的用途非常有限，这是由于人口有亚临床暴露(exposure)。显然所有暴露的人将在血液中拥有针对上述抗原的循环抗体。因此，如果预暴露但无症状的人(已有阳性抗体)获得新的结核菌脑部感染(TB脑膜炎)和在其他预显露但无新感染的人，在这种情况下，由于这些患者都将对上述抗体呈现阳性，抗体检测化验对特异性诊断就失去了作用。换种说法解释就是，抗体检测化验对高流行性疾病(比如空气传播的结核病)具有很低的特异性，而且全然不能做出器官特异性诊断，由于抗体检测方法是感染的间接证据。

另一方面，如PCR的分子方法具有高度特异性，这是因为在这些方法中，所检测的是来自特异患病位点的活生物体的基因组。换句话说，使用PCR扩增，可以进行除肺结核外包括结核性脑膜炎、腹部结核病、胃肠结核病、泌尿生殖器结核病的特异诊断。PCR扩增还将只检测活性疾病而且不检测过去的暴露。而且，分子方法最大的优势是可以从如木乃伊、化石等的老样品中检测出病原体(分枝杆菌)的DNA，而抗体则不能。

本发明首次显示了使用esat-6基因扩增在结核病的种特异性和快速分子诊断上的用途。

说明书中特定术语的定义

AIDS-获得性免疫缺陷综合征；

M.tb-结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；

NTM-非结核性分枝杆菌(Non-tubercular Mycobacteria)；

MDR-TB-多药耐药结核病(Multi drug resistant tuberculosis)

附图简述

图1依据16s rRNA基因用于分枝杆菌种的属特异性鉴定的PCR方法。1，11和22泳道为100bp的分子量标准。2，13和23泳道为结核分枝杆菌的H37rv标准菌株。3-10泳道为标准非结核性分枝杆菌(如表1所示)，13-21和24-26为临床分离物。

图2：对依据属特异性16s rRNA PCR鉴定为分枝杆菌的分离物进行基于ESAT-6区域的扩增。1和17泳道为100bp的分子量标准。2和18泳道为结核分枝杆菌的H37rv标准菌株。3-15和19-24泳道为与A实验组所示相同的临床分离物。16泳道为牛分枝杆菌(M.bovis)，其表现为无扩增带。

发明目的

本发明的主要目的是开发一种用于特异性扩增分枝杆菌种早期分泌抗原靶点(esat)-6基因的寡聚核苷酸引物对。

本发明的另一目的是开发一种基于使用上述引物对扩增esat-6基因来检测样品中结核分枝杆菌的方法。

本发明的另一个目的是开发一种检测结核分枝杆菌的方法，其中所述扩增通过聚合酶链式反应进行。

本发明的又一目的是开发一种基于扩增esat-6基因来检测结核分枝杆菌的诊断试剂盒，其。

发明概述

本发明提供新型的用于扩增分枝杆菌种早期分泌抗原靶点(esat)-6-基因的寡聚核苷酸引物对，其具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列。本发明还提供一种依据esat-6基因的扩增检测样品中结核分枝杆菌的方法，其包括从样品中分离DNA模板，用上述寡核苷酸引物对扩增并将扩增得到的DNA产物分离出来，染色以检测扩增DNA产物的存在以识别样品中的结核分枝杆菌。本发明进一步提供一种用于结核分枝杆菌检测的诊断试剂盒。本发明还提供一种从样品种检测结核分枝杆菌的方法，其通过从常规方法分离的DNA模板中扩增16s rRNA区域以检测分枝杆菌种，并用ESAT-6区域的新型寡聚核苷酸引物对进一步扩增含有分枝杆菌种的阳性样品，其中所述ESAT-6区域为320bp的片段，是结核分枝杆菌存在的指示。

发明详述

据此，本发明提供一种用于扩增分枝杆菌种早期分泌抗原靶点(esat)-6基因的寡聚核苷酸引物对，其包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列。

