WO2016106465A1 - Método basado en pcr-rflp para identificar y determinar pureza de piscirickettsia salmonis - Google Patents

Método basado en pcr-rflp para identificar y determinar pureza de piscirickettsia salmonis Download PDF

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WO2016106465A1
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Verónica CAMBIAZO AYALA
Dinka MANDAKOVIC SEYLER
Benjamín Enrique GLASNER VIVANCO
Pamela Beatriz ARAVENA ESPINOZA
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Universidad De Chile
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00

Definitions

  • PCR-RFLP based method to identify and determine purity of Piscirickettsia salmonis.
  • the present invention relates to a rapid, sensitive, specific, reproducible and low-cost method for the identification and purity determination of the bacterium Piscirickettsia salmonis.
  • This method is a method based on PCR-RFLP (Complete) to identify Piscirickettsia salmonis and also establish whether a sample of Piscirickettsia salmonis (a bacterial culture, for example) is pure or contaminated with other bacteria that could cohabit with Piscirickettsia salmonis.
  • This method could be established in laboratories throughout the world as a standard technology for monitoring bacterial cultures and for epidemiological control technologies of Piscirickettsia salmonis.
  • the present invention also protects a kit for identifying and determining purity of Piscirickettsia salmonis.
  • Piscirickettsia salmonis is the etiologic agent of Rickettsial Salmonide Septicemia (SRS), a disease that has high mortality rates that reach 30-90% in farmed salmon in Chile.
  • SRS Rickettsial Salmonide Septicemia
  • SRS is a disease that spreads throughout salmon farming sites, accounting for 1-20% and up to 40% of the monthly mortality of total production of farmed fish in Chile (Cvitanich JD et al 1991.
  • PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction of Polymorphic Length Restriction Fragments
  • CN103923972 discloses a PCR-RFLP-based method that discriminates against the IOC gene of 17 sea cucumbers ⁇ Stichopodidae).
  • a template is established, and using the primers COIE-F: 5 '-ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3', COIE-R: 5-
  • GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3 'PCR' a fragment of the IOC gene is amplified, then the enzymatic digestion of the IOC fragment is performed using the restriction endonuclease Ddel / SFCI or BstNI / Sau3AI, and then electrophoresis of the digestion product obtained. Subsequently, the size of each of the bands resulting from the electrophoresis of the samples is estimated, contrasting the number and size of them with the reference band spectra of the seventeen sea cucumbers.
  • the method has wide application, is simple to operate, and makes an accurate and rapid detection, and is especially suitable for identifying a large number of commodity sea cucumbers, so it can assist in the normalization of the raw materials market Sea cucumbers and the protection of these resources.
  • CN103525933 discloses a PCR-RFLP method to distinguish Ctenopharyngodon idellus from Mylopharyngodon piceus, and using specific molecular markers discloses a DNA fragment to distinguish between these two species.
  • the method comprises a group of primers and the amplification of a fragment of the cytochrome b gene of 1140bp length of Ctenopharyngodon idellus and Mylopharyngodon piceus.
  • the PCR product is subjected to enzymatic digestion through the use of the restriction endonuclease BglI.
  • the fish is Ctenopharyngodon idellus, if two bands appear in the electrophoresis pattern and it is Mylopharyngodon piceus, if one band appears in the electrophoresis pattern. Therefore, species can be accurately and quickly identified based on the change in the restriction pattern of the amplification product.
  • the invention of CN103436612 describes a PCR-RFLP method for the rapid detection of common sturgeons. The method comprises the extraction of DNA from the genome from a sample that is then used as a template, the PCR amplification reaction is performed and then the enzymatic digestion of this product is performed using restriction enzymes.
  • the digestion product is subjected to fractionation by electrophoresis in agarose gels and species identification is done according to the differences observed in the electropherogram.
  • the method provided by the invention is simple to operate, fast and accurate, allowing the identification of fry of common sturgeon fish.
  • the invention of CN103290131 describes a pair of primers (direct and reverse) and a kit to distinguish the Channa argus and Channa maculata fish.
  • the kit containing the pair of primers and also comprises a PCR reagent conventional, a Taq polymerase buffers, dNTPs (triphosphate deoxyribonucleotides), a digestion reagent, a digestion buffer and an EcoRI restriction enzyme.
  • the method described by the invention is simple to operate, you just have to cut a small sample of the fin or muscles, guaranteeing the survival of the fish, being this fast and accurate.
  • the invention of CN101724690 describes a method for the detection of polymorphism in the flora of shrimp culture water from genomic DNA of microbes mixed in a sample of water for shrimp culture and designing a universal T-RFLP-PCR primer PCR reaction is performed.
  • the product is purified and the enzymatic DNA cut is performed by the specific restriction enzyme Hae III, then the DNA segments are separated on a 1% agarose gel, performing fluorescent scanning on the DNA segments.
  • quantitative detection of the predominant bacteria is performed by means of fluorescence in an in situ hybridization technology.
  • US2008305484 teaches the specific identification of a species of Campylobacter that does not have adequate biochemical tests for its differentiation. Twelve Campylobacter species were studied based on the partial sequence (1,020 bp) of the gyrB gene (beta subunit DNA topoisomerase gene), the topology of the resulting phylogenetic tree based on the gyrB gene was similar to the topology of a phylogenetic tree previously reported based on the 16S rDNA gene.
  • the gyrB gene offers a better resolution than the 16S rDNA gene for Campylobacter species with sequence similarities between species ranging from 58.3 to 89.2%.
  • a set of universal primers was designed to amplify a 960 bp fragment of the gyrB gene from Campylobacter spp. , which was used for the 19-strain PCR-RFLP representing the twelve Campylobacter species, including C. jejuni subsp jejuni, C. col !, C. concisus, C. curvus, C. showae, C. mucosalis, C . fetus C. hyointestinalis f, C.
  • ES2161135 describes the identification of Auxis thazard in canned fish, by amplifying an 187 bp fragment (BDR) of the mitochondrial DNA cytochrome b gene, also using a restriction endonuclease. This facilitates differentiation with respect to other species used as substitutes for Auxis thazard by PCR-RFLP.
  • BDR 187 bp fragment
  • the solution proposed in this case refers to a method of amplification of a fragment of the bacterial ribosomal 16S gene (16S rDNA), shared by all bacteria, through the use of universal splitters, and the subsequent digestion of the amplified mediator restriction enzymes (PCR-RFLP) that recognize specific nucleotides and in particular positions of the 16S rDNA of Piscirickettsia salmonis.
  • This digestion product can be visualized in an electrophoresis, which allows to identify the specific and characteristic digestion pattern of Piscirickettsia salmonis.
  • the presence of a different electrophoretic pattern or bands than those of the Piscirickettsia salmonis pattern indicates the presence of other bacteria in the sample.
  • the methodology is fast, highly specific, low cost and as much or more sensitive than screening tests currently in use.
  • restriction enzyme groups are revealed, each group associated with a specific digestion band pattern, that is 5 groups of ischysomers.
  • the restriction enzyme groups are, according to the digestion band pattern, the following: Group 1: Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l and PspCI; Group 2. BspCNI and BseMII; Group 3: TspEI, MluCI, Sse9l, TasI and Tsp509l; Group 4: Bfal, FspBI, XspI and Mael; and Group 5: Ddel, BstDEI and HpyF3l.
  • the present method allows the individual or combined use of the restriction enzymes that generate the above-mentioned digestion band patterns.
  • the present invention has been tested under laboratory controlled conditions for microbiological cultures of Piscirickettsia salmonis and in field samples, that is, in tissues of culture fish infected with Piscirickettsia. sa1moni s.
  • the present method is a PCR-RFLP based method to identify Piscirickettsia salmonis and also establish whether the sample is pure or contaminated with other pathogens or environmental bacteria that could cohabit with Piscirickettsia salmonis.
  • this method could be established in laboratories throughout the world as a standard technology for monitoring bacterial cultures and for epidemiological control technologies of Piscirickettsia salmonis.
  • the present invention still relates to a reproducible, fast, specific and low-cost method for the identification and purity determination of Piscirickettsia salmonis.
  • the present method is based on PCR-RFLP techniques to identify Piscirickettsia salmonis, and also establish, if the sample is pure or contaminated with other pathogens or environmental bacteria that could cohabit with Piscirickettsia salmonis.
  • the present invention also protects a kit for identifying and determining purity of Piscirickettsia salmonis.
  • the present method from the extraction of genomic DNA, whether from infected salmonid tissue, cell cultures infected with. Piscirickettsia salmonis or Piscirickettsia salmonis growing in an artificial medium in a bacterial culture, allows the realization of a polymerase chain reaction (PCR) protocol to amplify a region in the pathogen's genome using universal 16S gene amplification primers rDNA (27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG3') and 1492R (5'CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT3 '), amplifying the version of this gene of any bacteria present in the sample.
  • the PCR products thus obtained are enzymatically digested by one.
  • Figure 1 Represents a flow chart of the methodology conducted to determine RFLP patterns. They are shown as consecutive steps represented as rectangles and the logical order is represented by blue junctions.
  • FIG. 2 The five digestion patterns that allow to distinguish Piscirickettsia salmonis from other bacteria are observed. These bacteria represent examples of bacteria that cohabit with. Piscirickettsia salmonis in both natural and laboratory environments.
  • Each pattern is formed by the digestion of the amplification product by PCR (with universal splitters 27F and 1492R) of the 16S ribosomal gene of Piscirickettsia salmonis, by means of a restriction endonuclease or some of its isosquizers which are nominated in the lower zone of each Pattern in blue color. Nucleotide recognition sequences are also shown. used for digestion by restriction enzymes in the upper zone of each pattern in red.
  • Each pattern is accompanied by a size standard (with units of 100 nucleotides) that allows estimating the band sizes of each generated pattern.
  • FIG. 3 The experimental validation of the five digestion patterns is observed, which allow Piscirickettsia salmonis to be distinguished from the rest of the bacteria used as an example.
  • Each pattern is formed by the digestion of the PCR amplification product (with 27F and 1492R universal splitters) of the ribosomal 16S gene of Piscirickettsia. salmonis and the other bacterial genera in question, by means of a restriction endonuclease or some of its ischysomers of the groups indicated in table 1, which are nominated in the lower zone of each pattern in blue, at Left gives each electrophoresis image.
  • Figure 4A — 4D Characterization and detection of Piscirickettsia salmonis by traditional techniques.
  • Figure 4A Gram staining of Piscirickettsia salmonis cells
  • White bar 1.25 ym (a) and colony morphology.
  • Black bar : : 1.25 cm (b).
  • Figure 4B IFAT assay of exponentially growing Piscirickettsia salmonis cells observed by confocal microscopy, in blue, DAPI staining that marks genetic material (a); in green, the fluorescence associated with the immunodetection antibody of Piscirickettsia salmonis (b) and in celestial overlapping of the previous signals (c)
  • White bar 2.5 ⁇ .
  • Figure 4C 2% agarose gel electrophoresis.
  • Figure 4D qPCR reaction curves using Psl6SRNA-Fl / Psl6SRNA-R splitters in reactions containing or not containing Pisc ⁇ rickettsia salmonis AD as substrate: (left) amplification curve and (right) fusion curve.
  • Figure 5A — 5C Nested PCR amplification and ITS-PCR assay. 2% agarose gel electrophoresis of (A) PCR Nested of 16S ribosomal DNA amplification (Ps2s / PsAs splitters), Figure 5A, (B) ITS-PCR using RTS1 / RTS2 splitters, Figure 5B and (C) ITS-PCR using RTS1 / RTS4 splitters, Figure 5C:
  • Figure 6A — 6B Mixed sample test. Pisirickettsia salmonis and Vibrio anguillarum (in the same growth state) were mixed with. different proportions: 100/0, 75/25, 50/50, 25/75 and 0/100 of Piscirickettsia salmonis / Vibrio anauillarum v subjected to Gram staining. Bar corresponds to 1.25 ⁇ im ( Figure 6A). After dell6S rDNA amplification of the mixed samples and digestion with the restriction enzyme Pmll the resulting PCR-RFLP digestion pattern was examined by electrophoresis using ScreenTape DNA on the Tape Station 2200 instrument ( Figure 6B): (lane 1) ladder lOObp plus
  • Figure 7 Test of samples of different tissues and different stages of infection. DNA extracted from fish tissues infected with Piscirickettsia salmonis was used to amplify 16S rDNA and perform PCR-RFLP assays. "Early” represents early stages of infection in farmed fish in which no symptoms of the disease are observed. "Afternoon” represents late stages of infection in farmed fish that manifest the symptoms of the disease. (A) PCR amplification of the 60S rDNA gene
  • Figure 8 Sensitivity tests.
