JPH07163400A - 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリの亜群を検出するためのｄｎａ変異配列 - Google Patents
複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリの亜群を検出するためのｄｎａ変異配列Info
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- JPH07163400A JPH07163400A JP6180705A JP18070594A JPH07163400A JP H07163400 A JPH07163400 A JP H07163400A JP 6180705 A JP6180705 A JP 6180705A JP 18070594 A JP18070594 A JP 18070594A JP H07163400 A JPH07163400 A JP H07163400A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 複製連鎖反応を利用してＢ．ブルグドルフエ
リの亜群を検出することを可能にするＤＮＡ変異配列を
提供すること。 【構成】 ５１７番のヌクレオチドから７４２番のヌク
レオチドにわたるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉフラジェ
リン遺伝子の開放型読み枠の高度可変領域の配列の変異
配列であって、５３１、５４９、５５２、６１２、６１
３、６８４及び６９３位のグアノシンによる、５３９、
５９１、６０３、６２２、６３９、６５１及び６６６位
のアデノシンによる、５４０、５７３、６３０及び６９
６位のチミジンによる、並びに７３５位のシトシンによ
る塩基置換を特徴とする、又は、５３１、５９５、６１
２、６４９及び６６３位のグアノシンによる、５３９、
５５２、６５１、６６６、６７０及び６８８位のアデノ
シンによる、５４０、５７１、５９４、６３０及び６９
６位のチミジンによる、並びに６４４及び７２６位のシ
トシンによる塩基置換を特徴とする変異配列。
リの亜群を検出することを可能にするＤＮＡ変異配列を
提供すること。 【構成】 ５１７番のヌクレオチドから７４２番のヌク
レオチドにわたるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉフラジェ
リン遺伝子の開放型読み枠の高度可変領域の配列の変異
配列であって、５３１、５４９、５５２、６１２、６１
３、６８４及び６９３位のグアノシンによる、５３９、
５９１、６０３、６２２、６３９、６５１及び６６６位
のアデノシンによる、５４０、５７３、６３０及び６９
６位のチミジンによる、並びに７３５位のシトシンによ
る塩基置換を特徴とする、又は、５３１、５９５、６１
２、６４９及び６６３位のグアノシンによる、５３９、
５５２、６５１、６６６、６７０及び６８８位のアデノ
シンによる、５４０、５７１、５９４、６３０及び６９
６位のチミジンによる、並びに６４４及び７２６位のシ
トシンによる塩基置換を特徴とする変異配列。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体由来試料中に微量
に存在する感染因子を検出するための核酸プローブアッ
セイ法に関する。
に存在する感染因子を検出するための核酸プローブアッ
セイ法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ライム
病は、ダニ媒介スピロヘータＢｇｏｒｒｅｌｉａ ｂｕ
ｒｇｄｏｒｆｅｒｉがひき起こす臨床疾患の一群であ
る。それは、北米および欧州で最も普通の節足動物媒介
疾患である。この感染症独特の病形としては、慢性遊走
性紅斑、慢性萎縮性先端皮膚炎、リンパ球性背髄神経根
炎およびライム関節炎がある。この疾患の第２期および
第３期には、重篤な神経系または心臓への迷入が観察さ
れる。臨床提示の多様性と周知の通りこの疾患が他の神
経障害、リウマチ性障害に似ていることとが、正確な診
断を困難にしている。ライム病の臨床および病因の面か
らの総説については、Ｓｔｅｅｒｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．３０８：７３３およびＤｕｒａｙ，Ｒｅ
ｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１２：Ｓ１４８７を参照
されたい。ライム病の極めて重篤な臨床経過にもかかわ
らず、診断と適切な治療を早期に実施できれば、ライム
病は抗生物質療法に極めてよく反応する。しかし、早期
診断は、感染後の最初の何日間あるいは何週間のうちに
信頼すべき鑑別診断を可能にする試験法がないために、
できないことである。現在用いられている診断用試験は
いずれも血清学的なもので、間接免疫蛍光法（ＩＦ
Ａ）、酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）及び免疫
ブロッティングを包含する。このような免疫学的試験
は、所期疾患の患者の約５０〜６０％しか、感染後の最
初の３〜６週間の間にＩＦＡやＥＬＩＳＡによって測定
可能で診断に役立つ値を持たないので、信頼できないも
のである。 その上、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍが惹起する
梅毒およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉが惹起す
る回帰熱の患者で、ＩＦＡおよびＥＬＩＳＡでの偽陽性
反応が報告されている。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの
血清依拠アッセイで偽陽性が多いのは、病原性スピロヘ
ータ間で遺伝的相互関係が高度な結果、主要構造決定基
の血清学的交差反応性が生じることに帰しうる。たとえ
ば、Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓ．，１５６：１８３（１９８７）参照。
病は、ダニ媒介スピロヘータＢｇｏｒｒｅｌｉａ ｂｕ
ｒｇｄｏｒｆｅｒｉがひき起こす臨床疾患の一群であ
る。それは、北米および欧州で最も普通の節足動物媒介
疾患である。この感染症独特の病形としては、慢性遊走
性紅斑、慢性萎縮性先端皮膚炎、リンパ球性背髄神経根
炎およびライム関節炎がある。この疾患の第２期および
第３期には、重篤な神経系または心臓への迷入が観察さ
れる。臨床提示の多様性と周知の通りこの疾患が他の神
経障害、リウマチ性障害に似ていることとが、正確な診
断を困難にしている。ライム病の臨床および病因の面か
らの総説については、Ｓｔｅｅｒｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．３０８：７３３およびＤｕｒａｙ，Ｒｅ
ｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１１２：Ｓ１４８７を参照
されたい。ライム病の極めて重篤な臨床経過にもかかわ
らず、診断と適切な治療を早期に実施できれば、ライム
病は抗生物質療法に極めてよく反応する。しかし、早期
診断は、感染後の最初の何日間あるいは何週間のうちに
信頼すべき鑑別診断を可能にする試験法がないために、
できないことである。現在用いられている診断用試験は
いずれも血清学的なもので、間接免疫蛍光法（ＩＦ
Ａ）、酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）及び免疫
ブロッティングを包含する。このような免疫学的試験
は、所期疾患の患者の約５０〜６０％しか、感染後の最
初の３〜６週間の間にＩＦＡやＥＬＩＳＡによって測定
可能で診断に役立つ値を持たないので、信頼できないも
のである。 その上、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍが惹起する
梅毒およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉが惹起す
る回帰熱の患者で、ＩＦＡおよびＥＬＩＳＡでの偽陽性
反応が報告されている。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの
血清依拠アッセイで偽陽性が多いのは、病原性スピロヘ
ータ間で遺伝的相互関係が高度な結果、主要構造決定基
の血清学的交差反応性が生じることに帰しうる。たとえ
ば、Ｍａｇｎａｒｅｌｌｉら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓ．，１５６：１８３（１９８７）参照。
【０００３】血清学的アッセイに代るものとして、核酸
プローブが極めて特定された標的配列に結合するという
性質に基いた試験がある。ライム病では、微生物自体が
感染中極めて少数存在するだけであるので、まず標的核
酸配列を増幅して、シグナル発生分子を結合させたプロ
ーブが十分な数だけハイブリダイズして、検出可能なシ
グナルを発生するようにすることが必要である。かかる
プローブ依存アアセイ法の戦略は、検出しようとする微
生物種のついて標的配列が特異性をもち、標的配列の認
識がその種のあらゆるメンバー株に及ぶということにあ
る。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの核酸プローブアッセ
イは、この微生物とそれに密接に関連する種、とくに回
帰熱の諸変種であるＢ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｐａｒｋ
ｅｒｉ、Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔｒａｅ、Ｂ．ｈｉｓｐａｎ
ｉｃａおよびＢ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓとを弁別でき
なければならない。種々のＢｏｒｒｅｌｉａについての
ＤＮＡの相同性の検討により、Ｈｙｄｅ ＆ Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ａ，２６３：１１
９（１９８８）において報告されているように、種々の
程度の相同性が示され、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉが５８〜６
３％という最大の相同性を示す。北米の３つの種、Ｂ．
ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅおよびＢ．ｐ
ａｒｋｅｒｉは７７〜１００％の相同性を共有するが、
欧州と北米の諸株の比較により、実質的な種内変動が示
されている。
プローブが極めて特定された標的配列に結合するという
性質に基いた試験がある。ライム病では、微生物自体が
感染中極めて少数存在するだけであるので、まず標的核
酸配列を増幅して、シグナル発生分子を結合させたプロ
ーブが十分な数だけハイブリダイズして、検出可能なシ
グナルを発生するようにすることが必要である。かかる
プローブ依存アアセイ法の戦略は、検出しようとする微
生物種のついて標的配列が特異性をもち、標的配列の認
識がその種のあらゆるメンバー株に及ぶということにあ
る。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの核酸プローブアッセ
イは、この微生物とそれに密接に関連する種、とくに回
帰熱の諸変種であるＢ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｐａｒｋ
ｅｒｉ、Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔｒａｅ、Ｂ．ｈｉｓｐａｎ
ｉｃａおよびＢ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓとを弁別でき
なければならない。種々のＢｏｒｒｅｌｉａについての
ＤＮＡの相同性の検討により、Ｈｙｄｅ ＆ Ｊｏｈｎ
ｓｏｎ，Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ａ，２６３：１１
９（１９８８）において報告されているように、種々の
程度の相同性が示され、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉが５８〜６
３％という最大の相同性を示す。北米の３つの種、Ｂ．
ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅおよびＢ．ｐ
ａｒｋｅｒｉは７７〜１００％の相同性を共有するが、
欧州と北米の諸株の比較により、実質的な種内変動が示
されている。
【０００４】核酸プローブアッセイによるＢ．ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉの検出に当っては、ＯｓｐＡおよびＯｓ
ｐＢ表面蛋白抗原に対するプローブが注目されてきた。
Ｎｉｅｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，
４：７３（１９９０）は、増幅された１４５塩基対のＯ
ｓｐＡセグメントを成功裏にプローブ探査して、スピロ
ヘータ５０抗凝固剤に相当するＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ ＤＮＡわずか５０ｆｇを検出したことを報告して
いる。プローブは、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｔ．ｐａｌｌ
ｉｄｕｍ、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａあるいはＳ．ａｕｒ
ｅｕｓとの交差反応性が認められなかったことから、
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに対し特異的であることが
見出された。しかし、Ｐｅｒｓｉｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏ．，２８：５６６（１９９０）は、多数
の真正なＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｒｅｉ分離株のＯｓｐＡ
領域をプローブ探査し、それらのプローブが分離株の全
てを断定的に同定できるわけではないことを見出した。