在一个实施方案中，本发明提供一种使用上述寡聚核苷酸引物对检测结核分枝杆菌的方法，所述方法包括步骤步骤：

a)从样品中分离DNA模板，

b)通过加入反应缓冲液、具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列的寡聚核苷酸引物对、和热稳定DNA聚合酶进行DNA模板扩增，以获得扩增的DNA产物，和

c)将步骤(b)得到的扩增DNA产物进行分离，染色以检测扩增DNA产物的存在，其中所述扩增DNA产物的存在是样品中结核分枝杆菌的指示。

本发明的另一个实施方案是一种基于扩增反应混合物的检测结核分枝杆菌的方法，所述的反应混合物包含来自样品的DNA、具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列的寡聚核苷酸引物对、反应缓冲液、dNTPs和优选为Taq聚合酶的DNA聚合酶。

本发明的另一个实施方案是为了一种从临床或培养样品中检测结核分枝杆菌的方法，其中所述临床样品选自于痰液、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、腹/腹膜液(ascetic/peritoneal fluid)、脑脊髓液(CSF)、脓、渣物质、尿、羊膜水、月经血、外周血或其它体液、淋巴结、脓或其它抽出物，和组织活检。

本发明的进一步实施方案是一种检测结核分枝杆菌的方法，其使用具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列的寡聚核苷酸引物对，从分枝杆菌培养物中获得的DNA样品。

本发明的另一实施方案是一种检测结核分枝杆菌的方法，其中所述扩增由聚合酶链式反应得到。

本发明的另一实施方案是扩增得到的320bp大小的DNA产物的存在是结核分枝杆菌的指示。

本发明的另一实施方案中是一种基于(esat)-6基因的扩增检测结核分枝杆菌的诊断试剂盒。上述试剂盒进一步包含具有SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的序列的寡聚核苷酸引物对、反应缓冲液、优选Taq聚合酶的DNA聚合酶、阴性和阳性对照、DNA分子量标准、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和操作手册。

本发明的另一实施方案是基于扩增来检测结核分枝杆菌的方法，其中所述方法包括步骤：

i.通过常规方法用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列的寡聚核苷酸引物对从分离的DNA模板中扩增16s rRNA区域，以得到第一扩增产物，

ii.检测步骤(a)的扩增产物，其中存在1030个碱基对的扩增DNA产物是阳性样品存在分枝杆菌种的指示，

iii.使用来自鉴定自步骤(b)中的阳性样品的DNA，基于esat-6基因扩增来进一步检测结核分枝杆菌，

iv.通过权利要求2所述的方法用具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列的寡聚核苷酸引物对扩增esat-6基因，以得到第二扩增产物，和

v.检测步骤(d)的扩增产物，其中所述320个碱基对产物的存在是样品中结核分枝杆菌的指示，其不存在是其它分枝杆菌种的指示。

本发明教导了一种以依据esat-6基因的扩增检测结核分枝杆菌的方法。本发明提供新型寡聚核苷酸引物对和下文给出的检测方法：本研究召集265名患者进行分枝杆菌感染的检测。分析他们临床和实验室数据，以确定多种诊断方法的灵敏性(表1)。在L-J培养物中，只有85名患者(32％)表现出存在分枝杆菌(分枝杆菌的培养参见实施例1)。其他的患者，其培养物在培养10周后保持为阴性，被排除在本研究外。依据临床疾病表现和HIV状况将上述85名患者分为4组。70名患者为HIV阴性和15名患者为HIV-1阳性。在70名HIV阴性患者中，24名患者表现出淋巴腺炎，其余46名患者有肺部症状。其中只有22名患者为未接受任何抗结核治疗的新病例，而其他24名患者在细菌学上确认为肺结核病例，而且进行抗结核治疗但无效果。由于，即使在用异烟肼(Isoniazide)、利福平(Rifampicin)、乙胺丁醇(Ethambutol)和吡嗪酰胺(Pyrazinamide)治疗6个月后，所述患者在痰液中继续分泌抗酸杆菌(acid fast bacilli)，将这些病例标记为MDR(多药耐药)患者。上述患者抗结核治疗的平均时间为26.7±17个月，最长时间为6年。本研究中包含的所有感染HIV的患者表现出肺部症状。