  • amplicons of 16S rRNA Piscirickettsia salmonis (lane 1) ladder lOObp plus (Thermo scientific); (lane 2) 500ng PCR product; (lane 3) 250 ng PCR product; (lane 4) 125 ng PCR product; (lane 5) 62.5 ng PCR product; (lane 6) 31.25 ng PCR product. (Down) . Enzymatic digestion with Pmll of correlated classified PCR products with panel A.
  • Figure 9 Gram staining and IFAT assays for P. salmonis and cohabitant bacteria.
  • A Microcript ⁇ .a. of bacteria after Gram staining. The white bar represents a 1.25 Hm.
  • B Images by confocal microscopy of bacteria stained with DAPI (DNA marker) and with anti-P antibody. salmonis (Bios Group). The series of images below represent the images composed of B and C, in which the light blue color represents the presence of genetic material and immunodetection for each bacterium. The bar corresponds to 2.5 Dm.
  • the solution proposed herein refers to a method of amplification of the 16S ribosomal gene shared by all the bacteria present in a sample, and the subsequent digestion of the amplified mediating restriction enzymes (PCR-RFLP) that recognize specific nucleotides and positions individuals of the 16S rDNA gene of Piscirickettsia salmonis.
  • This digestion product can be visualized in an electrophoresis, which allows to identify the specific and characteristic digestion pattern of Piscirickettsia salmonis.
  • the presence of a different electrophoretic pattern or bands than those of the Piscirickettsia salmonis pattern in the sample indicates the presence of other bacteria (s) in the sample.
  • the methodology is fast, highly specific, low cost and as sensitive as the PCR assay currently in use.
  • restriction enzyme groups are revealed, each group associated with a specific digestion band pattern.
  • the restriction enzyme groups are, according to the digestion band pattern, the following: Group 1: Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l and PspCI; Group 2. BspCNI and BseMII; Group 3: TspEI, MluCI, Sse9l, TasI and Tsp509l; Group 4: Bfal, FspBI, XspI and Mael; and Group 5: Ddel, BstDEI and HpyF3l.
  • the present method allows the individual or combined use of the restriction enzymes that generate the above-mentioned digestion band patterns.
  • the method of the present invention is distinguished from what exists for its high specificity of detection of Piscirickettsia salmonis, which prevents the generation of false positives, improving the diagnostic capacity and the possibility of monitoring cultures of Piscirickettsia salmonis certifying its purity, both in microbiological media as in cultures in host cells.
  • the present invention consists in the extraction of genomic DNA, from either salmon infected tissue from a cell culture infected with Piscirickettsia salmonis or from Piscirickettsia salmonis growing in an artificial medium in. a bacterial culture Then, a polymerase chain reaction (PCR) protocol is performed to amplify a region of the genome of any bacteria present in.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR product thus obtained is enzymatically digested by an enzyme belonging to one of the 5 groups of enzymes of which are indicated in the table For example, if
  • Piscirickettsia salmonis is the only bacterium present in the sample, the Pmll enzyme produces 3 cuts and 4 bands in an elect roforesis in agarose or acrylamide gels, see Figure 2. This pattern is characteristic of Piscirickettsia saimonis and allows in a protocol of no more than 3 hours to determine its identity and purity in a sample.
  • the broth contains casein peptone 17.0 g / 1, soybean peptone 3.0 g / 1, D (+) glucose 2.5 g / 1, NaCl 20.0 g / 1, dipotassium monoacid phosphate 2 , 5 g / 1 (Broth A), which was supplemented with 0.1% L-Cys, 2.5% SBF, 10 mg / 1 FeCl3, 15 g / 1 NaCl.
  • the cultures were incubated at 17 ° C with gentle agitation.
  • the Broth was used to generate solid culture media, with 15 g / 1 agar agar and 15 g / 1 NaCl was autoclaved and supplemented with 1 g / 1 L-Cys, FeCl 3 20 mg / 1, SBF 5%. The cultures were incubated at 17 ° C for 12 days.).
  • Example 2 Obtaining environmental bacterial isolates from fish and laboratory environment.
  • Samples of Atlantic salmon tissues were obtained directly from the salmon cage ⁇ Salmo salar). Samples of heart, kidneys and gills were taken, which were gently rubbed on the glass sheets (slides), and grown in solid growth medium for 5 days at 18 ° C. Additionally, four environmental bacterial contaminants were obtained by exposing flasks with liquid culture medium for 24 hours to the laboratory environment. Samples of this medium were also grown in solid medium for 5 days at 18 ° C. All isolated samples were grown in the same medium and the growth conditions described above.
  • Example 3 Extraction of AD and amplification of 16S rAD Bacteria DNA was purified from 1 mL of exponentially growing OD600 culture: ⁇ 0, 5 or from infected tissue samples ⁇ 20 mg) using the DNeasy Blood & Tissue kit Quiagen, among others. In the case of bacterial culture samples they were centrifuged 10 min. at 8,000 rpm and the supernatant was discarded, and for the tissue samples the standard protocol recommended by the manufacturer was used. 16S rDNA was amplified by PCR with universal splitters 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'.
  • PCR amplifications were conducted in 25 ⁇ i volume containing 200 " g of bacterial DNA ( ⁇ 4 uL) and 20 uL of amplification cocktail, which contained the following components: 12.5] iL of GoTaq mix Promega, 5 , 5 u of water-free nuclease and 1 ⁇ i in progressive or inverse splitters at 10 mM of each concentration, final PCR amplification was performed on a cyclic thermal controller MJ reasercn, Inc. Samples were incubated for 10 min at 95 2 C to denature the DNA amplification was performed in 30 cycles of 95 2 C for 60 sec., 58 ° C for 30 sec. And 72 ° C for 60 sec.
  • Example 4 Restriction analysis of 16S amplified rDNA Five microliters (of each amplified PCR product was digested with restriction endonucleases for 30 min at 37 ° C The restriction fragments were fractionated on a 2% w / v agarose gel stained with ethidium bromide and photographed, the fragment lengths of They were estimated to compare them with the standard DNA lOObp Plus DNA Ladder, Thermo Scientific O'GeneRuler TM (SM1153).
  • Restriction fragments were also analyzed at Tape Station 2200, Agilent Technologies using Genomic DNA Screen Tape, Agilent Kit plus genomic DNA reagents as directed by the manufacturer.
  • the nucleotide sequence of the 16S rDNA fragment sequenced from our isolates of Piscirickettsia salmónis was used to validate its identity and select 16S rDNA genes of this genus from the ribosomal DNA databases SILVA, RDP and GreenGenes. These sequences were subsequently aligned, identifying conserved regions and variables comparing all selected sequences. From this information, all restriction enzymes that cut all 16S rDNA sequences from Pisciri ckettsia were selected.
  • the selected restriction enzymes were used to generate the cut patterns of all 16s rDNA sequences (from the complete SILVA, RDP and GreenGenes ribosomal DNA databases) that were susceptible to being digested by them. This analysis compared, it allowed us to identify a subgroup of restriction enzymes (Table 1) that generate an exclusive digestion pattern for Pyscirickettsia salmonis that allows this bacterium to be distinguished from all other bacteria analyzed.
  • the bacteria Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, Shewanella frigidimarina, Photobacterium phosphoreum, Psychrobacter sp, Arthrobacter sp, Staphylococcus saprophyticus abacteriumum, Microbacterium abacteriumum, which were Microbacterium DNA was extracted from them, the 16S ribosomal gene was amplified with universal cleaners, digested with the restriction enzymes of the groups indicated in Table 1 and visualized on 2% agarose gels, as previously described.
  • Example 6 Quantitative Nested PCR and Taqman probe assays: Nested PCR tests were performed using the method and starting points described in Mauel et al. 2006 using Ps2s 5 'CTA GGA GAT GAG CCC GCG TTG 3' and PsAs 5 'GCT ACA CCT GCG AAA CCA CTT 3' in thermal cycle controller from MJ Research, Inc. Samples were denatured at 95 ° C for 5 min , and then, in 30 cycles it was driven at 95 ° C for 1 min, 60 ° C for 30 sec and 72 ° C for 2 min.
  • the PCR reaction was conducted in 25 L of final reaction containing 2 ⁇ L of the 16S amplification PCR product described above, 12.5 iL of GoTaq, 8.5 iL nuclease free of water and 1 yi of each splitter.
  • the qPCR assay was performed using the 16SRNA-F15 'AGG GAG ACT GCC GGT GAT A 3' and 16SRNA-R5 'ACT ACG AGG CGC TTT CTC A 3' splitters described by Karatas, S. et al. Real time PCR detection of Piscirickettsia salmonis from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. J. Fish Dis. 31, 747-53 2008. The reaction was performed in a final volume of 10 pL containing 50 ng of gD A and each splitter at 10 mM final concentration using the Light Cycler Syber Green kit, Roche.
  • the amplification conditions were: 10 min at 95 ° C, followed by 30 amplification cycles of 95 ° C for 10 sec, 55 ° C for 15 sec and an extension at 72 ° C for 10 sec.
  • the tests with the TaqMan probe were performed as described in. Corbeil, S., et al 2003. Development of a TaqMan quantitative PCR assay for the Identification of Piscirickettsia salmonis. Bulletin of the European Associat ion. of Fish Pathologists 23: 95-101.
  • the splitter used was F-760 5 'TCT GGG AAG TGT GGC GAT AGA 3' and R-836 5 'TCC CGA CCT ACT CTT GTT TCA TC 3' and 6- carboxy fluorescein 6FAM and 6-carboxytetramethylrodamine TAMRA, probe labeled PS23S: 6FAM-TGA TAG CCC CGT ACA CGA AAC GGC ATA-TAMRA. All reactions were conducted in the same thermal cycler according to other qPCR reactions. For each reaction, the splitters were used according to the recommended concentrations: 900 nM of each splitter and 250 nM of each 23S FAM probe. The cycle conditions were as follows: 50 ° C for 2 min, 95 ° C for 10 min, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 min.
  • Example 7 Gram staining, fluorophore and IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test:
  • IFAT was carried out according to the recommendations of the manufacturer SRS-Fuorotest indirect, GrupoBios, with some modifications as indicated below. 20 uL were allowed to dry at room temperature. Afterwards, the samples were fixed with stopping ormaldehyde diluted in 4% PBS for 10 min followed by three washes with sterile PBS solution.
  • Example 8 Infection of fish and PCR-RFLP from infected fish tissues in culture centers:
  • Tissue samples were intestine, spleen, liver, kidney and brain. A portion of tissue was cut to obtain the sample ( ⁇ 20 mg) of tissue, which was aseptically nomogenized into small pieces to proceed with DNA extraction as described above. PCR amplification of the 16S rDNA gene and subsequent enzymatic digestion described above was performed for each tissue sample.
  • Example 9 Piscirickettsia salmonis detection:
  • Fig. 4 shows the bacterial growth curve, starting with an inoculum medium of OD600-0.05.
  • the exponential phase takes place between days two and seven as previously reported by Figueroa et al. 2012.
  • the referred techniques described for this purpose were tested: microscopic visualization of the Fryer, JL, Lannan, C., Giovannoni, SJ & Wood, ND Piscirickettsia salmonis gen. nov., sp. nov., the causative agent of an epizootic disease in salmonid fishes. Int. J. Syst. Bacterium! 42, 120-6 1992 .; Lannan, C. N.
  • Fig. 4C corresponds to an agarose gel electrophoresis of the amplification product obtained using the universal splitters of the bacterial 16S gene (27F and 1492R) and the Nested-PCR with the PsAs and Ps2s splitters described in Mauel et al. 1996, identifies a 1547 bp fragment and a 469 bp fragment, respectively as described by the authors.
  • Fig. 4C corresponds to an agarose gel electrophoresis of the amplification product obtained using the universal splitters of the bacterial 16S gene (27F and 1492R) and the Nested-PCR with the PsAs and Ps2s splitters described in Mauel et al. 1996, identifies a 1547 bp fragment and a 469 bp fragment, respectively as described by the authors.
  • Fig. 4C corresponds to an agarose gel electrophoresis of the amplification product obtained using the universal splitters of the bacterial 16S gene (27F and 14
  • 5D shows the amplification and fusion curves of qPCR reactions containing or not containing Piscirickettsia salmónis AD as a substrate using Psl6Sreal-Fl / Psl6Sreal-R Karatas, S. et al. Real time PCR detection. of Piscirickettsia salmonis from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. J. Fish Dis. 31, 747-53 2008. The amplification of Piscirickettsia salmonis is initiated in cycle 10.59, and the analysis of the fusion curve shows a unique peak for the bacterium.
