CN109112185B - 一种用于鉴别中国人参的dna杂交方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的鉴别中国人参的DNA杂交方法中使用的探针是基于人参属基因组中达玛烯二醇合酶(dammarenediol synthase)基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点设计。本发明人实验中发现中国人参、西洋参和三七的达玛烯二醇合酶基因相似性高，为了更加准确的鉴别中国人参，发明人设计了多种探针序列，最后筛选出了可以准确鉴别中国人参的探针序列。

Description

一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法
技术领域
本发明涉及一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法。
背景技术
中药材人参在分类学上,属于Plantae(植物界)，Apiales(伞形目)，Araliaceae(五加科)，Aralioideae(人参亚科)，Panax(人参属)。人参属下有三个主要的种分类：Panax Ginseng(亚洲参/中国人参)，Panax notoginseng(三七)和Panax Quinquefolius(西洋参)。
虽然中国人参、三七和西洋参起源于同一属，但三种中药材的用途和性质有不同。如 中国人参并不会影响华法林(Warfarin)药物的效果，但是西洋参可以显著影响华法林的 抗凝血活性性质。另外非人工养殖的、自然生长的中国人参价格也比三七和西洋参要高得 多。
由于中国人参、三七和西洋参功效各异、价值相差大，对中国人参快速鉴别的技术和 手段对于保护消费者权益显得十分重要。然而中国人参、三七和西洋参三种中药材在外观 形态学和化学指纹图谱上都极度相似，鉴别中国人参至今仍然是一个十分大的挑战。
基于人参属基因组达玛烯二醇合酶(dammarenediol synthase)基因的单核苷酸多态 性建立的DNA条形码技术，为准确鉴别中国人参提供了一种新方法。但是现在用于鉴别中 国人参的DNA条形码技术，步骤都会包括形成PCR产物和序列鉴别2步，并且都涉及凝胶 电泳分离(gel electrophoretic separation)，过程涉及电场作用及特殊染色，需要花费 大量时间和操作技术上的成本，快速鉴别中国人参的需求任然无法满足，因此需要提供一 种快速鉴别中国人参的技术。
微流控芯片，是一种操控流体在微小通道中流动的系统，能够大幅减少样品消耗，减 少样品处理时间，提高检测分辨率/灵敏度，在疾病诊断、药物筛选、环境检测、食品安全等领域中有广阔的使用前景。
发明内容
本发明提供一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法。
一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，所述方法的探针序列为SEQ ID NO：2。
所述用于鉴别中国人参的DNA杂交方法中使用的洗涤液为金纳米颗粒溶液。
所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的粒径为5nm，金纳米颗粒的浓度为5-20nM。
所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的浓度为5nM。
所述金纳米颗粒溶液中起稳定作用的DNA浓度为8nM。
所述用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，为基于微流控芯片的方法，所述微流控芯片 包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流 道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样 本DNA流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹交叉处为反应区。
所述通道板的数量为不少于1块。
所述用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其操作步骤包括：
(1)探针加入到微流控芯片中，沿探针固定轨迹被固定到所述测试板表面；
(2)洗涤微流控芯片后，移除流道板，分别洗涤和吹干流道板和测试板，重新叠放流 道板和测试板；
(3)将生物素标记的单链待测样本DNA加入到微流控芯片中，待测样本DNA沿待测样 本DNA流动轨迹流动，在反应区与固定的探针杂交；
(4)除去微流道芯片中的溶液，洗涤微流道芯片，在微流道芯片中加入Cy-5标记的链霉亲和素溶液；
(5)洗涤和干燥微流道芯片，取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。
一种鉴别中国人参的DNA杂交方法试剂盒，所述试剂盒包括微流控芯片、Cy-5标记的 链霉亲和素溶液、洗涤溶液、溶解液、探针；所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹交叉处为反应区；所述探针序列为SEQ ID NO：2，所述的溶解液用于溶解和稀释所述探针和待测样本DNA。