在申请人的实验室中，L-J培养的总体检测率为32％(85/265)。相似地，萋-尼染色(Ziehl-Neelson(Z-N)staining)的检测率仅为19.6％，金胺O染色(Auramine-O(AO)staining)的检测率为22.3％。(如实施例2所给)然而，对MDR病例而言，对培养物进行AO染色和ZN染色涂片而证实的病例的灵敏度分别为75％和66.6％，对新肺结核病例为72.7％和68.2％，对结核淋巴腺炎为66.6％和58.3％，和对感染HIV的肺结核病例分别为60％和46.6％。因此，AO染色法比Z-N染色法具有明显优势，并且培养物的检测率最高。

在培养物检查中，可以从85个样品中分离出86个菌株(详见实施例1和2)。一个样品生长出2种菌落类型，其中一个为快速生长菌落。使用标准流程如实施例2中例证的培养物检查流程，所有的86种培养物都被鉴定为本质上是分枝杆菌。

属特异性PCR检验

培养物进一步使用分子工具进行分枝杆菌种存在性检测。DNA直接从上述86份培养物中分离。按实施例3给出的方法分离DNA。按实施例4给出的方法对所有的86份DNA样品进行属特异性扩增。简要地，使用16SrRNA基因引物(属特异性引物)用合适的缓冲液扩增样品的DNA。所述引物(属特异性引物)给出如下：

引物16S rRNA 285：5’gag agt ttg atc ctg gct cag 3’(SEQ ID NO：1)和

引物16S rRNA 264：5’tgc aca aca ggc cac aag gga 3.(SEQ ID NO：2)

用上述引物扩增后，扩增的产物在0.9％的琼脂糖凝胶上分离并用溴化乙锭染色。所有的样品都显示一种1030bp大小的产物。图1显示一些分析样品的PCR检验的典型分布。所有的泳道都显示一种1030bp大小的产物，表明分枝杆菌种的存在。如图1所示，这清楚地表明显示分枝杆菌存在的阳性结果。对一些扩增的产品测序(29)以确定上述序列是否是分枝杆菌起源。从序列分析清楚地看到所有的菌株都是分枝杆菌菌株，详情在实施例6中给出。

种特异性PCR检验

所有的上述86份DNA样品进一步用ESAT-6区域种特异性引物进行PCR检验。详细资料在实施例5中给出。简要地，使用具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4序列的引物对扩增86份DNA样品。引物序列给出如下：

ESAT-6F：5’gcg gat ccc atg aca gag cag cag tgg a 3’(SEQ IDNO：3)和

ESAT-6R：5’ccc aag ctt cct atg cga aca tcc cag tga cg 3’(SEQID NO：4)

DNA样品和引物、DNA聚合酶在合适的缓冲液中扩增。86份分析样品中(85份加在一名患者身上的2种生长类型)，仅有67(77.9％)份样品显示出320bp的扩增产物，其与结核分枝杆菌种特异性esat-6基因相符(详见表1)。图2显示一些样品的扩增分布，所述样品依据属特异性16srRNA PCR检验和其它常规诊断方法为阳性存在分枝杆菌种。从图2可以清楚地看出不是所有的泳道都显示320bp扩增产物的存在。泳道16没有显示任何扩增，其与牛分枝杆菌相符。这清楚地表明基于esat 6基因的检验是对结核分枝杆菌特异的。表2给出使用不同的分枝杆菌菌株进行种特异性检验的数据。从表2和图2可以清楚地看出基于esat-6基因的检验是对结核分枝杆菌特异的。

