KR19990088425A - 장관출혈성대장균검출을위한올리고뉴클레오티드및이를이용한검출방법 - Google Patents
장관출혈성대장균검출을위한올리고뉴클레오티드및이를이용한검출방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR19990088425A KR19990088425A KR1019990018196A KR19990018196A KR19990088425A KR 19990088425 A KR19990088425 A KR 19990088425A KR 1019990018196 A KR1019990018196 A KR 1019990018196A KR 19990018196 A KR19990018196 A KR 19990018196A KR 19990088425 A KR19990088425 A KR 19990088425A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- seq
- vtec
- ehec
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 34
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 14
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 108010017898 Shiga Toxins Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 16
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 6
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010014896 Enterocolitis haemorrhagic Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000032759 Hemolytic-Uremic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 식중독·설사증에 관한 검사에 있어서, 간편, 신속, 및 고감도의 EHEC 또는 VTEC의 검사법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 EHEC (또는 VTEC)의 베로독소 유전자 또는 병원성 대장균 O157의 O 항원 합성영역 유전자와 선택적으로 혼성화하는 서열번호 1∼9의 올리고뉴클레오티드를 제조하여, 그 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 유전자증폭에 이용하고 있다. 이것에 의해, 이들 균의 병원인자의 하나인 O157을 생산하는 균 및 베로독소를 생산할 수 있는 대장균을 선택적으로 검출하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 임상검사, 식품의 품질검사, 특히 식중독에 관한 검사 또는 설사증 검사에 있어서, 장관 출혈성 대장균(이하, "EHEC" 라 한다) 또는 베로독소(Vero toxin) 생산성 대장균(이하, "VTEC"라 한다)의 검출 및 동정에 관한 것이다.
장관 출혈성 대장균증의 원인균인 EHEC (또는 VTEC)은 출혈성 대장염에 대표되는 식중독 증상 뿐 아니라, 소아에 있어서 중증의 질환인 용혈성 뇨독증 증후군(hemolytic uremic syndrome)의 원인균으로도 되는 것이 알려져 있으며, 최근, 임상검사에서는 이러한 균의 검출이 중요시되고 있다.
EHEC (또는 VTEC)에 행해지는 검사에 있어서 주된 검사재료는 환자의 대변, 식품, 또는 환자의 주변환경으로부터 채취되는 물(음료수, 하천수 등)이다. 이들 검체로부터 EHEC 또는 VTEC를 검출하여 동정하려고 할 경우, 직접분리배양, 1차확인배양시험, 2차확인배양시험, 항혈청에 의한 응집반응시험, 및 독소생산시험에 이르는 조작을 수행하여야만 한다. 그러나, 이들 배양의 각 단계에 있어서 소요시간은 각각 18∼24 시간이며, 총 소요시간으로 하면 3∼4일이 되어 매우 장시간이 된다. 따라서, 현재 EHEC (또는 VTEC)의 검사법은 신속성 및 간편성이 결여되어 있고, 실효적 수단이라고는 할 수 없다. 한편, EHEC (또는 VTEC)의 혈청형으로서는 O157:H7이 대표적이며, 장관 출혈성 대장균증의 80%이상을 차지하는 것이 알려져 있다.
본 발명의 목적은 올리고뉴클레오티드를 핵산합성반응의 프라이머로서 기능하게 하여 유전자 증폭기술에 의해, EHEC (또는 VTEC)의 병원인자의 하나인 베로독소 유전자와 O157 항원 합성영역 유전자의 각각의 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 임상검사, 특히 식중독·설사증에 관한 검사, 특히 중증의 질환을 일으키는 장관 출혈성 대장균증에 있어서, 간편, 신속, 및 고감도의 검사법을 제공하는데 있다.
도 1에서, (A)는 프라이머의 조합이 (1)인 경우의 전기영동 도면이고, (B)는 프라이머의 조합이 (2)인 경우의 전기영동 도면이며, (C)는 각 균주가 보유하는 유전자를 나타내는 도면이다.
도 2에서, (A)는 프라이머의 조합이 (3)인 경우의 전기영동 도면이고, (B)는 프라이머의 조합이 (4)인 경우의 전기영동 도면이며, (C)는 각 균주가 보유하는 유전자를 나타내는 도면이다.
