CN110551830A - 人y-str基因座荧光标记试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人Y‑STR基因座荧光标记试剂盒及检测方法。所述试剂盒包含使用四色荧光标记的17个特异性引物对、PCR Master Mix、带荧光标记的M13通用引物、ddH2O、去离子甲酰胺和SIZE‑500Plus内标，可同时扩增17个新的Y‑STR基因座：DYS715、DYS709、DYS716、DYS713、DYS607、DYS718、DYS723、DYS708、DYS714、DYS712、DYS717、DYS721、DYS605、DYS719、DYS726、DYS598、DYS722。与目前的Y‑STR试剂盒无重合基因座，可应用于疑难亲缘鉴定及嫌疑人家系排查等鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种用于建库排查、亲权鉴定及DNA家谱构建的Y-STR基因座试剂盒及其检测方法。
背景技术
Y染色体STR遗传标记指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列（shorttandem repeats, STR），大多数含有两种或两种以上的不同重复单位，群体中个体的核心重复序列或重复次数不同，形成群体遗传多态性。具有男性特有、父系遗传和单倍型遗传三大特点。Y-STR检验技术是常染色体STR检验技术的补充，广泛应用于混合成分中男性成分排查检测、个体识别和亲缘鉴定等侦查过程。目前，以各种形式确认并命名的Y-STR基因座已有220余个。
公安部公布的20个Y-STR核心基因座和15个优选基因座是从全国已展开研究的所有基因座中选择出的突变率较低，多态性较好的基因座。针对全国性调查，应有效利用包含了这35个基因座的相关试剂盒。然而，在分别针对四川、广东、山西、海南等地区男性的Y-STR基因座遗传多态性研究中，研究者发现不同地区人群有着独特的Y-STR基因座重复序列和重复次数，其多态性和突变率也有不同。且目前除主要的35个Y-STR基因座外，对Y-STR遗传多态性了解有限，区域性个体识别和亲缘鉴定的能力也有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人Y-STR基因座荧光标记试剂盒及检测方法，扩大检测范围，提高累积个体识别能力和累积非父排除率。满足Y-STR建库、补充常规Y-STR疑难亲缘鉴定及嫌疑人家系排查的需求。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
本发明所述的人Y-STR基因座的荧光标记试剂盒，包括5’端已标记M13序列的17对特异性PCR引物对、PCR Master Mix、带荧光标记的M13通用引物、PCR缓冲液、用于检测扩增产物的去离子甲酰胺溶液和SIZE-500Plus内标。
所述的Y染色体17个STR基因座为：DYS715、DYS709、DYS716、DYS713、DYS607、DYS718、DYS723、DYS708、DYS714、DYS712、DYS717、DYS721、DYS605、DYS719、DYS726、DYS598、DYS722。
其中，所述17对特异性多重PCR引物对通过扩增能够得到包含不同Y-STR基因座的靶基因片段，17对引物的序列如下所述：
DYS715的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 1所示的上游引物和SEQ ID NO. 2所示的下游引物；DYS709的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物；DYS716的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物；DYS713的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物；DYS607的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 9所示的上游引物和SEQ ID NO. 10所示的下游引物；DYS718的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；DYS723的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 13所示的上游引物和SEQ IDNO. 14所示的下游引物；DYS708的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 15所示的上游引物和SEQID NO. 16所示的下游引物；DYS714的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 17所示的上游引物和SEQ ID NO. 18所示的下游引物；DYS712的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 19所示的上游引物和SEQ ID NO. 20所示的下游引物；DYS717的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 21所示的上游引物和SEQ ID NO. 22所示的下游引物；DYS721的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 23所示的上游引物和SEQ ID NO. 24所示的下游引物；DYS605的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 25所示的上游引物和SEQ ID NO. 26所示的下游引物；DYS719的PCR引物对为序列SEQ ID NO.27所示的上游引物和SEQ ID NO. 28所示的下游引物；DYS726的PCR引物对为序列SEQ IDNO. 29所示的上游引物和SEQ ID NO. 30所示的下游引物；DYS598的PCR引物对为序列SEQID NO. 31所示的上游引物和SEQ ID NO. 32所示的下游引物；DYS722的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 33所示的上游引物和SEQ ID NO. 34所示的下游引物。