16S rRNA基因的序列分析

携带2种类型分枝杆菌菌落生长的患者在过去的四年里接受抗结核治疗但是没有任何显著临床受益。对上述2种菌落遵循常规方法和聚合酶链式反应和16S rRNA测序进行菌落特征描述。2菌落其中之一没有包含esat-6基因，然而其属特异性PCR为阳性。ESAT-6PCR阴性的非结核菌落鉴定为耻垢分枝结核杆菌(M.smegmatis)，而其它菌落依据16S rRNA基因序列分析鉴定为结核分枝杆菌。16S rRNA基因测序的详细结果在实施例6中给出。耻垢分枝结核杆菌的16S rRNA基因序列(Accession No：AF504932)与结核分枝杆菌的不同。由申请人获得的结核分枝杆菌序列与Gen Bank数据库中的序列相同。

各种环境和人类机会致病性非结核分枝杆菌菌株通过基因测序鉴定，并且其序列已经提交到GenBank，入藏登记号(Accession no.)为AF419854，AF504932，AF504931，AF504926，AF498754，AF498317。

依据本研究使用的属和种特异性引物，申请人发现在感染HIV的患者中有很高的非结核分枝杆菌感染率(33.3％，5/15)。紧随其后的为淋巴炎患者(29.1％，7/24)，和对抗结核治疗反应迟钝的患者(20.8％，5/24)。当比较非结核性分枝杆菌在所有上述群体中的发病率和在新病例中的流行率(4.5％)时，上述发现是非常显著的(p＜0.001)。已经从表型和基因型上鉴定了所有18株非结核性分枝杆菌。扩增了所有上述菌株的16S rRNA基因，并对其测序以确定样品中不存在结核分枝杆菌。

新德里All India Institute of Medical Sciences(AIIMS)是一所三级护理医院，大多数患者已经得到对结核病在局部周围水平的经验性治疗。因此，较少病例不经过预治疗就直接到该医院就诊。如图所示，多于一半(52.2％)的所述患者接受了治疗但没有改善。非结核性分枝杆菌在上述患者中的流行率显著(p＜0.001)高于新病例(20.8％对4.5％)。这一发现与南印度最近发表的另一主要研究结果相一致(21)。在本研究中，在新诊断肺结核病例中，MDR的流行率为2.5％，而在早先治疗的病例中，结核分枝杆菌分离物的概率为81.2％(21)。本研究还表明79.2％的病例是MDR-结核分枝杆菌，而其余20.8％的病例由于其感染是由非结核性分枝杆菌引起故没有反应。

在本研究中，正如预计，非结核性分枝杆菌在伴有AIDS的肺结核病中有很高的的流行率。在南印度进行的关于HIV-TB共感染的另一研究中(5)，近来表明在伴有AIDS的肺结核病中，对抗结核治疗的初级无反应性高达33.9％。我们还发现我们33.3％的患者具有非结核性分枝杆菌，其中大多数通过16s rRNA测序鉴定为鸟-胞内分枝杆菌(Mycobacteriumavium-intracellular)(见实施例6)。由于非结核性分枝杆菌对常规抗结核治疗不敏感，将所述分离物，尤其是药物抗性病例的分离物鉴定到种的水平总是需要的。虽然，南印度的早先研究(5)没能从无反应性的AIDS患者中详细说明病原物种，我们的发现是这一趋向的另一个里程碑，无疑地强调了对分离分枝杆菌病原物种的需要。本研究推翻了认为印度所有的无反应性病例都归因于MDR-TB的普遍认识。我们的数据表明上述对初级ATT无反应性的患者中，多于四分之一是感染了非结核性分枝杆菌。

已报道在发展中世界和美国，结核分枝杆菌是淋巴腺炎的主要病因。来自印度的数据不充足，只有少数病例报告可得到，并且物种形成仅仅依据具有一些局限性的表型特征。因此，本研究中，非结核性分枝杆菌引起淋巴腺炎的高概率(29.2％)可以依据所用的高度敏感和结核分枝杆菌特异的分子方法进行解释。并且，依据实施例6给出的16s rRNA测序，大多数非结核性分枝杆菌被鉴定为鸟分枝杆菌复合体(Mycobacterium aviumcomplex)。分枝杆菌菌株通过对16s rRNA区域测序鉴定，其序列已提交到GenBank，其入藏登记号为AF419854，AF504932，AF504931，AF504926，AF498754，AF498317。