  • Example 10 Classifications of bacterial and phylogenetic strains:
  • Table 2 Strains used. Twelve strains were identified according to the best match obtained when searching for
  • Ribosomal Datábase Pro ect RDP Sequence identity score between 0 and 1.
  • Table. 3 Quantitative PCR-based assays, qPCR based on 16SRNA-F1 / 16SRNA-R Karatas, S. et al. Real time PCR detection of Piscirickettsia salmonis from formalin-fixed paraffin-embedded tissues, J. Fish Dis. 31, 747-53 2008. Ct amplification cycle, Tm fusion temperature, EGC equivalent genome copies and status of the samples obtained for each test during amplification. of 16S ribosomal DNA from each bacterium obtained during amplification of 16S ribosomal DNA. *
  • Example 12 A Application in sample infected with
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, Pmll .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the first pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is a 100% match, then the presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • Example 12 B Application in a sample infected by a pathogen other than Piscirickettsia salmonis
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, Pmll .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the first pattern in Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, not having a 100% match, then it is confirmed that there is no presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • Example 12 C Application in infected sample treated with a restriction enzyme that does not allow to discriminate against Piscirickettsia salmonis from other bacteria causing the infection.
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, Taql .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the first pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, not having a 100% match, so it is not possible to determine with which pathogen the sample is infected because it is not a unique pattern is available since the enzyme shows the electrophoretic bands of the bp indicated in table 4 below: Table 4
  • Example 13 Example of group application
  • Example 13 A Application in sample infected with Piscirickettsia salmonis
  • At least 200 mg of tissue is obtained from the infected specimen, subsequently the extraction of bacterial DNA from the tissue sample is performed using conventional techniques and according to the instructions of the manufacturer of the kit to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, BspCNI .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the second pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is a 100% match, then the presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • Example 13B Application in sample infected by a
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, BspCNI .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the second pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is no 100% match, so it is confirmed that There is no presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • Example 13C Application in infected sample treated with a restriction enzyme that does not allow to discriminate against Piscirickettsia salmonis from other bacteria causing the infection.
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using the 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3' splitters, the product is digested using the restriction enzyme, Rsal .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the second pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, not having a 100% match, so it is not possible to determine with which pathogen is infected because the sample does not have a unique pattern since the enzyme shows the electrophoretic bands of the bp indicated in table 5 below: Table 5
  • Example 14 Group III application example
  • Example 14A Application in a sample infected with Piscirickettsia salmonis
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, SSe9l .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the third pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is a 100% match, then the presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • the pattern shows electrophoretic bands of 419 bp, 334 bp, 245 bp, 119 bp, 116 92 bp, 82 bp, 46 bp, 40 bp and 16 bp.
  • Example 14B Application in sample infected by pathogen other than Piscirickettsia salmonis
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, Sse9l .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the third pattern in Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is no 100% match, so it is confirmed that There is no presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • Example 14C Application in infected sample treated with a restriction enzyme that does not allow to discriminate against Piscirickettsia salmonis from other bacteria causing the infection. At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry. The DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, Smll .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the third pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, not having a 100% match, so it is not possible to determine with which pathogen is infected because the sample does not have a unique pattern since the enzyme shows the electrophoretic bands of the bp indicated in table 6 below: Table 6
  • Example 15 Example application group IV
  • Example 15A Application in sample infected with
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', the product is digested using the restriction enzyme, XspI .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the fourth pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is a 100% match, then the presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • the pattern shows electrophoretic bands of 403 bp, 326 bp, 195 bp, 175 bp, 135 bp, 95 bp, 74 bp, 71 bp, 27 bp and 8 bp.
  • Example 15B Application in a sample infected by a pathogen other than Piscirickettsia salmonis
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3 ", the product is digested using the restriction enzyme, XspI
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the fourth pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is no 100% match, then, it is confirmed that there is no presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • Example 15C Application in infected sample treated with a restriction enzyme that does not allow to discriminate against Piscirickettsia salmonis from other bacteria causing the infection.
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3 ", the product is digested using the restriction enzyme, Bael
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the fourth pattern in Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, not having a 100% match, so it is not possible to determine with which pathogen the sample is infected because a unique pattern is not available since the enzyme shows the electrophoretic bands in the bp indicated in table 7 below:
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3 ", the product is digested using the restriction enzyme, Ddel
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product it is compared with a DNA standard (ladder) and with the fifth pattern of Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is a 100% match, then the presence of Piscirickettsia salmonis is confirmed in the sample.
  • the pattern shows electrophoretic bands of 337 bp, 245 bp, 231 bp, 163 bp, 161 bp, 138 bp, 97 bp, 83 bp, 38 bp and 16 bp.
  • Example 16 B Application in a sample infected by a pathogen other than Piscirickettsia salmonis (Aeromonas salmonicida)
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • the DNA extracted is amplified by PCR using 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3 ", the product is digested using the restriction enzyme, Ddel
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the fifth pattern in Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, and there is no 100% match, then, it is confirmed that there is no presence of Piscirickettsia salmonis, in the sample.
  • Example 16C Infected sample treated with a restriction enzyme that does not allow to discriminate against Piscirickettsia salmonis from other bacteria causing the infection.
  • At least 200 mg of tissue are obtained from the infected specimen, subsequently the bacterial DNA is extracted from the tissue sample using conventional techniques and according to the instructions of the kit manufacturer to use. Then, the purity of the total bacterial DNA isolated is verified using conventional techniques, for example, spectrophotometry.
  • Amplification of the DNA extracted by PCR is performed using the 27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' and 1492R 5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3' splitters, the product is digested using the restriction enzyme, Smal .
  • the electrophoretic bands or digestion pattern of the product is compared with a DNA standard (ladder) and with the fourth pattern in Figure 2 that is characteristic of Piscirickettsia salmonis, not having a 100% match, so it is not possible to determine with which pathogen is infected the sample because a pattern is not available unique since the enzyme shows the electrophoretic bands of the bp indicated in table 8 below: Table 8
  • Piscirickettsia Salmonis is an important etiological agent for a fish disease that produces great economic losses for the salmon industry. For this reason, several efforts have been made to develop epidemiological control for this bacterium responsible for SRS syndrome.
  • the present method allows to certify and identify samples of the pure culture of Piscirickettsia salmonis and also. its identification in infected tissues. This method also improves the specificity of the other techniques tested in a simple and fast way. It is possible to differentiate between all the bacteria that present the greatest change when cohabiting with Piscirickettsia salmonis.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método rápido, sensible, específico, reproducible y de bajo costo para la identificación y determinación de pureza de la bacteria Piscirickettsia salmonis. Este método es un método basado en PCR-RFLP (Completar) para identificar Piscirickettsia salmonis y también establecer si una muestra de Piscirickettsia salmonis (un cultivo bacteriano, por ejemplo) está pura o contaminada con otras bacterias que podrían cohabitar con Piscirickettsia salmonis. Así, este método podría ser establecido en laboratorios a lo largo del mundo como una tecnología estándar para monitorear cultivos bacterianos y para tecnologías de control epidemiológico de Piscirickettsia salmonis. La presente invención también protege un kit para identificar y determinar pureza de Piscirickettsia salmonis.

Description

Método basado en PCR-RFLP para identificar y determinar pureza de Piscirickettsia salmonis .
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a un método rápido, sensible, especifico, reproducible y de bajo costo para la identificación y determinación de pureza de la bacteria Piscirickettsia salmonis . Este método es un método basado en PCR-RFLP (Completar) para identificar Piscirickettsia salmonis y también establecer si una muestra de Piscirickettsia salmonis (un cultivo bacteriano, por ejemplo) está pura o contaminada con otras bacterias que podrían cohabitar con Piscirickettsia salmonis . Así, este método podría ser establecido en laboratorios a lo largo del mundo como una tecnología estándar para monitorear cultivos bacterianos y para tecnologías de control epidemiológico de Piscirickettsia salmonis . La presente invención también protege un kit para identificar y determinar pureza de Piscirickettsia salmonis .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Piscirickettsia salmonis es el agente etiológico de Septicemia Rickettsial de Salmónido (SRS) , una enfermedad que presenta alta tasas de mortalidad que alcanzan 30-90% en salmones de cultivo en Chile. Aunque hay disponibles varias técnicas para detección e identificación de Piscirickettsia salmonis que implican técnicas de microbiología clásica, microscopía y métodos basados en PCR, ninguna de ellas permite establecer, de manera especifica, la identidad y la pureza de Piscirickettsia salmonis en medios de cultivos y/o en muestras de tejido. La SRS es una enfermedad que se extiende a lo largo de los lugares de cultivo de salmones, dando cuenta del 1-20% y hasta el 40% de la mortalidad mensual de la producción total de peces de cultivo en Chile (Cvitanich J.D. et al. 1991. The Isolation of Rickettsia-like organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch' s postúlate. J. Fish Dis. 14: 121- 145) . Su agente etiológico es Piscirickettsia salmonis, patógeno intracelular de peces, gram-negativo, no móvil, siempre pleomorfico pero predominantemente cocoide (Fryer, J. L., Lannan, C. N., Giovannoni, S. J. & Wood, N. D. Piscirickettsia salmonis gen. nov., sp . nov., the causative agent of an epizootic disease in salmonid fishes. Int. J. Syst . Bacteriol. 42, 120-6 (1992) . La enfermedad causa importantes pérdidas mundiales (Mauel, M. J. & Miller, D. L. Piscirickettsiosis and piscirickettsiosis-like infections in fish: a review. Vet . Microbiol. 87, 279-89 (2002) .; Cvitanich J.D. et al. 1991. The Isolation of Rickettsia-like organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch' s postúlate. J. Fish Dis. 14: 121-145) y su presencia ha sido informada globalmente. (Olsen et al. 1997; Rodger, H.D.; E.M. Drinan. 1993. Observation of a rickettsialike organism in Atlantic salmón, Salmo salar, L., in Ireland. J. Fish Dis. 16: 361- 369; Birrell et al. 2003; Corbeil, S., Hyatt, A. D. & Crane, M. S. J. Characterisation of an emerging rickettsia- like organism in Tasmanian farmed Atlantic salmón Salmo salar. Dis. Aquat . Organ. 64, 37-44 (2005); Cusack, R. R., Groman, D. B. & Jones, S. R. M. Rickettsial infection in farmed Atlantic salmón in eastern Canadá. Can. Vet . J. 43, 435-40 (2002) ; Brocklebank JR, Speare DJ, Armstrong RD, Evelyn TPT (1992) Septicemia suspected to be caused by a rickettsialike agent in farmed Atlantic salmón. Can Vet J 33 : 407-408) .
Asi, la bacteria Piscirickettsia salmonis es el patógeno más importante para la industria del salmón, con mermas económicas de más de US$200 millones/año. Por esta razón, la mayoría de los países con una actividad importante en esta industria, han normado su seguimiento.
Las características facultativas y no intracelularmente estrictas de Piscirickettsia salmonis (Cvitanich J.D. et al. 1991. The Isolation of Rickett sia-like organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch' s postúlate. J. Fish Dis. 14: 121-145; F Gómez, V Henríquez, S. M. Additional evidence of the facultative intracellular nature of the fish bacterial Evidencia adicional de la naturaleza intracelular facultativa del patógeno bacteriano de peces Piscirickettsia salmonis. Arch. Med. Vet. 267, 261-267 (2009) ; F Gómez, V Henríquez, S. M. Additional evidence of the facultative intracellular nature of the fish bacterial Evidencia adicional de la naturaleza intracelular facultativa del patógeno bacteriano de peces Piscirickettsia salmonis. Aren. Med. Vet . 267, 261-267
(2009)) permitieron el diseño de algunos medios de cultivo nutritivos que permiten crecer las bacterias en altas concentraciones después de 10-12 días de crecimiento a 18°C. Sin embargo, no hay medios de cultivo selectivos para crecer Piscirickettsia salmonis, tornando la contaminación con otras bacterias uno de los problemas principales
(Figueroa et al. 2012) .
Para detectar la presencia del patógeno, varios métodos se han desarrollado, incluyendo PCRs cuantitativos (Karatas, S. et al. Real time PCR detection of Piscirickettsia salmonis from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. J. Fish Dis. 31, 747-53 (2008)), Nested PCR (Mauel, M. J.; Giovannoni, S. J.; Fryer, J. L. 1996. Development of polymerase chain reaction assays for detection and differentiation of Piscirickettsia salmonis. Dis. Aquat . Org. 26: 189-195) y una prueba de anticuerpo de fluorescencia indirecta (Lannan, C. N., Ewing, S. a. & Fryer, J. L. A Fluorescent Antibody Test for Detection of the Rickettsia Causing Disease in Chilean Salmonids. J. Aquat. Anim. Health 3, 229-234 (1991)) y una prueba de anticuerpo de fluorescencia indirecta (IFAT) (Lannan, C. N., Ewing, S. a. & Fryer, J. L. A Fluorescent Antibody Test for Detection of the Rickettsia Causing Disease in Chilean Salmonids. J. Aquat . Anim. Health 3, 229-234 (1991)), que permiten detectar Piscirickettsia salmonis en muestras de tejidos y en medios de cultivo pero ninguno de ellos puede garantizar su pureza.