所述的荧光标记染料分别为：蓝色荧光标记染料羧基荧光素（FAM）、绿色荧光标记染料2, 7-二甲基-4, 5-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、黄色荧光标记染料四甲基-6羧基罗丹明（TAMRA）、红色荧光标记染料若丹明（ROX）。内标选用STRtyper-21G的橙色内标SIZE-500Plus，此内标包含19条标记橙色荧光染料的DNA片段，分析时定义长度分别为：75，87，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500。但本发明不限于此内标，只要由橙色标记，且长度范围在75-500之间均可使用。
进一步地，17个Y-STR基因座利用荧光染料FAM, JOE, TAMRA, ROX标记分为四组，基因座排布如图1，所述基因座分组及上下游引物浓度见表1。
进一步地，本发明还提供了一种Y-STR基因座的荧光标记复合扩增方法，包括以下步骤：
1、 提取待测样品DNA为模板，利用17对Y-STR基因座特异性引物构建多重PCR扩增体系，得到扩增产物；
2、使用试剂盒中的去离子甲酰胺和SIZE-500Plus内标，热变性后利用基因分析仪检测扩增产物并分析结果。
所述样品的提取方法是基于《GA/T 383-2014法庭科学DNA实验室检验规范》使用免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布等载体收集的人类血液或口腔细胞，也可使用Chelex法、磁珠法或有机提取法。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明所选取的Y-STR基因座多态性良好，针对现有试剂盒中未涉及的17个非核心Y染色体STR基因座进行检测，满足了Y-STR基因座应用于法医学鉴定工作的需要。和现有商品试剂盒联合应用于疑难亲缘关系鉴定及区域性嫌疑人家系排查案件，可提高个体识别能力、非父排除率和鉴定结论的科学性，可作为现有Y-STR鉴定的有益补充。
附图说明
图1是基因座排布示意图。
图2是对照品2800M的Y-STR分型结果。
图3是等位基因分型标准物的电泳图谱。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：亲权鉴定
1、样品来源
本实施例中样本为人静脉血，由某司法鉴定中心提供。采用《GA/T 383-2014法庭科学DNA实验室检验规范》中的方法提取基因组DNA。
2、扩增检测
使用海尔施STRtyper-21G试剂盒检测人21个常染色体STR分型情况，本发明试剂盒检测17个Y-STR分型情况。父亲和孩子分型比对结果如表2所示：父子21个常染色体STR的检测结果有13个不符合遗传规律，可以排除父子关系。进一步检测Y染色体STR，17个Y-STR位点中有12个不符合遗传规律，也验证了上述结论。
实施例2：人群频率调查建库
1、收集不同地区的男性检材
本实验中1260份来自不同地区的样本为：太原市（山西省）394例、重庆市162例、乌兰察布市（内蒙古自治区）154例、三门峡市（河南省）155例、佛山市（广东省）95例、海南黎族113例、海南苗族63例、荆州市（湖北省）124例。
2、提取基因组DNA
DNA的提取参照《GA/T 383-2014法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、利用17对Y-STR基因座特异性引物构建多重PCR扩增体系
PCR反应为15μL体系，包括：7.5μL PCR Master Mix，1.5 μL PCR上下游引物混合物(引物终浓度为0.2～1 μM不等)，5 μL带荧光标记的M13通用引物（浓度5μM），4.4μL ddH2O，10ng DNA模板。
PCR扩增程序为：95℃ 10min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，25个循环；95℃25s，53℃ 30s，72℃ 60s，8个循环；72℃ 15min。
4、检测扩增产物
1）取扩增产物0.4μL，加入10μL去离子甲酰胺和0.3μL SIZE-500Plus 内标，经95℃5min，0℃ 3min 使其变性；
2）利用3130xl基因分析仪、Genemapper 3.2软件检测扩增产物并分析结果。
3）根据测序结果，计算各人群在每个Y-STR位点的等位基因频率，从表3可以得出结论：等位基因在不同地区人群中的分布有明显差异。
实施例3：种属特异性研究
1、收集动物检材
本实验中动物样本分别来自于鸡、牛、鱼、猪、兔、鼠、羊和虾。使用凯杰（DNeasy Blood& Tissue Kit ）试剂盒提取基因组DNA。
2、扩增检测
依照实施例2的方法进行多重PCR扩增和电泳检测。未检出17个Y-STR基因座，说明这些基因座仅存在于人类Y染色体中，具有种属特异性。
序列表
<110> 湖北崇新司法鉴定中心；山西医科大学
<120> 一种人Y-STR基因座荧光标记试剂盒及检测方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ggagaaaatt caatgcagat 20
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<212> DNA
