CN114269766A

CN114269766A - 新型甜菊醇糖苷及其制造方法，以及含有该物质的甜味剂组合物

Info

Publication number: CN114269766A
Application number: CN202080053645.5A
Authority: CN
Inventors: 浦井聡一郎; 岩城一考; 宫川克郎; 平井正良; 长尾浩二; 横尾芳明; 渡辺健宏; 藤川纮树
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2022-04-01
Also published as: WO2021020516A1; AR119530A1; NZ785123A; MX2022000996A; EP4006046A1; JPWO2021020516A1; JP7002703B2; KR20220038435A; US20220256902A1; EP4006046A4; CA3145619A1; AU2020320849A1; BR112021026835A2; CL2022000223A1; AU2020320849B2

Abstract

本发明提供一种含有木糖的新型甜菊醇糖苷。根据本发明，提供一种化合物，或其盐或其水合物，其特征在于，由式(1)所示，(式中，(i)R₁表示Xyl(1‑2)Glc1‑，且R₂表示Glc(1‑2)[Glc(1‑3)]Glc1‑；或者，(ii)R₁表示Glc(1‑2)[Glc(1‑3)]Glc1‑，且R₂表示Xyl(1‑2)[Glc(1‑3)]Glc1‑，Glc表示葡萄糖，Xyl表示木糖)。

Description

新型甜菊醇糖苷及其制造方法，以及含有该物质的甜味剂组合物

技术领域

本发明涉及一种新型甜菊醇糖苷及其制造方法，以及含有该物质的甜味剂组合物。本发明进一步涉及一种含有新型甜菊醇糖苷的饮食品、植物体及其萃取物，以及风味调节剂。

背景技术

在菊科甜菊(Stevia rebaudiana)的叶中含有作为二萜的一种的被称作甜菊醇(Steviol)的次级代谢产物，甜菊醇糖苷由于呈现砂糖的约300倍的甜味而被作为低热量的甜味剂利用于食品产业。肥胖作为深刻的社会问题在国际上日益严峻，从增进健康及削减医疗费的观点出发低热量甜味剂的需求也日益增大。目前，人工合成的氨基酸衍生物阿斯巴甜(Aspartame)、乙酰磺胺酸钾(Acesulfame Potassium)被作为人工甜味剂利用，然而像甜菊醇糖苷这样天然存在的低热量甜味剂更为安全，从而期待其容易得到消费者理解(Public Acceptance)。

甜菊的主要甜菊醇糖苷，由糖最终修饰为附加了4个糖的被称为瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A；Reb.A)的糖苷(图1)。其前体的甜菊醇3糖糖苷的甜菊苷(Stevioside)在量上最多，这两种物质是甜菊的甜味的核心物质。已知甜菊苷在甜菊叶中的含量最多，且呈现砂糖的250～300倍程度的甜味。Reb.A是甜味高(砂糖的350～450倍)且味道好的甜菊醇4糖糖苷，这些作为低热量甜味剂受瞩目。除此以外，已知存在被认为是反应中间体的糖苷或糖的种类不同的类似物。例如，Reb.A的4个糖苷糖均为葡萄糖，但是已知有在其中13位的葡萄糖的2位上附加了并非葡萄糖而是鼠李糖的瑞鲍迪苷C(Reb.C)或在同位置上附加了木糖的瑞鲍迪苷F(Reb.F)。

迄今为止，由于4个糖苷糖均为葡萄糖的Reb.A的味道好，正在尝试通过对相比野生型的甜菊植物，Reb.A的含量更多的甜菊植物进行品种改良等而获取Reb.A(例如，专利文献1)。此外，还尝试通过用酸对味道良好的瑞鲍迪苷M(Reb.M(也称作Reb.X))等已知的甜菊醇糖苷进行分解，来获得新型甜菊醇糖苷(例如，专利文献2)。

专利文献

专利文献1：日本专利第3436317号公报

专利文献2：国际公开第2014/146135号

发明内容

甜菊醇糖苷根据作为骨格的二萜结构上附加的糖分子的数量或种类的不同，甜味度或味道大有不同，因此追求新型的甜菊醇糖苷。

本发明提供一种下述所示的含有木糖的新型甜菊醇糖苷，含有该物质的甜味剂组合物及饮食品等。

[1]一种化合物，或其盐或其水合物，其特征在于，由式(1)所示，

[化学式1]

式中，

(i)R₁表示Xyl(1-2)Glc1-，且R₂表示Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-；或者，

(ii)R₁表示Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-，且R₂表示Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-，Glc表示葡萄糖，Xyl表示木糖。

[2]根据[1]所述的化合物，或其盐或其水合物，其特征在于，由下述式(2)或(3)所示，

[化学式2]

[3]根据[1]或[2]所述的化合物，或其盐或其水合物，其特征在于，由下述式(4)或(5)所示，

[化学式3]

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的化合物，其特征在于，为植物来源物、化学合成物或生物合成物。

[5]一种饮食品，其特征在于，含有[1]～[4]中任一项所述的化合物。

[6]根据[5]所述的饮食品，其特征在于，[1]～[4]中任一项所述的化合物的含量为1质量ppm～600质量ppm。

[7]一种甜味剂组合物，其特征在于，含有[1]～[4]中任一项所述的化合物。

[8]根据[7]所述的甜味剂组合物，其特征在于，[1]～[4]中任一项所述的化合物的含量为1重量％～99重量％。

[9]根据[7]或[8]所述的甜味剂组合物，其特征在于，进一步含有选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷I、瑞鲍迪苷J、瑞鲍迪苷K、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷O、瑞鲍迪苷Q、瑞鲍迪苷R、杜克苷A、杜克苷C、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的一种以上的甜菊醇糖苷。

[10]一种饮食品，其特征在于，含有[7]～[9]中任一项所述的甜味剂组合物。

[11]根据[10]所述的饮食品，其特征在于，所述饮食品为饮料。

[12]一种应用，其特征在于，将[1]～[3]中任一项所述的化合物用作甜味剂。

根据本发明，可提供一种含有木糖的新型甜菊醇糖苷，其制造方法，以及含有新型甜菊醇糖苷的甜味剂组合物、饮食品、植物及其萃取物，以及风味调节剂。本发明的优选方式的甜菊醇糖苷具有优异的味道和高甜味度。本发明的其他方式的甜味剂组合物具有优异的味道。

附图说明

图1为表示甜菊醇糖苷的结构和名称的图。

图2为表示开发品种A的m/z 1097.4的选择性离子色谱的图。

图3为表示开发品种A的m/z 1259.5的选择性离子色谱的图。

图4为表示新型甜菊醇糖苷1E的MS/MS及MS³碎片化质谱的图。

图5为表示新型甜菊醇糖苷2E的MS/MS及MS³碎片化质谱的图。

图6为表示化合物15的¹H-NMR频谱(400MHz,Pyr-d5)的图。

图7为表示化合物15的¹³C-NMR频谱(100MHz,Pyr-d5)的图。

图8为表示化合物17的¹H-NMR频谱(400MHz,Pyr-d5)的图。

图9为表示化合物17的¹³C-NMR频谱(100MHz,Pyr-d5)的图。

图10为表示新型甜菊醇糖苷1E(甜菊叶萃取物)和化学合成品(化合物15的β体)的提取离子色谱的图。

图11为表示新型甜菊醇糖苷1E(甜菊叶萃取物)和化学合成品(化合物15的β体)的MS/MS及MS³碎片化质谱的图。

图12为表示新型甜菊醇糖苷2E(甜菊叶萃取物)和化学合成品(化合物17的β体)的提取离子色谱的图。

图13为表示新型甜菊醇糖苷2E(甜菊叶萃取物)和化学合成品(化合物17的β体)的MS/MS及MS³碎片化质谱的图。

图14为表示将新型甜菊醇糖苷A与砂糖(sugar)、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷D及瑞鲍迪苷M进行比较的感官评价的结果的图。

图15为表示将新型甜菊醇糖苷B与砂糖(sugar)、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷D及瑞鲍迪苷M进行比较的感官评价的结果的图。

图16为表示关于实施例中的遗传性状鉴定而实施的表达分析结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，并非将本发明仅限定于该实施方式的意思。只要不脱离该主旨，本发明可以各种各样的方式进行实施。另外，本说明书中引用的所有文献及公开公报、专利公报及其他的专利文献作为参考纳入本说明书中。此外，本说明书包含2019年7月31日提出申请的成为本申请优先权主张的基础的日本专利申请(日本特愿2019-141627号)的说明书及附图中所述的内容。

本说明书中，“瑞鲍迪苷”、“Reb”及“Reb.”表示相同的意思，皆表示“rebaudioside”。同样地，本说明书中，“杜克苷”表示“dulcoside”。

1.新型甜菊醇糖苷

本发明者等率先确认了含有木糖的新型甜菊醇糖苷的结构。本发明的新型甜菊醇糖苷(本说明书中，也称作“本发明的糖苷”)为式(1)：

[化学式4]

(式中，

(i)R₁表示Xyl(1-2)Glc1-，且R₂表示Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-或者：(ii)R₁表示Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-，且R₂表示Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-，Glc表示葡萄糖，Xyl表示木糖)

所表示的化合物，或其盐或其水合物。另外，糖链中的葡萄糖分子和木糖分子也分别称作吡喃葡萄糖基和吡喃木糖基。

本发明的糖苷如上所述，包含：在甜菊醇的第13位上具有含有3个分子的葡萄糖的糖链，在第19位上具有1个分子的葡萄糖和1个分子的木糖的甜菊醇糖苷(本说明书中，也称作“本发明的糖苷A”)，和在甜菊醇的第13位上具有含有2个分子的葡萄糖和1个分子的木糖的糖链，在第19位上具有含有3个分子的葡萄糖的糖链的甜菊醇糖苷(本说明书中，也称作“本发明的糖苷B”)。

此外，如上所述，Glc表示葡萄糖，Xyl表示木糖。在本说明书中，Glc可为α-葡萄糖或β-葡萄糖，Xyl可为α-木糖或β-木糖。或者在本说明书中，Glc可为α-葡萄糖及β-葡萄糖，Xyl可为α-木糖及β-木糖。且，“Glc1-”表示在葡萄糖的1位的碳原子上与甜菊醇进行糖苷键合，“Glc(1-3)-Glc1-”表示在“Glc1-”所示的葡萄糖的3位的碳原子上，葡萄糖的1位的碳原子进一步进行糖苷键合。此外，“Xyl(1-2)-Glc1-”表示在“Glc1-”所示的葡萄糖的2位的碳原子上木糖的1位的碳原子进行糖苷键合。进一步，“Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-”表示在“Glc1-”所示的葡萄糖的2位的碳原子上木糖的1位的碳原子进行糖苷键合，且在“Glc1-”所示的葡萄糖的3位的碳原子上葡萄糖的1位的碳原子进行糖苷键合。

作为糖苷A，例如，包含具有式(2)、式(2)’、式(4)及式(4)’所示的结构的糖苷。

[化学式5]

就式(2)所示的糖苷A而言，在甜菊醇的19位的羧基上葡萄糖进行β糖苷键合，在该葡萄糖上木糖进行β1-2键合，就式(2)’所示的糖苷A而言，在甜菊醇的19位的羧基上葡萄糖进行β糖苷键合，在该葡萄糖上木糖进行α1-2键合。式(4)和式(4)’分别表示进一步对式(2)和式(2)’的糖苷A的构象进行确定的结构。

作为糖苷B，例如，包含具有式(3)、式(3)’、式(5)及式(5)’所示的结构的糖苷。

[化学式6]

就式(3)所示的糖苷B而言，在甜菊醇的13位的羟基上葡萄糖进行β糖苷键合，在该葡萄糖上其他葡萄糖进行β1-3键合，且木糖进行β1-2键合。就式(3)’所示的糖苷B而言，在甜菊醇的13位的羟基上葡萄糖进行β糖苷键合，在该葡萄糖上其他葡萄糖进行β1-3键合，且木糖进行α1-2键合。式(5)和式(5)’分别表示进一步对式(3)和式(3)’的糖苷B的构象进行确定的结构。