在申请人进行的多发源点研究中，发现分枝杆菌在所有痰液样品中的检出率在90-96％之间，其中痰液样品取自肺结核确诊病例，而且如实施例7所给没有观察到假阳性。

本发明教导关于检测结核分枝杆菌的特异方法。本发明教导ESAT-6引物可以用作从分枝杆菌分离物中鉴定结核分枝杆菌的快速而准确的方法，其中分枝杆菌分离物通过常规或快速培养技术获得。这将避免对一些耗费时间而且常常不可重复的生化方法的需要。表(1)清楚地证明esat-6引物对生化物种形成方法的优越性，生化物种形成方法错误地将4份分离物鉴定为结核分枝杆菌，然而其最终被鉴定为非结核性分枝杆菌。我们还建议所述引物可以用于诊断结核感染，直接用于临床样品。然而，当预见到患非结核性分枝杆菌疾病的百分率比较高时，比如在感染HIV的患者中、对标准抗结核治疗无反应的患者、和分枝杆菌淋巴腺炎患者中，所述引物应该总是与属特异性引物联合应用。

进一步用下述实例例证本发明，这些实例是提供给本领域普通技术人员的而且这些实例并不认为限制了本发明的范围。

实施例

实施例1

临床样品：

临床样品获得于OPD门诊(out patient department)患者、或者在印度新德里All India Institute of Medical Sciences(AIIMS)就医的患者。所有样品在实验医学部(Department of Laboratory Medicine)的临床微生物部门(Clinical Microbiology Division)进行处理。作为常规病情检查，总共调查了3072名AIIMS OPD门诊患者以排除结核病，其患者带有发烧、咳嗽和咳痰病症。然而，只有265名上述患者具有暗示结核病因学的临床放射线学发现，这些患者被转到专科门诊。所述的被转送患者满足CDC指南中的每一条包含标准，并都参与了本研究。在告知并征得患者同意后，他们的常规调查开始展开，并对其血液样品进行人体免疫缺陷病毒(HIV)检测。根据临床表现，调查分枝杆菌分离物的临床样品包括痰液、淋巴结吸出物或组织活检标本和胸膜液，如果是痰液，则获取1-3份来自患者的样品，而其它待试验样品的取样只进行一次。然而，没有将来自同一患者的重复取样计数为不同样品，即使来自同一患者的一份或所有三份样品为阳性培养物，其仍计数为一份样品。所有的样品都在收到的同一天进行处理。痰液样品在收到的24小时内用Petroff’s方法(12)进行净化和浓缩处理。净化后的样品进行L-J斜面培养。一部分沉淀保存在-20℃以备将来使用。余下的沉淀用于制备玻片涂片。

实施例2

显微镜方法和常规培养：

将玻片涂片在空气中晾干和热固定。一套涂片用金胺荧光染色法(auramine-O(A-O)fluorochrome staining)染色，并用尼康荧光显微镜(Nikon^TM fluorescent mieroscope)在400X放大倍数进行表面荧光检查，另一套Zeihl-Neelsen染色法(Zeihl-Neelsen staining)染色的涂片在油浸下(1000X)检查。按照修订的WHO指南报道抗酸杆菌(AFB)的结果和量化(33)：稀疏(在300油浸视野中AFB数目为1或2个)，1+(在100油浸视野中AFB数目为3-9个)，2+(每个油浸视野中AFB数目为1-10个)，或3+(每个油浸视野中AFB数目为10个或更多)。

按照标准方法(12，36)进行培养和鉴定，其中标准方法通过在Lowenstein-Jensen(L-J)斜面培养0.2-0.5ml净化的痰液。将培养物在37℃培养培养8周或直至生长，以较早时间为准。培养的分枝杆菌用染色和包括烟酸、热稳定过氧化氢酶、芳基硫酸酯酶和土温-80水解检测的标准生化方法进行鉴定。