Los principales métodos que hoy se utilizan para la detección de Piscirickettsia salmonis, se basan en PCR e inmunodetección (IFAT), sin embargo, ellos no son suficientemente específicos y generan resultados positivos para otras bacterias patógenas de peces y contaminantes ambientales. Así, estos métodos son inútiles para definir la causa final de la mortalidad y para evaluar la pureza de los cultivos de Piscirickettsia salmonis, una característica necesaria para el diseño de vacunas. El método de la presente invención (PCR-RFLP, Reacción en Cadena de Polimerasa de Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica) beneficia directamente a la industria acuícola y a la industria veterinaria de producción de soluciones contra la infección Piscirickettsia salmonis (SRS) .
En el arte previo, se describen diversos métodos que utilizan las técnicas PCR y PCR-RFLP con diversos propósitos, por ejemplo, discriminar genes específicos en organismos marinos, identificar especies, entre otras. A continuación, se refieren algunas de dichas publicaciones: La publicación CN103923972 revela un método basado en PCR- RFLP que discrimina el gen COI de 17 pepinos marinos {Stichopodidae) . Asi, a partir de muestras de ADN de la especie, se establece un molde, y utilizando los cebadores COIE-F: 5 ' -ATAATGATAGGAGGRTTTGG-3 ' , COIE-R: 5-
GCTCGTGTRTCTACRTCCAT-3 ' PCR ' se amplifica un fragmento del gen COI, luego se realiza la digestión enzimática del fragmento de COI usando la endonucleasa de restricción Ddel/SFCI o BstNI / Sau3AI , para luego realizar la electroforesis del producto de digestión obtenido. Posteriormente, se estima el tamaño de cada una de las bandas resultantes de la electroforesis de las muestras, contrastando número y tamaño de ellas con los espectros de bandas de referencia de los diecisiete pepinos de mar. El método tiene amplia aplicación, es simple de operar, y realiza una detección precisa y rápida, y es especialmente adecuado para identificar un gran número de pepinos de mar de productos básicos, por lo que puede asistir en la normalización del mercado de materias primas de pepinos de mar y la protección de estos recursos.
CN103525933 divulga un método de PCR-RFLP para distinguir Ctenopharyngodon idellus de Mylopharyngodon piceus, y usando marcadores moleculares específicos da a conocer un fragmento de ADN para distinguir entre estas dos especies. El método comprende un grupo de cebadores y la amplificación, de un fragmento del gen citocromo b de longitud de 1140bp de Ctenopharyngodon idellus y Mylopharyngodon piceus. El producto de PCR, se somete a digestión enzimática mediante el uso de la endonucleasa de restricción BglI. El pez es Ctenopharyngodon idellus, si dos bandas aparecen en el patrón de electroforesis y es Mylopharyngodon piceus, si una banda aparece en el patrón de electroforesis . Por lo tanto, las especies se pueden identificar con precisión y rapidez en función del cambio en el patrón de restricción del producto de amplificación. La invención de CN103436612, describe un método PCR-RFLP para la detección rápida de esturiones comunes. El método comprende la extracción de ADN del genoma de una muestra que se usa luego como plantilla, se realiza la reacción de amplificación de PCR y luego se realiza la digestión enzimática de este producto usando enzimas de restricción. El producto de digestión se, somete a un fraccionamiento mediante electroforesis en geles de agarosa y la identificación de especies se realiza de acuerdo a las diferencias observadas en el electroferograma . El método proporcionado por la invención es simple de operar, rápido y preciso, permitiendo la identificación de alevines de peces de esturiones comunes.
La invención de CN103290131 describe un par de cebadores (directo e inverso) y un kit para distinguir a los peces Channa argus y Channa maculata. El kit que contiene el par de cebadores y también comprende un reactivo de PCR convencional, una Taq polimerasa tampones, dNTPs (desoxiribonucleótidos de trifosfato) , un reactivo de digestión, un tampón de digestión y una enzima restricción EcoRI . El método descrito por la invención es simple de operar, sólo tiene que cortar una pequeña muestra de la aleta o músculos, garantizando la supervivencia de los peces, siendo este rápido y preciso.
La invención de CN101724690, describe un método para la detección de polimorfismo en la flora del agua de cultivo de gambas a partir de ADN genómico de microbios mezclados en una muestra del agua para el cultivo de gambas y diseñando un cebador universal T-RFLP-PCR se realiza la reacción PCR. Se purifica el producto y se realiza el corte enzimático del ADN mediante la enzima de restricción especifica Hae III, luego se separan los segmentos de ADN en un gel de agarosa al 1%, realizando el escaneo fluorescente en los segmentos de ADN. Luego de analizar la estructura de polimorfismo de la flora microbiana, se realiza la detección cuantitativa de las bacterias predominantes por medio de fluorescencia en una tecnología de hibridación in situ. El método es altamente reproducible, sensible, rápido, preciso y estable, y permite el análisis cualitativo y cuantitativo de la diversidad ecológica de microbios en un cuerpo de agua de cultivo de gambas. US2008305484 enseña la identificación especifica de una especie de Campylobacter que no cuenta con ensayos bioquímicos adecuados para su diferenciación. Se estudian doce especies de Campylobacter en base a la secuencia parcial (1.020 pb) del gen gyrB (gen subunidad beta ADN topoisomerasa) , siendo la topología del árbol filogenético resultante basado en el gen gyrB fue similar a la topología de un árbol filogenético informado anteriormente basado en el gen 16S rADN . Sin embargo, el gen gyrB ofrece una mejor resolución que el gen 16S rADN para especies de Campylobacter con similitudes de secuencia entre especies que van desde 58,3 hasta 89,2%. Se diseñó un conjunto de cebadores universales para amplificar un fragmento de 960 pb del gen gyrB de Campylobacter spp . , el que se usó para el PCR-RFLP de 19 cepas que representan las doce especies de Campylobacter, incluyendo C. jejuni subsp jejuni, C. col!, C. concisus, C. curvus, C. showae, C. mucosalis, C. fetuSf C. hyointestinalis, C. sputorum biovar sputorum, C. helveticuSf C. upsaliensis y C. lar!. La digestión enzimática del fragmento de 960 pb se realizó con la enzima de restricción Ddel, XspI, o la combinación de Mbol y HindIII, como una doble digestión, lo que resultó en patrones de digestión únicos para las doce especies de Campylobacter . Se usaron también conjuntos de cebadores específicos para la amplificación de las regiones del gen gyrB específicos para cada especie Campylobacter, produciendo productos que variaron entre 86 y 493 pb en tamaño. Se demostró que los conjuntos de cebadores específicos de especies de Campylobacter eran altamente específicos. El método es rápido e identifica en forma inequívoca de la mayoría de especies de Campylobacter .
ES2161135 describe la identificación de Auxis thazard en conservas de pescado, mediante la amplificación de un fragmento de 187 pb (BDR) del gen de citocromo b del ADN mitocondrial , usando además una endonucleasa de restricción. Lo que facilita la diferenciación con respecto a otras especies utilizadas como sustitutos de Auxis thazard mediante PCR-RFLP .
En tanto, la solución propuesta en este caso se refiere a un método de amplificación de un fragmento del gen 16S ribosomal bacteriano (16S rADN) , compartido por todas las bacterias, a través del uso de partidores universales, y la posterior digestión del amplificado mediantes enzimas de restricción (PCR-RFLP) que reconocen nucleótidos específicos y en posiciones particulares del 16S rADN de Piscirickettsia salmonis . Este producto de digestión puede ser visualizado en una electroforesis , lo que permite identificar el patrón de digestión específico y característico de Piscirickettsia salmonis . La presencia de un patrón o bandas electroforáticas distintas a las del patrón de Piscirickettsia salmonis indican la presencia de otras bacterias en la muestra. La metodología es rápida, altamente específica, de bajo costo y tanto o más sensible que los ensayos de detección actualmente en uso.
Se revelan 5 grupos de enzimas de restricción, cada grupo asociado un patrón de banda de digestión específico, esto es 5 grupos de isoesquizómeros . Los grupos de enzimas de restricción, son según el patrón de banda de digestión, los siguientes: Grupo 1: Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l y PspCI; Grupo 2. BspCNI y BseMII; Grupo 3: TspEI, MluCI, Sse9l, TasI y Tsp509l; Grupo 4: Bfal, FspBI,XspI y Mael; y Grupo 5: Ddel, BstDEI y HpyF3l.
El presente método permite el uso individual o combinado de las enzimas de restricción que generan los patrones de banda de digestión antes mencionados.
La presente invención ha sido probada en condiciones de controladas de laboratorio para cultivos microbiológicos de Piscirickettsia salmonis y en muestras de campo, esto es, en tejidos de peces de cultivo infectados con Piscirickettsia. sa1moni s .
Existen técnicas para detectar Piscirickettsia salmonis, pero con baja especificidad, generando falsos positivos. Para la determinación de pureza en cultivos o en tejidos de peces se utilizan técnicas microbiológicas clásicas como la tinción de Gram, pero esta carece de especificidad para Piscirickettsia. salmonis . El método de la presente invención se distingue de lo que existe por su alta especificidad para la detección de Piscirickettsia salmonis lo cual evita la generación de falsos positivos, rué "j orarulo la capacidad de diagnóstico y la posibilidad de monitorear cultivos de Piscirickettsia salmonis certificando su pureza.
El presente método es un método basado en PCR-RFLP para identificar Piscirickettsia salmonis y también establecer si la muestra es pura o contaminada con otros patógenos o bacterias ambientales que podrían cohabitar con Piscirickettsia salmonis . Así, este método podría ser establecido en laboratorios a lo largo del mundo como una tecnología estándar para monitorear cultivos bacterianos y para tecnologías de control epidemiológico de Piscirickettsia salmonis .
Breve Descripción de la Invención
La presente invención se refiere aun un método reproducible, rápido, específico y de bajo costo para la identificación y determinación de pureza de Piscirickettsia salmonis . El presente método se basa en técnicas PCR-RFLP para identificar Piscirickettsia salmonis, y también establecer, si la muestra es pura o está contaminada con otros patógenos o bacterias ambientales que podrían cohabitar con Piscirickettsia salmonis . La presente invención también protege un kit para identificar y determinar pureza de Piscirickettsia salmonis .
Una comparación de las secuencias del gen 16S rAD de Piscirickettsia salmonis con las secuencias de los genes 16S rADNs de otras bacterias patogénicas y ambientales de peces, asi como contaminantes bacterianos que crecen en los medios de cultivo de Píscirickettsía salmonis, reveló la presencia nucleótidos específicos y en posiciones particulares del 16S rADN de Piscirickettsia salmonis . Este análisis se complementó con la comparación de las secuencias del gen 16S rADN de todos las bacterias presentes en las bases de datos públicas SILVA, RDP, Greengenes y NCBI .
Tras la obtención de estas secuencias, se realizó un alineamiento para la búsqueda ele nucleótidos 100% conservados en el género Piscirickettsia, y posteriormente, se contrastaron estos nucleótidos contra los genes 16S rADNs de otras bacterias para confirmar cuales de estos son únicos para el género. Con esta información se procedió a seleccionar enzimas de restricción que reconocen específicamente las secuencias particulares identificadas en el gen 16S rADN de Piscirickettsia salmonis . Luego las enzimas seleccionadas fueron agrupadas en función de la posición de corte del gen 16S, y posteriormente, se calcularon los patrones de banda in silico para cada grupo de enzimas .
La selección de enzimas permitió determinar cual (es) patrón (es) permiten diferenciar la especie de interés de todas las demás especies y géneros analizados, tal como muestra el diagrama del flujo de la Figura 1, Tabla 1 y Figuras 2 y 3.
Tabla 1 Patrones de digestión, secuencia de corte y grupo de enzimas de restricción.
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De este modo, el presente método a partir de la extracción de ADN genómico, ya sea de tejido infectado de salmónidos, cultivos celulares infectados con. Piscirickettsia salmonis o bien Piscirickettsia salmonis creciendo en un medio artificial en un cultivo bacteriano, permite la realización de un protocolo de reacción, en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una región en el genoma del patógeno utilizando partidores universales de amplificación del gen 16S rADN (27F 5 'AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG3 ' ) y 1492R (5'CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT3 ' ) , amplificando la versión de este gen de cualquier bacteria presente en la muestra.. Los productos de PCR así obtenidos, son digeridos enzimáticamente por una. enzima representante de los 5 grupos de enzimas de restricción que se indican en la tabla 1, por ejemplo Pmll, que produce 3 cortes y 4 bandas observables en una electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, ver Figura 2. Este patrón característico de Piscirickettsia salmonis permite 3 horas determinar su identidad y la pureza, en una muestra.