本发明的糖苷如上所述，还包含α体或β体等异构体。从而，本发明的糖苷为仅α体、仅β体、或α体与β体的混合物的任一种均可。就本发明的糖苷而言，β体的比例优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，特别优选为99％以上。另外，α体和β体可通过使用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography：HPLC)、超高效液相色谱法(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC)等公知的方法，进行分离、提纯。

本发明的糖苷，不仅是式(1)所示的化合物，还可以是其衍生物、其盐或其水合物。本说明书中，所谓“衍生物”是指化合物中的小部分的结构上有变化，从而生成的化合物，例如，指如羟基的一部分被取代为其他的取代基的化合物。因此，作为式(1)所示的化合物的衍生物，包含将该化合物中含有的羟基的一部分，取代为选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、氨基、氰基等中的取代基的化合物。本说明书中，所谓“式(1)的化合物的盐”是指式(1)的化合物在生理学上可容许的盐，例如钠盐。此外，关于本说明书，所谓的“式(1)的化合物的水合物”，是指在式(1)的化合物上附加了水分子的化合物。

本发明的糖苷并无特别限定，也可为植物来源物、化学合成物或生物合成物。例如，也可从富含本发明的糖苷的植物体中分离、提纯，也可以由化学合成或生物合成而获得。关于本发明的糖苷的制造方法的细节，稍后会在本说明书中说明。

本发明的糖苷，具有比砂糖(蔗糖)更高的甜味，仅在饮食品等中少量含有就可以影响甜味。因此，本发明的糖苷可以作为新型的甜味剂使用。

本发明的优选方式的糖苷选自糖苷A或糖苷B。糖苷A具有比砂糖还高的甜味度，且甜味和苦味的后味少，苦味与包括砂糖的其他成分相比少。糖苷B也具有比砂糖还高的甜味度，与其他甜菊醇糖苷相比苦味弱。从而，本发明的甜菊醇糖苷，如后所述，适合作为甜味剂用于各种用途。

2.含有新型甜菊醇糖苷的甜味剂组合物

根据本发明的一种方式，可以提供含有式(1)所示的化合物，或其衍生物、其盐或其水合物的甜味剂组合物(本说明书中，也称作“本发明的甜味剂组合物”)。本发明的甜味剂组合物，只要含有式(1)所示的化合物，或其衍生物、其盐或其水合物即可，并无特别限定，也可以是含有以下物质的组合物，该物质为含有式(1)所示的化合物，或其衍生物、其盐或其水合物的萃取物。

本发明的甜味剂组合物中所含的本发明的糖苷的量并无特别限定，例如，相对于甜味剂组合物的总量，可为1重量％～99重量％、5重量％～95重量％、10重量％～90重量％、15重量％～85重量％、20重量％～80重量％、25重量％～75重量％、30重量％～70重量％、35重量％～65重量％、40重量％～60重量％、45重量％～55重量％、1重量％～5重量％、1重量％～10重量％、1重量％～15重量％、1重量％～20重量％、1重量％～25重量％、1重量％～30重量％、1重量％～35重量％、1重量％～40重量％、1重量％～45重量％或1重量％～50重量％。

本发明的甜味剂组合物也可进一步含有其他甜菊醇糖苷。例如，本发明的甜味剂组合物，除本发明的糖苷外，也可进一步含有选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷I、瑞鲍迪苷J、瑞鲍迪苷K、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷O、瑞鲍迪苷Q、瑞鲍迪苷R、杜克苷A、杜克苷C、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的一种以上的甜菊醇糖苷。

含有其他甜菊醇糖苷时，本发明的糖苷与其他甜菊醇糖苷的组成比，以质量比计，可为1：99～99：1、5：95～95：5、10：90～90：10、15：85～85：15、20：80～80：20、25：75～75：25、30：70～70：30、35：65～65：35、40：60～60：40、45：65～65：45或50：50。此外，本发明的糖苷可仅使用一种，也可使用多种。

本发明的甜味剂组合物也可进一步含有甜菊醇糖苷以外的甜味剂。作为这样的甜味剂，可列举果糖，砂糖，果葡糖浆(Glucose-fructose syrup)、葡萄糖、麦芽糖、高果糖浆(High Fructose Syrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁液(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、糖精等人工甜味剂等。其中，从清爽度、饮用容易度、自然的味道、赋予适度的浓郁味道的观点出发，优选使用天然甜味剂，特别适合使用果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、砂糖。这些甜味剂可仅使用一种，也可使用多种。

本发明的甜味剂组合物的制造方法只要可获得具有上述组成的甜味剂组合物即可，并无特别限定。根据本发明的一种方式，提供一种制造方法，其为本发明的甜味剂组合物的制造方法，其特征在于，包含获得本发明的糖苷的工序，和将所述糖苷与其他甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷以外的甜味剂混合的工序。获得本发明的糖苷的工序可通过从植物体的分离、提纯、化学合成或生物合成来实施，通过该工序而得的本发明的糖苷也可作为与其他甜菊醇糖苷(例如，Reb.A或Reb.D)的混合物来获得。

3.含有新型甜菊醇糖苷的饮食品、香料及医药品

根据本发明的一种方式，提供含有式(1)所示的化合物、或其衍生物、其盐或其水合物或本发明的甜味剂组合物的饮食品、香料及医药品(本说明书中，也可分别称作“本发明的饮食品”、“本发明的香料”及“本发明的医药品”)。本发明的饮食品、香料及医药品，只要含有式(1)所示的化合物，或其衍生物、其盐或其水合物即可并无特别限定，也可为含有下述萃取物或甜味剂组合物的饮食品、香料及医药品，该萃取物或甜味剂组合物含有式(1)所示的化合物，或其衍生物、其盐或其水合物。这里所谓饮食品，指饮料及食品。因此，在某种实施方式中，本发明提供新型的饮料或食品，此外提供该饮料或食品的制造方法。

本发明的饮食品、香料及医药品中所含的本发明的糖苷的量，根据具体的饮食品而不同，为饮料时，优选大致为1质量ppm～600质量ppm，例如也可为20质量ppm～550质量ppm、25质量ppm～550质量ppm、30质量ppm～550质量ppm、35质量ppm～550质量ppm、40质量ppm～550质量ppm、45质量ppm～550质量ppm、50质量ppm～550质量ppm、55质量ppm～550质量ppm、20质量ppm～540质量ppm、25质量ppm～540质量ppm、30质量ppm～540质量ppm、35质量ppm～540质量ppm、40质量ppm～540质量ppm、45质量ppm～540质量ppm、50质量ppm～540质量ppm、55质量ppm～540质量ppm、20质量ppm～530质量ppm、25质量ppm～530质量ppm、30质量ppm～530质量ppm、35质量ppm～530质量ppm、40质量ppm～530质量ppm、45质量ppm～530质量ppm、50质量ppm～530质量ppm、55质量ppm～530质量ppm、20质量ppm～520质量ppm、25质量ppm～520质量ppm、30质量ppm～520质量ppm、35质量ppm～520质量ppm、40质量ppm～520质量ppm、45质量ppm～520质量ppm、50质量ppm～520质量ppm、55质量ppm～520质量ppm、20质量ppm～510质量ppm、25质量ppm～510质量ppm、30质量ppm～510质量ppm、35质量ppm～510质量ppm、40质量ppm～510质量ppm、45质量ppm～510质量ppm、50质量ppm～510质量ppm、55质量ppm～510质量ppm、20质量ppm～505质量ppm、25质量ppm～505质量ppm、30质量ppm～505质量ppm、35质量ppm～505质量ppm、40质量ppm～505质量ppm、45质量ppm～505质量ppm、50质量ppm～505质量ppm、55质量ppm～505质量ppm、20质量ppm～500质量ppm、25质量ppm～500质量ppm、30质量ppm～500质量ppm、35质量ppm～500质量ppm、40质量ppm～500质量ppm、45质量ppm～500质量ppm、50质量ppm～500质量ppm、55质量ppm～500质量ppm、20质量ppm～495质量ppm、25质量ppm～495质量ppm、30质量ppm～495质量ppm、35质量ppm～495质量ppm、40质量ppm～495质量ppm、45质量ppm～495质量ppm、50质量ppm～495质量ppm、55质量ppm～495质量ppm、20质量ppm～490质量ppm、25质量ppm～490质量ppm、30质量ppm～490质量ppm、35质量ppm～490质量ppm、40质量ppm～490质量ppm、45质量ppm～490质量ppm、50质量ppm～490质量ppm、55质量ppm～490质量ppm、100质量ppm～400质量ppm、150质量ppm～400质量ppm、200质量ppm～400质量ppm、250质量ppm～400质量ppm、300质量ppm～400质量ppm、100质量ppm～150质量ppm、100质量ppm～200质量ppm、100质量ppm～250质量ppm或100质量ppm～300质量ppm。通过使含量在该范围内，具有可赋予适度的甜味的优点。通过使含量在该范围内，具有可抑制后味的优点。在本说明书中，所谓“ppm”，除非特别说明，是指“质量ppm”。

本发明的饮食品、香料及医药品也可进一步含有其他甜菊醇糖苷。例如，本发明的甜味剂组合物，除本发明的糖苷外，也可进一步含有选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷I、瑞鲍迪苷J、瑞鲍迪苷K、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷O、瑞鲍迪苷Q、瑞鲍迪苷R、杜克苷A、杜克苷C、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的一种以上的甜菊醇糖苷。

含有其他甜菊醇糖苷时，本发明的糖苷与其他甜菊醇糖苷的组成比，以质量比计，可为1：99～99：1、5：99～95：5、10：90～90：10、15：85～85：15、20：80～80：20、25：75～75：25、30：70～70：30、35：65～65：35、40：60～60：40、45：65～65：45或50：50。

本发明的饮食品、香料及医药品也可进一步含有甜菊醇糖苷以外的甜味剂。作为这样的甜味剂，可列举果糖，砂糖，果葡糖浆(Glucose-fructose syrup)、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、高果糖浆(High Fructose Syrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁液(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、糖精等人工甜味剂等。其中，从清爽度、饮用容易度、自然的味道、赋予适度的浓郁味道的观点出发，优选使用天然甜味剂，特别适合使用果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、砂糖。这些甜味剂可仅使用一种，也可使用多种。

作为本发明的食品的例子，并无特别限定，作为食品，可列举点心、面包类、谷粉、面类、米饭类、农业或林业加工食品、畜牧业加工品、水产加工品、奶或乳制品、油脂或油脂加工品、调料或其他食品原材料等。

作为本发明的饮料的例子，并无特别限定，例如可列举碳酸饮料、非碳酸饮料、酒精饮料、非酒精饮料、啤酒或无酒精啤酒等啤酒风味饮料、咖啡饮料、茶饮料、可可饮料、营养饮料、功能性饮料等。

本发明的饮料，也可经加热杀菌，制备成填充在容器中的状态的包装饮料。作为容器并无特别限定，例如可列举PET瓶、铝罐、钢罐、纸盒、冷藏杯、瓶等。进行加热杀菌时，其种类并无特别限定，例如可利用UHT杀菌及高温高压杀菌等通常的方法来实施。加热杀菌工序的温度并无特别限定，例如为65～130℃，优选为85～120℃下，10～40分钟。其中，只要能得到和上述的条件相同的杀菌值，于适当的温度下杀菌数秒，例如5～30秒，也没有问题。

本发明的饮食品、香料及医药品的制造方法只要可获得具有上述成分的饮食品、香料及医药品即可，并无特别限定。根据本发明的一种方式，提供一种制造方法，其为本发明的饮食品、香料及医药品的制造方法，其特征在于，包含获得本发明的萃取物、糖苷或甜味剂组合物的工序，和将所述萃取物、糖苷或甜味剂组合物添加至饮食品、香料及医药品或其原料中的工序。获得本发明的糖苷或甜味剂组合物的工序及获得本发明的萃取物的工序，分别如“2.含有新型甜菊醇糖苷的甜味剂组合物”及“4.含有新型甜菊醇糖苷的甜菊植物体及其萃取物”中记载。将本发明的萃取物、糖苷或甜味剂组合物添加至饮食品、香料及医药品或其原料中的工序，可在饮食品、香料及医药品的制造工序的任意工序中进行，例如，可在混合饮食品、香料及医药品的原料时，或在饮食品、香料及医药品的味道的最终调整时进行。