본 발명은 EHEC (또는 VTEC)의 베로독소 생산성 대장균, 및 그의 대부분을 차지하는 병원성 대장균 O157을 선택적으로 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드, 또는 베로독소 1형(VT1) 유전자, 베로독소 2형(VT2) 유전자, 베로독소 2형의 변이형(VT2vha, VT2vhb, VT2vpl, 및 VT2vp2)의 각 유전자, 및 병원성 대장균 O157의 O 항원 합성영역 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하여, 그 뉴클로오티드의 서열과 상보적이 되도록 화학합성된 올리고뉴클레오티드의 혼합용액에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 EHEC (또는 VTEC)의 베로독소 유전자 또는 대장균 O157 항원 합성영역 유전자와 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 제작하여 그 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 유전자증폭에 사용한다. 이것에 의해, 병원성 대장균중 베로독소 유전자를 갖는 균, 또는 O157의 혈청형을 갖는 균만을 선택적으로 검출하는 것을 특징으로 하고 있다.
여기서, 프라이머는 다음 서열번호 1∼9
의 각 서열을 갖는다.
또한, 상기 프라이머는 다음의 조합
으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 PCR법을 사용하고, 또한 장관 출혈성 대장균증의 주요한 원인균인 병원성 대장균 O157의 O 항원 합성영역 유전자를 표적으로 하는 프라이머 및 장관 출혈성 대장균의 병원인자의 하나인 베로독소 유전자를 표적으로 하는 프라이머를 조합하여 사용함으로써, O157 항원을 갖는 대장균 및 베로독소를 생산할 수 있는 대장균의 검출에 있어서, 유전자 증폭작용에 의한 높은 검출감도와 두개 또는 그 이상의 프라이머로 반응을 규정시킴으로써 높은 선택성이 얻어진다. 게다가, 검출감도가 높으므로, 다량의 검체를 필요로 하지 않고, 검체의 전처리도 간편하게 끝난다. 본 발명에 있어서 실시예에서는 반응시간 3시간, 검출에 걸리는 조작이 30분 이었다. 게다가, 검출에 아가로스 겔 전기영동법과 브롬화 에티디움(ethidium bromide)에 의한 핵산염색법을 사용함으로써, 프라이머 등을 표지하지 않고 검출이 행해질 수 있다. 또한 증폭시킨 뉴클레오티드의 길이를 확인할 수 있으므로 시험결과의 신뢰성이 높아진다.
장관 출혈성 대장균증의 검사에는 발견환자의 신속·적절한 치료 및 방역조치를 위해 지체없는 정확한 결과가 요구된다. 또한 본 발명은 장관 출혈성 대장균증의 주요한 원인균인 병원성 대장균 O157 균체의 일부를 구성하고 있는 당쇄(sugar chain) 항원의 유전자 및 그의 병원인자인 베로독소 유전자를 선택적으로 검출하는 것이다. 따라서, 본 발명에 의해 장관 출혈성 대장균증의 원인균의 검출·결정을 신속하고 정확하게 행하는 것이 가능해진다.
유전자 증폭은 Saiki 등이 발견한 폴리머라제 연쇄 반응법(Polymerase Chain Reaction method) (이하, PCR법이라고 약칭하다; Science 230, 1350 (1985))을 근거하여 행해진다. 이 방법은 어떤 특정의 뉴클레오티드 서열영역 (본 발명의 경우는 EHEC 또는 VTEC의 베로독소 유전자 및 대장균의 O157 항원 합성영역 유전자)을 검출하는 경우, 그 영역의 양 말단의 한쪽은 + 가닥을, 다른 쪽은 - 가닥을 각각 인식하여 혼성화하도록 올리고뉴클레오티드를 준비하고, 이것을 열변성에 의해 단일가닥 상태로 한 시료핵산에 대하여 주형의존성 뉴클레오티드 중합반응의 프라이머로서 작용시켜, 생성된 이중가닥 핵산을 다시 단일가닥으로 분리하고, 다시 동일한 반응을 일으킨다. 이러한 일련의 조작을 반복함으로써 두개의 프라이머에 좁혀진(sandwiched) 영역을 검출할 수 있기까지 복사 수 (copy number)가 증대된다.