Breve Descripción de las Figuras
Figura 1: Representa un diagrama de flujo de la metodología conducida para determinar patrones de RFLP . Se muestran como pasos consecutivos representados como rectángulos y el orden lógico está representado por uniones de color azul .
Figura 2: Se observan los cinco patrones de digestión que permiten distinguir a Piscirickettsia salmonis del resto de bacterias. Estas bacterias representan ejemplos de bacterias que cohabitan con. Piscirickettsia salmonis tanto en ambientes naturales como de laboratorio. Cada patrón es formado por la digestión del producto de amplificación por PCR (con partidores universales 27F y 1492R) del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia salmonis, mediante una endonucleasa de restricción o alguna de sus isoesquizómeros las cuales se encuentran nominadas en la zona inferior de cada patrón en color azul. También se muestran las secuencias nucleotídicas de reconocimiento utilizadas para la digestión por las enzimas de restricción en la zona superior de cada patrón en rojo. Cada patrón se encuentra acompañado por un estándar de tamaño (con unidades de 100 nucleótidos) que permite estimar los tamaños de las bandas de cada patrón generado.
Figura 3: Se observan la validación experimental de los cinco patrones de digestión, que permiten distinguir a Piscirickettsia salmonis del resto de bacterias usadas como ejemplo. Cada patrón es formado por la digestión del producto de amplificación por PCR (con partidores universales 27F y 1492R) del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia. salmonis y los otros géneros bacterianos en cuestión, mediante una endonucleasa de restricción o alguna ele sus isoesquizómeros de los grupos indicados en la tabla 1, las cuales se encuentran nom.inad.as en la zona inferior de cada patrón en color azul, a la izquierda da cada imagen de electroforesis .
Figura 4A—4D : Caracterización y detección de Piscirickettsia salmonis mediante técnicas tradicionales. Figura 4A: tinción Gram de células de Piscirickettsia salmonis Barra blanca = 1,25 y.m (a) y morfología de la colonia. Barra negra :=: 1,25 cm (b) . Figura 4B: ensayo IFAT de células de Piscirickettsia salmonis en crecimiento exponencial observado por microscopía confocal, en azul, la tinción DAPI que marca material genético (a) ; en verde, la fluorescencia asociada al anticuerpo de inmunodetección de Piscirickettsia salmonis (b) y en celeste el sobrelapamiento ele las señales anteriores (c) Barra blanca = 2,5μκι. Figura 4C: electroforesis en gel de agarosa al 2%. Figura 4D: curvas de reacción qPCR que usan partidores Psl6SRNA-Fl/Psl6SRNA-R en reacciones que contienen o no AD de Piscírickettsia salmonis como sustrato: (izquierda) curva de ampli icación y (derecha) curva de fusión.
Figura 5A—5C : Amplificación PCR Nested y ensayo ITS-PCR. Electroforesis 2% gel de agarosa de (A) PCR Nested de amplificación ADN ribosomal de 16S (partidores Ps2s/PsAs), Figura 5A, (B) ITS-PCR usando partidores RTS1/RTS2, Figura 5B y (C) ITS-PCR usando partidores RTS1/RTS4, Figura 5C:
(carril 1) ladder lOObp plus. (carril 2) Piscírickettsia salmonis . (carril 3) Vibrio anguillarum; (carril 4) Aeromonas salmonicida; (carril 5) Flavobacterium psychrophilum; (carril 6) Renibacteríum salmoninarum;
(carril 7) Shewanelia frigidimarina; (carril 8) Photobacterium phosphoreum; (carril 9) Psychrobacter sp . ;
(carril 10) Arthrobacter sp . ; (carril 11) Staphyiococcus saprophyricus; (carril 12) Microbacterium aurum; (carril 13) Escherichia col i; (carril 14) ladder lOObp plus.
Figura 6A—6B : Ensayo muestra mezclada. Pisirickettsia salmonis y Vibrio anguillarum (en el mismo estado de crecimiento) fueron mezclados con. proporciones diferentes: 100/0, 75/25, 50/50, 25/75 y 0/100 de Piscirickettsia salmonis/Vibrio anauillarum v sometidas a tinción Gram. Barra corresponde a 1,25 \im (Figura 6A) . Después de la amplificación dell6S rADN de las muestras mezcladas y la digestión con la enzima de restricción Pmll el patrón de digestión PCR-RFLP resultante fue examinado por electroforesis usando DNA ScreenTape en el instrumento Tape Station 2200 (Figura 6B) : (carril 1) ladder lOObp plus
(carril 2) 100% Piscirickettsia salmonis. 0% Vibrio anguiliarum; (carril 3) 75% Piscirickettsia salmonis . 25% Vibrio anguiliarum; (carril 4) 50% Piscirickettsia salmonis . 50% Vibrio anguiliarum; (carril 5) 25% Piscirickettsia salmonis. 75% Vibrio anguiliarum; (carril 6) 0% Piscirickettsia salmonis . 100% Vibrio anguiliarum
Figura 7: Ensayo de muestras de diferentes tejidos y diferentes etapas de la infección. ADN extraído de tejidos de peces infectados con Piscirickettsia salmonis se usó para amplificar 16S rADN y realizar ensayos PCR-RFLP. "Temprano" representa estados tempranos de la infección en peces de cultivo en los cuales no se observan síntomas de la enfermedad. "Tarde" representa estados tardíos de la infección en peces de cultivo que manifiestan los síntomas de la enfermedad. (A) la amplificación PCR del gen 60S rADN
(Ss60sS27F/Ss60s27R) de salmón. (B) amplificación PCR de 16S rADN (partidores 27F/1492R) . (C) patrón de digestión PCR-RFLP (amplificación 16SrADN usando partidores 27F/1492R y digestión por la enzima de restricción Pmll) . En todos los casos: (carriles 1 y 8) camino lOObp plus (Thermo scientific) ; (carriles 2 y 5) muestras de riñon; (carriles 3 y 6) muestras ele bazo; (carriles 4 y 7) muestras de cerebro .
Figura 8: Ensayos sensibilidad. En geles de agarosa al 2% (A), (arriba) amplicones de 16S rRNA Piscirickettsia salmonis: (carril 1) ladder lOObp plus (Thermo scientific); (carril 2) 500ng producto PCR; (carril 3) 250 ng producto PCR; (carril 4) 125 ng producto PCR; (carril 5) 62,5 ng producto PCR; (carril 6) 31,25 ng producto PCR. (Abajo) . Digestión enzimática con Pmll de productos de PCR clasificados correlativo con panel A. En Bioanalyzer Tape Station (Agilent Technologies) (B) , (arriba) amplicones de 16S rRNA Piscirickettsia salmonis (carril 1) ladder tape station (Agilent Technologies) ; (carril 2) 1 ng producto PCR; (carril 3) 0,5 ng producto PCR; (carril 4) 0,25 ng producto PCR; (carril 5) 0,125 ng producto PCR; (carril 6) 0.0625 ng producto PCR. (Abajo) . Digestión enzimática con Pmll de productos de PCR clasificados correlativos con panel B.
Figura 9: Tinción Gram y ensayos de IFAT para P. salmonis y bacterias cohabitantes. (A) Microfotograf í.a. de las bacterias luego de la tinción Gram. La barra blanca representa un 1.25 Hm. (B) Imágenes mediante microscopía confocal de bacterias teñidas con DAPI (marcador de ADN) y con anticuerpo anti-P. salmonis (Grupo Bios) . La serie de imágenes inferiores representan las imágenes compuesta de B y C, en las que el color celeste representa la presencia de material genético e inmunodetección para cada bacteria. La barra corresponde a 2,5 Dm.
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La solución propuesta en la presente, se refiere a un método de amplificación del gen 16S ribosomal compartido por todas las bacterias presentes en una muestra, y la posterior digestión del amplificado mediantes enzimas de restricción (PCR-RFLP) que reconocen nucleótidos específicos y en posiciones particulares del gen 16S rADN de Piscirickettsia salmonis . Este producto de digestión puede ser visualizado en una electroforesis , lo que permite identificar el patrón de digestión específico y característico de Piscirickettsia salmonis . La presencia de un patrón o bandas electroforáticas distintas a las del patrón de Piscirickettsia salmonis en la muestra indica presencia de otra(s) bacteria (s) en la muestra. La metodología es rápida, altamente específica, de bajo costo y tan sensible como el ensayo PCR actualmente en uso. Se revelan 5 grupos de enzimas de restricción, cada grupo asociado un patrón de banda de digestión específico. Los grupos de enzimas de restricción, son según el patrón de banda de digestión, los siguientes: Grupo 1: Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l y PspCI; Grupo 2. BspCNI y BseMII; Grupo 3: TspEI, MluCI, Sse9l, TasI y Tsp509l; Grupo 4: Bfal, FspBI,XspI y Mael; y Grupo 5: Ddel, BstDEI y HpyF3l. El presente método permite el uso individual o combinado de las enzimas de restricción que generan los patrones de banda de digestión antes mencionados.
El método de la presente invención se distingue de lo que existe por su alta especificidad de detección de Piscirickettsia salmonis, lo cual evita la generación de falsos positivos, mejorando la capacidad de diagnóstico y la posibilidad de monitorear cultivos de Piscirickettsia salmonis certificando su pureza, tanto en medios microbiológicos como en cultivos en células hospederas. Así, la presente invención consiste en la extracción de ADN genómico, de ya sea tejido infectado de salmón de un cultivo celular infectado con Piscirickettsia salmonis o bien de Piscirickettsia salmonis creciendo en un medio artificial en. un cultivo bacteriano. Luego, se realiza un protocolo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una región del genoma de cualquier bacteria presente en. la muestra utilizando los partidores universales 27F y 1492R (y sus derivados), que amplifican un fragmento del gen ribosomal 16S. El producto de PCR así obtenido es digerido enzimáticamente por una enzima perteneciente a alguno de los 5 grupos de enzimas de
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que se indican en la tabla Por e jemplo, si
Piscirickettsia. salmonis es la única bacteria presente en la muestra, la enzima Pmll produce 3 cortes y 4 bandas en una elect roforesis en geles de agarosa o acrilamida, ver Figura 2. Este patrón es característico de Piscirickettsia saimonis y permite en un protocolo de no más de 3 horas determinar su identidad y pureza en una muestra.
E jemplos
Ejemplo 1: Bacterias, medios y condiciones de crecimiento: Piscirickettsia saimonis (LF-89), fue cultivada a 18°C bajo agitación constante en medio de cultivo líquido descrito por Vera y colaboradores (Vera et al. 2012 http : / /'ww . scielo. cl/scielo. php?pid::::S 0301 - 732X2012000300010&script=sci_arttext ) .
El caldo contiene peptona de caseína 17,0 g/1, peptona de harina de soya 3,0 g/1, D ( + ) glucosa 2,5 g/1, NaCl 20,0 g/1, fosfato monoácido de dipotasio 2,5 g/1 (Caldo A), el cual fue suplementado con L-Cys 0,1%, SBF 2,5%, FeCl3 10 mg/1, NaCl 15 g/1. Los cultivos fueron incubados a 17°C con agitación suave. El Caldo fue utilizado para generar medios de cultivo sólidos, con agar-agar a 15 g/1 y NaCl 15 g/1 se esterilizó por autoclave y se suplemento con L-Cys 1 g/1, FeCl3 20 mg/1, SBF 5%. Los cultivos se incubaron a 17°C durante 12 días.) . Todas las otras bacterias, Piscirickettsia saimonis, Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, Shewanella frigidimarina, Photobacterium phosphoreum, Psychrobacter sp, Arthrobacter sp, Staphylococcus saprophyticus, Microbacterium aurum y Escherichia coli fueron cultivadas en las mismas condiciones .
Ejemplo 2: Obtención de aislados bacterianos ambientales desde peces y ambiente de laboratorio.
Muestras de tejidos de salmón Atlántico fueron obtenidas directamente desde la jaula de los salmones {Salmo salar) . Se tomaron muestras de corazón, ríñones y branquias, las que fueron frotadas suavemente en las láminas de vidrio (portaobjetos), y se cultivaron en medio de crecimiento sólido por 5 días a 18°C. Adicionalmente, cuatro contaminantes bacterianos medioambientales fueron obtenidos al exponer matraces con medio de cultivo líquidos durante 24 hrs al ambiente del laboratorio. Muestras de este medio fueron también cultivadas en medio sólido por 5 días a 18°C. Todas las muestras aisladas fueron cultivadas en el mismo medio y las condiciones de crecimiento antes descritas .