所述的溶解液成分为含0.15M NaCl、0.015M PH7.0的柠檬酸钠缓冲液、0.15％十二烷 基苯磺酸钠的溶液。
所述洗涤溶液为NaCl-NAHCO3水溶液、NABH4溶液、1倍PBS缓冲液，金纳米颗粒溶液、含0.15％吐温的1倍PBS缓冲液。
本发明提供的鉴别中国人参的DNA杂交方法中使用的探针是基于人参属基因组中达玛 烯二醇合酶(dammarenediol synthase)基因的单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism,SNP)位点设计。本发明人实验中发现中国人参、西洋参和三七的达玛烯二醇合酶基因相似性高，为了更加准确的鉴别中国人参，发明人设计了多种探针序列，最后筛选出了可以准确鉴别中国人参的探针序列。
本发明提供的鉴别中国人参的DNA杂交方法将微流控芯片和基因多态性检测相结合， 一方面保留了微流控芯片无需电泳、可以使用体积小(0.5μL)和低浓度(为0.1nM)样品、可同时检测多个样品、以及反应速度快的优点，另一方面也保留了基因多态性检测准确度高的优点，因此本发明的鉴别中国人参的NA杂交方法检测性能优越。
附图说明
图1微流控芯片示意图
其中1为测试板，2为通道板。
图2微流控芯片使用原理示意图
其中3为探针固定轨迹；4为待测样品DNA轨迹；5为反应区；
图2-a为探针加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；
图2-b为探针固定轨迹3示意图；
图2-c为待测样品DNA加入微流控芯片时，测试板1和通道板2的叠放位置示意图；
图2-d为探针固定轨迹3和待测样品DNA轨迹4交叉状态示意图；
图2-e为测试板用激光扫描仪扫描荧光信号下的示意图。
图3探针筛选结果
Pgin为中国人参的待测样本DNA反应区，Pquin为西洋参的待测样本DNA反应区；
A为N1G探针的反应区，B为N2G探针的反应区。
图4探针鉴定人参验证
具体实施方式
为了更好理解本发明的技术方案和优点，以下通过具体实施方式，并结合附图对本发 明做进一步说明。
实施例1
1、各种溶液配置
探针溶液的配置
取溶解液与探针，配置探针溶液，其中配置成的探针溶液成分如下：
(1)25μM胺标记的寡核苷酸单链
(2)1.5M NaCl
(3)0.15M碳酸氢钠
(4)0.15％十二烷基苯磺酸钠(SDS)
待测样本DNA溶液的配置
取溶解液与待测样本DNA，配置待测样本DNA溶液，其中配置成的待测样本DNA溶液成分如下：
(1)25ng/uL生物素标记的寡核苷酸单链
(2)0.015M NaCl
(3)0.015M柠檬酸钠(pH 7.0)
(4)0.15％十二烷基苯磺酸钠(SDS)
金纳米颗粒(AuNP)溶液的配置
实验前将AuNP储存液加至AD6(注：AD6是一条单链DNA，序列为：CGC CGA TTG GACAAA ACT TAA A)及PBS等混合溶液中，进行如下操作：
(1)以8000rpm离心5秒(离心分离至管底)，然後振荡数秒；
(2)将离心管置于95℃上加热10min，取出在室温下冷却90min；
(3)加入1倍PBS溶液，随后进行离心和振荡，该溶液需在1h内使用。
2、实验操作步骤
(1)1μL探针溶液加入到微流控芯片中，室温反应1小时，让探针沿探针固定轨迹被固定到测试板表面；
(2)移除探针溶液，用NaCl-NaHCO3水溶液(含1.5M NaCl，0.15M NaHCO3)洗涤微 流控芯片，移除流道板，放测试板在2.5mg/mL的NaBH4溶液，室温反应15min,再以1倍 PBS溶液清洗测试板,分别吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；
(3)将1μL已变性且生物素标记的待测样本DNA溶液加入到微流控芯片中，待测样本DNA沿待测样本DNA流动轨迹流动，等待待测样本DNA在反应区与固定探针杂交1小 时；
(4)除去微流道芯片中的溶液，洗涤微流道芯片，移除微流道芯片中的液体，然后在 微流道芯片中加入0.6μL 50μg/mL的Cy-5标记的链霉亲和素溶液，室温反应15min；
(5)除去Cy-5标记的链霉亲和素溶液，用含0.15％吐温的1倍PBS缓冲液洗涤干燥微流道芯片，移开通道板，再以1倍PBS溶液清洗测试板，干燥测试板；
(6)取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。
实施例2探针序列的筛选
探针设计了两种，分别记为N1G和N2G，两种探针的序列分别为：
N1G：CTAAAAAAAAAGTATTTTTCATCTAAATTTTGAA(SEQ ID NO：1)
N2G：GAATTTGAAAGTGTCTTAAATTGATTTTCAA(SEQ ID NO：2)
待测样本DNA制备2份，分别来源于中国人参和西洋参，中国人参的待测DNA样本记为Pgin，西洋参的待测DNA样本记为Pquin。
按照实施例1的操作进行实验，其中实施例1中步骤(4)洗涤微流道芯片中洗涤液使 用1倍PBS缓冲液，实验结果如图3所示。
从图3上可以看到，探针N1G固定的反应区，中国人参和西洋参的荧光反应无显著性 差异，探针N1G无法很好的区分出中国人参和西洋参；而在探针N2G固定的反应区，中国人参的反应信号高于西洋参的反应信号，探针N2G可以很好的区分出中国人参和西洋参。所以探针N1G被排除，选择探针N2G作为鉴别中国人参的探针。