검체로서는 임상검사재료, 예를들면 대변, 뇨, 혈액, 조직 단편(tissue homogenate) 등, 또는 식품재료이어도 좋다. 이들 재료를 PCR의 시료로서 사용하기 위하여는 재료중에 존재하는 균체로부터 핵산성분을 유리시키는 조작이 전처리로서 필요하게 된다. 그러나 프라이머가 혼성화할수 있는 핵산이 몇개의 분자로부터 수십분자이상 존재하면 PCR은 진행되므로 검사재료를 용균효소, 계면활성제, 알카리 등으로 단시간 처리하는 것 만으로 PCR을 진행시키기에 충분한 핵산량을 갖는 시료액이 조제될 수 있다. 본 발명에서 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 선택성이나 검출감도 및 재현성을 고려하여, 10 염기 이상, 바람직하게는 15 염기 이상의 길이를 갖는 뉴클레오티드 단편이며, 화학합성 또는 천연의 어떤 것도 좋다. 또한, 프라이머는 특히 검출용으로서 표지되어 있어도 좋고 표지되어 있지 않아도 좋다.
프라이머가 규정된 병원성 대장균 O157의 O 항원 합성영역 유전자의 뉴클레오티드 서열에 있어서 증폭영역은 50 염기로부터 2,000 염기, 바람직하게는 100 염기로부터 1,000 염기가 되면 좋다. 주형의존성(template-dependent) 뉴클레오티드 중합반응에는 내열성 DNA 폴리머라제를 사용하고 있으나, 그 효소의 기원에 관해서는 90∼95℃의 온도에서 활성을 유지하고 있다면 어느 생물종 유래이어도 좋다. 열변성 온도는 90∼95℃, 프라이머를 혼성화시키는 어닐링(annealing) 조작의 온도는 37∼65℃, 중합반응은 50∼75℃ 이며, 이를 1 사이클로 한 PCR을 20부터 42 사이클을 행하여 증폭시킨다.
검출은 PCR이 완료된 반응액을 그대로 아가로스 겔 전기영동에 걸므로써 증폭시킨 뉴클레오티드 단편의 존재 및 그의 길이를 확인할 수 있다. 그 결과로부터 검체중에 프라이머가 인식될 만한 서열을 갖는 뉴클레오티드가 존재하고 있는 지를 판정할 수 있다. 이 판정은 그대로 O157 항원 합성영역 유전자를 갖는 대장균의 유무를 판정하는 것이 된다. 증폭된 뉴클레오티드 단편의 검출에는 기타의 전기영동법이나 크로마토그래피도 유효하다. 또한, 상기 프라이머 한개를 프로브(probe)로서 기능시켜, 막위 또는 기타 지지체 위의 표적 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 검출하여도 좋다.
실시예 1
검체의 조제
사용한 EHEC (또는 VTEC)은 환자등으로부터 유래한 것으로, 총합계 347주이었다. 각 균주를 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 및 1% 염화나트륨)에 접종하여 37℃, 호기적 조건하에서 밤새 배양하였다. 각 균주배양액을 10mM 트리스-염산 완충액 pH 7.5 (이하, TE 완충액)으로 10배 희석하여 95℃에서 10분간의 열처리한 후, 이것을 원심분리하여 상등액을 검체로 하였다.
프라이머의 합성
베로독소 생산성이며, 또한 그 혈청형이 O157인 EHEC 균주의 베로독소 유전자 및 O 항원 합성영역 유전자의 염기서열로부터, 서열번호 1∼9에 표시한 각 서열을 선정하고, 이들과 동일한 서열의 올리고뉴클레오티드를 화학합성하였다. 화학합성은 β-시아노에틸포스파미다이트 법(β-cyanoethylphosphamidite method)으로 행하였다. 합성한 올리고뉴클레오티드의 정제는 C18 역상 컬럼을 사용한 고속액체 크로마토그래피로 행하였다.
PCR
상기 검체액 3㎕를 사용하고, 이것에 멸균증류수 17.05㎕, 10 x 반응용 완충액 3㎕, dNTP용액 4.8㎕, 프라이머(1) 1.0㎕, 프라이머(2) 1.0㎕, 및 내열성 DNA 폴리머라제 0.15㎕를 가하여, 전량 30㎕의 반응액을 조제하였다. 이 반응액을 넣은 용기에 미네랄오일(SIGMA사제)을 50㎕ 가하고, 반응액상에 중층(layered)하였다. 각각의 사용한 용액의 내용물을 다음과 같다:
10 x 반응용 완충액 : 500mM KCl, 100mM 트리스-염산, pH8.3, 15mM 염화마그네슘, 0.1% (W/V) 젤라틴
dNTP 용액 : dATP, dCTP, dGTP, dTTP 를 혼합시킨 것으로 최종농도가 1.25mM
프라이머(1) 및 (2) : 상술한 화학합성 정제품의 수용액(농도 3.75 OD/ml)
프라이머의 조합 : 상술한 화학합성 정제품을 조합하여 사용했다. 조합은 특허청구범위 제3항에서 정의된 것으로 하였다.