Ejemplo 3: Extracción de AD y amplificación del 16S rAD El ADN de las bacterias fue purificado desde 1 mL de cultivo en crecimiento exponencial OD600 : ~0, 5 o desde muestras de tejido infectadas {≤ 20 mg) usando el kit DNeasy Blood & Tissue Quiagen, entre otros. En el caso de las muestras de cultivos bacterianos ellas fueron centrifugadas 10 min. a 8.000 rpm y el sobrenadante fue descartado, y para las muestras de tejidos se utilizó el protocolo estándar recomendado por el fabricante. El 16S rADN fue amplificado por PCR con los partidores universales 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'. Las amplificaciones PCR fueron conducidas en 25 }i de volumen que contienen 200 "g de ADN bacteriano (~4 uL ) y 20 uL de coctel de amplificación, el cual contenia los siguientes componentes: 12,5 ]iL of GoTaq mix Promega, 5,5 u de nucleasa libre de agua y 1 \i en partidores progresivos o inversos en 10 mM de cada concentración, final. La amplificación PCR fue realizada en un controlador cíclico térmico MJ reasercn, Inc. Las muestras fueron incubadas por 10 min a 952C para desnaturar el ADN la amplificación se realizó en 30 ciclos de 952C por 60 seg., 58 °C por 30 seg. y 72 °C por 60 seg. Las muestras fueron entonces incubadas a 722C por 10 min para una extensión, final y se mantuvieron a 42C hasta que fueron analizadas. El ADN amplificado fue fraccionado por electroforesis en un gel de agarosa al 2% p/'v en amortiguador TAE . Los geles fueron teñidos con. bromuro de etidio para detectar el producto de amplificación y fotografiados . Los productos de PCR fueron secuenciados y la identidad bacteriana fue verificada mediante comparación con bases de datos de 16S rDANs bacterianos utilizando el algoritmo BLAST.
Ejemplo 4: Análisis de restricción de 16S rADN amplificado Cinco microlitros (de cada producto PCR amplificado fue digerido con endonucleasas de restricción por 30 min a 37 °C. Los fragmentos de restricción fueron fraccionados en un gel de agarosa 2% p/v teñidos con bromuro ele etidio y fotografiados, las longitudes de los fragmentos de
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fueron estimados compararlos con el ADN estándar lOObp Plus DNA Ladder, Thermo Scientific O'GeneRuler™ (SM1153) .
Los fragmentos de restricción fueron también analizados en el Tape Station 2200, Agilent Technologies usando Genomic DNA Screen Tape, Kit Agilent más reactivos de ADN genómico según indicaciones del fabricante.
Ejemplo 5. Selección ele las enzimas de restricción
La secuencia nucleotidica del fragmento 16S rADN secuenciado de nuestros aislados de Piscirickettsia salmónis fue utilizada para validar su identidad y seleccionar los genes 16S rADN de este género en las bases de datos de ADN ribosomales SILVA, RDP y GreenGenes. Estas secuencias, fueron posteriormente alineadas, identificando regiones conservadas y variables comparando todas las secuencias seleccionadas. A partir de esta información, se seleccionaron todas las enzimas de restricción que corten a todas las secuencia 16S rADN de Pisciri ckettsia. saimonis . Posteriormente, las enzimas de restricción seleccionada fueron utilizadas para generar los patrones de corte de todas las secuencia 16s rADN (de las bases de datos de ADN ribosomales SILVA, RDP y GreenGenes completas) que eran susceptibles de ser digeridaspor ellas. Este análisis comparado nos permitió identificar un subgrupo de enzimas de restricción (Tabla 1) que generan un patrón de digestión exclusivo para Píscirickettsía salmonis que permite distinguir a esta bacteria de todos el resto de las bacterias analizadas. Para validar experimentalmente esta predicción de patrones de digestión se utilizaron las bacterias Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, Shewanella frigidimarina, Photobacterium phosphoreum, Psychrobacter sp, Arthrobacter sp, Staphylococcus saprophyticus, Microbacterium aurum y Escherichia coli, a las cuales se les extrajo el ADN, se amplificó el gene 16S ribosomal con partidores universales, se digirieron con las enzimas de restricción de los grupos indicados en la Tabla 1 y se visualizaron en geles de agarosa al 2%, como fue descrito previamente.
Ejemplo 6: Ensayos cuantitativos PCR Nested y sonda Taqman: Las pruebas PCR Nested fueron realizadas usando el método y los partidores descritos en Mauel et al. 2006 usando partidores Ps2s 5' CTA GGA GAT GAG CCC GCG TTG 3' y PsAs 5' GCT ACA CCT GCG AAA CCA CTT 3' en controlador de ciclo térmico de MJ Research, Inc. Las muestras fueron desnaturadas a 95°C por 5 min, y entonces, en 30 ciclos se condujo a 95 °C por 1 min, 60 °C por 30 seg y 72 °C por 2 min. La reacción PCR fue conducida en 25 L de reacción final que contiene 2 μL del producto PCR de amplificación 16S antes descrito, 12,5 iL de GoTaq, 8,5 iL nucleasa libre de agua y 1 yi de cada partidor.
El ensayo qPCR fue realizado usando los partidores 16SRNA- F15' AGG GAG ACT GCC GGT GAT A 3' y 16SRNA-R5 ' ACT ACG AGG CGC TTT CTC A 3' descritos por Karatas, S. et al. Real time PCR detection of Piscirickettsia salmonis from formalin- fixed paraffin-embedded tissues. J. Fish Dis. 31, 747-53 2008. La reacción fue realizada en un volumen final de 10 pL que contiene 50 ng de gD A y cada partidor a 10 mM de concentración final usando el kit Light Cycler Syber Green, Roche. Las condiciones de amplificación fueron: 10 min a 95°C, seguido de 30 ciclos de amplificación de 95°C por 10 seg, 55°C por 15 seg y una extensión a 72°C por 10 seg. Los ensayos con la sonda TaqMan fueron realizados como se describe en. Corbeil, S., et al 2003. Development of a TaqMan quantitative PCR assay for the Identification of Piscirickettsia salmonis . Bulletin of the European Associat ion. of Fish Pathologists 23:95-101. El partidor usado fue F-760 5' TCT GGG AAG TGT GGC GAT AGA 3' y R-836 5' TCC CGA CCT ACT CTT GTT TCA TC 3' y 6- carboxi fluoresceina 6FAM y 6-carboxitetrametilrodamina TAMRA, sonda etiquetada PS23S: 6FAM-TGA TAG CCC CGT ACA CGA AAC GGC ATA-TAMRA. Todas las reacciones fueron conducidas en el mismo termociclador según otras reacciones de qPCR. Para cada reacción, los partidores fueron usados conforme las concentraciones recomendadas: 900 nM de cada partidor y 250 nM de cada sonda 23S FAM. Las condiciones de ciclo fueron las siguientes: 50°C para 2 min, 95°C para 10 min, seguido de 40 ciclos de 95°C para 15 segundos y 60°C para 1 min .
Ejemplo 7: Tinción Gram, fluoroforo y Prueba de Anticuerpo Fluorescente Indirecta IFAT:
Las tinciones Gram fueron realizadas fijando muestras en una placa de vidrio con calor. El proceso de tinción se realizó usando cristal violeta por 1 min, yodo por 1 min, etanol por 30 seg y safranin por Imin. Entre cada etapa, las muestras fueron lavadas con agua destilada. Todas las muestras fueron observadas en microscopio Nikon Eclipse Ni. con objetivo lOOx con inmersión en aceite. Para mezclar los dos cultivos bacterianos de Piscirickettsia salmóni sI'Vibrio anguillarum se hicieron crecer a. OD6oo=0,5 y mezclando en diferente proporciones: 100/0, 75/25, 50/50, 25/75 y 0/100 Pisciri cke11sia salmoni s/ Vibri o anguillarum .
La prueba. IFAT fue realizada según las recomendaciones del fabricante SRS-Fuorotest indirect, GrupoBios, con algunas modificaciones conforme se indica más adelante. 20 uL se dejaron secar a temperatura ambiente. Poster.iorm.ente, las muestras se fijaron con parar ormaldehido diluido en PBS al 4% por 10 min seguido de tres lavados con solución estéril de PBS .
A cada muestra se agregó 100 uL de reactivo Oligoclonal previamente diluido 1:100 con solución de dilución, y se incubo 30 rain a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Las muestras fueron lavadas por cuatro minutos con solución de lavado, previamente diluida 1:25 con agua destilada. Posteriormente, se agregó a cada muestra 100 uL de solución anti-IgG FITC diluida 1:100 y DAPI diluido 1:200 en solución de dilución. Se incubaron las placas a temperatura ambiente por 30 min en una cámara húmeda evitando la luz, y luego, se lavaron las muestras dos veces con solución lavado diluido 1:25 con agua destilada por cuatro minutos. Finalmente, se agregó 6 uL de medio Mounting Dako y se colocaron en una placa de vidrio, para luego almacenar a 4°C una vez solidificado el medio de montaje. Las muestras fueron analizadas en microscopio cofocal Nikon Eclipse Ti usando objetivo 60X con inmersión en aceite.
Ejemplo 8: Infección, de peces y PCR-RFLP desde tejidos de peces infectados en centros de cultivo:
Los ensayos fueron realizados usando tejido que se obtiene directamente de muestras de peces infectados de las jaulas de centros de cultivo. Las muestras de tejido fueron intestino, bazo, hígado, riñon y cerebro. Una porción de tejido fue cortada para obtener la muestra (≤ 20 mg) de tejido, el cual fue asépticamente nomogenizado en pequeñas piezas para proceder con la extracción de ADN como se describió antes. Para cada muestra de tejido se realizó amplificación PCR del gen 16S rADN y la posterior digestión enzimática descrita anteriormente. Ejemplo 9: Detección Piscirickettsia salmonis:
La Fig. 4 muestra la curva ele crecimiento bacteriano, comenzando con un medio de inoculo de OD600- 0,05. La fase exponencial toma lugar entre los días dos y siete como fue anteriormente reportado Figueroa et al. 2012. Para detectar Piscirickettsia salmonis en el medio de crecimiento, se probaron las técnica referidas descritas para este propósito: visualización microscópica del cultivo Fryer, J. L., Lannan, C. ., Giovannoni, S. J. & Wood, N. D. Piscirickettsia salmonis gen. nov., sp . nov., the causative agent of an epizootic disease in salmonid fishes. Int. J. Syst. Bacterio!. 42, 120-6 1992.; Lannan, C. N . , E ing, S. a. & Fryer, J. L. A Fluorescent Antibody Test for Detection of the Rickettsia Causing Disease in Chilean Salmonids. J. Aquat . Anim. Health 3, 229-234 1991. ver Figs. 3A y 3B y técnicas basados en PCR Mauel et al.1996; Karatas, S. et al. Real time PCR detection of Piscirickettsia salmonis from. formalin-fixed paraffin-embedded tissues. J. Fish Dis. 31, 747-53 2008. ver Fig. 5C y 5D . En la metodología de visua.liza.ción por tinción grara, un coco gram negativo se observa en la ver Fig. 4.A, mientras la colonia Piscirickettsia salmonis es gris opaca y de forma circular ver Fig. 4A. Adicionalmente , la tinción DAPI, la immuno- detección con el anticuerpo comercia.lmen.te disponible usado como referencia contra Piscirickettsia salmonis Lannan, C. N., Ewing, S. a. & Fryer, J. L. A Fluorescent Antibody Test for Detection of the Rickettsia Causing Disease in Chilean Salmonids. J. Aquat . Anim. Health 3, 229-234 1991 y la imagen de las señales de fluorescencia fusionadas se muestra en la Fig. 3B. Las imagines fusionadas muestran la correlación entre la tinción DAPI y la localización del anticuerpo, la que permite la identificación de Piscirickettsia salmónis en el medio de cultivo.