实施例3

提取基因组DNA：

从分枝杆菌培养物中直接分离DNA，其中使用的流程是申请人近几年在实验室中一直使用的。简要地，将2-3菌环量(～100mg)的分枝杆菌培养物转移到一个含有200μl无菌蒸馏水的微量离心管(eppendorf tube)中。悬浮液在80℃水浴中温育20分钟。向悬浮液中加入200μl氯仿，然后旋涡震荡。将悬浮液再在65℃温育10分钟，接着9000rpm转速离心2分钟。取含有分枝杆菌DNA的上层清液用作检验。

实施例4

属特异性PCR检验：

将分枝杆菌DNA(50ng)在50μl 16S rRNA基因扩增的反应混合物中进行扩增。反应混合物包含：200μM脱氧核苷三磷酸dNTPs(BangaloreGenei，Pvt.Ltd.，Bangalore，印度)、5μl 10X缓冲液[100mM TAPS(pH8.8)，15mM MgCl₂，500mM KCl和0.1％明胶]和1.5个单位的Taq DNA聚合酶。每一条引物的工作浓度为0.5μM。使用的温度为：94℃5分钟；然后进行25-35个循环，每个循环的条件为94℃1分钟，62℃2分钟和72℃2分钟。总共进行40个扩增循环最后紧随72℃延伸10分钟。溴化乙啶染色后，PCR产物在0.9％的琼脂糖凝胶上分离出来。大小为1030bp的扩增带表明阳性结果(图1)。用于扩增1030bp 16S rRNA基因的引物在别处也有描述(14，15，28和33)。16S rRNA引物如下：

引物16S rRNA 285：5’gag agt ttg atc ctg gct cag 3’(SEQ ID NO1)和

引物16S rRNA 264：5’tgc aca aca ggc cac aag gga 3’.(SEQ ID NO2)

实施例5

种特异性PCR检验：

所有样品还进行结核分枝杆菌特异性PCR，使用设计为扩增esat-6(Rv3875)基因全长的引物。所述新型引物首次设计用于依据种特异性PCR的结核分枝杆菌诊断。引物还含有限制性位点，可以克隆到表达载体中。

引物为：

ESAT-6F：5’gc g gat ccc atg aca gag cag cag tgg a 3’(下划线为BamHI位点)(SEQ ID NO 3)和

ESAT-6R：5’ccc  aag ctt cct atg cga aca tcc cag tga cg 3’(下划线为Hind III位点)(SEQ IDNO 4)

将分枝杆菌DNA(50ng)在50μl eaat-6基因扩增的反应混合物中进行扩增。反应混合物包含，200μM脱氧核苷三磷酸盐dNTPs(BangaloreGenei，Pvt.Ltd.，Bangalore，印度)、5μl 10X缓冲液[100mM TAPS(pH8.8)，15mM MgCl₂，500mM KCl和0.1％明胶]和1.5个单位的Taq DNA聚合酶。每一条引物的工作浓度为0.5μM。使用的温度循环为：30个循环，每个循环的条件为94℃1分钟，65℃1分钟和72℃1分钟；最后在72℃延伸10分钟。溴化乙啶染色后，PCR产物在0.9％的琼脂糖凝胶上分离出来。产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，以分离320bp的PCR产物(图2)。并且，将用具有SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4序列的引物从结核分枝杆菌当地临床分离物的基因组DNA中得到的PCR扩增片段克隆到质粒载体中并测序。得到的核苷序列与Cole et al(4)发表的一致。所述序列已经存到GenBank，入藏登记号为AF420491。

