MX2007010819A - Edulcorante de stevia. - Google Patents

Abstract

Una planta nueva que pertenece a la variedad Stevia Rebaudiana Bertoni que contiene por lo menos cuatro partes en peso o mas de Rebaudiosida A con respecto a una parte en peso de Esteviosida, y permite obtener un edulcorante de una buena calidad que es facilmente producido de dicha planta o de las hojas secas de la misma.

Description

EDULCORANTE DE STEVIA SOLICITUDES RELACIONADAS ANTERIORES Esta solicitud reclama prioridad de la WO2006093229, presentada el 02/03/2006 y la JP2005-060930 Presentada 04/03/2005. Cada una se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

DECLARACIÓN DE INVESTIGACIÓN PATROCINADA FEDERALMENTE No aplicable REFERENCIA AL APÉNDICE MICROFICHAS No aplicable CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente ¡nvención se relaciona con una planta que pertenece a la variedad de la Stevia Rebaudiana Bertoni con un alto contenido en proporción de Rebaudiosida-A comparado con la Esteviosida, y un método para la producción de un edulcorante extraído de dicha planta y/o sus hojas secas. En adición, la presente invención está relacionada con un método para producir Rebaudiosida A de alta pureza a partir de dichos edulcorantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La Stevia es una planta perenne del Compositae Asteraceae originalmente de Paraguay, Sur América, y su nombre científico es Stevia Rebaudiana Bertoni.

La Síe 'a contiene componentes edulcorantes que tienen una dulzura de 300 veces o más de aquella del azúcar, y es plantada para uso como un edulcorante natural extraído mediante la extracción de estos componentes edulcorantes. La Esteviosida (C38H6oOi8), la Rebaudiosida A (C44H20O23), la Rebaudiosída C, D y E, la Dulcosida A etc., han sido conocidos como componentes edulcorantes. En la variedad generalmente plantada, la Esteviosida (ST) es el principal componente entre los componentes dulces anteriormente mencionados, con un contenido de Rebaudiosida A (RA) de alrededor de 3/10 a 4/10 aquel de la Esteviosida y aquel de la Rebaudiosida C siendo ligeramente menor, pero dependiendo de las variedades, existe la Stevia con Rebaudiosida C como el mayor componente. Esto es, hay varias variedades. Entre los gustos tal como el amargor y la astringencia, la dulzura es muy delicada. Ya que la Esteviosida tiene un grado de dulzura de 300 veces la del azúcar, ésta ha sido usada como un edulcorante natural en la industria alimenticia. Su dulzura es relativamente similar a aquella del azúcar, sin embargo, existe un defecto ya que un gusto amargo desagradable permanece en la boca. Por lo tanto, no es deseable para un edulcorante contener una gran cantidad de Esteviosida. De otro lado, la Rebaudiosida A tiene una dulzura de una buena calidad y un grado de dulzura de 1 ,3 a 1 ,5 veces aquella de la Esteviosida. Por lo tanto es necesario reducir el costo de producción de la Rebaudiosida A, para mantener un rendimiento estable de las hojas secas, para desarrollar una variedad de Stevia que contenga un alto contenido de Rebaudiosida A que tenga excelente calidad edulcorante para su uso como materia prima edulcorante, y al mismo tiempo, poder mantener su suministro continuo y producir un edulcorante excelente con base en lo anterior. Los inventores de la presente invención llevaron a cabo un cultivo de plantas mediante la repetición de cruces selectivos de variedades convencionales, obteniendo así variedades de Sfe 'a con una proporción alta de contenido de Rebaudiosida (RA) con respecto a la Esteviosida (ST), y se han producido edulcorantes excelentes con una proporción de contenido de Rebaudiosida A con respecto a Esteviosida (ST), mediante la extracción de componentes edulcorantes de estas plantas (ver la Literatura de Patentes 1-1- a 1-3 que se describirá posteriormente), sin embargo, se ha deseado el desarrollo de variedades estables con un alta y mejor proporción de contenido de Rebaudiosida A. Por otro lado, en la reproducción de plantas de Stevia, un asunto clave es encontrar un método de identificación de las plantas de Stevia. Como método de identificación de plantas de Stevia mejoradas, podemos pensar en identificaciones mediante la altura de las plantas, la forma de las hojas, etc., sin embargo, ya que la Síe 'a no es compatible con si misma y tiende a convertirse en híbridos, solamente la clasificación por las alturas de las plantas, las formas de las hojas, etc. no puede lograrse. Además, existe una identificación comparativa con base en la resistencia a las enfermedades, a patógenos específicos de la Stevia, sin embargo, aunque las hojas muertas y los puntos negros de las hojas que se presentan específicamente en la Stevia son causados por los hongos Septoria y la Alternaría, estos hongos viven en el suelo. Por lo tanto, ya que estos síntomas ocurren no solamente en Japón sino también en todo el mundo, estas características solas son insuficientes para la identificación de una variedad. Con una variedad mejorada con alto contenido edulcorante y una proporción alta de contenido de Rebaudiosida A en comparación con la Esteviosida, uno puede pensar en un método de identificación por la proporción del contenido, sin embargo, una variación en la proporción del contenido de edulcorante puede inevitablemente suceder dependiendo de la condición del clima durante el periodo de crecimiento, un tiempo de cosecha, etc., este método no es práctico. Recientemente, se ha desarrollado un método mediante el cual se hace la identificación mediante identificación de ADN con base en el método RAPD que usa una mezcla de cebador (ver Referencia de Patente 2 más adelante), sin embargo, no es claro si es posible o no aplicar esto para identificar una planta de acuerdo con la presente ¡nvención.

Referencia de Patente 1 : Publicación de Patente Abierta al Público Gazeta 59/1984-045848 Referencia de Patente 2: Publicación de Patente Abierta al Público Gazeta 60/1985-160823 Referencia de Patente 3: Publicación de Patente Abierta al Público Gazeta 61/1986-202667 Referencia de Patente 4: Publicación de Patente Abierta al Público Gazeta 2003-9878 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Abreviaturas: ST = Esteviosida; RA = Rebaudiosida A La presente invención es para crear variedades de plantas con excelentes resultados en la cantidad del contenido del componente edulcorante y la proporción del contenido del componente edulcorante, que permita distinguir los genes de la mismas mediante el método RAPD para mantener las características de la misma, diferenciándolas así de las otras variedades de Stevia, y para proporcionar edulcorantes con excelentes en propiedades edulcorantes y un método para la producción de estos. El primer aspecto de la presente ¡nvención se relaciona con una variedad de Stevia Rebaudiana Bertoni que contiene 4 partes en peso o más de Rebaudiosida A con respecto a una parte en peso de Esteviosida. Para esto, como se describirá posteriormente, mediante cruzamiento repetido y selección, se crearon nuevas plantas que pertenecen a la variedad Stevia Rebaudiana Bertoni, las cuales contienen por lo menos 4 partes en peso de Rebaudiosida A con respecto a una parte en peso de Esteviosida. El segundo aspecto de la presente invención se relaciona con un método para la producción de un edulcorante que contiene 4 partes en peso o más de Rebaudiosida A con respecto a una parte en peso de Esteviosida, dicho método para la producción se ha caracterizado mediante llevar a cabo la extracción desde la planta descrita en el parágrafo anterior o de las hojas secas de la misma, con agua o un disolvente que contiene agua. El tercer aspecto de la presente invención se relaciona con un método para la producción de un edulcorante de alta pureza que contiene 40 partes o más de Rebaudiosida A con respecto a una parte en peso de Estevíosida; dicho método para la producción de un edulcorante que contiene 40 partes en peso o más de Rebaudiosida A con respecto a una parte en peso de Esteviosida, siendo el contenido del mismo de 92% o más alto, se caracteriza por llevar a cabo la recristalización del edulcorante obtenido en el párrafo anterior. En una mejora de una variedad por medio de cruce y selección, el método de identificación de una variedad seleccionada tiene un significado importante. Los inventores de la presente invención han estudiado los métodos de identificación con base en la identificación del ADN mediante el método RAPD.

La presente invención suministra un edulcorante excelente en calidad de endulzamiento y un método para la producción del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es un diagrama de electroforesis de las secuencias de base del ADN de la variedad Morita, SS y SN. Las secuencias de base características son indicadas con flechas. Los símbolos en la Fig. 1 son los siguientes: a: Marcador Hind lll b y e: Variedad SN c y f: Variedad Morita d y g: Variedad SS h: 1 kbp del marcador en escalera del ADN La Fig. 2 es un diagrama de electroforesis de la secuencia del nucleótido base de ADN de la variedad Morita y de la SN. Las secuencias de base características están indicadas con flechas. Los símbolos en la Fig. 2 son los siguientes: Morí: Variedad Morita SN: Variedad SN M: Marcador de ADN (escalera de 100 bp) DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES DE LA INVENCIÓN El método RAPD (método de ADN polimórfico amplificado aleatorio) usado para la identificación en la presente invención es uno de los métodos analíticos de ADN, y es un método para el análisis mediante electroforesis de un patrón de ADN amplificado en una región de ADN que está entre secuencias iguales o similares como la de los cebadores usados en una reacción PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) usando un número plural de cebadores. Adicionalmente, debido a que el bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) es una sal de amonio cuaternaria que tiene un grupo alquilo de cadena larga, y forma un complejo ¡nsoluble con un poli anión tal como un ácido nucleico, este puede ser utilizado para aislar un ácido nucleico. En los medios mediante los cuales se clasifica una variedad con base en diferencias en el ADN, un ADN del genoma es aislado únicamente de una planta mediante CTAB, el ácido ribonucleico (ARN) es removido, y el producto PCR amplificado obtenido mediante el método PCR se distingue por el uso de una mezcla de cebador por las diferencias en la huella digital de ADN obtenida mediante el método de electroforesis de gel de agarosa. En el caso de la planta de acuerdo con la presente invención, como se describirá más adelante, se ha confirmado que se muestra una secuencia base característica en una porción ¡nferior a 2000 bp.

En realidad, con el ADN del genoma precipitado selectivamente como un patrón con respecto a la planta como materia prima, una reacción de 35 ciclos se lleva a cabo a 94 grados (30 s), 55 grados (30 s), y 72 grados (120 s) mediante el uso de un conjunto de, por ejemplo, A06 (ACTGGCCGAGGG (SEQ ID NO: 1)) y A48 (CCGCAGGGACCA (SEQ ID NO: 2)) como cebadores y rTaq (Takara), y después, se permite una reacción durante 10 min a 72 grados. Después de esto, el producto PCR amplificado es confirmado mediante el método de electroforesís de gel de agarosa, y por lo tanto la planta puede ser confirmada por una banda específica de ADN. Entonces, para la producción de un edulcorante, dicha planta u hojas secas de la misma son sometidas a extracción con agua o un disolvente que contiene agua, la solución del extracto se concentra como está o si es necesario, se remueven las impurezas iónicas con una resina de intercambio aniónico o una resina de intercambio catiónico, o con carbón activado, se permite a los componentes edulcorantes ser absorbidos en la resina de absorción, seguido por la elución con un disolvente hidrofílico, y el eluído es concentrado, y secado para producir el edulcorante. El método para la producción de un edulcorante puede incluir medios de refinamiento usuales tales como una etapa de decoloración además de lo anterior, según se requiera de manera apropiada, y un método mediante el cual obtener una Rebaudiosida A de alta pureza puede incluir etapas usuales tales como la separación de membrana, extracción con alcohol, y cristalización, etc. Además, el método de cristalización, es posible usarlo apropiadamente al agregar agua a un disolvente orgánico tal como etanol y metanol como disolvente de cristalización. Es posible agregar otros edulcorantes naturales o artificiales, un agente de dilución, etc., a este edulcorante así obtenido. Para la reproducción, las variedades que contienen una relativamente alta concentración de Rebaudiosida A son cruzadas, y seleccionadas. Primero, SF5-1 y SF5-2 (descritas en la Publicación de Patente Abierta al Público Gazeta No. Hei 10 1998-271928 No. 271928-1998) que contienen Rebaudíosida A a una alta concentración, son artificialmente cruzados, TD-1 (descrito en la Publicación de Patente Abierta al Público Gazeta No. 2003-9878) es seleccionada de las semillas así obtenidas, las que son cruzadas artificialmente adicionalmente, una variedad que tiene resistencia al hongo Septoria y al hongo Alternaria es seleccionada entre estas semillas, el componente edulcorante de esta es analizada, y se selecciona una planta que contiene 4 partes en peso o más de Rebaudiosida A con respecto a una parte en peso de Esteviosida, que tiene un alto contenido de edulcorante, y es relativamente excelente en resistencia a la enfermedad. Más aún, la cantidad de contenido de los componentes edulcorantes, la proporción de los componentes edulcorantes, y las condiciones de crecimiento son observados repetidamente, y finalmente esta es llamada la variedad Morita cuyos genes fueron buscados. Adicionalmente, en este momento, la Solicitante ha completado el depósito internacional de la variedad Morita concerniente a esta invención (Depositario de Organismos de Patente Internacional (IPOD)(Japón) (Recibo No. FERM BP-10353). Por lo tanto, es posible obtener fácilmente la planta de dicha invención de las semillas de la variedad Morita del depósito. La Stevia es auto incompatible, y por lo tanto no es necesariamente verdad que la planta objetivo pueda ser siempre obtenida de dichas semillas, la planta objetivo puede ser fácilmente seleccionada por identificación de ADN descrita en esta Solicitud. Y si es necesario, es cruzada con otra variedad de Síe 'a de alta calidad (por ejemplo TD-1) y la selección se hace de acuerdo con el Ejemplo 1 ilustrado que va a ser descrito más adelante, puede ser fácilmente obtenida una planta que contiene Rebaudiosida A a una alta concentración. Estas plantas están todas cubiertas por las plantas que pueden ser obtenidas de la variedad Morita depositada internacionalmente, esto es, la variedad Morita. Ahora se describen específicamente el proceso de cosecha, las características de la misma, etc. Sin embargo, la presente invención no está limitada a estos procesos de reproducción y métodos de cultivo.

EJEMPLO 1: REPRODUCCIÓN Y ENSAYOS De las semillas obtenidas por cruce de las variedades que contenían Rebaudiosida A en una concentración relativamente alta, las semillas obtenidas mediante reproducción por cruce artificial de SF-1 y SF 5-2 (descritas en la Publicación de Patente Abierta al Público No. Heí 10/1998-271928) que contienen Rebaudiosida A fueron cosechadas en un invernadero en la planta Nimi, las plántulas germinadas fueron replantadas en macetas de crecimiento de plántulas, y 600 plántulas de una altura de cerca de 8 cm o más fueron transplantadas a una tierra de agricultura en la planta a principios de mayo, mientras que cerca de 20 kg por área de cada uno de los componentes fertilizadores de nitrógeno, fósforo y potasio fueron aplicados a la tierra. A principios de julio, se aplicó como fertilizantes adicionales, 10 kg de cada uno de los componentes fertilizadores de nitrógeno, fósforo y potasio por área a la tierra. A principios de septiembre, los componentes edulcorantes fueron analizados, y el material de la variedad TD-1 (descrita en la Publicación de Patente Abierta al Público No. 2003-9878) fue seleccionada por contener 3 veces más de Rebaudiosida A con respecto a la Esteviosida. En 1998, la variedad TD-1 fue obtenida por cruzamiento artificial en el invernadero en la planta Nimi, las semillas obtenidas fueron sembradas en un invernadero en la planta Nimi en marzo de 1999, las plántulas que germinaron fueron replantadas en macetas para el crecimiento de plántulas, y 300 plántulas de una altura de cerca de 7 cm o mayores fueron transplantas en una tierra de agricultura en la planta a principios de mayo, mientras que 20 kg por área de cada uno de los componentes fertilizantes de nitrógeno, fósforo y potasio fueron aplicados a la tierra. A comienzos de julio, se utilizó fertilizante adicional, 10 kg de cada uno de los componentes fertilizadores de nitrógeno, fósforo y potasio fueron aplicados adicionalmente a la tierra. A principios de septiembre, los componentes edulcorantes fueron analizados, y se seleccionó el material que contiene 4 partes en peso o más de Rebaudíosida A con respecto a la Steviosída, y es superior en resistencia a las enfermedades y tiene un mejor crecimiento que la variedad TD-1. A mitad de abril de 2000, las 100 plántulas que germinaron de estas fueron cortadas y plantadas. A principios de mayo, estas, similarmente, fueron plantadas en una tierra de agricultura de la planta, y para finales de julio, la resistencia a las enfermedades y el crecimiento de las mismas fueron investigados nuevamente, y se confirmó que las proporciones de los componentes edulcorantes y las cantidades en contenido fueron superiores. Adicionalmente, durante 3 años, desde el 2001 , se ha confirmado que la resistencia a las enfermedades, las proporciones de componentes edulcorantes, las cantidades de contenidos de los componentes edulcorantes y el rendimiento de las hojas secas fueron superiores y no había cambio en el crecimiento ni en los componentes, y esta nueva planta se llamó la variedad Morita. Para poder comparar la variedad Morita y otras variedades, se hicieron cortes de 40 de cada una de las TD-1 (TD) cuyo principal componente era Rebaudiosida A, y de otra variedad de Stevia general (SN) cuyo principal componente edulcorante era la Esteviosida y cuyos componentes edulcorantes secundarios eran Rebaudiosida A y fueron plantadas similarmente en la tierra de agricultura en la planta. La presencia o ausencia de apariciones de cualquier enfermedad fue investigada en cada una de las 10 variedades arbitrariamente seleccionadas a comienzos de junio escogidas de las 200 plántulas de la variedad Morita multiplicadas de los cortes anteriormente mencionados transplantados en la tierra de agricultura a comienzos de mayo, y 40 plántulas cada una de la variedad TD y SN, y de ahí en adelante, las plántulas de las variedades Morita, TD y SN cada una fueron cortadas a una altura de 15 cm por encima de la tierra, las hojas fueron separadas y luego secadas, y estas fueron usadas como muestras para el análisis.

Los resultados del análisis son como sigue.

A mitad de julio, se agregaron o se aplicaron fertilizantes adicionales, y después se seleccionaron 20 patrones de cada variedad por sección y se investigó el establecimiento de condiciones de enfermedades debido a los hongos Septoria y Alternaría, cada variedad fue recortada por las secciones por encima de la tierra, las hojas fueron separadas y luego secadas, y estas fueron usadas como muestras analíticas.

Los resultados del análisis fueron como sigue.

Con la variedad Morita, la proporción de ocurrencia de puntos negros en las hojas inferiores fue relativamente baja, y esta fue superior a las otras variedades en cuanto al contenido de componentes edulcorantes, y el rendimiento de las hojas secas. Con la variedad TD en comparación con la variedad Morita, un gran número de puntos negros en las hojas inferiores debido al hongo Septoria fueron observados, las hojas empezaron a ponerse amarillosas debido al hongo Septoria. La variedad SN mostró amarillamiento de las hojas hasta el tercer nodo de las hojas inferiores debido al hongo Septoria, y las hojas del primer nodo se marchitaron. En marzo de 2004, 200 cortes de las puntas de las orejas que nacieron de la variedad Morita fueron plantadas, al final de abril, ellas fueron replantadas en la tierra de agricultura, las secciones por encima de la tierra fueron cosechadas a final de mayo, a final junio, a final de julio, a final de agosto, a final de septiembre y al final de octubre después de la florescencia, solamente las hojas fueron separadas y secadas y la cantidad de contenido de componentes edulcorantes se midió. Los componentes edulcorantes fueron medidos por cromatografía líquida de alto rendimiento.

La variedad Morita mostró diferentes cantidades de contenido de componentes edulcorantes y proporciones de componentes edulcorantes dependiendo del periodo de crecimiento; se observó una tendencia en la cual a medida que el periodo de crecimiento se hacía más largo, la cantidad de contenido de componentes edulcorantes se incrementaba, y por otro lado la cantidad de contenido de Esteviosida disminuía. A finales de octubre, que es el tiempo de la florescencia, la cantidad de contenido de componente edulcorante disminuyó.

La variedad Morita resultó la mejor en términos de cantidad de contenido de componente edulcorante, la proporción del componente edulcorante y el rendimiento, y la variedad Morita fue identificada por el método PCR. Un mortero esterilizado por secado y calentamiento fue cargado con cerca de 0.2 g de hojas de variedad Morita, a las cuales se agregó nitrógeno líquido, estas fueron molidas y aplastadas por un triturador, y cerca de 0.05 g al mismo tiempo se colocaron en microtubos mediante una espátula. Se agregaron a esta 300 µl de solución CTAB al 2% (solución de CTAB al 2% (50 ml): composición de 100 mM, tris-HCl (pH 8.0) 20 mM, EDTA (pH 8.0), CTAB al 2%, 1.4 M NaCI), y después de agitado y mezclado, el tubo fue movido a un bloque de calor calentado a 65°C, y fue calentado durante 30 min. Una cantidad igual (300 µl) de cloroformo/alcohol isoamilico (24:1) se agregó a esta, seguido por agitación gradual. Después de centrifugar y separarla a 14000 rpm durante 15 min, la capa acuosa, que fue la capa superior del contenido separado en dos capas fue movida a un nuevo tubo. Las operaciones después del cloroformo/alcohol isoamilico anteriormente mencionado fueron repetidas una vez más, y una capa acuosa fue movida a un nuevo tubo. 400 µl de solución de CTAB al 1% (solución de CTAB al 1% (50 ml): composición tris-HCl 1 M, 2.5 mM, EDTA 1.0 ml, CTAB al 1% 0.5 g) se agregó a este, y después de agitación y mezclado durante 15 minutos se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 h, seguido por separación centrifuga a 14000 rpm durante 15 minutos.

El sobrenadante fue descartado, seguido por la adición de 400 µl de CSCI 1 M, y el precipitado fue disuelto completamente mediante pipeteado. 900 µl de 100% de etanol se agregaron a este, y después de agitación y mezclado, se dejó en reposo a temperatura de -20°C durante 20 min, seguido por separación centrifuga a 14000 rpm durante 15 min. El sobrenadante fue descartado, seguido por la adición de 400 µl de etanol al 70% al precipitado, este fue sometido a separación centrífuga a 14000 rpm durante 15 min, y después de repetir esta operación, el sobrenadante fue descartado, el precipitado fue secado en un secador a vacío, y este fue disuelto en 30 µl de agua extra pura. La solución fue sometida a la electroforesis de gel de agarosa, confirmando así que el ADN estaba aislado. Para remover el ARN, se permitió someterlo a una reacción en 500 µl de solución de RNasa (composición: 100 µl de la solución de ADN aislado anteriormente mencionada y 5 µl de RNasa (5 g/ ml) a 37°C durante 1 h, y una cantidad igual de solución de PCl (composición: una solución obtenida por centrifugar a 13000 rpm durante 5 min y al separar una capa acuosa después de mezclar fenol: cloroformo: alcohol isoamilico (25:24:1) gradualmente) se agregó a la solución de reacción. Después de colocar una tapa y mezclar gradualmente, esta fue centrifugada a 13000 rpm durante 5 min. La capa acuosa (capa superior) fue transferida a un nuevo microtubo, al cual una cantidad igual de solución de CÍA (composición: cloroformo: alcohol isoamílico, en una proporción en volumen de 24:1) que se preservó a temperatura ambiente fue agregada, y después fue mezclada gradualmente, centrifugada a 15000 rpm durante 3 min, la capa acuosa fue transferida a un nuevo microtubo seguido por el tratamiento con CÍA una vez más, acetato de sodio 3M de una cantidad de 1/10 veces aquel del sobrenadante obtenido y etanol al 100% de 2.5 veces en cantidad fueron agregados a este, seguido por un buen mezclado, y enfriado a -20°C durante 20 min o más, y luego fue centrifugado a 15000 rpm durante 15 min, granulando así el ADN, el sobrenadante fue descartado, y después de agregar los granulos a 1 ml de 70% de etanol que fue enfriado, este fue centrifugado a 15000 rpm durante 15 min, el sobrenadante fue descartado, y después de agregar 1 ml de etanol al 70% que fue enfriado, este fue centrifugado a 15000 rpm durante 15 min, el sobrenadante fue descartado y este fue secado durante 5 min mediante el uso de secador bajo presión reducida.

Con el ADN del genoma así obtenido como plantilla, usando la composición PCR (Tabla 4), una reacción de 35 ciclos fue llevada a cabo a 94°C (30 s), 55°C (30 s), y 72°C (120 s), y luego, se le permitió sufrir una reacción a 72°C durante 10 min. Después de la reacción, se mantuvo a 4°C y se obtuvo un producto amplificado PCR. Cuando la banda de ADN en el producto amplificado PCR fue confirmado por la electroforesis del gel de agarosa al 1 %, un fragmento de ADN característico fue confirmado en una posición que esta cerca de 2000 bp inferior como se muestra en la Morita de la figura 1.

* Los cebadores AO6 y A48 fueron hechos por BEX Corp. Simílarmente, las bandas de ADN obtenidas mediante tratar de manera similar a lo anterior se muestran en la Figura 1 para la variedad SN (SN) y la variedad SS (SS) que tiene Esteviosida como el componente principal y Rebaudiosida A como un componente secundario. La variedad Morita tiene la secuencia base característica en una posición que esta cerca de aproximadamente inferior a 2000 bp o más abajo y por lo tanto puede ser distinguida fácilmente de las otras variedades al detectar el ADN por electroforesis de agarosa. Al utilizar cebadores que son diferentes a los anteriores, se comparó la variedad Morita y la variedad SN. La extracción de ADN fue llevada a cabo por el método CTAB. Alrededor de 0.5 g de cada una de las hojas de la variedad Morita y de la variedad SN fueron congeladas con nitrógeno líquido en un mortero, las hojas fueron maceradas mediante un triturador. Cada muestra macerada fue mezclada con 20 ml de una solución de CTAB al 2% (100 mM de tris-HCl (pH 8.0) 20 mM, de EDTA (pH 8.0), CTAB al 2%, NaCI 1.4 M, 1% de PVP) en un tubo Falcon de 50 ml, seguido por incubación a 65°C durante 30 min. Una cantidad igual de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) fueron agregados a esta, seguido por agitación durante 10 minutos, y luego fue sometida a separación centrifuga a 3500 rpm durante 15 min, y la capa acuosa fue retirada en otro tubo Falcon de 50 ml. Adicionalmente una cantidad igual de isopropanol al 100% fue agregado a esta, seguido por separación centrifuga a 3500 rpm durante 15 min, el precipitado fue recolectado mediante un gancho, que fue transferido a un microtubo de 1.5 ml. Después de enjuagar el precipitado con etanol al 75% este fue secado y luego disuelto en 600 µl de amortiguador de TE. Después de agregar 1 µl de una solución de una RNasa (1 mg/ml) e incubar a 37°C durante 1 h, una cantidad igual de fenol saturado TE fue agregado a esta, seguido por mezclado y separación centrifuga a 15000 rpm durante 30 min. La capa acuosa fue movida a otro microtubo, seguido por la adición de acetato de sodio 3M de 1/10 en cantidad y una cantidad igual de isopropanol, y se mezcló, y luego fue sometido a separación centrífuga a 15000 rpm durante 30 min. Después de enjuagar el precipitado así obtenido con etanol al 75% dos veces, este fue secado, y luego fue disuelto en 50 µl de amortiguador de TE para hacer una muestra de ADN. Con la muestra de ADN así obtenida como una plantilla, tuvo lugar la reacción PCR con la siguiente composición de reacción. En cuanto al ciclo del PCR, después de permitir que ocurra la reacción se permitió que tuviera lugar a 96°C durante 30 s, 35 ciclos a 96°C durante 10 s, a 42°C durante 2 min, y 72°C durante 2 min., y entonces se hizo reaccionar nuevamente a 72°C durante 4 min. Después de la reacción, el producto PCR fue fraccionado por la electroforesis de gel de agarosa al 1.8% y después fue teñido con EtBr, la imagen fue tomada bajo irradiación UV. Como resultado, la banda especifica de la variedad Morita podría ser confirmada en la cercanía de alrededor de 2000 bp con el cebador UBC-66. Adicionalmente, bandas especificas de la variedad SN fueron confirmadas en las cercanías de alrededor de 600 bp con el cebador UBC-72, y en las cercanías de 700 bp con UBC-106. Como resultado, se hizo claro que la variedad Morita y la variedad SN son genéticamente diferentes y la diferencia puede ser fácilmente detectada por el análisis RAPD.

EJEMPLO 2 PRODUCCIÓN DE UN EDULCORANTE Veinte g de hojas secas de la variedad Morita obtenidas al final de septiembre fueron extraídas con agua 20 veces hasta que no hubo sabor dulce, la solución se le permitió fluir por una columna empacada con 20 ml de una resina de intercambio de cationes (Amberlite IR-120B), y una columna empacada con 20 ml de una resina de intercambio de aniones (Duolite A-4) y 5 ml de carbón activado granulado, la solución que había pasado por la columna se le permitió fluir a través de una columna empacada con 100 ml de una resina de adsorción (Diaion HP-20), adsorbiendo así los componentes edulcorantes, y después de lavado suficiente con agua, esta fue disuelta en 300 ml de etanol. El eluyente así obtenido se concentró bajo presión reducida, y se secó, obteniéndose así un polvo de un color blanco amarilloso claro. Para propósitos de comparación, los componentes edulcorantes fueron obtenidos de TD y SN mediante tratamientos similares, y fueron analizados.

Los resultados del análisis de los productos extraídos y refinados se dan en Ensayo sensorial 1 : Cada solución de 0.1% de Morita y SN obtenidas en el Ejemplo 2 y una solución al 0.1 % de polvo amarillo fueron preparados separadamente, y 10 participantes de un panel, quienes estaban muy familiarizados con el gusto de los edulcorantes de Stevia fueron seleccionados. Se comparó el amargor, la astringencia y calidad de endulzamiento.

En cada una de las muestras, la variedad Morita había mejorado en cuanto a amargor y astringencia en comparación con las otras muestras, y su endulzamiento era superior. Ensayo sensorial 2: Cada solución al 0.1 % de la Morita y del TD obtenidas en el Ejemplo 2 que eran el polvo amarillo claro fueron preparadas separadamente, y se escogieron 10 participantes en un panel que estaban familiarizados con el gusto de los edulcorantes de Stevia. Se comparó la calidad de amargor, astringencia y endulzamiento.

En cada una de las muestras, la variedad Morita fue superior en cuanto amargor y astringencia en comparación con las otras muestras y su endulzamiento fue también superior.

EJEMPLO 3 PRODUCCIÓN DE REBAUDIOSIDA A Después de calentar y disolver 2 g de producto extraído y refinado (variedad Morita) obtenida en el Ejemplo 2 en 95% de metanol de un volumen de 10 veces, se le permitió permanecer a 4°C durante 6 días mientras se enfrío. El cristal así obtenido fue separado, y después de lavarlo con metanol frío, fue secado bajo presión reducida, y se obtuvieron 1.2 g de un cristal blanco. Con objeto de comparación, del TD y la SN, se obtuvieron mediante otorgamiento similar 0.9 g de un cristal blanco y 0 6 g de un cristal blanco, respectivamente y ellos fueron analizados.

Los resultados del análisis de los productos extraídos y refinados se dan en la Tabla 8.

Ensayo sensorial 3: cada una de las soluciones al 0.1% de polvo blanco de SN obtenidas en el ejemplo 3 fueron preparadas, y se escogieron 10 participantes en un panel quienes estaban muy familiarizados con el sabor de los edulcorantes de la Stevia. Se comparó la calidad del amargor, astringencia y endulzamiento.

En cada una de las muestras, la variedad Morita tuvo mejor comportamiento en cuanto a amargor y astringencia en comparación con las otras muestras, y su endulzamiento fue superior. La tasa de recuperación de un producto de alta pureza del mismo fue también superior.

Ensayo sensorial 4: se prepararon soluciones al 0.1% de polvo blanco de TD obtenidas en el Ejemplo 3, y se escogieron 10 participantes en un panel quienes estaban muy familiarizados con el sabor de los edulcorantes de Stevia. Se comparó la calidad del amargor, astringencia y endulzamiento.

En cada una de las muestras, la variedad Morita tuvo mejor comportamiento en cuanto a amargor y astringencia en comparación con las otras muestras, su endulzamiento es superior y su tasa de recuperación de un producto de alta pureza también fue superior.

EJEMPLO 4 PURIFICACIÓN DE LA REBAUDIOSIDA A Después de calentar y disolver 2 g del producto extraído y refinado (variedad Morita) obtenido en el Ejemplo 2 en metanol al 75% de un volumen de 5 veces, se le permitió permanecer a 4°C durante 7 días mientras se enfrío. El cristal así obtenido fue separado, y después de lavarlo con metanol frío, fue secado bajo presión reducida, y se obtuvieron y analizaron 0.9 g de un cristal.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de un edulcorante, que comprende extraer una planta de Stevia rebaudiana o sus hojas secas con un disolvente que comprende agua para producir un edulcorante, en donde dicha planta contiene por lo menos una proporción en peso de 11 ,3:1 de Rebaudiosida A con respecto a Esteviosida y una banda de 2000 bp cuando es analizada por ADN Polimorfico Amplificado Aleatorio (RAPD) usando los cebadores de la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2.

2. El método de la reivindicación 1 en donde dicha planta es la variedad bertoni.

3. El método de la reivindicación 1 en donde dicha planta es obtenida de semillas del Deposito de Organismos de Patente Internacional (IPOD) (Japón) (Recibo No. FERM BP-10353).

4. El método de la reivindicación 1 en donde dicho edulcorante es por lo menos 92% Rebaudiosida A

5. El método de la reivindicación 1 en donde dicho edulcorante es por lo menos 97% Rebaudiosida A

6. El método de la reivindicación 3 en donde dicho edulcorante es por lo menos 92% Rebaudiosida A

7. El método de la reivindicación 3 en donde dicho edulcorante es por lo menos 97% Rebaudiosida A

8. Un método para producir Rebaudiosida A mediante extraer una planta Stevia rebaudiana o sus hojas secas con un disolvente de Rebaudiosida A, remover dicho disolvente de rebaudiosida A y dejar la Rebaudiosida A, en donde dicha planta es obtenida de las semillas del Deposito de Organismos de Patente Internacional (Recibo No. FERM BP-10353)

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha Rebaudiosida-A es por lo menos 92% pura.

10. El método de la reivindicación 8 en donde dicha Rebaudiosida-A es por lo menos 97% pura. Un método para la producción de un edulcorante caracterizado en que la planta descrita en la reivindicación 1 o las hojas secas de la misma se extrae con un disolvente que comprende agua.