4.含有新型甜菊醇糖苷的甜菊植物体及其萃取物

根据本发明的一种方式，提供含有式(1)所示的化合物、或其衍生物、其盐或其水合物的甜菊植物体及其萃取物(本说明书中，也称作“本发明的植物体及其萃取物”)。此外，根据本发明的一种其他方式，提供含有本发明的植物体或其萃取物的饮食品、香料及医药品，优选饮料。本发明的植物体中所含的本发明的糖苷的量并无特别限定，在干燥叶中也可为0.001重量％～1.000重量％、0.005重量％～0.950重量％、0.008重量％～0.900重量％、0.010重量％～0.850重量％、0.015重量％～0.800重量％。

在本发明的一种方式中，本发明的植物体具有以下(1)～(8)的至少1种的遗传性状。

(1)对于与序列号1的298位、序列号3的11位、序列号5的21位或序列号7的26位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

(2)对于与序列号1的328位、序列号9的11位、序列号11的21位、序列号13的26位相当的位置的碱基为C的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

(3)对于与序列号1的360位、序列号15的11位、序列号17的21位、序列号19的26位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

(4)对于与序列号1的386位、序列号21的11位、序列号23的21位、序列号25的26位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

(5)对于与序列号1的393位、序列号27的11位、序列号29的18位、序列号31的23位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

(6)对于与序列号1的411位、序列号33的11位、序列号35的18位、序列号37的23位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

(7)对于与序列号1的427位、序列号39的11位、序列号41的18位、序列号43的23位相当的位置的碱基为C的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

(8)对于与序列号1的453位、序列号45的11位、序列号47的18位、序列号49的23位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

在本发明的其他方式中，本发明的植物体具有遗传性状(1)～(8)的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8个全部的遗传性状。

所谓“与～相当的位置(或部分)”，当在基因组中存在与标准序列(例如，序列号1等)相同的序列时，指在基因组中存在的该序列中的位置或部分(例如，298位、328位、360位、386位、393位、411位、427位及453位等)，当在基因组中不存在与标准序列相同的序列时，指基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分。在基因组中是否存在与标准序列相同或与其相当的序列，例如可通过以下方法决定：通过可用PCR对标准序列进行扩增的引物对作为对象的甜菊植物的基因组DNA进行扩增，并实施扩增产物的测序，实施所得序列和标准序列的对比分析。作为与标准序列相当的序列的非限定例，例如可列举相对于标准序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列一致性的碱基序列。基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分，可以考虑标准序列中的位置或部分的前后的碱基序列等而决定。例如，可通过对标准序列和基因组中的与标准序列相当的序列的对比分析，决定基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分。

例如，若以本发明的遗传性状(1)的“与序列号1的298位相当的位置”为例，当甜菊植物体的基因组具有由与序列号1相同的碱基序列构成的部分时，“与序列号1的298位相当的位置”为自基因组中的由与序列号1相同的碱基序列构成的部分的5’侧开始的298位。另一方面，当甜菊植物体的基因组与序列号1不同但是具有由与其相当的碱基序列构成的部分时，由于基因组不具有由与序列号1相同的碱基序列构成的部分，“与序列号1的298位相当的位置”并非一定是自与序列号1相当的部分的5’侧开始的298位，但是考虑序列号1的298位的前后的碱基序列等，可以确定涉及的甜菊植物的基因组中的“与序列号1的298位相当的位置”。例如，通过甜菊植物的基因组中的与序列号1相当的部分的碱基序列和序列号1的碱基序列的对比分析，可以确定甜菊植物的基因组中的“与序列号1的298位相当的位置”。

上述遗传性状可通过以下方法进行检测：PCR法、TaqMan PCR法、测序法、微阵列法、Invader法、TILLING法、RAD(random amplified polymorphic DNA)法、限制酶片段长度多态性(RFLP)法、PCR-SSCP法、AFLP(amplified fragment length polymorphism)法、SSLP(simple sequence length polymorphism)法、CAPS(cleaved amplified polymorphicsequence)法、dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequence)法、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)法、ARMS法、变性梯度凝胶电泳(DGGE)法、CCM(chemical cleavageof mismatch)法、DOL法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、锁式探针法、分子信标法、DASH(dynamicallele specific hybridization)法、UCAN法、ECA法、PINPOINT法、PROBE(primer oligobase extension)法、VSET(very short extension)法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、GOOD法、LCx法、SNaPshot法、Mass ARRAY法、Pyrosequences法、SNP-IT法、熔解曲线分析等，但检测方法并不限定于这些。

在特定方式中，“由与序列号1相当的碱基序列构成的部分”，例如，包含可通过使用含有序列号51的碱基序列的正向引物和含有序列号52的碱基序列的反向引物的PCR进行扩增的甜菊植物体的基因组的部分。

在特定方式中，“与序列号1的298位相当的位置的碱基为T的等位基因”包含序列号4、6或8的碱基序列。

在特定方式中，“与序列号1的328位相当的位置的碱基为C的等位基因”包含序列号10、12或14的碱基序列。

在特定方式中，“与序列号1的360位相当的位置的碱基为T的等位基因”包含序列号16、18或20的碱基序列。

在特定方式中，“与序列号1的386位相当的位置的碱基为T的等位基因”包含序列号22、24或26的碱基序列。

在特定方式中，“与序列号1的393位相当的位置的碱基为T的等位基因”包含序列号28、30或32的碱基序列。

在特定方式中，“与序列号1的411位相当的位置的碱基为T的等位基因”包含序列号34、36或38的碱基序列。

在特定方式中，“与序列号1的427位相当的位置的碱基为C的等位基因”包含序列号40、42或44的碱基序列。

在特定方式中，“与序列号1的453位相当的位置的碱基为T的等位基因”包含序列号46、48或50的碱基序列。

本发明的植物体的制作方法，并无特别限定，也可通过杂交，或向甜菊植物体的基因组中导入本发明的变异来制作。变异的导入，可通过转基因的方法来实施，也可通过非转基因的方法来实施。作为“非转基因的方法”的例子，可列举不导入外来基因而诱导宿主细胞(或宿主植物体)的基因变异的方法。作为那样的方法可列举使植物细胞的诱变剂作用的方法。作为那样的诱变剂，可列举甲磺酸乙酯(EMS)及叠氮化钠等。例如甲磺酸乙酯(EMS)可以0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等浓度对植物细胞进行处理。处理时间为1～48小时、2～36小时、3～30小时、4～28小时、5～26小时、6～24小时。处理流程自身为公知，可通过使经过吸水过程的吸水种子在以上述浓度含有诱变剂的处理液中浸渍上述处理时间来实施。

或者，作为非转基因的方法的例子，也可为使X射线、γ射线、紫外线等放射线或光线照射植物细胞的方法。此时，将用适当的紫外线的照射量(紫外线灯强度、距离、时间)进行照射后的细胞于选择培养基等中进行培养后，可选择具有目标性状的细胞、愈伤组织、植物体。此时的照射强度为0.01～100Gr、0.03～75Gr、0.05～50Gr、0.07～25Gr、0.09～20Gr、0.1～15Gr、0.1～10Gr、0.5～10Gr、1～10Gr，照射距离为1cm～200m、5cm～100m、7cm～75m、9cm～50m、10cm～30m、10cm～20m、10cm～10m，照射时间为1分钟～2年、2分钟～1年、3分钟～0.5年、4分钟～1个月、5分钟～2周、10分钟～1周。照射的强度、距离及时间根据放射线的种类或作为照射对象的状态(细胞、愈伤组织、植物体)而不同，若为本领域技术人员可进行适当调整。

此外，“相对于叶中所含的总甜菊醇糖苷量为0.050重量％以上”，是指相对于从本发明的甜菊植物体的干燥叶中获得的萃取液中存在的总甜菊醇糖苷量，本发明的糖苷以0.050重量％以上的比例存在。在此，所谓总甜菊醇糖苷，不包含未知的甜菊醇糖苷，此外也不包含以低于检测界限的含量存在的甜菊醇糖苷。总甜菊醇糖苷优选由瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷G、瑞鲍迪苷I、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷N、甜菊苷、杜克苷A、甜菊双糖苷及甜叶悬钩子苷，以及新型甜菊醇糖苷(新型甜菊醇糖苷A及/或新型甜菊醇糖苷B)构成。就本发明的甜菊植物体而言，叶中所含的新型甜菊醇糖苷A或新型甜菊醇糖苷B的含量相对于总甜菊醇糖苷量，可为0.055重量％以上、0.060重量％以上、0.065重量％以上、0.070重量％以上、0.075重量％以上、0.080重量％以上、0.085重量％以上、0.090重量％以上、0.095重量％以上、0.10重量％以上、0.15重量％以上、0.20重量％以上、0.30重量％以上、0.50重量％以上、0.60重量％以上、0.80重量％以上、1.00重量％以上、2.00重量％以上、4.00重量％以上、6.00重量％以上、8.00重量％以上、10.00重量％以上的量，且也可为10.00重量％以下、8.00重量％以下、6.00重量％以下、4.00重量％以下、2.00重量％以下、1.00重量％以下、0.80重量％以下、0.60重量％以下、0.30重量％以下。

或者，就本发明的甜菊植物体而言，叶中所含的新型甜菊醇糖苷A或新型甜菊醇糖苷B的含量相对于叶中所含的瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M及甜菊苷的合计含量，可为0.050重量％以上、0.055重量％以上、0.060重量％以上、0.065重量％以上、0.070重量％以上、0.075重量％以上、0.080重量％以上、0.085重量％以上、0.090重量％以上、0.095重量％以上、0.10重量％以上、0.15重量％以上、0.20重量％以上、0.30重量％以上、0.50重量％以上、0.60重量％以上、0.80重量％以上、1.00重量％以上、2.00重量％以上、4.00重量％以上、6.00重量％以上、8.00重量％以上、10.00重量％以上的量，且也可为10.00重量％以下、8.00重量％以下、6.00重量％以下、4.00重量％以下、2.00重量％以下、1.00重量％以下、0.80重量％以下、0.60重量％以下、0.30重量％以下。

在此所谓本发明的植物体的干燥叶，是指通过使本发明的植物体的新鲜叶干燥，使含水量下降至10重量％以下、7重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下、2重量％以下、1重量％以下的叶。本发明的植物体的干燥叶的含水量优选为3～4重量％。

本发明的植物体中并非仅包含植物体整体，还可包含植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵状组织等)或各种形态的植物细胞(例如，悬浊培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。

此外，本发明的植物体也可包含组织培养物或植物培养细胞。是因为通过培养这样的组织培养物或植物培养细胞，可使植物体再生。作为本发明的植物体的组织培养物或植物培养细胞的例子，可列举胚、分裂组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织等，但并不限定于这些。

本发明的植物体的萃取物可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应而得。萃取条件等可参照国际公开2016/090460号中记载的方法或后述的实施例中记载的方法。

本发明的植物体的萃取物，相对于总甜菊醇糖苷量优选含有0.050重量％以上的本发明的糖苷。在本发明的其他方式中，本发明的糖苷的含量相对于总甜菊醇糖苷量，可为0.055重量％以上、0.060重量％以上、0.065重量％以上、0.070重量％以上、0.075重量％以上、0.080重量％以上、0.085重量％以上、0.090重量％以上、0.095重量％以上、0.10重量％以上、0.15重量％以上、0.20重量％以上、0.30重量％以上、0.50重量％以上、0.60重量％以上、0.80重量％以上、1.00重量％以上、2.00重量％以上、4.00重量％以上、6.00重量％以上、8.00重量％以上、10.00重量％以上的量，且也可为10.00重量％以下、8.00重量％以下、6.00重量％以下、4.00重量％以下、2.00重量％以下、1.00重量％以下、0.80重量％以下、0.60重量％以下、0.30重量％以下。