实施例6：测序分枝杆菌种的16S rRNA

将用引物(SEQ.ID.NO.1和2)从结核分枝杆菌的当地临床分离物基因组DNA中得到的PCR扩增片段克隆到中间载体pGEM-T easy，并确定其核苷序列。将几个在种特异性扩增后表现为阳性扩增的临床样品用16SrRNA基因序列进行分析，以确定结核分枝杆菌的存在。将用基于esat-6基因的引物无扩增的临床样品用16S rRNA基因序列进行分析。可以清楚看到无esat-6基因扩增的样品不是结核分枝杆菌。大多数上述样品依据16S rRNA序列鉴定为鸟-胞内分枝杆菌。各种非结核性分枝杆菌通过基因测序鉴定，并且其序列已经提交到GenBank，入藏登记号为AF419854，AF504932，AF504931，AF504926，AF498754，和AF498317。由于非结核分枝杆菌对常规抗结核治疗不敏感，通常需要将所述分离物，尤其是抗药性病例的分离物，鉴定到种的水平。

实施例7：已确诊临床样品的结核分枝杆菌检测

在进行的临床研究中，50份临床样品用于分枝杆菌检测。所有上述50份痰液样品取自肺结核确诊病例。将痰液样品进行如实施例4和5给出的两种PCR扩增。扩增产物通过溴化乙啶染色检测。50份样品中的大多数显示出长度为320bp的扩增DNA产物。来自临床样品的数据如表3所示。

实施例8：不同种分枝杆菌的检测

PCR检验还在不同种的分枝杆菌中进行。本研究中所用的不同分枝杆菌菌株如表2所示。不同菌株的DNA样品按实施例3给出的方法分离。将各种DNA样品进行属特异性和种特异性两种PCR检验。属特异性检验使用如实施例4给出的具有SEQ ID NO：1和2序列的16S rRNA引物进行。种特异性检验使用如实施例5给出的具有SEQ ID NO：3和4序列的中特异性引物进行。PCR扩增产物在琼脂糖凝胶上分离，并进行分析。上述实验数据如表2所示。

表2清楚地显示esat-6种特异性引物对结核分枝杆菌高度特异。尽管对结核分枝杆菌复合体(其中包括牛分枝杆菌(M.bovis))特异的引物已有报道，我们的引物是可以区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的首次发明。由于牛分枝杆菌可能因后卡介苗(BCG)免疫接种感染而流行，将结核分枝杆菌和牛分枝杆菌区分开来是重要的。在印度，卡介苗(BCG，Bacillusof Calmette和Guerin)疫苗在儿童早期就给全体儿童接种。所述疫苗包含牛分枝杆菌突变的BCG菌株。目前为止还没有进行结核分枝杆菌唯一诊断的快速和直接的分子方法。并且，在印度，早有描述使用ESAT-6抗原进行抗体检测化验有很大的局限。牛分枝杆菌也是印度动物(牛)结核病的重要病原，传统上，消费生牛奶的印度农夫将具有抗所述细菌的抗体。因此，抗体检测方法将在健康个体中给出假阳性结核病报告，许多患者可能遭受不必要的抗结核治疗，然而并没有治疗真正的疾病。因此，我们的发明将大力改革结核分枝杆菌种特异性诊断，通过对临床样品直接使用多重PCR(用16S rRNA和esat-6引物)或对培养分离物只使用esat-6引物。

1.

表1.使用各种常规和分子方法对4组患者的分枝杆菌病因学检测率。

*从一名患者得到2种类型分离物。其中一种鉴定为结核分枝杆菌，另外一种为耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)。

表2

分枝杆菌种	16S rRNA PCR结果	6PCR结果
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)	+	+
			牛分枝杆菌(BCG)(M.bovis)	+	-
鸟分枝杆菌(M.avium)	+	-
			耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)	+	-
杜氏分枝杆菌(M.duvalli)	+	-
			偶发分枝杆菌(M.fortuitum)	+	-
隐藏分枝杆菌(M.celatum)	+	-
			南非分枝杆菌(M.austroafricanum)	+	-
微黄分枝杆菌(M.flavescence)	+	-