Por otra parte, las técnicas de detección que implican la amplificación, mediante PCR con. partidores de identificación específicos se muestran en Fig. 4C y 4D. La Fig. 4C corresponde a una electroforesis en gel de agarosa del producto de amplificación obtenido usando los partidores universales del gen 16S bacteriano (27F y 1492R) y el Nested-PCR con los partidores PsAs y Ps2s descritos en Mauel et al. 1996, identifica un fragmento 1547 bp y un fragmento 469 bp, respectivamente como describieron los autores . Fig. 5D muestra la amplificación y curvas de fusión de reacciones qPCR que contienen o no AD de Piscirickettsia salmónis como sustrato usando partidores Psl6Sreal-Fl/Psl6Sreal-R Karatas, S. et al. Real time PCR detection. of Piscirickettsia salmonis from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. J. Fish Dis. 31, 747-53 2008. La amplificación de Piscirickettsia salmonis es iniciada en ciclo 10,59, y el análisis de la curva de fusión muestra un pico único para la bacteria. Ejemplo 10: Clasificaciones de cepas bacterianas y filogenética :
Cuando se aislaron las bacterias, se les clasificó en tres categorías: patógeno pez, aislado de pez y contaminante de laboratorio ver Tabla 2. La secuencia obtenida por amplificación del ADN ribosomal fue usado como plantilla para buscar en las bases de datos RDP para asignar identificación ele secuencia.
Tabla 2: Cepas usadas. Doce cepas fueron, identificadas de acuerdo a la mejor coincidencia obtenida al buscar e
Ribosomal Datábase Pro ect RDP. Puntaje de identidad de secuencia entre 0 y 1.
Código RDP Puntaje Mejor Categoría Referencia coincidencia
S003803882 0,991 Pisciricketssia Patógeno de Bravo et al salmonis pez 2012
S003807761 1,000 Vibrío Patógeno de Frans. et pez
angullarum al 2013
S000494055 1,000 Aeromonas Patógeno de Haveman S .
pez
salmón! elda A. et al
2005
S002288664 0,876 Flavobacterium Patógeno de Duchaud et pez
psychroph11 um al 2007
S000487822 0, 895 Renibacteri um Patógeno de Konigsson pez
sa1mon1narum et al 2005
S000134127 0 ,996 Shewanelia Aislado desde Bozal et frigidimarina pez al 2001
S000407844 1,000 Photobacterium Aislado desde Budsberg K pez
phosphoreum J et al
2003
S003721215 0, 995 Psychrobacter sp Aislado desde Xing M et pez
al 2013
S001589700 0, 995 Arthobcter sp Contaminante Mou et al de 2009
Laboratorio
S003715369 0,998 Staphylococcus Contaminante Zhang X et de
saprophyticus Laboratorio al 2012
S000842579 0, 981 Micobacteri um Contaminante Dekas A et de
aurum Laboratorio al 2006
S001572565 1,000 Escherichla coli Contaminante Yoshiyama M de
Laboratorio et al 2009
Ejemplo 11: Análisis de especificidad de las técnicas existentes para identificar Piscirickettsia salmónis
Con el objetivo de determinar la especificidad de las técnicas de diagnóstico utilizadas comúnmente para detectar Piscirickettsia saímonis se realizaron algunos ensayos usando a las bacterias descritas en la Tabla 2. El primer ensayo evaluó el uso del anticuerpo comercial contra Piscirickettsia salmónis BioSigma para corroborar la detección de Piscirickettsia saim.onis en muestras de cultivo, de acuerdo a las indicaciones recomendadas por el fabricante. Mediante microscopía confocal, se detectó la inmunodetección de Piscirickettsia salmonis v una coincidencia similar de señales de anticuerpo en dos aislados marinos que corresponden al género Shewanella y Photobacterium (Figura 9) considerándose esta una inmunodetección no especifica. Para todas las otras cepas, el anticuerpo probado fue negativo.
Por otra parte, el PCR ested Mauel et al. 1996 descrito como especifico para Piscirickettsia salmonis fue evaluado en todas las cepas contaminantes (Tabla. 2) . Los resultados indican que además de Piscirickettsia salmonis, ocho bacterias aisladas muestran la banda 469 bp descrita como especifica asi como también otros amplicones no específicos
(Fig. 5) . Además, la reacción específica de PCR cuantitativo de Piscirickettsia salmonis usando partidores 16SRNA-F1 / 16SR A-R, resultó en la amplificación de tocias las cepas contaminantes, con la excepción de Microbacterium aurum y Renibacterium salmonínarum . Si bien en este ensayo los valores de ciclo umbral (Ct) , obtenidos con el ADN de Piscirickettsia. salmonis correspondieron a ciclos tempranos, se observó la amplificación del ADN de otras bacterias a ciclos más tardíos, produciéndose en todos los casos/curvas de fusión ("melting curves") con diferencias no significativas en los valores de temperatura de fusión
(Tm) , lo que no permite distinguir específicamente a Piscirickettsia. salmonis de otras bacterias analizadas ver Tabla 3. De la misma forma, cuando se probó una sonda de amplificación taqman, descrita como específica de Piscirickettsia salmonis, Corbeil, S., Mccoll, K. A. & Crane, M. S. J. Development of a TaqMan quantitative PCR assay for the identification of Piscirickettsia salmonis. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 23, 95-101 2000, el ensayo resultó positivo para todas las muestras Tabla 3, implicando que la sonda carece de especificidad para Piscirickettsia salmonis.
Tabla. 3: Ensayos basados en PCR cuantitativos, qPCR basados en partidores 16SRNA-F1/16SRNA-R Karatas, S. et al. Real time PCR detection of Piscirickettsia salmonis from formalin-fixed paraffin-embedded tissues, J. Fish Dis. 31, 747-53 2008. Ciclo de amplificación Ct, temperatura de fusión Tm, copias de genoma equivalente EGC y estado de las muestras obtenidas para cada ensayo durante la amplificación. de 16S ADN ribosomal de cada bacteria obtenida durante la amplificación de 16S ADN ribosomal. *
Indica valores significativamente diferentes. ANOVA de una vía p>0, 005.
Muestra Ensayo Qpcr Ensayo Taqman
Ct tm Estado Ct EGC Estado de la de la muestra muestra
Piscírícketssi 10, 59=0, 24 89, 4±0, 0 Positiv 11, 7, SxlO1 Positiv a salmonis * Q 0 o
Vibrio 18, 73±0, 89 87,3+1, Posit iv 24, 4, 9x106 Positiv
8 Q o
8
Aeromonas 22,31+1,35 91,5+1, 0 Positiv 23, 1, 0x107 Positiv
9 o o salmonicida /
Flavobacteri um 20, 21±0, 35 89, 0±0, 3 Positiv 21, 6, OxlO7 Positiv o o psychrophi1 um 3
Renibacterium Negati 31, 8, OxlO3 Positiv o sa1moninarum o 8
Shewanella 21, 33±0, 79 87, 8±0, 4 Positiv 28, 3, OxlO5 Positiv η o friqidimarina o 1
Photobacteri um 25, 16=1, 02 88, 8±0, 3 Positiv 27, 6, 5xl05 Positiv
0 o o phosphoreum 3
Psychrobacter 22, 19±0, 93 87, 7±0, 5 Positiv 28, 2, OxlO5 Positiv
9 o o
Sp 5
Arthobcter sp 27, 68±0, 84 92, 3+0, 0 Positiv 29. 1, 3xl05 Positiv
3 o o
0
Staphyl ococcus 25,39+0, 84 89,4+0, 0 Positiv 28, 1, 6xl05 Positiv
9 o o saprophyti cus g
Micobacterí um Negativ 27, 5, 7xl05 Positiv o auru o 4
Escherí chía 23, 93±1, 92 89, 0±0, 3 Positiv 35, 6, 8x101 Positiv
1 o colí o 8
Ejemplo 12: Ejemplo de aplicación grupo I
Ejemplo 12 A: Aplicación en muestra infectada con
Piscirickettsia salmonis
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometría . Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, Pmll. Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el primer patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y hay coincidencia de un 100%, entonces se confirma la presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforéticas de 733 pb, 396 pb, 283 pb y 97 pb
Ejemplo 12 B: Aplicación en muestra infectada por un patógeno distinto a Piscirickettsia salmonis
(Staphylococcus saprophyticus) .
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometría .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, Pmll. Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el primer patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, no habiendo coincidencia de un 100%, entonces se confirma que no hay presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra 1: bandas electroforéticas de 1118 pb, 284 pb y 114 pb . Estos resultados, descartan que la infección de la muestra sea producida por Piscirickettsia salmonis
Ejemplo 12 C: Aplicación en muestra infectada tratada con una enzima de restricción que no permite discriminar a Piscirickettsia salmonis de otras bacterias causantes de la infección.
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometría .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, Taql . Las bandas electroforéticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el primer patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, no habiendo coincidencia de un 100%, entonces no es posible determinar con que patógeno está infectada la muestra porque no se dispone de un patrón único ya que la enzima muestra las bandas electroforét icas de las pb que indica la tabla 4 a continuación: Tabla 4
Patrón confundible 1
Bacterias (Taql) pb
Piscirickettsia
salmonis 901 361 192 55
Vibrio anguillarum 899 361 193 55
Aeromonas
salmonicida 683 361 194 86 80 55 53
Flavobacterium
psychrophil um 883 316 184 55 41
Renibacteri um
salmóninarum 891 360 147 55 50
Shewanella
frigidimarina 901 361 220 55
Photobacterium
phosphoreum 906 359 194 55
Psychrobacter sp . 597 361 198 198 66 55 34
Arthrobacter sp . 878 359 148 55 50
Staphylococcus
saprophyticus 907 361 145 55 48
Microbacterium aurum 664 360 146 120 95 55 50
Escherichia coli 759 360 221 86 55 53
Ejemplo 13: Ejemplo de aplicación grupo Ejemplo 13 A: Aplicación en muestra infectada con Piscirickettsia salmonis
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, BspCNI . Las bandas electroforéticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el segundo patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y hay coincidencia de un 100%, entonces se confirma la presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforéticas de 529 pb, 434 pb, 239 pb, 140 pb, 138 pb y 29 pb .
Ejemplo 13B: Aplicación en muestra infectada por un
patógeno distinto a Piscirickettsia salmonis (Renibacterium salmóninarum)
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria . Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, BspCNI . Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el segundo patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y no hay coincidencia de un 100%, entonces, se confirma que no hay presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforéticas de 563 pb, 426 pb, 249 pb, 209 pb, 29 pb y 27 pb . Estos resultados, descartan que la infección de la muestra sea producida por Piscirickettsia salmonis .
Ejemplo 13C: Aplicación en muestra infectada tratada con una enzima de restricción que no permite discriminar a Piscirickettsia salmonis de otras bacterias causantes de la de la infección.
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometría . Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, Rsal . Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el segundo patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, no habiendo coincidencia de un 100%, entonces no es posible determinar con que patógeno está infectada la muestra porque no se dispone de un patrón único ya que la enzima muestra las bandas electroforáticas de las pb que indica la tabla 5 a continuación: Tabla 5
Bacterias Patrón confundible 2 (Rsal) pb
Piscirickettsia
salmonis 886 357 146 120
Vibrio anguillarum 650 503 234 121
Aeromonas
salmonicida 887 357 146 122
Flavobacterium
psychrophil um 400 354 161 146 126 98 83 77 34
Renibacteri um
salmóninarum 469 252 227 155 147 129 121 3
Shewanella
frigidimarina 886 357 148 146
Photobacterium
phosphoreum 457 434 399 122 102
Psychrobacter sp . 880 357 146 126
Arthrobacter sp . 456 355 252 155 147 122 3
Staphylococcus
saprophyticus 503 486 406 121
Microbacterium aurum 457 356 252 155 147 120 3
Escherichia coli 502 456 427 149
Ejemplo 14: Ejemplo aplicación grupo III Ejemplo 14A: Aplicación en muestra infectada con Piscirickettsia salmonis
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, SSe9l. Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el tercer patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y hay coincidencia de un 100%, entonces se confirma la presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforéticas de 419 pb, 334 pb, 245 pb, 119 pb, 116 92 pb, 82 pb, 46 pb, 40 pb y 16 pb .
Ejemplo 14B: Aplicación en muestra infectada por patógeno distinto a Piscirickettsia salmonis
(Photobacterium phosphoreum) Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, Sse9l. Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el tercer patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y no hay coincidencia de un 100%, entonces, se confirma que no hay presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforáticas de 558 pb, 557 pb, 249 pb, 116 pb y 40 pb . Estos resultados descartan que la infección de la muestra sea producida por Piscirickettsia salmonis .