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gaatgacaga ccaagactct ctc 23
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<212> DNA
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tgtaaaacga cggccagtct ttattaggca ggcagttttg 40
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
ccagacaatg tatgagcaag c 21
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
tgtaaaacga cggccagtcc actcatcagt gctcagcta 39
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
gccaaccagc aatgttgtc 19
Claims (5)
1.一种人Y-STR基因座荧光标记试剂盒，其特征在于，包含17对特异性扩增引物，可分组复合扩增17个Y-STR基因座：DYS715、DYS709、DYS716、DYS713、DYS607、DYS718、DYS723、DYS708、DYS714、DYS712、DYS717、DYS721、DYS605、DYS719、DYS726、DYS598、DYS722。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，17个Y-STR基因座对应的特异性引物如下所述：
DYS715的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 1所示的上游引物和SEQ ID NO. 2所示的下游引物；DYS709的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物；DYS716的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物；DYS713的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物；DYS607的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 9所示的上游引物和SEQ ID NO. 10所示的下游引物；DYS718的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；DYS723的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 13所示的上游引物和SEQ IDNO. 14所示的下游引物；DYS708的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 15所示的上游引物和SEQID NO. 16所示的下游引物；DYS714的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 17所示的上游引物和SEQ ID NO. 18所示的下游引物；DYS712的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 19所示的上游引物和SEQ ID NO. 20所示的下游引物；DYS717的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 21所示的上游引物和SEQ ID NO. 22所示的下游引物；DYS721的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 23所示的上游引物和SEQ ID NO. 24所示的下游引物；DYS605的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 25所示的上游引物和SEQ ID NO. 26所示的下游引物；DYS719的PCR引物对为序列SEQ ID NO.27所示的上游引物和SEQ ID NO. 28所示的下游引物；DYS726的PCR引物对为序列SEQ IDNO. 29所示的上游引物和SEQ ID NO. 30所示的下游引物；DYS598的PCR引物对为序列SEQID NO. 31所示的上游引物和SEQ ID NO. 32所示的下游引物；DYS722的PCR引物对为序列SEQ ID NO. 33所示的上游引物和SEQ ID NO. 34所示的下游引物。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，17个Y-STR基因座的特异性扩增引物对的正向引物5’端添加M13通用引物序列。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，特异性扩增引物利用荧光染料FAM,JOE, TAMRA, ROX标记分为四组：DYS715、DYS709、DYS716、DYS713、DYS607为第一组；DYS718、DYS723、DYS708、DYS714为第二组；DYS712、DYS717、DYS721、DYS605为第三组；DYS719、DYS726、DYS598、DYS722为第四组。
5.使用权利要求1所述试剂盒进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）提取待测样本中的DNA，利用所述17对引物进行分组多重PCR扩增；
2）使用基因分析仪检测所述扩增后的产物，并使用分析软件对结果进行分析。
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