或者，就本发明的植物体的萃取物而言，新型甜菊醇糖苷A或新型甜菊醇糖苷B的含量相对于瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M及甜菊苷的合计含量，可为0.050重量％以上、0.055重量％以上、0.060重量％以上、0.065重量％以上、0.070重量％以上、0.075重量％以上、0.080重量％以上、0.085重量％以上、0.090重量％以上、0.095重量％以上、0.10重量％以上、0.15重量％以上、0.20重量％以上、0.30重量％以上、0.50重量％以上、0.60重量％以上、0.80重量％以上、1.00重量％以上、2.00重量％以上、4.00重量％以上、6.00重量％以上、8.00重量％以上、10.00重量％以上的量，且也可为10.00重量％以下、8.00重量％以下、6.00重量％以下、4.00重量％以下、2.00重量％以下、1.00重量％以下、0.80重量％以下、0.60重量％以下、0.30重量％以下。

在本发明的一种方式中，提供含有本发明的植物体的萃取物的饮食品。进一步在本发明的其他方式中，饮食品为饮料。作为饮食品的种类，可列举“3.含有新型甜菊醇糖苷的饮食品”中记载的内容。

5.含有新型甜菊醇糖苷的风味调节剂

根据本发明的一种方式，提供一种风味调节剂，其特征在于，含有上述式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物。在本发明的一种方式中，可将具有“2.含有新型甜菊醇糖苷的甜味剂组合物”中记载的组成的组合物作为风味调节剂使用。

本说明书中，所谓“风味调节剂”，是指在添加至饮食品中时，调整该饮食品的风味的物质。本发明的风味调节剂，优选在添加至饮食品中时，该风味调节剂自身的味不被消费者识别，而可调整该饮食品自身的风味。例如，本发明的甜菊醇糖苷，具有与以往的甜菊醇糖苷相比苦味弱的特征，因此通过作为风味调节剂使用可调整饮食品的苦味。

本发明的风味调节剂，优选除上述式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物外，含有一种以上的其他甜味剂。作为这样的甜味剂，可列举选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷I、瑞鲍迪苷J、瑞鲍迪苷K、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷O、瑞鲍迪苷Q、瑞鲍迪苷R、杜克苷A、杜克苷C、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的一种以上的甜菊醇糖苷，或果糖，砂糖，果葡糖浆(Glucose-fructose syrup)、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、高果糖浆(High Fructose Syrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁液(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、糖精等人工甜味剂等。

6.新型甜菊醇糖苷的制造方法

如上所述，本发明的甜菊醇糖苷可通过(A)从植物体的分离、提纯、(B)化学合成或(C)生物合成来制造。以下分别进行说明。

(A)从植物体的分离、提纯

含有新型甜菊醇糖苷的植物体，例如可使用公知的任意的筛选方法获得具有上述遗传性状的植物体。且，可从该植物体中分离、提纯新型甜菊醇糖苷。新型甜菊醇糖苷可以通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应以萃取液的状态萃取。萃取条件等可参照国际公开第2016/090460号中记载的方法，或后述的实施例中记载的方法。

进一步，对于这样得到的萃取液，可通过使用乙酸乙酯或其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography：HPLC)、超高效液相色谱(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC)等公知的方法对新型甜菊醇糖苷进行分离、提纯。

植物体中的新型甜菊醇糖苷含量可通过国际公开2016/090460号中记载的方法，或后述的实施例中记载的方法进行测定。具体而言，可从本发明的植物体中采取新鲜叶作为样本，通过实施LC/MS-MS进行测定。

(2)化学合成

本发明的甜菊醇糖苷，例如可通过国际公开第2018/181515号中记载的公知的化学合成法合成。更具体而言，本发明的甜菊醇糖苷可通过后述的实施例中记载的方法来制造。

(3)生物合成

本发明的甜菊醇糖苷，可以通过将编码糖苷化酶等特定的蛋白质的多核苷酸导入来自细菌、植物、昆虫、除人类以外的哺乳动物等的宿主细胞中，以甜菊醇或甜菊醇糖苷、UDP-葡萄糖及/或UDP-木糖作为底物而生成。作为底物的甜菊醇、甜菊醇糖苷、UDP-葡萄糖、UDP-木糖可以加入，也可以使其在细胞内生物合成。

编码特定的蛋白质的多核苷酸，优选以插入到适当的表达载体的状态导入宿主中。上述多核苷酸可以各自插入到分别的载体中。

适当的表达载体，通常含有下述物质而构成：

(i)在宿主细胞内可转录的启动子；

(ii)与该启动子结合的本发明的多核苷酸；及

(iii)和RNA分子的转录终止及聚腺苷酸化相关，作为在宿主细胞内发挥作用的信号的构成要素而含有的表达盒。

作为表达载体的制作方法，可列举利用质粒、噬菌体或黏质体的方法，或具有必要的构成要素的DNA分子，但并无特别限定。

载体的具体的种类并无特别限定，可适当选择可以在宿主细胞中表达的载体。即，根据宿主细胞的种类，为了确切的使本发明的多核苷酸表达，选择适宜的启动子序列，并将在各种质粒等中编入了此序列和本发明的多核苷酸的载体作为表达载体使用即可。

表达载体依赖于需要导入的宿主的种类，含有表达控制区域(例如，启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，使用惯用的启动子(例如，trc启动子、tac启动子、lac启动子等)，作为酵母用启动子，例如可列举甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、PH05启动子、GAL1/10启动子等，作为丝状真菌用启动子，例如可列举淀粉酶、trpC等。此外，作为在植物细胞内使目的基因表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35SRNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子、将上述花椰菜花叶病毒的35SRNA启动子的增强序列附加到来自农杆菌的甘露碱合成酶启动子序列的5’侧的mac-1启动子等。作为动物细胞宿主用启动子，可列举病毒性启动子(例如，SV40初期启动子、SV40后期启动子等)。作为由于外在刺激而活化为诱导性的启动子的例子，可列举小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、四环霉素应答性启动子、金属硫蛋白启动子及热休克蛋白启动子等。

表达载体优选含有至少一种的选择标记。作为上述标记，可利用营养缺陷型标记(LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ura5、niaD)、耐药性标记(潮霉素、博来霉素)、耐遗传霉素性基因(G418r)、耐铜性基因(CUP1)(Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.81,p.337,1984)、耐浅蓝霉素性基因(fas2m、PDR4)(分别为，猪腰淳嗣等，生物化学，vol.64,p.660,1992；Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991)等。

作为宿主细胞的转化方法可以利用通常所用的公知的方法。例如，可以通过电穿孔法(Mackenxie,D.A.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,vol.66,p.4655-4661,2000)、粒子轰击法(日本特开2005-287403)、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.75,p.1929,1978)、醋酸锂法(J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983)、Methods in yeastgenetics,2000 Edition:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中记载的方法来实施，但并不限定于此。

此外，关于一般的分子生物学的方法，可以参照"Sambrook&Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress、Cold Spring Harbor,NY)”等。

通过培养这样得到的非人类转化体，可使非人类转化体生产甜菊醇糖苷。上述非人类转化体优选为酵母菌。此外，非人类转化体的培养优选在含有甜菊醇的培养基中进行。通过对累积的甜菊醇糖苷的萃取、提纯，可以获得本发明的甜菊醇糖苷。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明的内容并不由此而限定。

[新型甜菊醇糖苷的分离]

准备由三得利全球创新中心株式会社(SIC)开发的2个系统的新型甜菊植物体(开发品种A(EM3-4)及开发品种B(EM2-27-15)。这些开发品种以如下方式获取。首先，播种市售甜菊种子，育苗，对所得种子实施基于0.2％(开发品种B)或0.3％(开发品种A)的甲磺酸乙酯(EMS)处理的基因改变。将经EMS处理的种子，在三得利全球研究中心内温室中播种，获得EMS处理当代(M0世代)苗。未在处理浓度之间发现发芽率差异。开发品种A来自该M0世代的个体。进一步，通过所有M0世代个体的自繁采集处理第一代(M1世代)种子，在三得利全球研究中心内的温室内播种，获得M1世代苗。开发品种B来自该M1世代的个体。

实施从开发品种A及开发品种B的叶中获得的萃取物的高效液相色谱(HPLC)分离-质量分析(MS)，测定以含有D-吡喃葡萄糖基(Glc)、吡喃木糖基(Xyl)的糖链构成的甜菊醇糖苷的分子量，并实施甜菊植物体中所含的甜菊醇糖苷的筛选分析。此处，开发品种A及开发品种B为具有后述的遗传性状1～8的植物体。

关于测试溶液的制备方法，分别称量经冷冻干燥处理的甜菊干燥叶10.0mg到玻璃细颈瓶中，添加水/甲醇(1/1vol/vol)1.0mL作为萃取溶剂，然后在超声波清洗器(AS ONE,AS52GTU)中，在25℃的设定温度下施加超声波20分钟，从甜菊叶中得到甜菊醇糖苷的萃取液。为了进一步提供给HPLC-MS，用水/甲醇进行10倍稀释，用孔径0.45μm的过滤器(Nacalaitesque，COSMONICE Filter S(溶剂类))进行过滤。

HPLC-MS的HPLC，作为输液单元LC泵使用Nexera LC-30AD(岛津制作所)、作为分离柱使用SM-C18(4.6×250mm)(Imtakt公司制)。关于LC流动相的输液，流动相A使用含有0.2％乙酸的超纯水(MilliQ water)，流动相B使用甲醇，使二元梯度于流动相B浓度为10％保持恒定0-5分钟，然后用15分钟使流动相B浓度从10％变化至70％，进一步用5分钟使B浓度从70％变化至100％，最后使流动相B浓度维持在100％5分钟然后结束。以流动相的流速为0.4mL/分，注入稀释后经过滤器过滤的甜菊叶萃取液5μL。

MS使用装置有电喷射离子化(ESI)离子源的三重四极杆质谱仪LCMS-8030(岛津制作所)。质谱分析测定，在负离子测定模式、选择m/z值并进行测定的选择性离子检测(SIM)模式下进行测定。关于选择的m/z值，选择以构成含有D-吡喃葡萄糖基(Glc)、吡喃木糖基(xyl)的糖链的甜菊醇糖苷的分子量为基础计算的m/z值。从而，选择m/z＝965.3(Glc(4))、1097.4(Glc(4)、Xyl(1)),1127.4(Glc(5))、1259.5(Glc(5)、Xyl(1))、及1289.5(Glc(6))。进一步，通过在相同的条件下对可得到的高纯度试剂、瑞鲍迪苷A、D及M进行测定，确认HPLC的负离子m/z值、保留时间。检测出的主要的甜菊醇糖苷的峰面积值(任意单位：arbitraryunit)示于表1。

[表1]

表1.由HPLC-MS的SIM测定观测的峰面积值

图2中示出开发品种A的m/z 1097.4的选择性离子色谱。在甜菊醇糖苷的被修饰的糖链含有4个葡萄糖(Glc)和1个木糖(Xyl)的甜菊醇糖苷(m/z 1097.4)的选择性离子色谱中观测到具有至今未报告的分子量的谱峰。即，图2所示的Rt 29.05分的谱峰为未知物质。暂时将该物质作为“新型甜菊醇糖苷1E”。关于开发品种B也检测到同样的谱峰。

图3中示出开发品种A的m/z 1259.5的选择性离子色谱。在甜菊醇糖苷的被修饰的糖链含有5个葡萄糖(Glc)和1个木糖(Xyl)的甜菊醇糖苷(m/z 1259.5)的选择性离子色谱中观测到具有至今未报告的分子量的谱峰。即，图3所示的Rt 29.30分的谱峰为未知物质。暂时将该物质作为“新型甜菊醇糖苷2E”。关于开发品种B也检测到同样的谱峰。

[新型甜菊醇糖苷的结构分析]