Ejemplo 14C: Aplicación en muestra infectada tratada con una enzima de restricción que no permite discriminar a Piscirickettsia salmonis de otras bacterias causantes de la infección. Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria . Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, Smll. Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el tercer patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, no habiendo coincidencia de un 100%, entonces no es posible determinar con que patógeno está infectada la muestra porque no se dispone de un patrón único ya que la enzima muestra las bandas electroforáticas de las pb que indica la tabla 6 a continuación: Tabla 6
Patrón confundible 3
Bacterias (Smll) pb
Piscirickettsia
salmonis 835 674
Vibrio anguillarum 834 674
Aeromonas
salmonicida 837 368 307
Flavobacterium
psychrophil um 1479
Renibacteri um
salmóninarum 1503 Shewanella
frigidimarina 836 701
Photobacterium
phosphoreum 841 673
Psychrobacter sp . 830 609 70
Arthrobacter sp . 1490
Staphylococcus
saprophyticus 651 466 399
Microbacterium au 1490
Escherichia coli 701 644 189
Ejemplo 15: Ejemplo aplicación grupo IV
Ejemplo 15A: Aplicación en muestra infectada con
Piscirickettsia salmonis
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometría .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, XspI . Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el cuarto patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y hay coincidencia de un 100%, entonces se confirma la presencia de Piscirickettsia salmonis , en la muestra. Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforáticas de 403 pb, 326 pb, 195 pb, 175 pb, 135 pb, 95 pb, 74 pb, 71 pb, 27 pb y 8 pb .
Ejemplo 15B: Aplicación en muestra infectada por un patógeno distinto a Piscirickettsia salmonis
{Microbacterium aurum)
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3", el producto se digiere usando la enzima de restricción, XspI . Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el cuarto patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y no hay coincidencia de un 100%, entonces, se confirma que no hay presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforáticas de 622 pb, 520 pb, 175 pb y 173 pb . Estos resultados, descartan que la infección de la muestra sea producida por Piscirickettsia salmonis .
Ejemplo 15C. Aplicación en muestra infectada tratada con una enzima de restricción que no permite discriminar a Piscirickettsia salmonis de otras bacterias causantes de la infección .
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3", el producto se digiere usando la enzima de restricción, Bael. Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el cuarto patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, no habiendo coincidencia de un 100%, entonces no es posible determinar con que patógeno está infectada la muestra porque no se dispone de un patrón único ya que la enzima muestra las bandas electroforáticas en las pb que indica la tabla 7 a continuación:
Tabla 7 Patrón confundible 4
Bacterias (Bael) pb
Piscirickettsia
salmonis 776 700 33
Vibrio anguillarum 776 699 33
Aeromonas
salmonicida 700 529 217 33 33
Flavobacterium
psychrophil um 765 681 33
Renibacteri um
salmóninarum 766 704 33
Shewanella
frigidimarina 778 726 33
Photobacterium
phosphoreum 783 698 33
Psychrobacter sp . 772 480 191 33 33
Arthrobacter sp . 753 704 33
Staphylococcus
saprophyticus 783 700 33
Microbacterium aurum 754 703 33
Escherichia coli 775 726 33
Ejemplo 16: Ejemplo de aplicación grupo V
Ejemplol6A: Aplicación en muestra infectada con Piscirickettsia salmonis
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria . Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3", el producto se digiere usando la enzima de restricción, Ddel. Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el quinto patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y hay coincidencia de un 100%, entonces se confirma la presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforéticas de 337 pb, 245 pb, 231 pb, 163 pb, 161 pb, 138 pb, 97 pb, 83 pb, 38 pb y 16 pb .
Ejemplo 16 B: Aplicación en muestra infectada por un patógeno distinto a Piscirickettsia salmonis (Aeromonas salmonicida)
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometría .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3", el producto se digiere usando la enzima de restricción, Ddel. Las bandas electroforéticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el quinto patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, y no hay coincidencia de un 100%, entonces, se confirma que no hay presencia de Piscirickettsia salmonis, en la muestra.
Lo anterior porque el patrón muestra bandas electroforáticas de los 760 pb, 434 pb, 275 pb, 27 pb yl6 pb . Estos resultados, descartan que la infección de la muestra sea producida por Piscirickettsia salmonis.
Ejemplo 16C: Muestra infectada tratada con una enzima de restricción que no permite discriminar a Piscirickettsia salmonis de otras bacterias causantes de la infección.
Se obtienen al menos 200 mg de tejido desde el espécimen infectado, posteriormente se realiza la extracción del ADN bacteriano desde la muestra de tejido usando técnicas convencionales y de acuerdo a las instrucciones del fabricante del kit a usar. Luego, se verifica la pureza del DNA bacteriano total aislado utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, espectrofotometria .
Se realiza la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando los partidores 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', el producto se digiere usando la enzima de restricción, Smal . Las bandas electroforáticas o patrón de digestión del producto, se compara con un estándar de ADN (ladder) y con el cuarto patrón de la Figura 2 que es característico de Piscirickettsia salmonis, no habiendo coincidencia de un 100%, entonces no es posible determinar con que patógeno está infectada la muestra porque no se dispone de un patrón único ya que la enzima muestra las bandas electroforáticas de las pb que indica la tabla 8 a continuación: Tabla 8
I Patrón confundible 5
Bacterias (Smal) pb
Piscirickettsia
salmonis 1380 129
Vibrio anguillarum 772 606 130
Aeromonas
salmonicida 771 610 131
Flavobacterium
psychrophil um 1359 120
Renibacteri um
salmóninarum 1370 133
Shewanella
frigidimarina 771 609 157
Photobacterium
phosphoreum 770 613 131
Psychrobacter sp . 771 603 135
Arthrobacter sp . 1356 134
Staphylococcus
saprophyticus 1386 130
Microbacterium aurum 1358 132
Escherichia coli 769 607 158
Piscirickettsia. salmonis es un importante agente etiológico para una enfermedad de peces que produce grandes pérdidas económicas para la industria del salmón. Por esta razón, varios esfuerzos se han hecho para desarrollar control epidemiológico para esta bacteria responsable del síndrome SRS .
En la industria Chilena, las vacunas han. sido una importante aproximación para disminuir la mortalidad de peces y reducir la necesidad ele tratamiento médico para diferentes enfermedades bacterianas en cultivos de peces. Sin embargo, para el SRS las vacunas usadas no han mostrado una reducción significativa en las mortalidades de peces Bravo, S. & Midtlyng, P. J. The use of fish vaccines in the Chilean salmón industry 1999-2003. Aquaculture 270, 36-42 2007. Por esta razón, se ha tornado critico la correcta identificación y también la confirmación de pureza de Piscirickettsia salmonis en medios de cultivo y muestras de tejido. Entonces, el método PCR-RFLP se torna una importante herramienta en alcanzar este propósito según se basa en patrones dependientes de S P y esta, característica genética distintiva permite determinación de pureza.
El presente método permite certificar e identificar muestras ele cultivo puro de Piscirickettsia salmonis y también. su identificación en tejidos infectados. Este método también mejora la especificidad de las otras técnicas probadas de una forma simple y rápida. Se puede diferenciar entre todas las bacterias que presentan el mayor cambio al cohabitar con Piscirickettsia salmonis .

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método rápido, específico, sensible, de bajo costo y reproducible para detectar presencia de Piscirickettsia salmonis en una muestra, caracterizado porque comprende la amplificación de un fragmento del gen 16S ribosomal compartido por todas las bacterias presentes en una muestra de tejido, cultivo bacteriano y cultivo celular (hospedero) y la posterior digestión del amplificado mediante el uso individual o combinado de enzimas de restricción (PCR-RFLP) seleccionadas desde 5 grupos de isoesquizómeros, donde el primer grupo comprende las enzimas de restricción Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l o PspCI, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte CAC/GTG; el segundo grupo comprende enzimas seleccionadas de BspCNI o BseMII, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte CTCAG9/7; el tercer grupo comprende enzimas seleccionadas de TspEI, MluCI, Sse9l, TasI o Tsp509l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte AATT; el cuarto grupo comprende enzimas seleccionadas de Bfal, FspBI,XspI o Mael, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte C/ATG; y el quinto grupo comprende enzimas seleccionadas de Ddel, BstDEI o HpyF3l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte C/TNAG; las que reconocen secuencias nucleotídicas exclusivas en el gen 16S rADN de Piscirickettsia salmonis; y luego de obtenido las bandas electroforáticas o patrones de digestión del producto de PCR, comparar las bandas obtenidas contra cualquiera o todas las 5 bandas electroforáticas o patrones de digestión específicos de la Figura 2 que son características de Piscirickettsia salmonis; la no coincidencia del patrón de digestión obtenido de la muestra con cualquiera de patrones de digestión de la Figura 2 indica la no presencia de Piscirickettsia salmonis o contaminación o presencia de otras bacterias en la muestra, mientras que la coincidencia del patrón digestión obtenido de la muestra con cualquiera de patrones de digestión de la Figura 2, indica la presencia de Piscirickettsia salmonis en la muestra.
2. El método de la reivindicación 1 caracterizado porque además permite analizar cultivos de Piscirickettsia salmonis certificando su pureza.
3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra es seleccionada del grupo consistente de tejido infectado de salmón de un cultivo celular infectado con Piscirickettsia salmonis, Piscirickettsia salmonis creciendo en un medio artificial en un cultivo bacteriano o tejido que se obtiene directamente de muestras que a su vez, se obtienen de peces infectados de las jaulas.
4. El método de la reivindicación. 3, caracterizado porque las muestras de tejido se obtienen de tejido del intestino, bazo, hígado, riñon y cerebro del pez.
5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la amplificación con partidores seleccionados de 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3' y 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3' .
6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima de restricción es seleccionada del grupo Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l o PspCI, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CAC/GTG .
7. El método de la. reivindicación 1, caracterizado porque la enzima de restricción es seleccionada del grupo BspCNI o BseMII, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CTCAG9/7.
8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima de restricción es seleccionada del grupo TspEI, MluCI, Sse9l, TasI o Tsp509l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es AATT.
9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima de restricción es seleccionada del grupo Bfal, FspBI,XspI o Mael, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es C/ATG.
10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima de restricción es seleccionada del grupo Ddel, BstDEI o HpyF3l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte C/TNAG.
11. Kit para detectar presencia de Piscirickettsia salmonis en una muestra caracterizado porque comprende los componentes para caracterizar al menos uno de los 5 patrones de digestión específicos de la Figura 2 que son características de Piscirickettsia salmonis, partidores para la amplificación del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia salmonis seleccionados de 27F 5' AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 31 o 1492R 5' TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3', y al menos una enzima de restricción seleccionada desde 5 grupos distintos de endonucleasas que comparten la misma secuencia de corte, donde el primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l o PspCI, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CAC/GTG; el segundo grupo comprende enzimas seleccionadas de BspCNI o BseMII, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CTCAG9/7; el tercer grupo comprende enzimas seleccionadas de TspEI, MluCI, Sse9l, TasI o Tsp509l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es AATT; el cuarto grupo comprende enzimas seleccionadas de Bfal, FspBI,XspI o Mael, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es C/ATG; y el quinto grupo comprende enzimas seleccionadas de Ddel, BstDEI o HpyF3l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es C/TNAG; las que reconocen secuencias identificadas exclusivamente en el gen 16S rADN de Piscirickettsia salmonis .
12. El kit de la reivindicación 11 caracterizado porque comprende el patrón ele digestión asociado al primer grupo que comprende las enzimas de restricción seleccionadas de Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l o PspCI, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CAC/GTG de la Figura 2, partidores para la amplificación del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia salmonis, y al menos una enzima de restricción seleccionada del primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de Pmll, PmaCI, Acvl, BbrPI, Eco72l o PspCI, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CAC/GTG.
13. El kit de la reivindicación 11 caracterizado porque comprende el patrón de digestión asociado al primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de BspCNI o BseMII, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CTCAG9/7 de la Figura 2, partidores para la amplificación del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia salmonis , y al menos una enzima de restricción seleccionada del primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de BspCNI o BseMII, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CTCAG9/7.
14. El kit de la reivindicación 11 caracterizado porque comprende el patrón de digestión asociado al primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de TspEI, MluCI, Sse9l, TasI o Tsp509l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es AATT de la Figura 2, partidores para la amplificación del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia salmonis, y al menos una enzima de restricción seleccionada del primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de BspCNI o BseMII, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es AATT.
15. El kit de la reivindicación 11 caracterizado porque comprende el patrón ele digestión asociado al primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de Bfal, FspBI,XspI o Mael, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es C/ATG de la Figura 2, partidores para la amplificación del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia salmonis, y al menos una enzima de restricción seleccionada del primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de Bfal, FspBI,XspI o Mael, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es C/ATG.
16. El kit de la reivindicación 11 caracterizado porque comprende el patrón de digestión asociado al primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de Ddel, BstDEI o HpyF3l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CAC/GTG de la Figura 2, partidores para la amplificación del gen 16S ribosomal de Piscirickettsia salmonis, y al menos una enzima de restricción seleccionada del primer grupo comprende enzimas de restricción seleccionadas de Ddel, BstDEI o HpyF3l, teniendo todas ellas independientemente secuencia de corte es CAC/GTG.
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