내열성 DNA 폴리머라제 : Taq DNA 폴리머라제 (5 unit/ml:Perkin Elmer Cetus 사제)
반응조건은 다음과 같다.
내열성 : 94℃, 1분
어닐링 : 55℃, 1분
중합반응 : 72℃, 1분
열변성으로부터 어닐링을 경유하여 중합반응에 이르는 과정을 1 사이클(소요시간 5.7분)로 하여, 이것을 35 사이클 (총소요시간 약 3시간) 행하였다. 이 조작은 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus 사제)에 상기 반응조건을 프로그램하여 행하였다.
검출
반응액으로부터 증폭된 뉴클레오티드 단편을 검출하기 위하여, 아가로스 겔 전기영동을 아래와 같이 행하였다.
아가로스 겔은 겔농도 3%(W/V)으로 하여 브롬화 에티디움 (0.5㎕/ml)을 함유한 것을 사용하였다. 영동의 조건은 정전압 100V, 30분으로 행하였다. 조작방법 및 다른 조건은 Maniatis 등의 저서 Molecular Cloning 제2판 (1989) 에 기재되어 있는 방법으로 행하였다. 반응액 외에 분자량 마커의 영동도 동시에 행하여 상대이동도(relative mobility)의 비교에 의해 뉴클레오티드 단편의 길이를 산출하였다.
항 O157 혈청에 의한 응집시험
사용한 균주의 항원이 O157 인지 여부는 시판되는 항 O157 혈청 (Denka Seiken 제)를 사용한 균체의 응집시험에 의해 조사하였다. 응집시험의 상세는 혈청에 첨부된 사용설명서를 기초로 하여 행하였다.
결과
상술한 바와 같은 대장균의 O157 항원 합성영역 유전자는 이미 염기서열이 결정되어 있어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 즉, 프라이머가 PCR에 의해 증폭한 뉴클레오티드의 크기는 표1과 같이 용이하게 추정할 수 있다.
| 프라이머의조합 | PCR 증폭산물의 추정치 (염기) | ||
| O157 항원합성영역 유전자 | VT1유전자 | VT2유전자 | |
| (1) | 305 | 349 | 112 |
| (2) | 457 | 349 | 112 |
| (3) | 305 | 609 | 112 |
| (4) | 457 | 609 | 112 |
예를들면, 프라이머의 조합(1)에 있어서는, O157 항원 합성영역 유전자의 증폭산물로서 305 염기(또는 305 염기쌍) 길이의 뉴클레오티드가 증폭되게 된다. 또한, 베로독소 1형 및 2형의 각 유전자의 증폭산물로서 각각 349 염기(또는 349 염기쌍) 및 112 염기(또는 112 염기쌍)의 뉴클레오티드가 증폭되게 된다. 이들의 추정치와 실제 증폭되는 뉴클레오티드의 길이가 일치하는 경우, 이 프라이머의 조합은 표적으로 하고 있는 유전자 영역을 정확히 증폭하고 있으며, 또한, 당해 균주는 그 표적 유전자를 함유하고 있는 것으로 판단한다.
즉, 프라이머의 조합(1)에 있어서, 305, 349, 및 112 염기 (또는 염기쌍)의 3개의 증폭 뉴클레오티드가 검출되는 경우 그 피험균주에는 O157 항원 합성영역 유전자, VT1 유전자, VT2 유전자를 갖고 있다고 판단되며, 그 균주의 혈청형은 O157이고, 베로독소의 1형 및 2형을 생산하는 것으로 판단된다. 또한, 305 염기(또는 염기쌍)의 뉴클레오티드가 검출되지 않고 또한 VT2형 유전자의 증폭 뉴클레오티드만이 검출되는 경우에는, 혈청형이 O157 이외의 베로독소 생산성 대장균인 것으로 판단된다.
검출결과를 도1, 및 도2에 표시한다. 도1(A)는 프라이머의 조합이 (1)인 경우의 전기영동 도면, 도1(B)는 프라이머의 조합이 (2)인 경우의 전기영동 도면, 도2(A)는 프라이머의 조합이 (3)인 경우의 전기영동 도면, 도2(B)는 프라이머의 조합이 (4)인 경우의 전기영동 도면이다. 또한, 도1, 도2의 (C)는 전기영동의 각 레인(lane)을 나타낸다.