在本发明中，由开发品种中检测出的新型甜菊醇糖苷1E及2E的结构分析通过以下步骤实施。

(i)根据高效液相色谱法(HPLC)-高分辨率质谱分析(MS)及MS/MS、3级离子碎片化(MS³碎片化)的碎片化分析的结构推测，

(ii)通过化学反应进行的推测的甜菊醇糖苷标准品的化学合成，

(iii)根据化学合成标准品的HPLC-高分辨率MS及MS³碎片化的保留时间和碎片化模式的一致性进行的结构确认

以下分别针对上述(i)～(iii)的工序进行详细说明。

(i)根据高效液相色谱法(HPLC)-高分辨率质谱分析(MS)及MS/MS、3级离子碎片化(MS³碎片化)的碎片化分析的结构推测

关于测试溶液的制备，分别称量实施冷冻干燥处理的甜菊干燥叶10.0mg到玻璃细颈瓶中，添加水/甲醇(1/1vol/vol)1.0mL作为萃取溶剂，然后在超声波清洗器(AS ONE，AS52GTU)中，在25℃的设定温度下施加超声波20分钟，从甜菊叶中得到甜菊醇糖苷的萃取液。为了进一步提供给HPLC-MS，用水/甲醇进行10倍稀释，用孔径0.45μm的过滤器(Nacalaitesque，COSMONICE Filter S(溶剂类))进行过滤。

高效液相色谱法-电喷射离子化精密质谱分析(HPLC-ESI-HRMS)的机器构成中，关于HPLC的机器构成，作为输液单元LC泵使用Prominence LC-20AD(岛津制作所)，作为分离柱使用SM-C18(4.6×250mm)(Imtakt公司制)。关于LC流动相的输液，作为流动相A使用含有0.2％乙酸的超纯水(MilliQ water)，作为流动相B使用甲醇，使二元梯度于流动相B浓度为10％保持恒定0-5分钟，然后用15分钟使流动相B浓度从10％变化至70％，进一步用5分钟使B浓度从70％变化至100％。最后使流动相B浓度维持在100％5分钟然后结束。以流动相的流速为0.4mL/分，注入稀释后经过滤器过滤的甜菊叶萃取液20μL。质谱分析部使用装置有ESI离子源的Orbitrap Elite MS(Thermo Fisher Scientific公司制)。质谱分析测定在负离子测定模式下，在m/z 150-2000的范围内，设定分辨率60，000的条件下进行测定。MS/MS测定选择作为目标的m/z 1095.4或1257.5，并在通过和惰性气体的冲击进行碎片化的CID模式下实施。MS³的目标离子为MS/MS质谱中强度最强的离子。碎片化所需的能量的照射于作为装置固有的冲击能量标准的35下实施。

为了理解新型甜菊醇糖苷1E及2E的碎片化模式，对已知其结构的标准品瑞鲍迪苷A及D、M的MS/MS及MS³碎片化模式进行分析。结果在新型甜菊醇糖苷的MS/MS中得到了在19位上以酯键键合的糖链全部脱离的谱峰的离子强度表现为最强的数据。该结果表示在19位的碳原子上以酯键键合的糖链的总分子量。

图4中示出新型甜菊醇糖苷1E(与m/z 1097.4，Rt:29.05相当)的MS/MS及MS³碎片化质谱。从新型甜菊醇糖苷的MS/MS质谱中，在相当于脱离1个Glc份和1个Xyl份的m/z803.37处的谱峰被检测为主谱峰。由该结果可知与19位的碳原子以酯键键合的糖链数为1个Glc份和1个Xyl份。为了进一步获取结构信息，取得了对MS/MS中获得的主谱峰m/z 803.4进行碎片化的MS³质谱。其结果是，获得了具有和瑞鲍迪苷A的MS³质谱(965.4→803.4→)同样的谱峰模式的质谱。由此，可推断在13位上键合的糖链与瑞鲍迪苷A相同。推测结构示于图4。

图5中示出新型甜菊醇糖苷2E(与m/z 1259.5，Rt:29.30相当)的MS/MS及MS³碎片化质谱。从新型甜菊醇糖苷的MS/MS质谱中，在相当于脱离3个Glc份的m/z 773.36处的谱峰被检测为主谱峰。由该结果可知与19位的碳原子以酯键键合的糖链数为3个Glc份。为了进一步获取结构信息，取得了对MS/MS中获得的主谱峰m/z 773.4进行碎片化的MS³质谱。其结果是，获得了具有和瑞鲍迪苷F的MS³质谱(935.4→773.4→)同样的谱峰模式的质谱。由此，可推断在13位上键合的糖链与瑞鲍迪苷F相同。推测结构示于图5。

(ii)通过化学反应进行的推测的甜菊醇糖苷标准品(新型甜菊醇糖苷1S及2S)的化学合成

[新型甜菊醇糖苷1S的合成]

(1)合成路径概要

[化学式7]

方案1新型甜菊醇糖苷1S的合成策略

如方案1所示，在新型甜菊醇糖苷1S(目的化合物15)的合成中，通过光延反应使中间体(3)与2糖半缩醛体(8)进行缩合，获得新型甜菊醇糖苷1S(目的化合物15)的骨架。在中间体(3)的合成中，对作为已知的天然物的瑞鲍迪苷A(1)的甜菊醇19位的酯键进行碱水解后，通过用乙酰(Ac)基对糖链的羟基进行保护，得到中间体(3)。在2糖半缩醛体(8)的合成中，通过被适当保护的葡萄糖受体(4)与木糖供体(5)的缩合反应，制作2糖骨架，通过对还原末端1位的保护基进行脱保护，获得2糖半缩醛体(8)。通过光延反应使所得的中间体(3)与2糖半缩醛体(8)进行缩合时，反应以79％(仅β)的高收率且完全的β选择性进行。通过对所得的化合物的保护基进行脱保护，得到新型甜菊醇糖苷1S(目的化合物15)。

接下来对各合成工序进行说明。

(2)中间体(3)的合成

中间体(3)以国际公开第2018/181515号中记载的方法实施。

(3)2糖半缩醛体的合成

[化学式8]

方案2 2糖半缩醛体(8)的合成

如方案2所示，在2糖半缩醛体(8)的合成中，使葡萄糖受体(4)(40.0g，115mmol)与木糖供体(5)(53.4g，127mmol)、分子筛

(60g)溶解至二氯甲烷(1.2L)，于-20℃下加入三氟化硼二乙基醚络合物(1.46mL，11.5mmol)，并于-20℃下搅拌1小时。通过TLC(乙酸乙酯/己烷＝1/1，Rf值＝0.2)确认反应结束后，用三乙基胺(2.0mL)进行中和(pH8)，滤除分子筛

将减压浓缩而得的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗脱液(乙酸乙酯/己烷＝1/1)中得到化合物7(61.2g，88％)。

NMR频谱使用“AVANCE III HD 400 spectrometer”，Bruker公司制，测定¹H-NMR和¹³C-NMR。测定使用的溶剂及频率如下所示。关于NMR频谱的测定，后述的其他化合物也使用相同装置实施。

[化合物7]

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ2.01-2.10(complex,18H,OAc),3.35(dd,1H),3.68(m,1H),3.73(t,1H),4.13-4.27(complex,4H),4.38(m,1H),4.48(d,J＝8.0Hz,1H),4.74(d,J＝6.4Hz,1H),4.86(t,1H),4.90-4.99(complex,2H),5.09(t,1H),5.35(d,1H),5.91(m,1H)；¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz)δ20.6×2,20.7×2,20.8×2,61.9,62.0,68.7,68.9,70.5,70.7,71.2,71.5,74.5,98.9,100.3,117.8,133.4,169.4,169.7,170.0,170.7.

使化合物7(2.3g，3.8mmol)溶解于乙酸(100mL)和水(10mL)，于室温下加入氯化钯(1.2g，6.8mmol)，在氩气氛下，于室温下搅拌18小时。通过TLC(氯仿/乙酸乙酯＝2/1，Rf值＝0.2)确认反应结束后，滤除氯化钯，将减压浓缩而得的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗脱液(氯仿/乙酸乙酯＝2/1)中得到2糖半缩醛体(8)(1.6g，75％)。

[2糖半缩醛体(8)]

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ2.00-2.15(complex,27H,OAc),3.31-3.39(complex,2H),3.53-3.79(complex,3H),3.86(d,J＝2.8Hz,1H),4.06-4.33(complex,6H),4.58(d,J＝7.2Hz,1H),4.83-5.06(complex,5H),5.09-5.22(complex,2H),5.35(m,1H),5.45(t,1H)；¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz)δ20.4,20.5,20.6×2,20.7×2,61.9,62.2,67.2,68.3×2,68.5,68.7,70.7,71.4,71.5,76.7,92.0,101.6,169.5,169.7,169.8×2,170.1,170.7.

(4)化合物15的合成

[化学式9]

方案3新型甜菊醇糖苷1S的合成

如方案3所示，在化合物14的合成中，使2糖半缩醛体(8)(9.4g，16.7mmol)和中间体(3)(18.6g，15.1mmol)溶解于1，4-二氧杂环乙烷(150mL)中，于室温下加入三丁基膦(14.9mL，60.6mmol)、1，1’-偶氮二(N，N’-二甲基甲酰胺)(TMAD)(10.4g，60.6mmol)，于60℃下搅拌1小时。通过TLC(甲苯/乙酸乙酯＝3/2，Rf值＝0.2)确认反应结束后，以乙酸乙酯进行稀释，用水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行清洗，用硫酸镁进行干燥。滤除硫酸镁，将减压浓缩而得的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗脱液(甲苯/乙酸乙酯＝3/2)中得到化合物14(21.1g，79％)。

[化合物14]

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ0.75-1.32(complex,13H),1.37-2.32(complex,77H),3.36(t,1H),3.50-3.72(complex,4H),3.75-4.29(complex,14H),4.41(m,1H),4.52-4.65(complex,2H),4.77-5.27(complex,20H),5.62(d,J＝7.6Hz,1H)；¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz)δ16.3,19.3,20.3,20.4,20.5×2,20.6×3,20.7×3,20.9,21.2,21.3,28.9,36.5,36.8,39.3,40.3,41.1,42.6,43.3,43.8,45.1,47.2,53.5,57.3,60.3,61.1,61.7,62.0,62.6,67.9,68.0,68.1,68.3,68.7,70.6,71.4,71.6,71.7,71.8,72.1,72.9,73.0,74.7,80.1,85.8,85.9,91.2,96.2,98.9,99.2,100.9,104.5,125.2,128.1,128.7,152.7,168.9,169.2,169.3×2,169.6,169.7,169.9,170.0×2,170.3×2,170.5,170.7,174.5.

使化合物(14)(20.0g，11.3mmol)溶解于甲醇(100mL)、THF(100mL)，于4℃下加入甲醇钠(甲醇中0.5M)(25mL)，于室温下搅拌1小时。通过TLC(氯仿/甲醇/水＝5/4/0.1，Rf值＝0.1)确认反应结束后，加入Amberlite120B(H)进行中和，将减压浓缩而得的糖浆提供给凝胶过滤层析(GE Healthcare，Sephadex LH-20，乙醇)，得到化合物15(10.2g，69％)。

[化合物15]

¹H-NMR(pyridine-d5,400MHz)δ0.70(m,1H),0.88(m,1H),0.91-1.40(complex,10H),1.51-2.21(complex,14H),2.43-2.55(complex,2H),3.59-3.70(complex,2H),3.77-4.51(complex,36H),4.91(s,1H),5.03(d,J＝8.0Hz,1H),5.20(d,J＝7.6Hz,1H),5.35(d,J＝7.6Hz,1H),5.52(d,J＝8.0Hz,1H),5.61(m,1H),6.16(d,J＝7.6Hz,1H)；¹³C-NMR(pyridine-d5,100MHz)δ17.1,20.4,21.0,22.9,29.4,38.1,38.6,40.2,41.1,42.3,42.6,44.4,44.8,45.9,48.2,54.5,57.9,62.6,62.8×2,63.8,67.9,70.4,71.3,71.6,72.1,72.8,75.9,76.3,76.9,77.9,78.5,78.7,78.8,79.0,79.1,79.5,81.5,82.3,87.3,88.6,94.1,98.2,105.0,105.1,105.3,107.1,154.4,176.4.