この結果の分子レベルでの根拠は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉが株によっては大きく異なるＯｓｐＡ蛋白を有
したり、ＯｓｐＡ蛋白を全くもたず、代りに、より小さ
いｐＣという蛋白を持つという知見であった。それゆ
え、現在のところ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに対す
る決定的なアッセイ法はない。
ｄｏｒｆｅｒｉの検出に当っては、ＯｓｐＡおよびＯｓ
ｐＢ表面蛋白抗原に対するプローブが注目されてきた。
Ｎｉｅｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，
４：７３（１９９０）は、増幅された１４５塩基対のＯ
ｓｐＡセグメントを成功裏にプローブ探査して、スピロ
ヘータ５０抗凝固剤に相当するＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉ ＤＮＡわずか５０ｆｇを検出したことを報告して
いる。プローブは、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｔ．ｐａｌｌ
ｉｄｕｍ、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａあるいはＳ．ａｕｒ
ｅｕｓとの交差反応性が認められなかったことから、
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに対し特異的であることが
見出された。しかし、Ｐｅｒｓｉｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏ．，２８：５６６（１９９０）は、多数
の真正なＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｒｅｉ分離株のＯｓｐＡ
領域をプローブ探査し、それらのプローブが分離株の全
てを断定的に同定できるわけではないことを見出した。
この結果の分子レベルでの根拠は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉが株によっては大きく異なるＯｓｐＡ蛋白を有
したり、ＯｓｐＡ蛋白を全くもたず、代りに、より小さ
いｐＣという蛋白を持つという知見であった。それゆ
え、現在のところ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに対す
る決定的なアッセイ法はない。
【０００５】より最近の研究は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉが１群より多くの微生物を包含しているかもしれ
ないことを示している。Ｐｏｓｔｉｃら、Ｒｅｓ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：４６５（１９９０）は、種
々の出所からの１３株をＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼ
ーションによって分析し、４株からなる亜群を９参照株
から区別できることを見出した。Ｒｏｓａら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９：５２４（１９９
１）も、ゲノムの未知部分からのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉ特異性標的配列を用いてのＤＮＡ増幅パターンに
より、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの２亜群を識別でき
ることを見出した。これら２グループの結果の間には大
きな矛盾があって、これらの系が満足できるほどに特異
性のある診断上の価値をもっていないかもしれないこと
を示している点を注記しておくべきであろう。
ｅｒｉが１群より多くの微生物を包含しているかもしれ
ないことを示している。Ｐｏｓｔｉｃら、Ｒｅｓ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．，１４１：４６５（１９９０）は、種
々の出所からの１３株をＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼ
ーションによって分析し、４株からなる亜群を９参照株
から区別できることを見出した。Ｒｏｓａら、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９：５２４（１９９
１）も、ゲノムの未知部分からのＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉ特異性標的配列を用いてのＤＮＡ増幅パターンに
より、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの２亜群を識別でき
ることを見出した。これら２グループの結果の間には大
きな矛盾があって、これらの系が満足できるほどに特異
性のある診断上の価値をもっていないかもしれないこと
を示している点を注記しておくべきであろう。
【０００６】
【課題を解決するための手段】Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉおよびＢ．ｈｅｒｍｓｉｉからの、高保存性フラジ
ェリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列を比較すると、短
い欠失を含めて、５０〜７０％の食い違い（ミスマッ
チ）塩基を含む相対的に非相同性の小さい領域が明らか
になる。この領域から選んだプライマーは、Ｂ．ｂｕｒ
ｇｄｏｒｆｅｒｉに特異的なプライマー間配列の増幅を
指示することが見出された。このプライマー間領域のた
めに構築されたプローブは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉを特異的に同定する。
ｒｉおよびＢ．ｈｅｒｍｓｉｉからの、高保存性フラジ
ェリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列を比較すると、短
い欠失を含めて、５０〜７０％の食い違い（ミスマッ
チ）塩基を含む相対的に非相同性の小さい領域が明らか
になる。この領域から選んだプライマーは、Ｂ．ｂｕｒ
ｇｄｏｒｆｅｒｉに特異的なプライマー間配列の増幅を
指示することが見出された。このプライマー間領域のた
めに構築されたプローブは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉを特異的に同定する。
【０００７】本発明によれば、かかるプライマーおよび
プローブを用いて生体由来試料中のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉを特異的に検出するためのバイオアッセイ法
は、（１）該試料から核酸画分を抽出し、（２）鞭毛の
開放型読み枠をコードする核酸の半保存領域のフランキ
ング（隣りの）配列に対して相補鎖特異性プライマー対
を加え、（３）それらプライマーを相補鎖配列とハイブ
リダイズさせ、（４）核酸増幅技法によって該半保存領
域を増幅させ、（５）増幅された半保存領域を、プライ
マー間配列から構築されたシグナル発生プローブとハイ
ブリダイズさせ、（６）ハイブリダイズされたプローブ
が発生するシグナルを検出することからなる。
プローブを用いて生体由来試料中のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉを特異的に検出するためのバイオアッセイ法
は、（１）該試料から核酸画分を抽出し、（２）鞭毛の
開放型読み枠をコードする核酸の半保存領域のフランキ
ング（隣りの）配列に対して相補鎖特異性プライマー対
を加え、（３）それらプライマーを相補鎖配列とハイブ
リダイズさせ、（４）核酸増幅技法によって該半保存領
域を増幅させ、（５）増幅された半保存領域を、プライ
マー間配列から構築されたシグナル発生プローブとハイ
ブリダイズさせ、（６）ハイブリダイズされたプローブ
が発生するシグナルを検出することからなる。
【０００８】本発明の他の一面では、鞭毛の開放型読み
枠領域においてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに特異的で
あるオリゴヌクレオチドプライマー対を選ぶが、第一の
かかるプライマーは、鞭毛の開放型読み枠の３９０番〜
７７０番ヌクレオチドからの約８〜３２個の連続した塩
基の配列からなり、第二のかかるオリゴヌクレオチドプ
ライマーは、第一のプライマーの５’末端から少なくと
も５０ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖上にあり、
Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列との相同性が７０％
以下である８〜３２個の実質的に連続した塩基を含む配
列からなる。
枠領域においてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに特異的で
あるオリゴヌクレオチドプライマー対を選ぶが、第一の
かかるプライマーは、鞭毛の開放型読み枠の３９０番〜
７７０番ヌクレオチドからの約８〜３２個の連続した塩
基の配列からなり、第二のかかるオリゴヌクレオチドプ
ライマーは、第一のプライマーの５’末端から少なくと
も５０ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖上にあり、
Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列との相同性が７０％
以下である８〜３２個の実質的に連続した塩基を含む配
列からなる。
【０００９】本発明のさらに別の一面は、フラジェリン
遺伝子の開放型読み枠の非相同領域から増幅された核酸
を特異的に検出するためのプローブの選択を含む。これ
らのプローブは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの鞭毛の
開放型読み枠の配列に対しては実質的に相同であるが、
Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列に対しては約７０％
した相同でないシグナル発生性オリゴヌクレオチドトレ
ーサーからなる。トレーサーに結合されるシグナル発生
手段は、放射性標識、蛍光標識またはビオチニル化標識
であってよい。
遺伝子の開放型読み枠の非相同領域から増幅された核酸
を特異的に検出するためのプローブの選択を含む。これ
らのプローブは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの鞭毛の
開放型読み枠の配列に対しては実質的に相同であるが、
Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列に対しては約７０％
した相同でないシグナル発生性オリゴヌクレオチドトレ
ーサーからなる。トレーサーに結合されるシグナル発生
手段は、放射性標識、蛍光標識またはビオチニル化標識
であってよい。
【００１０】配列 ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＧＧ
ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＧＣＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔのオ
リゴヌクレオチドを含むプローブを用いて、プライマー
間配列の増幅を行っておいて多数のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉ株のスクリーニングを行った。このプローブは
いくつかの増幅された核酸を検出したが、他のものは検
出しなかった。従って、本発明のさらに別の一面は、こ
れらのプライマー間領域の配列を、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉの亜群を検出するための標的として利用するこ
とである。後述のように、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、５１７番ヌクレ
オチドから７４２番ヌクレオチドに至る高度可変領域の
一変異配列は、５３１、５４９、５５２、６１２、６１
３、６８４、６９３位でのグアノシンによる、５３９、
５９１、６０３、６２２、６３９、６５１、６６６位で
のアデノシンによる、５４０、５７３、６３０、６９６
位でのチミジンによるおよび７３５位でのシトシンによ
る塩基置換を含む。また後述のように、Ｂ．ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉフラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、５
１７番ヌクレオチドから７２４番ヌクレオチドに至る高
度可変領域の他の一変異配列は、５３１、５９５、６１
２、６４９および６６３位でのグアノシンによる、５３
９、５５２、６５１、６６６、６７０および６８８位で
のアデノシンによる、５４０、５７１、５９４、６３０
および６９６位でのチミジンによるならびに６４４およ
び７２６位でのシトシンによる塩基置換を含む。最後
に、標的配列の一部に対して相補性のプローブの１セッ
トは、ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＣ
Ａ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＡＣＣ
ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔ，ＣＴＣ ＴＧ
Ｇ ＴＧＡ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣＴＧＣ
ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＴＣＡ Ａ
ＧＡ ＡＧＧおよびＴＧＣ ＴＧＧ ＧＧＧ ＡＧＣ
ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ Ａ
ＣＣ ＴＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣからな
る群から選ばれた選ばれた配列をもつオリゴヌクレオチ
ドプローブと該プローブに結合されたシグナル手段とか
らなるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ亜群検出用オリゴヌ
クレオチドトレーサーを包含する。
ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＧＣＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔのオ
リゴヌクレオチドを含むプローブを用いて、プライマー
間配列の増幅を行っておいて多数のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉ株のスクリーニングを行った。このプローブは
いくつかの増幅された核酸を検出したが、他のものは検
出しなかった。従って、本発明のさらに別の一面は、こ
れらのプライマー間領域の配列を、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒ
ｆｅｒｉの亜群を検出するための標的として利用するこ
とである。後述のように、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、５１７番ヌクレ
オチドから７４２番ヌクレオチドに至る高度可変領域の
一変異配列は、５３１、５４９、５５２、６１２、６１
３、６８４、６９３位でのグアノシンによる、５３９、
５９１、６０３、６２２、６３９、６５１、６６６位で
のアデノシンによる、５４０、５７３、６３０、６９６
位でのチミジンによるおよび７３５位でのシトシンによ
る塩基置換を含む。また後述のように、Ｂ．ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉフラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、５
１７番ヌクレオチドから７２４番ヌクレオチドに至る高
度可変領域の他の一変異配列は、５３１、５９５、６１
２、６４９および６６３位でのグアノシンによる、５３
９、５５２、６５１、６６６、６７０および６８８位で
のアデノシンによる、５４０、５７１、５９４、６３０
および６９６位でのチミジンによるならびに６４４およ
び７２６位でのシトシンによる塩基置換を含む。最後
に、標的配列の一部に対して相補性のプローブの１セッ
トは、ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＣ
Ａ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＡＣＣ
ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔ，ＣＴＣ ＴＧ
Ｇ ＴＧＡ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣＴＧＣ
ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＴＧＴ ＴＣＡ Ａ
ＧＡ ＡＧＧおよびＴＧＣ ＴＧＧ ＧＧＧ ＡＧＣ
ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ Ａ
ＣＣ ＴＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣからな
る群から選ばれた選ばれた配列をもつオリゴヌクレオチ
ドプローブと該プローブに結合されたシグナル手段とか
らなるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ亜群検出用オリゴヌ
クレオチドトレーサーを包含する。
【００１１】Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの増幅された
標的配列に対するプローブ依存アッセイ法を開発しよう
とする従来の試みでは、ＯｓｐＡおよびＰｓｐＢ遺伝子
から発現される主要表面抗原蛋白が選択された。全ての
真正なＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株がこれらの抗原を
コードしているわけではないことが判明しているので、
異なる配列を選択しなければならないことは明らかであ
る。
標的配列に対するプローブ依存アッセイ法を開発しよう
とする従来の試みでは、ＯｓｐＡおよびＰｓｐＢ遺伝子
から発現される主要表面抗原蛋白が選択された。全ての
真正なＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株がこれらの抗原を
コードしているわけではないことが判明しているので、
異なる配列を選択しなければならないことは明らかであ
る。
【００１２】スピロヘータでは、内鞭毛は、単一のサブ
ユニットからなるアッセイブリーにより構成されてい
る。Ｗｉｌｓｋｅら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ａ２
６３：９２（１９８６）は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉのフラジェリン蛋白質に対して単離されたモノクロー
ナル抗体がＢ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｄｕｔｔｏｎｉ、
Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅおよびＢ．ｐａｒｋｅｒｉとも
反応することを報告した。その単一サブユニット構造、
抗原相同性の証拠および同一分子内での構造上および生
理学上の制約のため、フラジェリン遺伝子は高度に保存
されえて、それゆえ、プローブ依拠アッセイにおける標
的として、種の各メンバーを同定しそうに思われる。し
かし、同じ抗血清に対する数種の種の交差反応は、これ
らの遺伝子が同じ属内の諸種の間で高度に保存されうる
ことも示唆している。
ユニットからなるアッセイブリーにより構成されてい
る。Ｗｉｌｓｋｅら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ａ２
６３：９２（１９８６）は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉのフラジェリン蛋白質に対して単離されたモノクロー
ナル抗体がＢ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｄｕｔｔｏｎｉ、
Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅおよびＢ．ｐａｒｋｅｒｉとも
反応することを報告した。その単一サブユニット構造、
抗原相同性の証拠および同一分子内での構造上および生
理学上の制約のため、フラジェリン遺伝子は高度に保存
されえて、それゆえ、プローブ依拠アッセイにおける標
的として、種の各メンバーを同定しそうに思われる。し
かし、同じ抗血清に対する数種の種の交差反応は、これ
らの遺伝子が同じ属内の諸種の間で高度に保存されうる
ことも示唆している。
【００１３】事実、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに最も
密接に関連する種であるＢ．ｈｅｒｍｓｉｉについての
フラジェリン遺伝子の単離および配列決定は、Ｂ．ｂｕ
ｒｇｄｏｒｆｅｒｉと相同性の大きい領域を明らかにし
た。しかし、思いがけないことに、フラジェリン遺伝子
の開放型読み枠内に、相対的に非相同の配列を含むおよ
そ４８０塩基対の領域もあった。本発明では、相対的に
非相同のこれら配列が、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの
増幅、検出においては特異的であるが、他の密接に関連
した種は識別するところのプライマーおよびプローブを
構築するための基礎を与えてくれる。
密接に関連する種であるＢ．ｈｅｒｍｓｉｉについての
フラジェリン遺伝子の単離および配列決定は、Ｂ．ｂｕ
ｒｇｄｏｒｆｅｒｉと相同性の大きい領域を明らかにし
た。しかし、思いがけないことに、フラジェリン遺伝子
の開放型読み枠内に、相対的に非相同の配列を含むおよ
そ４８０塩基対の領域もあった。本発明では、相対的に
非相同のこれら配列が、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの
増幅、検出においては特異的であるが、他の密接に関連
した種は識別するところのプライマーおよびプローブを
構築するための基礎を与えてくれる。
【００１４】次の式Ａは、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
およびＢ．ｈｅｒｍｓｉｉからのフラジェリン遺伝子の
ヌクレオチド配列の相同性の比較を示す。
およびＢ．ｈｅｒｍｓｉｉからのフラジェリン遺伝子の
ヌクレオチド配列の相同性の比較を示す。
【００１５】
【化３】
【００１６】
【化４】
【００１７】
【化５】
【００１８】ヌクレオチドの整列には、Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１２：１２６（１９８８）に引用され
ている通り、ＵＷＧＣＧＴ分析プログラムＢＥＳＴＦＩ
Ｔの助けを借りた。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの配列
をＢ．ｈｅｒｍｓｉｉの配列の上方に位置させてある。
この比較から、非相同性の領域がおよそ３９０位および
７１２位のヌクレオチドによってはさまれていることが
わかる。約４７５位のヌクレオチドから約７７０位のヌ
クレオチドまでの領域が、それがＢ．ｈｅｒｍｓｉｉの
配列における少なくとも２つの小さい欠失を含んでいる
ため、プライマーおよびプローブの構築に好ましい。
ｄｓ Ｒｅｓ．，１２：１２６（１９８８）に引用され
ている通り、ＵＷＧＣＧＴ分析プログラムＢＥＳＴＦＩ
Ｔの助けを借りた。Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの配列
をＢ．ｈｅｒｍｓｉｉの配列の上方に位置させてある。
この比較から、非相同性の領域がおよそ３９０位および
７１２位のヌクレオチドによってはさまれていることが
わかる。約４７５位のヌクレオチドから約７７０位のヌ
クレオチドまでの領域が、それがＢ．ｈｅｒｍｓｉｉの
配列における少なくとも２つの小さい欠失を含んでいる
ため、プライマーおよびプローブの構築に好ましい。
【００１９】プライマー配列の選択に当たっては、好ま
しくは約８〜３２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを
利用するのが望ましい。８個未満のヌクレオチドを使用
すると、特異性が低下し、結合親和性が減少する。約３
２個より多いヌクレオチドを使用しても、プライマー機
能や特異性が増すことにはならず、顕著なミスマッチ領
域での結合の確率が増すかもしれない。しかし、６また
は７個のあるいは３２個より多くのヌクレオチドからな
るプライマーを使用できる配列が非相同領域内にあるで
あろうし、それらは、好ましい配列長の均等物であると
考えるべきである。
しくは約８〜３２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを
利用するのが望ましい。８個未満のヌクレオチドを使用
すると、特異性が低下し、結合親和性が減少する。約３
２個より多いヌクレオチドを使用しても、プライマー機
能や特異性が増すことにはならず、顕著なミスマッチ領
域での結合の確率が増すかもしれない。しかし、６また
は７個のあるいは３２個より多くのヌクレオチドからな
るプライマーを使用できる配列が非相同領域内にあるで
あろうし、それらは、好ましい配列長の均等物であると
考えるべきである。
【００２０】プライマー選択における戦略は、Ｂ．ｈｅ
ｒｍｓｉｉの対応する配列に対して最大限非相同の、
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ本来の短い配列を同定する
ことである。増幅反応では、プライマーはＢ．ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉの鋳型とのみアニールし、Ｂ．ｈｅｒｍ
ｓｉｉのＤＮＡとはアニールしないので、シグナル発生
プローブとハイブリダイズされうる諸配列の特異的増幅
は起こらない。さらに、プライマーは、向かい合った鎖
上で標的領域の隣にくるよう選択する。この標的領域
は、それがハイブリダイズするプローブと少なくとも同
じ長さであるべきで、好ましくは約５０ヌクレオチドの
長さであるべきである。かくして、鞭毛遺伝子の開放型
読み枠の３９０〜７１２番ヌクレオチドからの実質的に
連続した約８〜３２塩基を含む配列からなる群から選ば
れた第一のオリゴヌクレオチドと、第一のプライマーの
５’末端から約５０ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖
上にある配列であって、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する
配列の７０％以上の相同性しかもたない実質的に連続し
た８〜３２塩基を含む配列からなる群より選ばれた第二
のオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対を選択す
る。
ｒｍｓｉｉの対応する配列に対して最大限非相同の、
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ本来の短い配列を同定する
ことである。増幅反応では、プライマーはＢ．ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉの鋳型とのみアニールし、Ｂ．ｈｅｒｍ
ｓｉｉのＤＮＡとはアニールしないので、シグナル発生
プローブとハイブリダイズされうる諸配列の特異的増幅
は起こらない。さらに、プライマーは、向かい合った鎖
上で標的領域の隣にくるよう選択する。この標的領域
は、それがハイブリダイズするプローブと少なくとも同
じ長さであるべきで、好ましくは約５０ヌクレオチドの
長さであるべきである。かくして、鞭毛遺伝子の開放型
読み枠の３９０〜７１２番ヌクレオチドからの実質的に
連続した約８〜３２塩基を含む配列からなる群から選ば