도1, 도2에서 나타낸 것과 같이, 각각의 프라이머의 조합은, 각각 표적으로 하는 유전자 영역만을 증폭하며, 이것 이외의 유전자 영역과는 전혀 반응하지 않았다. 즉, 대장균의 O157 항원 합성영역 유전자, VT1 유전자, 및 VT2 유전자를 정확히 증폭하여 장관 출혈성 대장균을 정확히 검출하고 있는 것을 나타내고 있다.
서 열 목 록
서열번호(SEQ ID NO) : 1
서열의 길이 19염기
서열의 형 핵산
서열수(Strandedness) 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 CAACACTGGATGATCTCAG
서열번호(SEQ ID NO) : 2
서열의 길이 20염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 ATCAGTCGTCACTCACTGGT
서열번호(SEQ ID NO) : 3
서열의 길이 18염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 CCCCCTCAACTGCTAATA
서열번호(SEQ ID NO) : 4
서열의 길이 19염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 CTGCTGTCACAGTGACAAA
서열번호(SEQ ID NO) : 5
서열의 길이 21염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 ATCATTGACGATTGTAGCACC
서열번호(SEQ ID NO) : 6
서열의 길이 20염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 GTATTTGGAGACATGGGAGC
서열번호(SEQ ID NO) : 7
서열의 길이 21염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 ACATGAGGAGCATTAACTTCG
서열번호(SEQ ID NO) : 8
서열의 길이 21염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 ACTAATGACACGATTCGTTCC
서열번호(SEQ ID NO) : 9
서열의 길이 20염기
서열의 형 핵산
서열수 단일가닥
토폴로지 직쇄상
서열의 종류 Genomic DNA
하이포세티컬 NO
안티-센스 NO
기원 Escherichia coli
서열의 특징 특징을 결정하는 방법 S
서열 CTGAATCCCCCTCCATTATG
Claims (4)
- 검체중에 존재하는 장관 출혈성 대장균(EHEC)증의 원인균인 베로독소-생산성 대장균(VTEC), 및 그의 대부분을 차지하는 병원성 대장균 O157을 선택적으로 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드, 또는 베로독소 1형(VT1) 유전자, 베로독소 2형(VT2) 유전자, 베로독소 2형의 변이형(VT2vha, VT2vhb, VT2vpl, 및 VT2vp2)의 각 유전자, 및 병원성 대장균 O157의 O 항원 합성영역 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하여, 그 뉴클로오티드의 서열과 상보적이 되도록 화학합성된 올리고뉴클레오티드의 혼합용액.
- 제1항에 따른 합성 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1∼9의 각 서열의 적어도 연속된 10 염기 이상을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 제2항에 따른 합성 올리고뉴클레오티드를 다음 (1)∼(4)중 어느 하나의 조합으로 이용하는 것을 특징으로 하는 EHEC 또는 VTEC의 검출방법.(1) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 7(2) 서열번호 1, 2, 3, 4, 6, 8(3) 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 9(4) 서열번호 1, 2, 4, 6, 8, 9
- 제2항 또는 제3항에 기재된 서열중 적어도 1개를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사슬연장 반응(chain extension reaction)의 프라이머로 기능시켜 표적 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 증폭시키는 것을 특징으로 하는 EHEC 또는 VTEC의 검출방법으로서,(1) 검체중의 단일가닥 상태의 표적 뉴클레오티드 서열에 프라이머를 혼성시켜(hybridizing), 4종의 뉴클레오티드의 중합반응에 의해 사슬연장 반응을 수행시키고,(2) 얻어지는 이중 가닥의 표적 뉴클레오티드 서열을 단일가닥으로 분리한 경우, 그 상보사슬은 다른 쪽 프라이머에 의해 사슬연장 반응의 주형으로서 기능하고,(3) 이들 2종의 프라이머에 의한 혼성화를 반복함으로써, 특정의 뉴클레오티드 서열을 증식시키고, 전기영동 또는 크로마토그래피로 증폭시킨 뉴클레오티드 단편을 검출하고,(4) 그 결과, 상기 검체중에 인식될 만한 서열이 존재하고 있는지 여부를 판정함으로써 EHEC 또는 VTEC의 검출을 행하는 것을 포함하는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1998-149749 | 1998-05-29 | ||
| JP10149749A JPH11332599A (ja) | 1998-05-29 | 1998-05-29 | 腸管出血性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19990088425A true KR19990088425A (ko) | 1999-12-27 |
Family
ID=15481928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019990018196A KR19990088425A (ko) | 1998-05-29 | 1999-05-20 | 장관출혈성대장균검출을위한올리고뉴클레오티드및이를이용한검출방법 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6165724A (ko) |
| EP (1) | EP0976837A3 (ko) |
| JP (1) | JPH11332599A (ko) |
| KR (1) | KR19990088425A (ko) |
| CA (1) | CA2272231A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020090257A (ko) * | 2001-05-26 | 2002-12-02 | 주식회사 서린바이오사이언스 | 수계오염지표균인 대장균군, 비병원성 대장균, ｅｈｅｃ및 ｅｔｅｃ 등의 장염유발 대장균 및 대장균ｏ-157:ｈ7을 동시검출하기 위한 멀티플렉스 ｐｃｒ용프라이머 및 그를 이용한 멀티플렉스 ｐｃｒ 방법 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE466097T1 (de) * | 1997-05-01 | 2010-05-15 | Univ Sydney | Nukleinsäure-moleküle spezifisch für bakterielle antigene und deren verwendungen |
| EP1409738A4 (en) * | 2001-06-22 | 2005-03-30 | Marshfield Clinic | METHOD AND OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTING SALMONELLA SP., E.COLI O157: H7 AND LISTERIA MONOCYTOGENES |