实施例3
(1)1μL序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的2种探针溶液沿通道板上不同的微流道 加入到微流控芯片中，室温反应1小时，让2种探针分别沿探针固定轨迹被固定到测试板表面；
(2)移除探针溶液，用NaCl-NaHCO3水溶液(含1.5M NaCl，0.15M NaHCO3)洗涤微 流控芯片，移除流道板，用2mg/mL的NaBH4溶液分别洗涤流道板和测试板，分别吹干流道 板和测试板，重新叠放流道板和测试板；
(3)将1μL已变性且生物素标记的中国人参、西洋参、代号为Gin 3和代号为Am G的四种待测样本DNA沿通道板上不同的微流道加入到微流控芯片中，待测样本DNA沿待测样本DNA流动轨迹流动，等待待测样本DNA在反应区与固定探针杂交1小时；
(4)除去微流道芯片中的溶液，用0.6μL金纳米颗粒浓度为10nM的溶液(DNA含量为8nM)洗涤微流道芯片，移除微流道芯片中的液体，然后在微流道芯片中加入0.6μL 50μg/mL的Cy-5标记的链霉亲和素溶液，室温反应15min；
(5)除去Cy-5标记的链霉亲和素溶液，用含0.15％吐温的1倍PBS缓冲液洗涤干燥微流道芯片，移开通道板，再以1倍PBS溶液清洗测试板，干燥测试板；
(6)取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号，实验结果如图4所示。
从图4上可以看到，在探针序列为SEQ ID NO：1的实验区域，中国人参、西洋参、代号 为Gin 3和代号为Am G的四种待测样本DNA各自反应区的荧光强度相差不显著，该探针无 法很好的区分中国人参和西洋参，也无法鉴别出代号为Gin 3和代号为Am G的2种未知样 本的植物种类。在探针序列为SEQ ID NO：2的实验区域，中国人参、西洋参待测样本DNA各 自反应区的荧光强度相差显著；并且代号为Gin 3未知待测样本DNA的反应区荧光强度与 中国人参待测样本DNA反应区的荧光强度相当，与西洋参待测样本DNA反应区的荧光强度 差异显著；代号为Am G未知待测样本DNA的反应区荧光强度与中国人参待测样本DNA反应 区的荧光强度差异显著，而与西洋参待测样本DNA反应区的荧光强度相当。
因此根据图4的实验结果，可以判断代号为Gin 3未知待测样本DNA来自中国人参，代号为Am G未知待测样本DNA不是来自于中国人参。
经Sangar DNA测序证实，代号为Gin 3的待测样本DNA来自于人参品种，而代号为Am G的待测样本DNA不来自于中国人参，与本发明的鉴别中国人参的DNA杂交方法结果匹配。

Claims (6)

1.一种用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于操作步骤包括：将序列为SEQ IDNO：2探针固定到微流控芯片中，洗涤微流控芯片后， 将生物素标记的单链待测样本DNA加入到微流控芯片中，除去微流道芯片中的溶液，用金纳米颗粒溶液洗涤微流道芯片。
2.如权利要求1所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述金纳米颗粒溶液中金纳米颗粒的浓度为10nM。
3.如权利要求1所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述方法为基于微流控芯片的方法，所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹交叉处为反应区。
4.如权利要求3所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述流道板的数量为不少于1块。
5.如权利要求3所述的用于鉴别中国人参的DNA杂交方法，其特征在于所述方法其操作步骤包括：
（1）将序列为SEQ ID NO：2的探针加入到微流控芯片中，沿探针固定轨迹被固定到所述测试板表面；
（2）洗涤微流控芯片后，移除流道板，分别洗涤和吹干流道板和测试板，重新叠放流道板和测试板；
（3）将生物素标记的单链待测样本DNA加入到微流控芯片中，待测样本DNA沿待测样本DNA流动轨迹流动，在反应区与固定的探针杂交；
（4）除去微流道芯片中的溶液，用金纳米颗粒浓度为10nM的溶液洗涤微流道芯片，在微流道芯片中加入Cy-5标记的链霉亲和素溶液；
（5）洗涤和干燥微流道芯片，取测试板用激光扫描仪扫描荧光信号。
6.一种鉴别中国人参的DNA杂交方法试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括微流控芯片、Cy-5标记的链霉亲和素溶液、洗涤溶液、溶解液、探针；所述微流控芯片包括测试板和流道板，所述流道板表面刻有一条以上、互不交叉的微流道；调整所述流道板与所述测试板的叠放位置，在所述测试板表面形成相互交叉的探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹，所述探针固定轨迹和待测样本DNA流动轨迹交叉处为反应区；所述探针序列为SEQ ID NO：2，所述的溶解液用于溶解和稀释所述探针和待测样本DNA。
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