[新型甜菊醇糖苷2S的合成]

(1)合成路径概要

[化学式10]

方案4新型甜菊醇糖百2S的合成策略

如方案4所示，在新型甜菊醇糖苷2S(17)的合成中，通过光延反应使中间体(9)与3糖半缩醛体(13)进行缩合，获得新型甜菊醇糖苷2S(17)的骨架。在中间体(9)的合成中，对作为已知的天然物的瑞鲍迪苷F(2)的甜菊醇19位的酯键进行碱水解后，通过用乙酰(Ac)基对糖链的羟基进行保护，得到中间体(9)。通过光延反应使所得的中间体(9)与3糖半缩醛体(13)进行缩合时，反应以53％(仅β)的高收率且完全的β选择性进行。通过对所得的化合物的保护基进行脱保护，得到新型甜菊醇糖苷2S(17)。

接下来对各合成工序进行说明。

(2)中间体(9)的合成

[化学式11]

方案5中间体(9)的合成

如方案5所示，在中间体(9)的合成中，使瑞鲍迪苷F(2)(1.8g，1.9mmol)溶解于甲醇(20mL)和水(10mL)中，于室温下加入2mol/L氢氧化钠(10mL)，于100℃下进行3小时回流。通过TLC(氯仿/甲醇＝4/1，Rf值＝0.2)确认反应结束后，用Amberlite120B(H)对反应液进行中和(pH7)，滤除树脂后，减压浓缩，得到化合物6(2.1g)。

使化合物6(2.1g)溶解于吡啶(20mL)，于室温下加入乙酸酐(3.6mL)，于室温下搅拌24小时。通过TLC(氯仿/甲醇＝50/1，Rf值＝0.2)确认反应结束后，于0℃下加入饱和的碳酸氢钠水溶液(40mL)，用乙酸乙酯萃取3次。将对有机层减压浓缩而得的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗脱液(氯仿/甲醇＝50/1)中得到中间体9(2.0g，90％(2工序))。

[中间体9]

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ0.81(m,1H),0.89-1.12(complex,8H),1.22(s,3H),1.41-2.22(complex,50H),3.49(dd,1H),3.58(m,1H),3.65(m,1H),3.85(t,1H),3.96-4.15(complex,4H),4.42(m,2H),4.56(d,J＝7.6Hz,1H),4.81-4.94(complex,6H),5.00(t,1H),5.04-5.14(complex,3H)，5.25(t，1H)；¹³C-NMR(CDCl₃，100MHz)δ16.0，17.3，19.1，20.5，20.6，20.7，20.8×2，20.9，21.8，29.1，29.8，37.9，38.0，39.5，40.7，41.5，42.2，43.8，44.0，48.4，53.8，56.8，61.7，63.1，66.8，68.0，68.7，68.8，69.7，71.0，71.6，71.9，72.4，72.8，81.3，87.3，96.6，96.8，99.2，105.6，151.9，169.0，169.5，169.6，170.1×2，170.3，170.6，170.9，171.0，182.5.

(3)3糖半缩醛体的合成

3糖半缩醛体的合成以国际公开第2018/181515号中记载的方法来实施。

(4)化合物17的合成

[化学式12]

方案6新型甜菊醇糖苷2S(化合物17)的合成

如方案6所示，在化合物16的合成中，使3糖半缩醛体(13)(2.4g，2.6mmol)和中间体(9)(2.0g，1.7mmol)溶解于1，4-二氧杂环乙烷(20mL)，于室温下加入三丁基膦(4.3mL，17.3mmol)、1，1’-偶氮二(N，N’-二甲基甲酰胺)(TMAD)(3.0g，17.3mmol)，于60℃下搅拌2小时。通过TLC(乙酸乙酯/庚烷＝2/1，Rf值＝0.1)确认反应结束后，用乙酸乙酯进行稀释，用水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行清洗，用硫酸镁进行干燥。滤除硫酸镁，将减压浓缩而得的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗脱液(乙酸乙酯/庚烷＝2/1)中得到化合物16(1.9g，53％，仅β)。

[化合物16]

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)δ0.78-1.05(complex,9H),1.25(t,4H),1.36-2.31(complex,86H),3.51(dd,1H),3.59(m,1H),3.61-3.78(complex,4H),3.81(t,1H),3.91-4.21(complex,11H),4.31(dd,1H),4.40-4.59(complex,4H),4.73-5.29(complex,21H),5.60(d,J＝7.2Hz,1H)；¹³C-NMR(CDCl₃,100MHz)δ16.8,17.5,19.5,20.5,20.7×3,20.8×3,20.9×3,21.0,21.1×2,21.5,29.2,37.4,37.5,39.6,40.5,41.6,42.5,43.8,44.2,48.1,53.8,57.4,61.7,62.0,62.1,62.3,63.1,66.7,67.4,68.0,68.3,68.4,68.6,68.8,69.7,71.1,71.5,71.8,71.9,72.0,72.2,72.3,72.4,72.9,73.1,75.0,80.1,81.5,86.8,91.3,96.4,97.0,99.2,99.3,99.6,104.9,152.8,169.0,169.1,169.3,169.5×2,169.6,170.1×2,170.2×3,170.5,170.6,170.9,174.8.

使化合物(16)(2.2g，1.1mmol)溶解于甲醇(10mL)、THF(10mL)，于室温下加入甲醇钠(MeOH中0.5M)(2.5mL)，于室温下搅拌3小时。通过TLC(氯仿/甲醇/水＝5/4/1，Rf值＝0.4)确认反应结束后，用Amberlite120B(H)进行中和(pH7)，滤除树脂后，将减压浓缩而得的糖浆溶解于MeCN/H₂O＝1/2，实施冷冻干燥。由此得到化合物17(1.0g，70％)。

[化合物17]

¹H-NMR(pyridine-d5,400MHz)δ0.78(m,1H),0.91(m,1H),1.08(m,1H),1.31-1.48(complex,9H),1.62-1.80(complex,3H),1.81-1.89(complex,3H),2.00-2.06(complex,2H),2.29(m,3H),2.47(m,1H),2.69(m,1H),2.80(m,1H),3.41(t,1H),3.81(m,1H),3.90-4.41(complex,33H),4.53-4.61(complex,2H),4.70(m,1H),4.88-5.22(complex,14H),5.30(d,J＝8.0Hz,1H),5.37(d,J＝7.6Hz,1H),5.51-5.57(complex,2H),5.61(s,1H),5.77(s,2H),5.84(d,J＝7.6Hz,1H),6.46(d,J＝8.0Hz,1H)；¹³C-NMR(pyridine-d5,100MHz)δ18.3,21.2,21.7,25.1,29.8,39.9,41.3,41.7,42.5,44.2,44.7,45.8,47.9,55.9,58.9,63.3,63.5,63.6,64.2,65.6,68.5,71.7,72.2,72.6,72.9,75.2,76.9,77.0,77.2,78.4,79.2,79.3,79.4,79.5,79.6,79.9,80.0,80.6,83.7,89.2,89.5,90.2,96.5,97.7,105.4,105.7,105.9,106.4,107.3,154.9,178.5.

(iii)根据化学合成标准品的HPLC-高分辨率MS/MS及MS³碎片化的保留时间和碎片化模式的一致性进行的结构确认

在(i)中记载的条件下，使用装置有HPLC-ESI离子源的Orbitrap Elite MS(Thermo Fisher Scientific公司制)，通过HPLC-高分辨率MS/MS及MS³碎片化对新型甜菊醇糖苷1的化学合成品(化合物15的β体)和甜菊叶萃取液进行了对比，结果在保留时间29.34分或29.37分的谱峰检测出来自化学合成品和甜菊叶萃取液的谱峰(图10)。另外，图10中的保留时间29.34分或29.37分的谱峰与图2中的保留时间29.05分的谱峰相当，通过使用化学合成品对图2中使用的装置(LCMS-8030)中的保留时间测定来确认。此外，各MS/MS及MS³碎片化质谱(图11)也一致。由此结果，确认了从植物体的萃取液中得到的新型甜菊醇糖苷1E和化合物15的β体具有相同的结构。

进一步，在(i)中记载的条件下，使用装置有HPLC-ESI离子源的Orbitrap EliteMS(Thermo Fisher Scientific公司制)，通过HPLC-高分辨率MS/MS及MS³碎片化对新型甜菊醇糖苷2的化学合成品(化合物17的β体)和甜菊叶萃取液进行了对比，结果在保留时间29.67分或29.68分的谱峰检测出来自化学合成品和甜菊叶萃取液的谱峰(图12)。另外，图12中的保留时间29.67分或29.68分的谱峰与图3中的保留时间29.30分的谱峰相当，通过使用化学合成品对图3中使用的装置(LCMS-8030)中的保留时间测定来确认。此外，各MS/MS及MS³碎片化质谱(图13)也一致。由此结果，确认了从植物体的萃取液中得到的新型甜菊醇糖苷2E和化合物17的β体具有相同的结构。

新型甜菊醇糖苷的甜味度评价

为了评价新型甜菊醇糖苷A和B的甜味度，以Brix以0.5刻度达到3.0～5.0的方式制备将砂糖添加至纯水而得的样本。作为新型甜菊醇糖苷A和B，分别使用通过化学合成而得的化合物15和17，使48mg的样本溶解于400mL的纯水中进行试验。此外，为了对比还制作分别使Reb.A、Reb.D及Reb.M各48mg溶解至400mL的纯水中而得的样本。

(1)新型甜菊醇糖苷A的甜味度评价

评价通过选择添加有新型甜菊醇糖苷的样本和添加有具有相同甜味强度的砂糖的样本来实施，关于甜味剂的感官经训练者(7名)作为评审实施感官评价。结果明确本发明的新型甜菊醇糖苷A具有相对于砂糖平均354倍左右的甜味度。

[表2]

表2：新型甜菊醇糖苷A的甜味度评价

(2)新型甜菊醇糖苷B的甜味度评价

与新型甜菊醇糖苷A同样地评价甜味度。结果明确了本发明的新型甜菊醇糖苷B相对于砂糖具有平均250倍左右的甜味度。结果示于下表。

[表3]

表3：新型甜菊醇糖苷B的甜味度评价

新型甜菊醇糖苷A(化合物15)的感官评价

为了实施各种甜菊醇糖苷的味道的评价，将Reb.A、Reb.D、Reb.M、砂糖和新型甜菊醇糖苷A(化合物15)分别添加至纯水中，制备饮料样本。所有饮料样本以Reb.A为312、Reb.D为317、Reb.M为341、新型甜菊醇糖苷A(化合物15)为354，以砂糖(蔗糖)换算的甜味度(Brix)最终达到5的方式对甜味度进行调整。

针对所得饮料样本，以甜味开端、甜味后味、苦味及苦味后味的指标实施感官评价。关于甜味剂的感官接受训练者(7名)作为评审实施评价，评价标准如下所示。在各评价项目中，以砂糖为3分，以0.5分刻度对各甜菊醇糖苷的分数进行评分。数值越高，甜味开端越快，甜味后味越短，苦味越少，苦味后味越短。结果示于图14。图中所示评分为8名评审的评分的平均值。感官评价的结果明确新型甜菊醇糖苷A与其他糖苷相比，甜味和苦味后味少，苦味与包括砂糖的其他成分相比少。

新型甜菊醇糖苷B(化合物17)的感官评价

为了实施各种甜菊醇糖苷的味道的评价，将Reb.A、Reb.D、Reb.M、砂糖和新型甜菊醇糖苷B(化合物17)分别添加至纯水中，制备饮料样本。所有饮料样本以Reb.A为288、Reb.D为310、Reb.M为324、新型糖苷B(化合物17)为250，以砂糖(蔗糖)换算的甜味度(Brix)最终达到5的方式对甜味度进行调整。