| US8298758B2 (en) | 2003-12-26 | 2012-10-30 | Prima Meat Packers, Ltd. | Method of multiplex microorganism detection |
| US20060246463A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-02 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US20060240442A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| CN101118234B (zh) * | 2006-07-31 | 2011-04-06 | 天津生物芯片技术有限责任公司 | 引起猪断奶期腹泻和水肿病大肠杆菌的检测方法及试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2775663B2 (ja) * | 1993-06-15 | 1998-07-16 | 株式会社島津製作所 | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| EP0669399B1 (en) * | 1994-02-28 | 2003-10-01 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
| US5652102A (en) * | 1994-12-05 | 1997-07-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Assay for enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 by the polymerase chain reaction |
| WO1998020148A1 (en) * | 1996-11-04 | 1998-05-14 | The Regents Of The University Of California | Method for detection of pathogens in food |
-
1998
- 1998-05-29 JP JP10149749A patent/JPH11332599A/ja active Pending
-
1999
- 1999-05-18 CA CA002272231A patent/CA2272231A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-19 US US09/313,968 patent/US6165724A/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-20 EP EP99109961A patent/EP0976837A3/en not_active Withdrawn
- 1999-05-20 KR KR1019990018196A patent/KR19990088425A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020090257A (ko) * | 2001-05-26 | 2002-12-02 | 주식회사 서린바이오사이언스 | 수계오염지표균인 대장균군, 비병원성 대장균, ｅｈｅｃ및 ｅｔｅｃ 등의 장염유발 대장균 및 대장균ｏ-157:ｈ7을 동시검출하기 위한 멀티플렉스 ｐｃｒ용프라이머 및 그를 이용한 멀티플렉스 ｐｃｒ 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11332599A (ja) | 1999-12-07 |
| EP0976837A2 (en) | 2000-02-02 |
| CA2272231A1 (en) | 1999-11-29 |
| US6165724A (en) | 2000-12-26 |
| EP0976837A3 (en) | 2003-05-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0556504B1 (en) | Oligonucleotides for detecting Vibrio parahaemolyticus | |
| BR9203161B1 (pt) | processos para detecção e identificação opcional de ácido nucléico micobactériano e de micobactéria. | |
| Watterworth et al. | Multiplex PCR-DNA probe assay for the detection of pathogenic Escherichia coli | |
| JP2792462B2 (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| KR19990088425A (ko) | 장관출혈성대장균검출을위한올리고뉴클레오티드및이를이용한검출방법 | |
| JP2775663B2 (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2001095576A (ja) | 腸管出血性大腸菌の検出法 | |
| JP3414261B2 (ja) | 病原性大腸菌ｏ１５７検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3134907B2 (ja) | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3141976B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2885081B2 (ja) | エンテロトキシン産生性のウェルシュ菌を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3419299B2 (ja) | ウエルシュ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| CA2286308A1 (en) | Dna probes for campylobacter, arcobacter and helicobacter | |
| JPH04293486A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP3331977B2 (ja) | 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2993314B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH119281A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH03112498A (ja) | カンピロバクター検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 | |
| JPH0789959B2 (ja) | ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07102158B2 (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH11332598A (ja) | ベロ毒素産生性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH0349697A (ja) | 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH05317098A (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07114720B2 (ja) | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 | |
| JPH07236500A (ja) | サルモネラ属菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |