CN116411088B - 区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的pcr-rflp引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR‑RFLP引物及方法，包括因组DNA提取、通用引物设计、PCR扩增、BstUI限制性内切酶酶切反应和带谱分析。利用通用引物进行PCR扩增两种吸虫的核糖体内转录间隔区基因，短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫均可以扩增出长度733 bp的条带。PCR产物经BstUI限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳检测呈现大小为573bp和160bp两条带的为短肠重盘吸虫，酶切后条带无变化的则为日本重盘吸虫。本发明中的PCR‑RFLP方法较PCR测序鉴定物种的方法更加简单、经济和快速，将为两种吸虫的流行病学调查及疾病防控奠定了坚实的理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及农业和动物检疫技术领域，涉及一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的分子方法，具体涉及一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法。此外，本发明还涉及用于同时检测短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的通用引物。
背景技术
短肠重盘吸虫（Diplodiscus mehrai）和日本重盘吸虫（Diplodiscus japonicus）是寄生于蛙类肠道内的寄生虫。两种吸虫具有相同的生活史，即成虫寄生于终末宿主（蛙等两栖动物）的肠道内，虫卵随终末宿主粪便排入水中孵出毛蚴，感染中间宿主（淡水螺类），在中间宿主体内经过胞蚴、雷蚴和尾蚴三个发育阶段。成熟的尾蚴离开中间宿主，被终末宿主吞食获得感染并发育至成虫，完成其生活史。由于蛙类自身的生物学特性，决定了其生存环境必须有水源的存在，因此，短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫也是蛙类普遍感染的重要寄生虫。同时，两种吸虫引起的重盘吸虫病对蛙类的生存和繁殖造成了极大的威胁，大量寄生时可夺取宿主的营养，导致蛙类发育迟缓、发育不良甚至发育畸形。同时，重盘吸虫的感染可降低蛙类的免疫力，为细菌、真菌等微生物的继发感染提供了适宜的条件，最终可导致蛙类大量死亡。
准确的物种鉴定是从事一切科学研究的必要前提。对于短肠重盘吸虫病和日本重盘吸虫的准确鉴定可为其流行病学的调查，有效药物的研制及相关疾病的防控奠定坚实的基础。目前区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的方法主要为形态学鉴定，但是由于短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫形态极相似，肉眼观察很难鉴别，即使经验丰富的科研人员也容易造成误判，因此仅靠形态学鉴定有较大的局限性，迫切需要一种新的快速有效的鉴别短肠重盘吸虫与日本重盘吸虫的技术方法。
真核生物核糖体内转录间隔区（Internal transcribed spacers, ITS）具有相对进化速度快，物种内具有保守性而物种间又存在特异性的优势，因此适合作为寄生虫分子分类、物种鉴定和系统进化的分子标记。限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术（PCR-RFLP）技术是利用PCR扩增目的片段后，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，从而区分具有不同序列多态性位点的物种。该方法与PCR产物测序后对比鉴定方法相比，具有操作简单、用时短、价格低廉等优点。且目前国内外尚无区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法的报道。
基于上述情况，本发明建立了一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP引物及方法。该方法将为两种吸虫的流行病学调查及疾病防控奠定基础，具有十分重要的研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP引物及方法，该方法利用BstUI限制性内切酶进行两种吸虫的核糖体ITS序列酶切鉴别，可准确区分这两种形态相似的吸虫，该方法具有操作简单、用时短、价格低廉等优点。
本发明是通过采取以下技术方案来解决的：
一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP引物，引物为：上游引物DF：5’- GAATGACGGGGTATCTACTTA -3’，下游引物DR：5’- TACATCTCAACTGAAAACACT -3’。
一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法，包括以下步骤：
（1）提取短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫基因组DNA；
（2）利用上游引物DF：5’- GAATGACGGGGTATCTACTTA -3’，下游引物DR：5’-TACATCTCAACTGAAAACACT -3’对短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR的扩增；
（3）短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP酶切反应；
（4）短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP带谱分析。
所述的步骤（1）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫基因组DNA提取方法为：经形态学鉴定的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫虫体，利用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒，按照说明书分别提取两种吸虫的基因组DNA，-20℃保存备用。
所述的步骤（2）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR的扩增具体方法为：PCR反应体系为：反应体系为25 μL，其中10×Ex Buffer (Mg2+free) 2.5 μL，Mg2+(25Mm)1.5 μL，dNTP (10mM) 2 μL，上、下游引物(20 μM)各 0.5 μL，DNA模板 (20ng/μL) 2 μL，ExTaq DNA聚合酶 (5u/μL) 0.2 μL，加入ddH2O调整总体积至25 μL，PCR 反应条件为：92 ℃预变性2 min；92 ℃变性30 s、52 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s、共30个循环；72 ℃终延伸7 min，短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫ITS基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均在733 bp处形成单一条带。
所述的步骤（3）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP酶切反应具体方法为：将短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫核糖体ITS的扩增产物，分别利用BstUI限制性内切酶进行酶切，酶切体系为10 μL，其中10×NEB buffer 1 μL，PCR产物5 μL，BstUI限制性内切酶0.2 μL，加入ddH2O调整总体积至10 μL，混匀后，60℃温浴30 min，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析重盘吸虫种类。
所述的步骤（4）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP带谱分析具体方法为：短肠重盘吸虫核糖体ITS基因序列中存在BstUI限制性内切酶酶切位点，可被BstUI限制性内切酶酶切成大小为573bp和160bp的条带，而日本重盘吸虫核糖体ITS基因序列中没有BstUI限制性内切酶切位点，经BstUI限制性内切酶酶切后条带大小不变，因此，根据条带大小和数量可区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫。
本发明所具有的优点与效果是：
1、本发明利用BstUI限制性内切酶对两种重盘吸虫的ITS基因进行酶切，可根据酶切后条带的大小和数量准确区分两种形态相似的重盘吸虫，鉴定结果较传统的形态学方法更加直观和可信。
2、本发明将短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫核糖体ITS的扩增产物，分别利用BstUI限制性内切酶进行酶切，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析重盘吸虫种类。本发明所设计方法对仪器设备要求低，相比PCR测序鉴定物种的方法更加简单、经济和快速，可在6小时内得到结果。
附图说明
图1是本发明实施例中短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的引物及酶切位点设计示意图。
图2是本发明实施例中短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的ITS基因PCR扩增电泳图。M：DL 2 000 Marker；1：短肠重盘吸虫；2：日本重盘吸虫；3：阴性对照。
图3是本发明实施例中短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP检测的电泳图。M：DL 2 000 Marker；1：经酶切后的短肠重盘吸虫PCR产物；2：经酶切后的日本重盘吸虫PCR产物。
实施方式
本申请实施例提供一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP引物，引物为：上游引物DF：5’- GAATGACGGGGTATCTACTTA -3’，下游引物DR：5’-TACATCTCAACTGAAAACACT -3’。
应用生物学软件DNAstar 8.0分析短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫核糖体ITS基因序列的差异，利用生物学软件Primer Premier 6.0进行引物设计，如图1所示，将确定的引物送往生工生物工程（上海）有限公司进行合成。
引物的设计需满足如下要求：（1）引物需设计成短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的通用引物，即选择短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫ITS基因中保守区域进行引物设计，以便可以同时扩增出短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫基因组DNA的阳性条带。（2）引物设计需选择短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫ITS基因中保守区域，且必须跨过短肠重盘吸虫ITS基因中573位点的BstUI限制性内切酶酶切位点，以便对胶回收产物能够进行限制性片段长度多态性分析。
根据以上要求，本发明中设计的通用引物DF和DR的序列分别为：上游引物DF：5’-GAATGACGGGGTATCTACTTA -3’；下游引物DR：5’- TACATCTCAACTGAAAACACT -3’。
本申请实施例提供一种区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法，包括以下步骤：
（1）、提取短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫基因组DNA；
具体如下：经形态学鉴定的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫虫体，利用TIANGEN公司的组织基因组DNA提取试剂盒，按照说明书分别提取两种吸虫的基因组DNA，-20℃保存备用。方法如下：
1）将已鉴定的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫成虫虫体分别置于无菌的1.5 mLEppendorf管中；
2）加入灭菌ddH2O反复洗涤5次后，弃去ddH2O；
3）加入20μl QIAGEN蛋白酶至Eppendorf管的底部；
4）加入200μl Buffer AL至样品中，涡旋振荡15s混匀，56°C孵育2 h；
5）3 000 r/min离心20 s，去除残留在Eppendorf管盖中的液体；
6）加入200 μl的无水乙醇，涡旋振荡15s混匀；
7）将全部混合物转移至QIAamp Mini离心管柱中，6 000 r/min离心1 min；
8）将QIAamp Min离心柱放入一个新的干净2ml接收管中；
9）加入500 μL Buffer AW2，12 000 r/min 离心1 min，弃去收集管中液体；
10）将QIAamp Min离心柱放入一个新的干净2ml接收管中；
11）加入500μl Buffer AW2，12000 r/min 离心1 min，弃去收集管中液体；
12）12 000 r/min离心2 min，彻底去除残留的Buffer AW2；
13）将QIAamp Min离心柱置于另一无菌1.5 mL Eppendorf管中，加入50 μL的Buffer AE，室温静置1 min后，12 000 r/min离心3min，洗脱基因组DNA；
14）洗脱的DNA于-20℃保存备用。
（2）利用上游引物DF：5’- GAATGACGGGGTATCTACTTA -3’、下游引物DR：5’-TACATCTCAACTGAAAACACT -3’同时对短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR的扩增；
所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR的扩增具体方法为：PCR反应体系为：反应体系为25 μL，其中10×Ex Buffer (Mg2+free) 2.5 μL，Mg2+(25Mm) 1.5 μL，dNTP(10mM) 2 μL，上、下游引物(20 μM)各 0.5 μL，DNA模板 (20ng/μL) 2 μL，Ex Taq DNA聚合酶 (5u/μL) 0.2 μL，加入ddH2O调整总体积至25 μL，PCR 反应条件为：92 ℃预变性2 min；92 ℃变性30 s、52 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s、共30个循环；72 ℃终延伸7 min，所述得到相应的 ITS 基因片段，短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫ITS基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均在733 bp处形成单一条带，如图2所示。
（3）短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP酶切反应；应用生物学软件DNASTARLasergene 8.0分别分析短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫核糖体ITS基因序列中的酶切位点，根据短肠重盘吸虫ITS基因序列第571-574位为CGCG（BstUI限制性内切酶酶切位点）的序列特征，而日本重盘吸虫相应序列为CGTG，不可被BstUI限制性内切酶识别。因此，依据二者BstUI限制性内切酶酶切位点的不同设计本发明的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP方法。所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP酶切反应具体方法为：将短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫核糖体ITS的扩增产物，分别利用BstUI限制性内切酶进行酶切，酶切体系为10 μL，其中10×NEB buffer 1 μL，PCR产物5 μL，BstUI限制性内切酶0.2 μL，加入ddH2O调整总体积至10 μL，混匀后，60℃温浴30 min，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析重盘吸虫种类。BstUI限制性内切酶酶切位点位于短肠重盘吸虫ITS基因的571-574位，短肠重盘吸虫可被BstUI限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳检测可呈现大小不一的两条亮带（573 bp处条带和160 bp处条带）。而扩增的日本重盘吸虫ITS序列中没有BstUI限制性内切酶酶切位点，日本重盘吸虫经BstUI限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳检测条带大小不变，为733 bp处条带，如图3所示。
（4）短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP带谱分析。PCR-RFLP结果分析具体方法为：将短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫核糖体ITS的扩增产物，分别利用BstUI限制性内切酶进行酶切，酶切体系为10 μL，其中10×NEB buffer 1 μL，PCR产物5 μL，BstUI限制性内切酶0.2 μL，加入ddH2O调整总体积至10 μL。混匀后，60℃温浴30 min，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析重盘吸虫种类。
短肠重盘吸虫核糖体ITS基因序列中存在BstUI限制性内切酶酶切位点，可被BstUI限制性内切酶酶切成大小为573bp和160bp的条带，而日本重盘吸虫核糖体ITS基因序列中没有BstUI限制性内切酶切位点，经BstUI限制性内切酶酶切后条带大小不变，为733bp，如图3所示，因此，根据条带大小和数量可区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫。
应用PCR-RFLP方法进行临床样品检测：所述的临床样品检测具体为：随机地点采集的东北林蛙肠道内分离的32条吸虫，经形态学鉴定后，分别提取基因组DNA，按上述PCR-RFLP方法进行检测。结果显示所分离的吸虫中日本重盘吸21条，短肠重盘吸虫11条，上述检测结果与利用形态学检测的结果一致，证实了本方法的可行性。
Claims (4)
1.一种非诊断目的的区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法，包括以下步骤：
（1）提取短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫基因组DNA；
（2）利用上游引物DF：5’- GAATGACGGGGTATCTACTTA -3’，下游引物DR：5’-TACATCTCAACTGAAAACACT -3’对短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR的扩增；
（3）短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP酶切反应；
（4）短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP带谱分析；
步骤（3）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP酶切反应具体方法为：将短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫核糖体ITS的扩增产物，分别利用BstUI限制性内切酶进行酶切，酶切体系为10 μL，其中10×NEB buffer 1 μL，PCR产物5 μL，BstUI限制性内切酶0.2 μL，加入ddH2O调整总体积至10 μL，混匀后，60℃温浴30 min，进行琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析重盘吸虫种类。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的的区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫基因组DNA提取方法为：经形态学鉴定的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫虫体，利用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒，分别提取两种吸虫的基因组DNA，-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的非诊断目的的区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR的扩增具体方法为：PCR反应体系为：反应体系为25 μL，其中Mg2+ free 的10×Ex Buffer 2.5 μL，25 mM 的Mg2+ 1.5 μL，10mM 的dNTP 2 μL，上、下游引物20 μM各 0.5 μL，20ng/μL 的DNA模板2 μL，5u/μL 的Ex Taq DNA聚合酶 0.2 μL，加入ddH2O调整总体积至25 μL，PCR 反应条件为：92℃预变性2 min；92 ℃变性30 s、52 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s、共30个循环；72 ℃终延伸7 min，短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫ITS基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均在733 bp处形成单一条带。
4.根据权利要求1所述的非诊断目的的区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫的PCR-RFLP方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫PCR-RFLP带谱分析具体方法为：短肠重盘吸虫核糖体ITS基因序列中存在BstUI限制性内切酶酶切位点，可被BstUI限制性内切酶酶切成大小为573bp和160bp的条带，而日本重盘吸虫核糖体ITS基因序列中没有BstUI限制性内切酶切位点，经BstUI限制性内切酶酶切后条带大小不变，因此，根据条带大小和数量可区分短肠重盘吸虫和日本重盘吸虫。
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