针对所得饮料样本，以甜味开端、甜味后味、苦味及苦味后味的指标实施感官评价。关于甜味剂的感官接受训练者(7名)作为评审实施评价，评价标准如下所示。在各评价项目中，以砂糖为3分，以0.5分刻度对各甜菊醇糖苷的分数进行评分。数值越高，甜味开端越快，甜味后味越短，苦味越少，苦味后味越短。结果示于图15。图中所示评分为6名评审的评分的平均值。感官评价的结果明确新型甜菊醇糖苷B与其他糖苷相比苦味低。

含有新型甜菊醇糖苷A及B的植物体中所含的遗传性状的鉴定

使用富含新型甜菊醇糖苷A及B的系统(变异型：开发系统A及开发系统B)和新型糖苷A及B的含量少的系统(野生型：开发系统X及开发系统Y)，研究富含新型糖苷A及B的系统的特异性遗传性状的确定。对各系统的基因组进行测序时，明确富含新型糖苷A及B的系统，相对于野生型(WT)，具有序列号1的第298号、第328号、第360号、第386号、第393号、第411号、第427号及第453号的碱基中的取代、序列号57的第90号的碱基和第91号的碱基之间插入15碱基、序列号59的第98号、第102号、第111号、第113号、第116号、第119号及第122号的碱基中的取代(对应序列号1、57及59的变异型系统的碱基序列分别示于序列号2、58及60)。此外，明确序列号1中的取代、序列号57中的插入及序列号59中的取代，分别存在于对含有序列号53、61及63的氨基酸序列的蛋白质(本说明书中，有时分别称作P1、P2及P3)进行编码的基因的内含子区域。接下来，研究这些变异是否影响各基因的表达量。在液氮中对开发品种A、B、X(SR001)、Y(SS075-49)的展开叶100mg进行冷冻粉碎后，使用QIAGEN公司的RNAeasyPlant mini kit，依照制造者的使用手册提取total RNA。将提取的total RNA 500ng用于反转录。反转录使用Thermo Fisher Scientific公司制的SuperScript IV VILO，依照制造者的使用手册合成cDNA。使用将反转录反应液稀释至1/10的溶液1μL实施半定量PCR。半定量PCR使用岛津制作所公司制的Ampdirect，依照制造者的使用手册实施PCR。就PCR反应而言，95℃下使其热变性10分钟后，对于94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 25秒的反应，P3实施32个循环，P1、P2实施33个循环，对照区的肌动蛋白、泛素实施28个循环。PCR反应后的电泳使用PerkinElmer公司制的LabChip GX Touch，依照制造者的使用手册来实施。

半定量PCR中使用以下引物。

P1

正向：CCTGTTCATTACAAATTCAACCCG(序列号55)

反向：AACCCTAACATGTTCAATGTCCCTA(序列号56)

P2

正向：ATCAGATTTATCATCTTGCATGCCC(序列号65)

反向：TGCCAATTACATTCGTCTTAATCGT(序列号66)

P3

正向：AAAAGTTGCTGGTTGAAGTTGATCA(序列号67)

反向：CACACTAAATATGCTTGGTCTTGC(序列号68)

肌动蛋白

正向：CGCCATCCTCCGTCTTGATCTTGC(序列号69)

反向：CCGTTCGGCGGTGGTGGTAA(序列号70)

泛素

正向：TCACTCTTGAAGTGGAGAGTTCCGA(序列号71)

反向：GCCTCTGTTGGTCCGGTGGG(序列号72)

表达分析结果示于图16及表4。表4中所示数值，在图16所示电泳图中，示出将泛素基因的条带强度作为100时的P1～P3基因的条带强度的相对值。

[表4]

表4：各开发品种中的P1～P3基因的表达量

样品名	P1	P2	P3
				开发品种A	146.27	126.23	99.01
开发品种B	124.57	107.76	93.79
				开发品种X	0.20	72.14	40.23
开发品种Y	0.13	94.66	77.95

由这些结果，确认在含有新型糖苷A及B的2系统中，P1基因进行高表达。P1基因中发现的变异存在于内含子区域，推测因存在这些变异中的任意1种以上而P1的表达量有所增加，从而新型糖苷A及B的合成在植物中得到促进。

具有遗传性状1～8的植物体中的新型糖苷A含量的鉴定

从上述“含有新型甜菊醇糖苷A及B的植物体中所含的遗传性状的鉴定”中使用的开发品种A、B、X及Y的个体中，采取适量的新鲜叶作为样本，通过LC/MS-MS(岛津LCMS8050)对甜味成分的浓度进行定量。具体而言，通过冷冻干燥对规定量的新鲜叶进行干燥，将粉碎干燥物投入纯水中。通过超声波处理20分钟进行萃取，离心及过滤后获得5mL的萃取液。用LCMS8050离子模式(岛津LCMS8050)对该萃取液进行LC/MS-MS分析，对Reb.A、Reb.B、Reb.C、Reb.D、Reb.E、Reb.F、Reb.G、Reb.I、Reb.M、Reb.N、甜菊苷、杜克苷A、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷及新型甜菊醇糖苷A的浓度进行定量，将该合计作为甜味成分的浓度(本实施例中的总甜菊醇糖苷量(TSG))。干燥叶的水分量均约低于3％。结果示于表5～9。下述结果为分别测定2次的平均值。

[表5]

表5：各开发品种的干燥叶中的TSG量

样品名	甜菊叶重量(g)	TSG浓度(mg/L)	TSG量(mg)	TSG率(％)
					开发品种A	0.0565	1617.35	8.087	14.3％
开发品种B	0.0501	905.42	4.527	9.0％
					开发品种X	0.0445	1142.40	5.712	12.9％
开发品种Y	0.0576	1267.14	6.336	11.1％

[表6]

表6：各开发品种的干燥叶中所含的TSG中的各甜菊醇糖苷的比例

※：合计含量中包含Reb A、Reb B、Reb C、Reb D、Reb E、Reb F、Reb G、Reb I、RebM、Reb N、甜菊苷、杜克苷A、甜菊醇双糖苷、甜叶悬钩子苷及新型甜菊醇糖苷A。

[表7]

表7：相对于8种主要的甜菊醇糖苷^※1的新型糖苷A的比例

样品名	甜菊醇糖苷A的比例
		开发品种A	0.063％
开发品种B	0.210％
		开发品种X	0.018％
开发品种Y	0.046％

※1：表6中记载的Reb A、Reb B、Reb C、Reb D、Reb F、Reb M、Reb N及甜菊苷

[表8]

表8：各开发品种的干燥叶中所含的各甜菊醇糖苷的比例

[表9]

表9：相对于各开发品种的干燥叶中所含的各甜菊醇糖苷的新犁甜菊醇糖苷A的比例

具有遗传性状1～8的植物体中的新型糖苷B含量的鉴定

从上述“含有新型甜菊醇糖苷A及B的植物体中所含的遗传性状的鉴定”中使用的开发品种B及X的个体中，采取适量的新鲜叶作为样本，通过LC/MS-MS(岛津LCMS8050)对甜味成分的浓度进行定量。具体而言，通过冷冻干燥对规定量的新鲜叶进行干燥，将粉碎干燥物投入纯水中。通过超声波处理20分钟进行萃取，离心及过滤后获得5mL的萃取液。用LCMS8050离子模式(岛津LCMS8050)对该萃取液进行LC/MS-MS分析，对Reb.A、Reb.B、Reb.C、Reb.D、Reb.E、Reb.F、Reb.G、Reb.I、Reb.M、Reb.N、甜菊苷、杜克苷A、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷及新型甜菊醇糖苷B的浓度进行定量，将该合计作为甜味成分的浓度(本实施例中的总甜菊醇糖苷量(TSG))。干燥叶的水分量均约低于3％。结果示于表10～14。

[表10]

表10：各开发品种的干燥叶中的TSG量

样品名	甜菊叶重量(g)	TSG浓度(mg/L)	TSG量(mg)	TSG率(％)
					开发品种B	0.0524	777.42	3.887	7.4％
开发品种X	0.0553	1672.45	8.362	15.1％

[表11]

表11：各开发品种的干燥叶中所含的TSG中的各甜菊醇糖苷的比例

※：合计含量中包含Reb A、Reb B、Reb C、Reb D、Reb E、Reb F、Reb G、Reb I、RebM、Reb N、甜钓苷、杜克苷A、甜菊醇双糖苷、甜叶悬钩子苷及新型甜菊醇糖苷B。

[表12]

表12：相对于8种主要的甜菊醇糖苷^※1的新型糖苷B的比例

样品名	甜菊醇糖苷B的比例
		开发品种B	1.360％
开发品种X	0.000％

※1：表11中记载的Reb A、Reb B、Reb C、Reb D、Reb F、Reb M、Reb N及甜菊苷

[表13]

表13：各开发品种的干燥叶中所含的各甜菊醇糖苷的比例

[表14]

表14：相对于开发品种B的干燥叶中所含的各甜菊醇糖苷的新型甜菊醇糖苷B的比例

序列表

<110> 三得利控股株式会社

<120> 新型甜菊醇糖苷及其制造方法，以及含有该物质的甜味剂组合物

<130> G2366WO

<150> JP2019-141627

<151> 2019-07-31

<160> 72

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 635

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 1

atcaacctga gcaacaaagt tactgacaac acgaccatcg tcaatgcaca tcctaggacc 60

ataagtattg aatatcctcg caatcctcac ctgcaggttt tttttttttt tttttaatca 120

aaccaaatta atgattcttt ctgtagataa ccagagatta tatattatcc taaaatttaa 180

acaaaactac tctctacgtc cccaaaatac catgtgccat tgattacaat caaataaact 240

taatcttatt agtaaactga tggaaaacaa aatttagata aataaagcct tggacttctt 300

atgccaaatt tatttttatt ttttttcacc aactttaatt aatattgacc ataaacattc 360

ttgtttgtat gactcaactt taattctttt ttctttcatt ttgataacat cttttaaaca 420

ggactcacta tttgaacatt atgttccatt ttcttttaaa aaaaaataat gtggaaataa 480

taactgatta acataataat aattttgaga aagataatat atagaaacaa atttacttta 540

caataataag cttatcttga tttatggcat gcaatataat tttaattgcc ctttaacctt 600

taatatagtt tgtgtaacag tcaacttgtt ttggt 635

<210> 2

<211> 635

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 2

atcaacctga gcaacaaagt tactgacaac acgaccatcg tcaatgcaca tcctaggacc 60

ataagtattg aatatcctcg caatcctcac ctgcaggttt tttttttttt tttttaatca 120

aaccaaatta atgattcttt ctgtagataa ccagagatta tatattatcc taaaatttaa 180

acaaaactac tctctacgtc cccaaaatac catgtgccat tgattacaat caaataaact 240

taatcttatt agtaaactga tggaaaacaa aatttagata aataaagcct tggacttttt 300

atgccaaatt tatttttatt ttttttcccc aactttaatt aatattgacc ataaacattt 360

ttgtttgtat gactcaactt taattttttt ttttttcatt ttgataacat tttttaaaca 420

ggactcccta tttgaacatt atgttccatt tttttttaaa aaaaaataat gtggaaataa 480

taactgatta acataataat aattttgaga aagataatat atagaaacaa atttacttta 540

caataataag cttatcttga tttatggcat gcaatataat tttaattgcc ctttaacctt 600

taatatagtt tgtgtaacag tcaacttgtt ttggt 635

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 3

ccttggactt cttatgccaa a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 4

ccttggactt tttatgccaa a 21

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 5

ataaataaag ccttggactt cttatgccaa atttattttt a 41

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 6

ataaataaag ccttggactt tttatgccaa atttattttt a 41

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 7

tttagataaa taaagccttg gacttcttat gccaaattta tttttatttt t 51

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 8

tttagataaa taaagccttg gactttttat gccaaattta tttttatttt t 51

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 9

attttttttc accaacttta a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 10

attttttttc cccaacttta a 21

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 11

atttattttt attttttttc accaacttta attaatattg a 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 12