表3：各种诊断方法的相对敏感性

N＝50	涂片	培养物	16S rRNA	ESAT-6
					阳性	18	31	48	45/48
阴性	32	19	10	3/48*

*16S rRNA PCR阴性样品没有发现ESAT-6PCR阳性。

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                                     序列表

<110>全印度医疗科学学会，生物技术部

S.辛格

P.沙尔玛

<120>检测结核分枝杆菌的方法

<130>FPA2004

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>1

gagagtttga tcctggctca g                                              21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>2

tgcacaacag gccacaaggg a                                              21

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>3

gcggatccca tgacagagca gcagtgga                                       28

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>4

cccaagcttc ctatgcgaac atcccagtga cg                                  32

Claims (18)

1.一种用于扩增分枝杆菌种(Mycobacterium species)早期分泌抗原靶点(esat)-6-基因的寡聚核苷酸引物对，其具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列。

2.一种基于esat-6基因扩增的检测样品中结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的方法，所述方法包括步骤：

a)从样品中分离DNA模板，

b)通过加入反应缓冲液、具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列的寡聚核苷酸引物对、和热稳定DNA聚合酶扩增所述DNA模板，以获得扩增的DNA产物，和

c)将步骤(b)得到的扩增DNA产物进行分离、染色以检测扩增DNA产物的存在，其中所述扩增DNA产物的存在是样品中结核分枝杆菌的指示。

3.权利要求2所述的方法，其中所述样品是临床样品或培养样品。

4.权利要求3所述的方法，其中所述临床样品是选自于一组痰液、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、腹/腹膜液、脑脊髓液(CSF)、脓渣物质、尿、羊膜水、月经血、外周血或其它体液、淋巴结、脓或其它抽出物，和组织活检。

5.权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)中扩增是通过聚合酶链式反应。

6.权利要求2所述的方法，其中所述扩增由25-35个扩增循环组成。

7.权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)中热稳定DNA聚合酶是Taq聚合酶。

8.权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)中分离优选地通过凝胶电泳进行。

9.权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)中染色是用溴化乙锭。

10.权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)中扩增的DNA产物长度为320个碱基对。

11.一种用于从其它分枝杆菌种检测结核分枝杆菌的诊断试剂盒，其包含具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列的寡聚核苷酸引物对，全部四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，反应缓冲液，Taq聚合酶，DNA标记，阳性和阴性对照和操作手册。

12.一种基于扩增的检测结核分枝杆菌的方法，其中所述方法包括步骤：

i.通过常规方法用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列的寡聚核苷酸引物对从分离的DNA模板中扩增16s rRNA区域，以得到第一扩增产物，

ii.检测步骤(a)的扩增产物，其中存在1030碱基对的扩增DNA产物是阳性样品存在分枝杆菌种的指示，

iii.使用来自鉴定自步骤(b)中的阳性样品的DNA，基于esat-6基因扩增来进一步检测结核分枝杆菌，

iv.通过权利要求2所述的方法用具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列的寡聚核苷酸引物对扩增esat-6基因，以得到第二扩增产物，和

v.检测步骤(d)的扩增产物，其中存在320碱基对产物的是样品中结核分枝杆菌的指示，并且不存在是其它分枝杆菌种属的指示。

13.权利要求12所述的方法，其中所述DNA模板从临床样品或培养样品获得。

14.权利要求13所述的方法，其中所述临床样品是选自于一组痰液、支气管肺泡灌洗液、胸膜液、腹/腹膜液、脑脊髓液(CSF)、脓渣物质、尿、羊膜水、月经血、外周血或其它体液、淋巴结、脓或其它抽出物，和组织活检。

15.权利要求12所述的方法，其中所述扩增是通过聚合酶链式反应。

16.权利要求15所述的方法，其中所述扩增是通过热稳定DNA聚合酶如Taq聚合酶。

17.权利要求12所述的方法，其中步骤(i)中扩增由30-40个扩增循环组成。

18.权利要求12所述的方法，其中步骤(iii)中扩增由25-35个扩增循环组成。

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