れた第一のオリゴヌクレオチドと、第一のプライマーの
５’末端から約５０ヌクレオチドの間隔を置いて相補鎖
上にある配列であって、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する
配列の７０％以上の相同性しかもたない実質的に連続し
た８〜３２塩基を含む配列からなる群より選ばれた第二
のオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対を選択す
る。
【００２１】選んだプライマーは、相補鎖上での鎖伸長
のために変性核酸鋳型上の開始点として利用する。核酸
の増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号および同第
４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）中に記載されて
いる通りの複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うのが便
利である。この方法では、標的ＤＮＡが変性され、プラ
イマーが、それぞれの向かい合った鎖の上の増幅される
べき標的領域に隣る相補配列とハイブリダイズされる。
ヌクレオチド三リン酸類と共にＤＮＡポリメラーゼを加
えると、プライマーから新しいＤＮＡが合成される。反
応が完了すると、ＤＮＡを再び変性し、さらにポリメラ
ーゼを加えると、次のラウンドのＤＮＡ合成が起こる。
これを何回も繰り返すことにより、５〜６ logオーダー
の高度の増幅を達成できる。ハイブリダイゼーションお
よび重合はできるだけ厳格な条件組合せのものとで、す
なわち、プライマーの結合に、正確な配列への一層高い
忠実度が求められる高昇温度下で、行うことが望まし
い。好ましい温度は６５℃で、これには、米国特許第
４，８８９，８１９号（Ｇｅｌｆａｎｄら）に記載のも
のなどの耐熱性ポリメラーゼの使用が必要である。
のために変性核酸鋳型上の開始点として利用する。核酸
の増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号および同第
４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）中に記載されて
いる通りの複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うのが便
利である。この方法では、標的ＤＮＡが変性され、プラ
イマーが、それぞれの向かい合った鎖の上の増幅される
べき標的領域に隣る相補配列とハイブリダイズされる。
ヌクレオチド三リン酸類と共にＤＮＡポリメラーゼを加
えると、プライマーから新しいＤＮＡが合成される。反
応が完了すると、ＤＮＡを再び変性し、さらにポリメラ
ーゼを加えると、次のラウンドのＤＮＡ合成が起こる。
これを何回も繰り返すことにより、５〜６ logオーダー
の高度の増幅を達成できる。ハイブリダイゼーションお
よび重合はできるだけ厳格な条件組合せのものとで、す
なわち、プライマーの結合に、正確な配列への一層高い
忠実度が求められる高昇温度下で、行うことが望まし
い。好ましい温度は６５℃で、これには、米国特許第
４，８８９，８１９号（Ｇｅｌｆａｎｄら）に記載のも
のなどの耐熱性ポリメラーゼの使用が必要である。
【００２２】当業者に既知の他の核酸増幅プロトコール
をＰＣＲに替えてもよい。３ＳＲと呼ばれるかかる一方
法は、逆転写酵素を利用してＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ドをつくり出し、これより、Ｔ７または他の適当な転写
プロモーターを含有する二重ＤＮＡ構造を製出する。Ｄ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを系に加え、標的配列に
特異的な転写物を多数合成させる。これらの増幅された
転写物をつぎに適当なシグナル発生性オリゴヌクレオチ
ドでプローブ探査し、特定の標的を検出する。３ＳＲあ
るいはＴＡＳと呼ばれる関連した増幅法のためのプライ
マーを構築するに当っては、プロモーター配列がプライ
マーの５’末端に結合されなければならない。配列ＴＡ
ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡをもつＴ７プ
ロモーターが好ましい。
をＰＣＲに替えてもよい。３ＳＲと呼ばれるかかる一方
法は、逆転写酵素を利用してＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッ
ドをつくり出し、これより、Ｔ７または他の適当な転写
プロモーターを含有する二重ＤＮＡ構造を製出する。Ｄ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを系に加え、標的配列に
特異的な転写物を多数合成させる。これらの増幅された
転写物をつぎに適当なシグナル発生性オリゴヌクレオチ
ドでプローブ探査し、特定の標的を検出する。３ＳＲあ
るいはＴＡＳと呼ばれる関連した増幅法のためのプライ
マーを構築するに当っては、プロモーター配列がプライ
マーの５’末端に結合されなければならない。配列ＴＡ
ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡをもつＴ７プ
ロモーターが好ましい。
【００２３】プローブ配列は、非相同性開放型読み枠領
域内の任意のプライマー間配列から選択すればよい。最
良のプローブは、ミスマッチ極大の配列を組入れている
ものである。この領域では、約５８５番の塩基から約６
５０番の塩基までの配列が、欠失を含む領域にかかって
いて、全体としておよそ５０％のミスマッチ率をもつの
で、とくに有効である。この好ましい実施態様で、１つ
または２つのプライマーよりもむしろプローブをこの領
域から選択するのは、高度ミスマッチのプローブは増幅
が低レベルの標的とは有意にハイブリダイズせず、その
結果実質的に定量的アッセイが行えるという観察に基い
ている。
域内の任意のプライマー間配列から選択すればよい。最
良のプローブは、ミスマッチ極大の配列を組入れている
ものである。この領域では、約５８５番の塩基から約６
５０番の塩基までの配列が、欠失を含む領域にかかって
いて、全体としておよそ５０％のミスマッチ率をもつの
で、とくに有効である。この好ましい実施態様で、１つ
または２つのプライマーよりもむしろプローブをこの領
域から選択するのは、高度ミスマッチのプローブは増幅
が低レベルの標的とは有意にハイブリダイズせず、その
結果実質的に定量的アッセイが行えるという観察に基い
ている。
【００２４】プローブの長さは、数ないし数百塩基対と
いう、可能性として広い範囲にわたって変えうる。しか
し、プローブの特異性とその安定性との間でバランスを
とらなければならない。相対的に短いプローブ、とくに
高度非相同性領域から選ばれたものは、相対的に長いも
のよりは特異性がより高いが、ハイブリダイゼーション
の厳格さが良好となる温度で不安定な傾向がある。長い
プローブは、より多数のミスマッチを許容しうるため
に、一般に特異性が低い。好ましいプローブは、相対的
非相同の領域から選ばれたもので、ＧＣ含量が比較的高
く、約３５〜５５ヌクレオチド長である。
いう、可能性として広い範囲にわたって変えうる。しか
し、プローブの特異性とその安定性との間でバランスを
とらなければならない。相対的に短いプローブ、とくに
高度非相同性領域から選ばれたものは、相対的に長いも
のよりは特異性がより高いが、ハイブリダイゼーション
の厳格さが良好となる温度で不安定な傾向がある。長い
プローブは、より多数のミスマッチを許容しうるため
に、一般に特異性が低い。好ましいプローブは、相対的
非相同の領域から選ばれたもので、ＧＣ含量が比較的高
く、約３５〜５５ヌクレオチド長である。
【００２５】フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の、ミ
スマッチおよび非相同性が最高度の、５９４〜６４２位
ヌクレオチドに囲まれた領域から選ばれたオリゴヌクレ
オチド、すなわちＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＧＧ Ａ
ＧＣ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔを用
いて、32Ｐ結合プローブを構築した。多数のＢ．ｂｕｒ
ｇｄｏｒｆｅｒｉと推定される菌株を、上記プライマー
がアニールするフラジェリン遺伝子内部位間にわたる標
的領域（プライマー間増幅領域）をまず増幅させること
により、スクリーニングした。
スマッチおよび非相同性が最高度の、５９４〜６４２位
ヌクレオチドに囲まれた領域から選ばれたオリゴヌクレ
オチド、すなわちＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＧＧ Ａ
ＧＣ ＴＣＡ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧ
Ｃ ＡＣＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔを用
いて、32Ｐ結合プローブを構築した。多数のＢ．ｂｕｒ
ｇｄｏｒｆｅｒｉと推定される菌株を、上記プライマー
がアニールするフラジェリン遺伝子内部位間にわたる標
的領域（プライマー間増幅領域）をまず増幅させること
により、スクリーニングした。
【００２６】増幅された核酸類をつぎに、サザンブロッ
トアッセイで上記プローブを用いて探査した。驚くべき
ことに、真正なＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株のなか
に、プローブとのハイブリダイゼーションを示すもの
と、示さないものとがあった。増幅された配列の配列分
析を行った。それらの配列を次の式に示す。
トアッセイで上記プローブを用いて探査した。驚くべき
ことに、真正なＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株のなか
に、プローブとのハイブリダイゼーションを示すもの
と、示さないものとがあった。増幅された配列の配列分
析を行った。それらの配列を次の式に示す。
【００２７】
【化６】
【００２８】
【化７】
【００２９】これらの配列は、いくつかの位置のミスマ
ッチ塩基を含んでいる。最少５個のミスマッチ塩基を含
む１領域を選ぶことにより、プライマー間領域をまず増
幅し、つぎに増幅されたプローブを特定配列のプローブ
で探査するところのアッセイ法においてＢ．ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉの３つの亜群を区別できる３種のプローブ
を得た。３種のプローブの配列は次の通りである：プロ
ーブ１：ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＧＧ ＡＧＣ Ｔ
ＣＡ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＡＣ
Ｃ ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔ，プローブ
２：ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ
ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ
ＴＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＡＧＧ，プローブ３：ＴＧＣ
ＴＧＧＴＧＡ ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ Ｔ
ＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣＡＣＣ ＴＧＴ ＴＣＡ
ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ。
ッチ塩基を含んでいる。最少５個のミスマッチ塩基を含
む１領域を選ぶことにより、プライマー間領域をまず増
幅し、つぎに増幅されたプローブを特定配列のプローブ
で探査するところのアッセイ法においてＢ．ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉの３つの亜群を区別できる３種のプローブ
を得た。３種のプローブの配列は次の通りである：プロ
ーブ１：ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＧＧ ＡＧＣ Ｔ
ＣＡ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＡＣ
Ｃ ＧＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＧＧＧ Ｔ，プローブ
２：ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ
ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＣＣ
ＴＧＴ ＴＣＡ ＡＧＡ ＡＧＧ，プローブ３：ＴＧＣ
ＴＧＧＴＧＡ ＧＧＧ ＡＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ Ｔ
ＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣＡＣＣ ＴＧＴ ＴＣＡ
ＡＧＡ ＧＧＧ ＴＧＣ。
【００３０】次の表は、上記の対応するプローブの各々
によって特異的に検出されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ株の個々の亜群を示す。
によって特異的に検出されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ株の個々の亜群を示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】次の３つの式は、３亜群を特異的に検出す
るためのプローブオリゴヌクレオチドの配列を示す。
るためのプローブオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００３３】プローブ１．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
Ｂ３１
Ｂ３１
【化８】 CTCTGGTGAG GGAGCTCAAA CTGCTCAGGC TGCACCGGTT CAAGAGGGT
【００３４】プローブ２．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
Ｐ／Ｓｔｏ群
Ｐ／Ｓｔｏ群
【化９】 TGCTGGTGAG GGAGCTCAAG CTGCTCAGGC TGCACCTGTT CAAGAGGGTG CT
【００３５】プローブ３．Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
Ｐ／Ｂｉ群
Ｐ／Ｂｉ群
【化１０】 CTCTGGTGAA GGAGCTCAGG CTGCTCAGAC TGCACCTGTT CAAGAAGG
【００３６】出願人（発明者）らは、上記特定の諸配列
が、フラジェリン遺伝子の実質的に対応する各領域につ
いてミスマッチ塩基の度合が極大となって、得られるア
ッセイが厳格なものとなるため、とくに好ましいことを
見出している。しかし、アッセイの特異性を悪影響を与
えないような僅かな、重要でない塩基置換を行ってもよ
いことは明らかであろう。かかる微細な配列変更は、本
明細書で開示した配列と均等であると、出願人らは考え
る。
が、フラジェリン遺伝子の実質的に対応する各領域につ
いてミスマッチ塩基の度合が極大となって、得られるア
ッセイが厳格なものとなるため、とくに好ましいことを
見出している。しかし、アッセイの特異性を悪影響を与
えないような僅かな、重要でない塩基置換を行ってもよ
いことは明らかであろう。かかる微細な配列変更は、本
明細書で開示した配列と均等であると、出願人らは考え
る。
【００３７】これらプローブを、分子として、シグナル
発生手段と組合せると、それらが結合する標的配列にタ
グ（標識）を付けることのできる、すなわち直接的にあ
るいは間接的にシグナルを発しうるオリゴヌクレオチド
トレーサーとなる。かかるトレーサーは、放射性分子あ
るいは酵素に結合されたプローブであってもよく、それ
が便利である。トレーサーが標的にハイブリダイズする
と、その二重鎖デュープレックスは、慣用の分離手法に
よってハイブリダイズしていないトレーサーから分離で
き、結合放射能の量はシンチレーションカウンターまた
はガンマーカウンターで測定できる。ハイブリダイズし
た酵素結合トレーサーの分離にも、同様の慣用の分離手
法を用いうる。酵素結合デュープレックスが分離される
と、比色用または蛍光測定用の基質を加え、慣用の機器
によってシグナルを検出する。当業者に既知の他のシグ
ナル発生系としては、ＭｃＣａｐｒａら、Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．
（１９７３）に記載されているごとき、アクリジニウム
エステル類またはジオキセタン類を用いる化学発光法、
蛍光アッセイなどの蛍光標識（タグ）あるいはビオチン
結合プローブが挙げられる。
発生手段と組合せると、それらが結合する標的配列にタ
グ（標識）を付けることのできる、すなわち直接的にあ
るいは間接的にシグナルを発しうるオリゴヌクレオチド
トレーサーとなる。かかるトレーサーは、放射性分子あ
るいは酵素に結合されたプローブであってもよく、それ
が便利である。トレーサーが標的にハイブリダイズする
と、その二重鎖デュープレックスは、慣用の分離手法に
よってハイブリダイズしていないトレーサーから分離で
き、結合放射能の量はシンチレーションカウンターまた
はガンマーカウンターで測定できる。ハイブリダイズし
た酵素結合トレーサーの分離にも、同様の慣用の分離手
法を用いうる。酵素結合デュープレックスが分離される
と、比色用または蛍光測定用の基質を加え、慣用の機器
によってシグナルを検出する。当業者に既知の他のシグ
ナル発生系としては、ＭｃＣａｐｒａら、Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅ
ｓｃｅｎｃｅ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．
（１９７３）に記載されているごとき、アクリジニウム
エステル類またはジオキセタン類を用いる化学発光法、
蛍光アッセイなどの蛍光標識（タグ）あるいはビオチン
結合プローブが挙げられる。
【００３８】とくに興味があるのは、フルオレセイン標
識プローブがその標的にハイブリダイズしたときの偏光
の増加を測定する蛍光偏光法（ＦＰ）の応用である。こ
の検出系の重要性は、未結合のトレーサーをまず分離す
ることなく、トレーサーが標的にアニールすると直ちに
検出を行えることである。この検出法は、後記の実施例
２により詳細に記載されている。
識プローブがその標的にハイブリダイズしたときの偏光
の増加を測定する蛍光偏光法（ＦＰ）の応用である。こ
の検出系の重要性は、未結合のトレーサーをまず分離す
ることなく、トレーサーが標的にアニールすると直ちに
検出を行えることである。この検出法は、後記の実施例
２により詳細に記載されている。
【００３９】本発明のプライマーおよびプローブを使用
して、生体由来試料中のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの
診断検出法を都合よく構成する。かかるバイオアッセイ
法では、適切な配列の精製、クローニングされた遺伝子
断片を採用してもよいが、最良のプライマーおよびプラ
イマー源は慣用のオリゴヌクレオチド合成法によるもの
である。関心の持たれる生体由来試料としては、ライム
病症候群に関係あるとされた皮膚パンチバイオプシー検
体、血液および血液画分、脳背髄液、身体組織画分があ
る。パンチバイオプシー試料のための諸手法はＢｅｒｇ
ｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１
３：４４４（１９８６）に記載されている。血液からの
スピロヘータの分離は、Ｂｅｎａｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇ．
Ｊ．Ｍｅｄ．，３０８：７４０（１９８３）に記載され
ている。脳背髄液からのスピロヘータの分離は、Ｋａｒ
ｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２
８：４７３（１９９０）に記載されている。他の組織か
らの分離も文献に記載されている。
して、生体由来試料中のＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの
診断検出法を都合よく構成する。かかるバイオアッセイ
法では、適切な配列の精製、クローニングされた遺伝子
断片を採用してもよいが、最良のプライマーおよびプラ
イマー源は慣用のオリゴヌクレオチド合成法によるもの
である。関心の持たれる生体由来試料としては、ライム
病症候群に関係あるとされた皮膚パンチバイオプシー検
体、血液および血液画分、脳背髄液、身体組織画分があ
る。パンチバイオプシー試料のための諸手法はＢｅｒｇ
ｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１
３：４４４（１９８６）に記載されている。血液からの
スピロヘータの分離は、Ｂｅｎａｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇ．
Ｊ．Ｍｅｄ．，３０８：７４０（１９８３）に記載され
ている。脳背髄液からのスピロヘータの分離は、Ｋａｒ
ｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２
８：４７３（１９９０）に記載されている。他の組織か
らの分離も文献に記載されている。
【００４０】トレーサーハイブリダイゼーションに先立
つ増幅段階を実施するためには、核酸を抽出して、それ
らを利用できるようにすることが必要である。生体由来
試料から核酸を得るための抽出法は当該技術分野で周知
であり、本発明のバイオアッセイの実施に当っては常法
と考えられる。たとえば、Ｋｅｌｌｅｒ ＆ Ｍａｎａ
ｋ，ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ，第２章“Ｓａｍｐｌｅ Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”が、オリジナル文献の引用を含
めて、多くの標準的方法を極めて詳細に提示している。
さらに変性によって核酸を標準することも通常のもの
で、ｐＨまたは塩濃度の操作あるいは加熱によって行い
うる。
つ増幅段階を実施するためには、核酸を抽出して、それ
らを利用できるようにすることが必要である。生体由来
試料から核酸を得るための抽出法は当該技術分野で周知
であり、本発明のバイオアッセイの実施に当っては常法
と考えられる。たとえば、Ｋｅｌｌｅｒ ＆ Ｍａｎａ
ｋ，ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ，第２章“Ｓａｍｐｌｅ Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”が、オリジナル文献の引用を含
めて、多くの標準的方法を極めて詳細に提示している。
さらに変性によって核酸を標準することも通常のもの
で、ｐＨまたは塩濃度の操作あるいは加熱によって行い
うる。
【００４１】鋳型配列とハイブリダイズすると、ポリメ
ラーゼ媒介鎖伸張の基質として働くところのプライマー
は、変性の前または後に反応混合物に加えてよく、再生
条件へシフトさせるとき、アニールされる。つぎにポリ
メラーゼを加え、順次鎖伸張サイクルを起こさせる。Ｐ
ＣＲでは、ＤＮＡｔａｑポリメラーゼが好ましい。３Ｓ
Ｒでは、逆転写酵素がまずＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
を作り出し、これが、ＲＮＡｓｅＨ消化およびＤＮＡｔ
ａｑポリメラーゼによる再重合を行うとき、ＤＮＡ依存
生ＲＮＡポリメラーゼにより反復的に転写される。増幅
されプローブ探査された核酸の検出法は既に記載した。
ラーゼ媒介鎖伸張の基質として働くところのプライマー
は、変性の前または後に反応混合物に加えてよく、再生
条件へシフトさせるとき、アニールされる。つぎにポリ
メラーゼを加え、順次鎖伸張サイクルを起こさせる。Ｐ
ＣＲでは、ＤＮＡｔａｑポリメラーゼが好ましい。３Ｓ
Ｒでは、逆転写酵素がまずＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
を作り出し、これが、ＲＮＡｓｅＨ消化およびＤＮＡｔ
ａｑポリメラーゼによる再重合を行うとき、ＤＮＡ依存
生ＲＮＡポリメラーゼにより反復的に転写される。増幅
されプローブ探査された核酸の検出法は既に記載した。
【００４２】ハイブリダイズされた放射活性トレーサー
を検出するとくに有力な方法は、核酸増幅の生成物をア
ガロース電気泳動に付し、Ｐａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ
Ｂなどのナイロン膜の核酸バンドを移行させ、続いてシ
グナル発生プローブとハイブリダイズさせるもので、標
準的サザンブロットアッセイにおけるものである〔Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３
（１９７５）〕。特異的ハイブリダイゼーションの領域
をつぎに、プロローブ探査された核酸のオートラジオグ
ラフィーによって可視化する。
を検出するとくに有力な方法は、核酸増幅の生成物をア
ガロース電気泳動に付し、Ｐａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ
Ｂなどのナイロン膜の核酸バンドを移行させ、続いてシ
グナル発生プローブとハイブリダイズさせるもので、標
準的サザンブロットアッセイにおけるものである〔Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３
（１９７５）〕。特異的ハイブリダイゼーションの領域
をつぎに、プロローブ探査された核酸のオートラジオグ
ラフィーによって可視化する。
【００４３】かくして、本発明のバイオアッセイでは、
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ核酸と疑われる配列を含有
する生体由来試料から核酸を抽出し、鞭毛の開放型読み
枠をコードする核酸の半保存領域のフランキング（隣り
の）配列に対して相補鎖特異生をもつプライマー対の存
在下に変性して、プライマーを相補鎖配列にハイブリダ
イズさせ、核酸増幅技法によって該半保存領域を増幅
し、増幅された半保存領域を、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉの鞭毛遺伝子の開放型読み枠の一配列と実質的に相
同であるが、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列とは最
大７０％しか相同ではない配列を有するオリゴヌクレオ
チドトレーサーとハイブリダイズさせ、該トレーサーの
シグナル発生手段を発するシグナルを検出する。本発明
のその他の利点は、以下の実施例から明らかになるであ
ろう。
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ核酸と疑われる配列を含有
する生体由来試料から核酸を抽出し、鞭毛の開放型読み
枠をコードする核酸の半保存領域のフランキング（隣り
の）配列に対して相補鎖特異生をもつプライマー対の存
在下に変性して、プライマーを相補鎖配列にハイブリダ
イズさせ、核酸増幅技法によって該半保存領域を増幅
し、増幅された半保存領域を、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ
ｒｉの鞭毛遺伝子の開放型読み枠の一配列と実質的に相
同であるが、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉの対応する配列とは最
大７０％しか相同ではない配列を有するオリゴヌクレオ
チドトレーサーとハイブリダイズさせ、該トレーサーの
シグナル発生手段を発するシグナルを検出する。本発明
のその他の利点は、以下の実施例から明らかになるであ
ろう。
【００４４】
〔実施例１〕Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉおよびＢ．ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉは、アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョンから、それぞれ受入れ番号ＡＴＣＣ３５２０９およ
びＡＴＣＣ３５２１０のものを入手した。細菌を増殖さ
せ、回収し、常法によってＤＮＡを抽出した。染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて部分消化し、断片を
アガロースゲル電気泳動により特性決定した。９〜２３
ｂｐの適当な大きさの断片の付着端を、ｄＧＴＰおよび
ｄＡＴＰの存在下に部分的に埋め（フィルインし）た。
この材料をつぎにそのまま、制限酵素ＸｈｏＩで消化し
かつｄＴＴＰおよびｄＣＴＰで部分的にフィルインした
ラムダＧＥＭ１１ベクターに、クローン化した。
ｏｒｆｅｒｉは、アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョンから、それぞれ受入れ番号ＡＴＣＣ３５２０９およ
びＡＴＣＣ３５２１０のものを入手した。細菌を増殖さ
せ、回収し、常法によってＤＮＡを抽出した。染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて部分消化し、断片を
アガロースゲル電気泳動により特性決定した。９〜２３
ｂｐの適当な大きさの断片の付着端を、ｄＧＴＰおよび
ｄＡＴＰの存在下に部分的に埋め（フィルインし）た。
この材料をつぎにそのまま、制限酵素ＸｈｏＩで消化し
かつｄＴＴＰおよびｄＣＴＰで部分的にフィルインした
ラムダＧＥＭ１１ベクターに、クローン化した。
【００４５】つぎに、ラムダライブラリーを、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＬＥ３９２を宿主として平板培養した。プレート
から、Ｐａｌｌ ＢｉｏｄｙｎｅＢ膜を用いてプラーク
を拾い上げ、サザンブロット分析における通り、ハイブ
リダイゼーションによってスクリーニングした。Ｇａｓ
ｓｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：３
５９０（１９８９）が報告している通りのＢ．ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉの既知の配列からランダムに調製した合
成プライマーを用いて、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉお
よびＢ．ｈｅｒｍｓｉｉから導いた鋳型を増幅させた。
一例では、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉからの３００ｂ
ｐ断片を生じさせるのに用いた一プライマー対が、予期
しないことに、Ｂ．ｈｒｅｍｓｉｉの増幅に用いたとき
には、３００ｂｐのかすかなバンドを生じた。このかす
かなバンドは、フラジェリン遺伝子内の、その他の点で
はＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉとは比較的非相同の領域
がわずかに増幅されたことを証明した。この断片をプロ
ーブとして用いると、遺伝子のこの部分を含むラムダク
ローンを同定することができた。これらのクローンから
制限地図を作成し、構築物の配列を決定して、式Ａに示
した非相同配列の正しい配列が得られた。
ｌｉ ＬＥ３９２を宿主として平板培養した。プレート
から、Ｐａｌｌ ＢｉｏｄｙｎｅＢ膜を用いてプラーク
を拾い上げ、サザンブロット分析における通り、ハイブ
リダイゼーションによってスクリーニングした。Ｇａｓ
ｓｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：３
５９０（１９８９）が報告している通りのＢ．ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉの既知の配列からランダムに調製した合
成プライマーを用いて、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉお
よびＢ．ｈｅｒｍｓｉｉから導いた鋳型を増幅させた。
一例では、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉからの３００ｂ
ｐ断片を生じさせるのに用いた一プライマー対が、予期
しないことに、Ｂ．ｈｒｅｍｓｉｉの増幅に用いたとき
には、３００ｂｐのかすかなバンドを生じた。このかす
かなバンドは、フラジェリン遺伝子内の、その他の点で
はＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉとは比較的非相同の領域
がわずかに増幅されたことを証明した。この断片をプロ
ーブとして用いると、遺伝子のこの部分を含むラムダク
ローンを同定することができた。これらのクローンから
制限地図を作成し、構築物の配列を決定して、式Ａに示
した非相同配列の正しい配列が得られた。
【００４６】代表的な一実験で、式Ａに示したプライマ
ーを用いて、３０サイクルのＰＣＲによってプライマー
間領域の増幅を行った。つぎに増幅生成物を次の通り分
析した：アガロースゲルで電気泳動し、続いてサザンブ
ロット分析を行った。図１において、左のパネルは、ア
ガロースゲル電気泳動のパターンを示す。中央下方に一
緒に見られる２つのバンドは、ＯｓｐＡ遺伝子の増幅を
利用する増幅試験では陰性であった１菌株を含むＢ．ｂ
ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの独立した２株の増幅生成物に対
応している。各々の場合に、分子の大きさが、標的とし
た正しい領域の増幅に対して予期される大きさに相当し
ていることが明らかである。対照は全て陰性である。対
照についてゲルの他のセグメントで見られる小さいバン
ドが非特異性増幅を表わしていることを確認するため
に、図１の右のパネルに示したように、ゲルをサザンブ
ロット分析に付した。移行させた核酸を、式Ａに示した
配列を含むトレーサーによって探査した。結果は、この
アッセイの特異性を確認している。
ーを用いて、３０サイクルのＰＣＲによってプライマー
間領域の増幅を行った。つぎに増幅生成物を次の通り分
析した：アガロースゲルで電気泳動し、続いてサザンブ
ロット分析を行った。図１において、左のパネルは、ア
ガロースゲル電気泳動のパターンを示す。中央下方に一
緒に見られる２つのバンドは、ＯｓｐＡ遺伝子の増幅を
利用する増幅試験では陰性であった１菌株を含むＢ．ｂ
ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの独立した２株の増幅生成物に対
応している。各々の場合に、分子の大きさが、標的とし
た正しい領域の増幅に対して予期される大きさに相当し
ていることが明らかである。対照は全て陰性である。対
照についてゲルの他のセグメントで見られる小さいバン
ドが非特異性増幅を表わしていることを確認するため
に、図１の右のパネルに示したように、ゲルをサザンブ
ロット分析に付した。移行させた核酸を、式Ａに示した
配列を含むトレーサーによって探査した。結果は、この
アッセイの特異性を確認している。
【００４７】第二の実験は、増幅されたＢ．ｂｕｒｇｄ
ｏｒｆｅｒｉおよび対照ＤＮＡを、５’ＧＡＧＣＴＣＣ
ＣＴＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＤなる配列をもち、５’末
端にフルオレセインを結合させたプローブとのハイブリ
ダイゼーションによる均質アッセイにおいて蛍光偏光法
により分析した。プローブ混合物は、ＳＳＰＥ緩衝液
〔Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９８９）〕１．４ｍＬ、３．２Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ７μＬ、プローブ結合物２５０ｆｍｏｌ
およびホルムアミド２００μＬを含有していた。別の試
験管で、ＰＣＲにより増幅された材料の試料の０．１Ｍ
ＮａＯＨ中、５５℃で１５分間変性した。つぎに試料
をプローブ混合物に加え、蛍光偏光計を用いて７２分間
にわたり蛍光偏光の読みを記録した。
ｏｒｆｅｒｉおよび対照ＤＮＡを、５’ＧＡＧＣＴＣＣ
ＣＴＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＤなる配列をもち、５’末
端にフルオレセインを結合させたプローブとのハイブリ
ダイゼーションによる均質アッセイにおいて蛍光偏光法
により分析した。プローブ混合物は、ＳＳＰＥ緩衝液
〔Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第
２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（１９８９）〕１．４ｍＬ、３．２Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ７μＬ、プローブ結合物２５０ｆｍｏｌ
およびホルムアミド２００μＬを含有していた。別の試
験管で、ＰＣＲにより増幅された材料の試料の０．１Ｍ
ＮａＯＨ中、５５℃で１５分間変性した。つぎに試料
をプローブ混合物に加え、蛍光偏光計を用いて７２分間
にわたり蛍光偏光の読みを記録した。
【００４８】結果を図２にグラフで示したが、それら
は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ試料（それぞれＡＴＣ
Ｃ＃３５２１０およびＡＴＣＣ＃３５２１１と呼ぶ）に
ついて特異偏光が定性的に検出されることを示してい
る。対照は陰性である（ＡＴＣＣ＃３５２０９、Ｂ．ｈ
ｅｒｍｓｉｉ；ＡＴＣＣ＃４３３８１、Ｂ．ｃｏｒｉａ
ｃａｅ）。図３は７２分後の値と実質的に時間ゼロのと
きの値とのＭＰ（ミリ偏光単位）の差を棒グラフで示し
ているが、ＦＰが、均質フォーマットにおいて、増幅さ
れた標的配列を特異的に同定できることが明らかであ
る。
は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ試料（それぞれＡＴＣ
Ｃ＃３５２１０およびＡＴＣＣ＃３５２１１と呼ぶ）に
ついて特異偏光が定性的に検出されることを示してい
る。対照は陰性である（ＡＴＣＣ＃３５２０９、Ｂ．ｈ
ｅｒｍｓｉｉ；ＡＴＣＣ＃４３３８１、Ｂ．ｃｏｒｉａ
ｃａｅ）。図３は７２分後の値と実質的に時間ゼロのと
きの値とのＭＰ（ミリ偏光単位）の差を棒グラフで示し
ているが、ＦＰが、均質フォーマットにおいて、増幅さ
れた標的配列を特異的に同定できることが明らかであ
る。
【００４９】〔実施例２〕表１に列挙した一連のＢ．ｂ
ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株からＤＮＡを抽出した。複製連
鎖反応（ＰＣＲ）を、実施例１に述べたプライマーを用
いて、上記の通りに行った。表１に示したＢ．ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉの亜群１をＢ３１と名付ける。亜群２を
Ｐ／Ｂｉ、亜群３をＰ／Ｓｔｏと呼ぶ。上記の配列をも
つプローブ１〜３は、それぞれ亜群Ｂ３１、Ｐ／Ｓｔｏ
およびＰ／Ｂｉに特異的である。
ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ株からＤＮＡを抽出した。複製連
鎖反応（ＰＣＲ）を、実施例１に述べたプライマーを用
いて、上記の通りに行った。表１に示したＢ．ｂｕｒｇ
ｄｏｒｆｅｒｉの亜群１をＢ３１と名付ける。亜群２を
Ｐ／Ｂｉ、亜群３をＰ／Ｓｔｏと呼ぶ。上記の配列をも
つプローブ１〜３は、それぞれ亜群Ｂ３１、Ｐ／Ｓｔｏ
およびＰ／Ｂｉに特異的である。
【００５０】実施例１で述べた方法に従って、ハイブリ
ダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション生成物
をゲル電気泳動により分析した。図４のＡは、各々の増
幅され電気泳動された試料に対応するバンドを示してい
る。ゲルのバンドをつぎに膜上へサザンブロットし、32
Ｐ標識プローブ１〜３を用いて探査した。膜を２×ＳＳ
Ｃ緩衝液中で３０分間２回、続いて０．２×ＳＳＣ緩衝
液中で３０分間２回洗浄した。洗浄温度は６７．３℃
（Ｂ３１群プローブ）、６８．３℃（Ｐ／Ｓｔｏ群プロ
ーブ）、６５．８℃（Ｐ／Ｂｉ群プローブ）であった。
サザンブロット法のそれ以上の詳細は、Ｐｉｃｋｅｎ，
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｎｅ，９：４１２（１９９０）に
述べられている。図４のＢ、ＣおよびＤに示した結果
は、各プローブが、表１に示したＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉの対応する亜群に対して完全な特異性をもつこと
を示している。
ダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション生成物
をゲル電気泳動により分析した。図４のＡは、各々の増
幅され電気泳動された試料に対応するバンドを示してい
る。ゲルのバンドをつぎに膜上へサザンブロットし、32
Ｐ標識プローブ１〜３を用いて探査した。膜を２×ＳＳ
Ｃ緩衝液中で３０分間２回、続いて０．２×ＳＳＣ緩衝
液中で３０分間２回洗浄した。洗浄温度は６７．３℃
（Ｂ３１群プローブ）、６８．３℃（Ｐ／Ｓｔｏ群プロ
ーブ）、６５．８℃（Ｐ／Ｂｉ群プローブ）であった。
サザンブロット法のそれ以上の詳細は、Ｐｉｃｋｅｎ，
ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｎｅ，９：４１２（１９９０）に
述べられている。図４のＢ、ＣおよびＤに示した結果
は、各プローブが、表１に示したＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆ
ｅｒｉの対応する亜群に対して完全な特異性をもつこと
を示している。
【００５１】図４において各ゲルレーンには次のものが
対応する。 Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ １．＊ Ｂ３１〔ＡＴＣＣ ＃３５２１０〕 ２． ＩＲＳ〔ＡＴＣＣ ＃３５２１１〕 ３． 毒性 ＭＭ１ ４． 毒性 ＭＭＴ１ ５． 毒性 Ｉ．ｐａｃｉｆｉｃｕｓ ６． Ｎ４０ ７． Ｓｏｎ ３２８ ８． ＤＮ１２７ ９． ミネソタマウス １０． Ｌａｋｅ ３３９ １１． フランス ２０００１ １２． ＣＤ１６ １３． ＶＳ２１５ １４． ＮＥ５６ １５． Ｍｉｌｌｂｒｏｏｋ ２５０１５ １６． Ｐ／Ｓｔｏ １７． Ｐ／Ｇｕ １８． Ｐ／Ｂｉ １９． ドイツマダニ分離株 ２０． １２３塩基対はしご形分子量マーカー ２１． Ｇ２ ２２． ＶＳ３ ２３． ＶＳ１８５ Ｂｏｒｒｒｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉ ２４． ＨＳ１〔ＡＴＴＣ ＃３５２０９〕 ２５． Ｆｒｏｇｎｅｒ ２６． ＹＯＲ−１ ２７． ＣＯＮ−１ ２８． ＭＡＮ−１ ２９． Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ ３０． Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅ ３１． Ｂ．ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ ３２． Ｂ．ａｎｓｅｒｉｎａ ３３． Ｂ．ｃｏｒｉａｃｅａｅ ３４． Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ３５． Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕ
ｍ ３６． Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｐｅｄｅｎｉｓ ３７． Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ
ＳＶ．ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ ３８． Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄｅｉ ＳＶ．
ｌｙｍｅ ３９． 蒸留水対照 ４０． １２３塩基対分子量マーカー （注：＊ ゲルレーン番号）
対応する。 Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ １．＊ Ｂ３１〔ＡＴＣＣ ＃３５２１０〕 ２． ＩＲＳ〔ＡＴＣＣ ＃３５２１１〕 ３． 毒性 ＭＭ１ ４． 毒性 ＭＭＴ１ ５． 毒性 Ｉ．ｐａｃｉｆｉｃｕｓ ６． Ｎ４０ ７． Ｓｏｎ ３２８ ８． ＤＮ１２７ ９． ミネソタマウス １０． Ｌａｋｅ ３３９ １１． フランス ２０００１ １２． ＣＤ１６ １３． ＶＳ２１５ １４． ＮＥ５６ １５． Ｍｉｌｌｂｒｏｏｋ ２５０１５ １６． Ｐ／Ｓｔｏ １７． Ｐ／Ｇｕ １８． Ｐ／Ｂｉ １９． ドイツマダニ分離株 ２０． １２３塩基対はしご形分子量マーカー ２１． Ｇ２ ２２． ＶＳ３ ２３． ＶＳ１８５ Ｂｏｒｒｒｌｉａ ｈｅｒｍｓｉｉ ２４． ＨＳ１〔ＡＴＴＣ ＃３５２０９〕 ２５． Ｆｒｏｇｎｅｒ ２６． ＹＯＲ−１ ２７． ＣＯＮ−１ ２８． ＭＡＮ−１ ２９． Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ ３０． Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅ ３１． Ｂ．ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ ３２． Ｂ．ａｎｓｅｒｉｎａ ３３． Ｂ．ｃｏｒｉａｃｅａｅ ３４． Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ ３５． Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｃｔｉｎｏｖｏｒｕ
ｍ ３６． Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｐｅｄｅｎｉｓ ３７． Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ
ＳＶ．ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ ３８． Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄｅｉ ＳＶ．
ｌｙｍｅ ３９． 蒸留水対照 ４０． １２３塩基対分子量マーカー （注：＊ ゲルレーン番号）
【００５２】〔実施例３〕さらに一連の実験において、
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉについて記載したものに相
当する位置でＢ．ｈｅｒｍｓｉｉの一配列に隣る相補鎖
特異性プライマー対を用いて、１群のＢｏｒｒｅｌｉａ
からＤＮＡを増幅させた。第一のオリゴヌクレオチドプ
ライマーは、フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の３９
０〜７７０番ヌクレオチドからの実質的に連続した約８
〜３２塩基を含む配列よりなる群から選んだ。第二のオ
リゴヌクレオチドプライマーは、第一のプライマーの
５’末端から約３５〜５５ヌクレオチドの間隔を置いて
相補鎖上にあり、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの対応す
る配列とは７０％以下の相同性しかもたない約８〜３２
ヌクレオチドを含む配列よりなる群から選んだ。
Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉについて記載したものに相
当する位置でＢ．ｈｅｒｍｓｉｉの一配列に隣る相補鎖
特異性プライマー対を用いて、１群のＢｏｒｒｅｌｉａ
からＤＮＡを増幅させた。第一のオリゴヌクレオチドプ
ライマーは、フラジェリン遺伝子の開放型読み枠の３９
０〜７７０番ヌクレオチドからの実質的に連続した約８
〜３２塩基を含む配列よりなる群から選んだ。第二のオ
リゴヌクレオチドプライマーは、第一のプライマーの
５’末端から約３５〜５５ヌクレオチドの間隔を置いて
相補鎖上にあり、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの対応す
る配列とは７０％以下の相同性しかもたない約８〜３２
ヌクレオチドを含む配列よりなる群から選んだ。
【００５３】これらの実験に用いたプライマーを図５及
び次の式に示す。
び次の式に示す。
【００５４】
【化１１】
【００５５】これらのプライマーは、Ｂ．ｐａｒｋｅｒ
ｉおよびＢ．ｔｕｒｉｃａｔａｅに加えて、試験した全
てのＢ．ｈｅｒｍｓｉｉ株を増幅させた。Ｂ．ｐａｒｋ
ｅｒｉおよびＢ．ｔｕｒｉｃａｔａｅの増幅されたＤＮ
Ａの配列を血清したところ、これらの微生物について
は、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉと比較して、プライマー間配列
に差が認められた。これらの差を次の式に示す。
ｉおよびＢ．ｔｕｒｉｃａｔａｅに加えて、試験した全
てのＢ．ｈｅｒｍｓｉｉ株を増幅させた。Ｂ．ｐａｒｋ
ｅｒｉおよびＢ．ｔｕｒｉｃａｔａｅの増幅されたＤＮ
Ａの配列を血清したところ、これらの微生物について
は、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉと比較して、プライマー間配列
に差が認められた。これらの差を次の式に示す。
【００５６】
【化１２】 式中に太字で示した配列を選んでプローブを構築した。
ゲル電気泳動後、増幅されたバンドを膜に移し、このプ
ローブを用いてサザンブロッティングを行った。全ての
操作は前記両実施例に示した通りであったが、Ｂ．ｈｅ
ｒｍｓｉｉプローブの場合の洗浄温度は５７．７℃、
Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ／ｒｕｒｉｃａｔａｅプローブ（式
中に、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ（ＨＳ１）の太字で示されて
おり、これらの株（ｐａｒｋおよびｔｒｉ）がＨＳ１と
異なるヌクレオチドの位置では太字で置換してある）の
場合の洗浄温度は６２．０℃であった。
ゲル電気泳動後、増幅されたバンドを膜に移し、このプ
ローブを用いてサザンブロッティングを行った。全ての
操作は前記両実施例に示した通りであったが、Ｂ．ｈｅ
ｒｍｓｉｉプローブの場合の洗浄温度は５７．７℃、
Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ／ｒｕｒｉｃａｔａｅプローブ（式
中に、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ（ＨＳ１）の太字で示されて
おり、これらの株（ｐａｒｋおよびｔｒｉ）がＨＳ１と
異なるヌクレオチドの位置では太字で置換してある）の
場合の洗浄温度は６２．０℃であった。
【００５７】このプローブの配列は、本質的に、６０６
〜６３３番ヌクレオチドからのコア配列を含んでいる
が、ハイブリッド形成を安定化するために、あるいは洗
浄操作の厳格さを調整するために、各末端に塩基を府下
してもよい。かくして、好ましいプローブは、32Ｐなど
のシグナル発生手段に結合された配列ＴＧＣ ＡＧＧＴ
ＧＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＴＡのオリゴヌク
レオチドを包含する。
〜６３３番ヌクレオチドからのコア配列を含んでいる
が、ハイブリッド形成を安定化するために、あるいは洗
浄操作の厳格さを調整するために、各末端に塩基を府下
してもよい。かくして、好ましいプローブは、32Ｐなど
のシグナル発生手段に結合された配列ＴＧＣ ＡＧＧＴ
ＧＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ Ｔ
ＣＣＡ ＧＴＧ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＴＡのオリゴヌク
レオチドを包含する。
【００５８】上記の式中において太字で示したＢ．ｈｅ
ｒｍｓｉｉのヌクレオチド配列を用いるとき、Ｂ．ｈｅ
ｒｍｓｉｉの鑑別同定が可能であった。図６に示したサ
ザンブロット分析は、このプローブの高い特異性を確証
している。このことは、回帰熱を惹起するＢ．ｈｅｒｍ
ｓｉｉをライム病の原因因子から、また動物疾患を惹起
するＢｏｒｒｅｌｉａ菌から、区別できるという点で、
臨床上重要である。
ｒｍｓｉｉのヌクレオチド配列を用いるとき、Ｂ．ｈｅ
ｒｍｓｉｉの鑑別同定が可能であった。図６に示したサ
ザンブロット分析は、このプローブの高い特異性を確証
している。このことは、回帰熱を惹起するＢ．ｈｅｒｍ
ｓｉｉをライム病の原因因子から、また動物疾患を惹起
するＢｏｒｒｅｌｉａ菌から、区別できるという点で、
臨床上重要である。
【００５９】図６は、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉのフラジェリ
ン遺伝子から誘導した配列を用いて、１５種の異なるＢ
ｏｒｒｅｌｉａ株および他の５株のスピロヘータから増
幅を行った結果を示す。ゲルの写真８Ａ〜８Ｄの各々に
おける左から右へ向かっての菌株の順序は上記／下記に
列挙されている。
ン遺伝子から誘導した配列を用いて、１５種の異なるＢ
ｏｒｒｅｌｉａ株および他の５株のスピロヘータから増
幅を行った結果を示す。ゲルの写真８Ａ〜８Ｄの各々に
おける左から右へ向かっての菌株の順序は上記／下記に
列挙されている。
【００６０】８Ａは、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉプライマー対
を用いて増幅後の１８菌株からのＰＣＲ生成物のアガロ
ースゲル。Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ、
Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅ、Ｂ．ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ、
Ｂ．ａｎｓｅｒｉｎａおよびＢ．ｃｏｒｉａｃｅａｅの
場合にのみ、増幅が見られる。
を用いて増幅後の１８菌株からのＰＣＲ生成物のアガロ
ースゲル。Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ、Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ、
Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅ、Ｂ．ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ、
Ｂ．ａｎｓｅｒｉｎａおよびＢ．ｃｏｒｉａｃｅａｅの
場合にのみ、増幅が見られる。
【００６１】８Ｂは、Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉのフラジェリ
ン遺伝子配列から誘導したオリゴヌクレオチドプローブ
で探査後の、Ａに示したゲルのサザンブロット。
ン遺伝子配列から誘導したオリゴヌクレオチドプローブ
で探査後の、Ａに示したゲルのサザンブロット。
【００６２】８Ｃは、８Ｂで用いた、ただし２つの冗長
分を含むオリゴヌクレオチドプローブで探査後の、Ａに
示したゲルのサザンブロット。
分を含むオリゴヌクレオチドプローブで探査後の、Ａに
示したゲルのサザンブロット。
【００６３】８Ｄは、Ｂ．ＪｐａｒｋｅｒｉおよびＢ．
ｔｕｒｉｃａｔａｅのフラジェリン遺伝子配列から誘導
したオリゴヌクレオチドプローブで探査後の、Ａに示し
たゲルのサザンブロット。
ｔｕｒｉｃａｔａｅのフラジェリン遺伝子配列から誘導
したオリゴヌクレオチドプローブで探査後の、Ａに示し
たゲルのサザンブロット。
【００６４】図６において各ゲルレーンには次のものが
対応する。 １．＊ Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１ ２． Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｐ／Ｓｔｏ ３． Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｐ／Ｂｉ ４． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＨＳ１ ５． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ Ｆｒｏｇｎｅｒ ６． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＹＯＲ−１ ７． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＣＯＮ−１ ８． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＭＡＮ−１ ９． Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ １０． Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅ １１． Ｂ．ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ １２． Ｂ．ａｎｓｅｒｉｎａ １３． Ｂ．ｃｏｒｉａｃｅａｅ １４． Ｂ．ｐａｌｌｉｄｕｍ １５． Ｔ．ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ １６． Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ １７． Ｌ．ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ ＳＶ．ｉｃｔｅｒ
ｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ １８． Ｌ．ｉｎａｄｅｉ ＳＶ．ｌｙｍｅ １９． 蒸留水対照 ２０． １２３塩基対分子量マーカー （注：＊ ゲルレーン番号）
対応する。 １．＊ Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｂ３１ ２． Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｐ／Ｓｔｏ ３． Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ Ｐ／Ｂｉ ４． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＨＳ１ ５． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ Ｆｒｏｇｎｅｒ ６． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＹＯＲ−１ ７． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＣＯＮ−１ ８． Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉ ＭＡＮ−１ ９． Ｂ．ｐａｒｋｅｒｉ １０． Ｂ．ｔｕｒｉｃａｔａｅ １１． Ｂ．ｃｒｏｃｉｄｕｒａｅ １２． Ｂ．ａｎｓｅｒｉｎａ １３． Ｂ．ｃｏｒｉａｃｅａｅ １４． Ｂ．ｐａｌｌｉｄｕｍ １５． Ｔ．ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ １６． Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ １７． Ｌ．ｉｎｔｅｒｏｇａｎｓ ＳＶ．ｉｃｔｅｒ
ｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ １８． Ｌ．ｉｎａｄｅｉ ＳＶ．ｌｙｍｅ １９． 蒸留水対照 ２０． １２３塩基対分子量マーカー （注：＊ ゲルレーン番号）
【図１】 アガロースゲル電気泳動のパターン（左パネ
ル）及びサザンブロット分析（右パネル）を示す。
ル）及びサザンブロット分析（右パネル）を示す。
【図２】 増幅Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ及び対照Ｄ
ＮＡの、５’末端にフルオレセインを結合した５’ＧＡ
ＧＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＤなる配列を有
するプローブとのハイブリダイゼーションによる蛍光偏
光法分析結果を示すグラフ。
ＮＡの、５’末端にフルオレセインを結合した５’ＧＡ
ＧＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＡＤなる配列を有
するプローブとのハイブリダイゼーションによる蛍光偏
光法分析結果を示すグラフ。
【図３】 時間ゼロと７２分後の値とのＭＰ（ミリ偏光
単位）の差を示すグラフ。
単位）の差を示すグラフ。
【図４】 実施例１の方法によるハイブリダイゼーショ
ンによる生成物のゲル電気泳動結果を示す。
ンによる生成物のゲル電気泳動結果を示す。
【図５】 実施例３において使用したプライマーを示
す。
す。
【図６】 Ｂ．ｈｅｒｍｓｉｉのフラジェリン遺伝子か
ら誘導した配列を用いて、１５種の異なるＢｏｒｒｅｌ
ｉａ株および他の５株のスピロヘータから増幅を行った
結果を示す。
ら誘導した配列を用いて、１５種の異なるＢｏｒｒｅｌ
ｉａ株および他の５株のスピロヘータから増幅を行った
結果を示す。
フロントページの続き (72)発明者 ハリル、シー、アモンス アメリカ合衆国60085イリノイ、ウォーキ ーガン、サウスルイスアベニュー 138
Claims (2)
- 【請求項１】５１７番のヌクレオチドから７４２番のヌ
クレオチドにわたるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉフラジ
ェリン遺伝子の開放型読み枠の高度可変領域の配列、 【化１】 517 TTAAGAGTTC ATGTTGGAGC AACCCAAGAT GAAGCTATTG CTGTAAATAT 566 567 TTATGCAGCT AATGTTGCAA ATCTTTTCTC TGGTGAGGGA GCTCAAACTG 616 617 CTCAGGCTGC ACCGGTTCAA GAGGGTGTTC AACAGGAAGG AGCTCAACAG 666 667 CCAGCACCTG CTACAGCACC TTCTCAAGGC GGAGTTAATT CTCCTGTTAA 716 717 TGTTACAACT ACAGTTGATG CTAATA 742 の変異配列であって、５３１、５４９、５５２、６１
２、６１３、６８４及び６９３位のグアノシンによる、
５３９、５９１、６０３、６２２、６３９、６５１及び
６６６位のアデノシンによる、５４０、５７３、６３０
及び６９６位のチミジンによる、並びに７３５位のシト
シンによる塩基置換を特徴とするものである、Ｂ．ブル
グドルフエリの亜群を検出するための変異配列。 - 【請求項２】５１７番のヌクレオチドから７２４番のヌ
クレオチドにわたるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉフラジ
ェリン遺伝子の開放型読み枠の高度可変領域の配列、 【化２】 517 TTAAGAGTTC ATGTTGGAGC AACCCAAGAT GAAGCTATTG CTGTAAATAT 566 567 TTATGCAGCT AATGTTGCAA ATCTTTTCTC TGGTGAGGGA GCTCAAACTG 616 617 CTCAGGCTGC ACCGGTTCAA GAGGGTGTTC AACAGGAAGG AGCTCAACAG 666 667 CCAGCACCTG CTACAGCACC TTCTCAAGGC GGAGTTAATT CTCCTGTTAA 716 717 TGTTACAACT ACAGTTGATG CTAATA 742 の変異配列であって、５３１、５９５、６１２、６４９
及び６６３位のグアノシンによる、５３９、５５２、６
５１、６６６、６７０及び６８８位のアデノシンによ
る、５４０、５７１、５９４、６３０及び６９６位のチ
ミジンによる、並びに６４４及び７２６位のシトシンに
よる塩基置換を特徴とするものである、Ｂ．ブルグドル
フエリの亜群を検出するための変異配列。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53895790A | 1990-06-15 | 1990-06-15 | |
| US69118891A | 1991-04-25 | 1991-04-25 | |
| US691,188 | 1991-04-25 | ||
| US538,957 | 1991-04-25 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3511770A Division JPH074276B2 (ja) | 1990-06-15 | 1991-06-12 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリを検出するためのｄｎａプローブおよびプライマー |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163400A true JPH07163400A (ja) | 1995-06-27 |
| JP2657628B2 JP2657628B2 (ja) | 1997-09-24 |
Family
ID=27065973
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3511770A Expired - Lifetime JPH074276B2 (ja) | 1990-06-15 | 1991-06-12 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリを検出するためのｄｎａプローブおよびプライマー |
| JP6180705A Expired - Lifetime JP2657628B2 (ja) | 1990-06-15 | 1994-07-08 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリの亜群を検出するためのｄｎａ変異配列 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3511770A Expired - Lifetime JPH074276B2 (ja) | 1990-06-15 | 1991-06-12 | 複製連鎖反応を利用してｂ．ブルグドルフエリを検出するためのｄｎａプローブおよびプライマー |
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| Country | Link |
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| JP (2) | JPH074276B2 (ja) |
| CN (1) | CN1061245A (ja) |
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| CS (1) | CS183591A3 (ja) |
| DE (1) | DE69117885T2 (ja) |
| DK (1) | DK0487709T3 (ja) |
| ES (1) | ES2087298T3 (ja) |
| FI (1) | FI920636A0 (ja) |
| HU (2) | HU216204B (ja) |
| IE (1) | IE62797B1 (ja) |
| NO (1) | NO920606D0 (ja) |
| PL (1) | PL293741A1 (ja) |
| WO (1) | WO1991019814A2 (ja) |
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| WO1993003184A1 (en) * | 1991-08-09 | 1993-02-18 | Mccann Associates, Inc. | Method for detecting lyme disease and composition |
| US5932220A (en) * | 1995-05-08 | 1999-08-03 | Board Of Regents University Of Texas System | Diagnostic tests for a new spirochete, Borrelia lonestari sp. nov. |
| WO2003029450A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-10 | Københavns Universitet | Nucleic acid sequences encoding lysk from different borrelia strains and uses thereof |
| CN101886113B (zh) * | 2009-05-13 | 2012-10-17 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 蜱体内检测莱姆病病原的检测试剂盒 |
| FR3056991B1 (fr) * | 2016-10-03 | 2020-11-27 | C A L Laboratoire De Biologie Veterinaire | Methode et kit de detection, de discrimination et identification d'especes de borrelies presentes dans un echantillon d'origine humaine ou animale |
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|---|---|---|---|---|
| AU7058691A (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-24 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologically active proteines from borrelia burgdorferi, related test kits and vaccine |
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- 1991-06-15 CN CN91105020A patent/CN1061245A/zh active Pending
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