atttattttt attttttttc cccaacttta attaatattg a 41

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 13

gccaaattta tttttatttt ttttcaccaa ctttaattaa tattgaccat a 51

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 14

gccaaattta tttttatttt ttttccccaa ctttaattaa tattgaccat a 51

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 15

cataaacatt cttgtttgta t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 16

cataaacatt tttgtttgta t 21

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 17

taatattgac cataaacatt cttgtttgta tgactcaact t 41

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 18

taatattgac cataaacatt tttgtttgta tgactcaact t 41

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 19

ttaattaata ttgaccataa acattcttgt ttgtatgact caactttaat t 51

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 20

ttaattaata ttgaccataa acatttttgt ttgtatgact caactttaat t 51

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 21

aactttaatt cttttttctt t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 22

aactttaatt tttttttttt t 21

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 23

tgtatgactc aactttaatt cttttttctt tcattttgat a 41

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 24

tgtatgactc aactttaatt tttttttttt tcattttgat a 41

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 25

ttgtttgtat gactcaactt taattctttt ttctttcatt ttgataacat 50

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 26

ttgtttgtat gactcaactt taattttttt ttttttcatt ttgataacat 50

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 27

attctttttt ctttcatttt g 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 28

attttttttt ttttcatttt g 21

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 29

aactttaatt cttttttctt tcattttgat aacat 35

<210> 30

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 30

aactttaatt tttttttttt tcattttgat aacat 35

<210> 31

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 31

gactcaactt taattctttt ttctttcatt ttgataacat ctttt 45

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 32

gactcaactt taattttttt ttttttcatt ttgataacat ttttt 45

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 33

ttgataacat cttttaaaca g 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 34

ttgataacat tttttaaaca g 21

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 35

tttcattttg ataacatctt ttaaacagga ctcac 35

<210> 36

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 36

tttcattttg ataacatttt ttaaacagga ctccc 35

<210> 37

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 37

ttttctttca ttttgataac atcttttaaa caggactcac tattt 45

<210> 38

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 38

ttttttttca ttttgataac attttttaaa caggactccc tattt 45

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 39

aacaggactc actatttgaa c 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 40

aacaggactc cctatttgaa c 21

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 41

tcttttaaac aggactcact atttgaacat tatgt 35

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 42

ttttttaaac aggactccct atttgaacat tatgt 35

<210> 43

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 43

taacatcttt taaacaggac tcactatttg aacattatgt tccat 45

<210> 44

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 44

taacattttt taaacaggac tccctatttg aacattatgt tccat 45

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 45

gttccatttt cttttaaaaa a 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 46

gttccatttt tttttaaaaa a 21

<210> 47

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 47

acattatgtt ccattttctt ttaaaaaaaa ataat 35

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 48

acattatgtt ccattttttt ttaaaaaaaa ataat 35

<210> 49

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 49

tttgaacatt atgttccatt ttcttttaaa aaaaaataat gtgga 45

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 50

tttgaacatt atgttccatt tttttttaaa aaaaaataat gtgga 45

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 51

atcaacctga gcaacaaagt tactg 25

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 52

accaaaacaa gttgactgtt acaca 25

<210> 53

<211> 306

<212> PRT

<213> 甜菊

<400> 53

Met Gly Ser Glu Leu Thr Tyr Arg His Gln Asp Thr Leu Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Glu Ser Tyr Ser Pro Lys Pro Asn Lys Gln Ser Val Thr Arg Val

20 25 30

Val Arg Tyr Ile Leu Arg Glu Gln Arg Leu Val Phe Val Leu Leu Gly

35 40 45

Ile Ala Ile Ala Thr Ser Val Phe Thr Leu Leu Pro Ser Ser Thr Asn

50 55 60

Thr Val Thr Asp Ala Tyr Ser Val Ser Glu Ser Val Gln Leu Met Asn

65 70 75 80

Pro Gln Arg Ser Val Tyr Pro Ala Arg Phe Asn Met Gly Gly Lys Ile

85 90 95

Pro Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gly Leu Arg Ile Val Val Thr Gly Gly

100 105 110

Ala Gly Phe Val Gly Ser His Leu Val Asp Arg Leu Ile Ala Arg Gly

115 120 125

Asp Ser Val Ile Val Val Asp Asn Phe Phe Thr Gly Asn Lys Asp Asn

130 135 140

Val Met His His Phe Gly Asn Pro Arg Phe Glu Leu Ile Arg His Asp

145 150 155 160

Val Val Glu Pro Leu Leu Leu Glu Val Asp Gln Ile Tyr His Leu Ala

165 170 175

Cys Pro Ala Ser Pro Val His Tyr Lys Phe Asn Pro Thr Asn Val Val

180 185 190

Gly Thr Leu Asn Met Leu Gly Leu Ala Lys Arg Val Gly Ala Arg Phe

195 200 205

Leu Leu Thr Ser Thr Ser Glu Val Tyr Gly Asp Pro Leu Gln His Pro

210 215 220

Gln Val Glu Thr Tyr Trp Gly Asn Val Asn Pro Ile Ala Gln Val Val

225 230 235 240

Gln Glu Thr Ile Asp Pro Asn Ala Ser Ile Glu Phe Lys Pro Asn Thr

245 250 255

Glu Asp Asp Pro His Lys Arg Lys Pro Asp Ile Thr Lys Ala Lys Glu

260 265 270

Leu Leu Gly Trp Lys Pro Lys Val Pro Leu Arg Lys Gly Leu Pro Met

275 280 285

Met Val Ser Asp Phe Arg Arg Arg Ile Phe Gly Asp Gln Asn Asn Pro

290 295 300

Ser Ala

305

<210> 54

<211> 921

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 54

atgggatctg agttaacata ccggcaccaa gataccctac cgggggcgtc ggaatcttac 60

tcgccgaagc ctaacaagca gtccgtgact cgcgtcgttc gttacatcct ccgtgagcag 120

cgtctcgtat ttgtgctttt gggcattgca atcgctacct ccgtcttcac gctcctccca 180

tcatccacaa acaccgtcac cgatgcctat tccgtctctg aatcggtcca gttgatgaac 240

ccgcagcgat ccgtgtatcc tgcgagattc aatatgggcg ggaagattcc gctaggtttg 300

aaacgaaagg ggttaaggat tgtggtgacc ggtggtgcag gttttgtcgg aagtcatcta 360

gttgaccggt tgattgcgag gggagacagt gtgattgttg ttgataattt cttcactggt 420

aacaaggata acgtgatgca tcactttgga aaccctagat ttgagcttat tcgtcacgac 480

gttgttgagc ctttgctact cgaggtcgat cagatctatc acctggcttg tcctgcttcc 540

cctgttcatt acaaattcaa cccgacaaat gtggtaggga cattgaacat gttagggttg 600

gcgaagaggg ttggtgcgcg gttcttgcta acaagcacca gcgaggtata cggtgatcct 660

ttacagcatc ctcaagtcga aacctactgg ggcaacgtca atcctatcgc ccaggtggtc 720

caggaaacga tagacccaaa cgcaagcata gagttcaaac caaacacaga agacgaccca 780

cacaaacgga agccggatat cacaaaggct aaggaactcc tgggttggaa gcccaaggtc 840

cctcttcgca aaggtctccc catgatggtt tctgacttca ggcgccgcat ttttggtgac 900

caaaacaacc catccgctta a 921

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 55

cctgttcatt acaaattcaa cccg 24

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 56

aaccctaaca tgttcaatgt cccta 25

<210> 57

<211> 316

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 57

cgggcgtgtt gtgagtaatt ttatagctca agcacttcgg ttagtcctcc attataatca 60

gaatcagtat ttttaatttt aaatatattt ggttaatctt aattcttgca gcgatgaacc 120

tttaaccgtt caagcccctg gaacccaaac ccgcagtttc tgttacgtct ctgatatggt 180

attttgaaaa ataatatgat tatacattta tgatataact ggtgacgcgt gtcaaacatt 240

gacttttttt taaaccgtat aggttgatgg gcttgttaaa ctaatggaag gtgaaaacac 300

tggaccaatc aacatc 316

<210> 58

<211> 331

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 58

cgggcgtgtt gtgagtaatt ttatagctca agcacttcgg ttagtcctcc attataatca 60

gaatcagtat ttttaatttt aaatatattt tttttaaata tatttggtta atcttaattc 120

ttgcagcgat gaacctttaa ccgttcaagc ccctggaacc caaacccgca gtttctgtta 180

cgtctctgat atggtatttt gaaaaataat atgattatac atttatgata taactggtga 240

cgcgtgtcaa acattgactt ttttttaaac cgtataggtt gatgggcttg ttaaactaat 300

ggaaggtgaa aacactggac caatcaacat c 331

<210> 59

<211> 183

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 59

aacccaattg gtaagcgtgc atctctgttt attttttgtt aattattgtg tatttgttga 60

attatcaatt atattggtga ttctttcttc tttaaaataa ataaaaaccg tgaaattatg 120

gtttttatta tttatgtatt ttgcaggagt taggagttgc tatgatgaag gaaaacgcgt 180

ggc 183

<210> 60

<211> 183

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 60

aacccaattg gtaagcgtgc atctctgttt attttttgtt aattattgtg tatttgttga 60

attatcaatt atattggtga ttctttcttc tttaaaaaaa aaaaaaaccg gggaaataag 120

ggttttatta tttatgtatt ttgcaggagt taggagttgc tatgatgaag gaaaacgcgt 180

ggc 183

<210> 61

<211> 251

<212> PRT

<213> 甜菊

<400> 61

Met Ala Asn Asn Ala Ser Asn Gly Glu His Lys Ser Ser Lys Pro Pro

1 5 10 15

Pro Thr Pro Ser Pro Leu Arg Asn Ser Lys Phe Phe Gln Ser Asn Met

20 25 30

Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser His Leu Val

35 40 45

Asp Lys Leu Met Glu Asn Glu Lys Asn Glu Val Ile Val Ala Asp Asn

50 55 60

Tyr Phe Thr Gly Ser Lys Asp Asn Leu Arg Lys Trp Ile Gly His Pro

65 70 75 80

Arg Phe Glu Leu Ile Arg His Asp Val Thr Glu Pro Leu Leu Val Glu

85 90 95

Val Asp Gln Ile Tyr His Leu Ala Cys Pro Ala Ser Pro Ile Phe Tyr

100 105 110

Lys His Asn Pro Val Lys Thr Ile Ala Glu Thr Leu Met Phe Asp Tyr

115 120 125

His Arg Gln His Gly Ile Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile Phe Asn Thr

130 135 140

Tyr Gly Pro Arg Met Asn Ile Asp Asp Gly Arg Val Val Asp Gly Leu

145 150 155 160

Val Lys Leu Met Glu Gly Glu Asn Thr Gly Pro Ile Asn Ile Gly Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Thr Met Ile Glu Leu Ala Glu Met Val Lys Glu Leu

180 185 190

Ile Asn Pro Lys Ile Glu Ile Lys Met Val Glu Asn Thr Pro Asp Asp

195 200 205

Pro Arg Gln Arg Lys Pro Asp Ile Thr Asn Ala Lys Lys Met Leu Gly

210 215 220

Trp Glu Pro Lys Ile Lys Leu Arg Asp Gly Leu Pro Leu Met Glu Ala

225 230 235 240

Asp Phe Arg Leu Arg Leu Gly Val Ala Lys Lys

245 250

<210> 62

<211> 936

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 62

atggcgaata atgcttcaaa cggagaacat aaatcttcaa aaccgcctcc aacgccttct 60

cctttaagga actccaaatt ctttcagtca aacatgagga tattggttac tggtggtgct 120

ggatttatcg gctctcactt ggtggataaa cttatggaaa atgaaaagaa tgaggtaatt 180

gttgctgata attactttac tggctcaaaa gataatctta gaaaatggat tggtcatcca 240

agatttgagc ttattcgtca tgatgtcact gaaccattgc tagttgaggt tgatcagatt 300

tatcatcttg catgccccgc ttcaccaatt ttttataaac acaatcctgt aaagacgatt 360

aagacgaatg taattggcac actaaatatg cttggtcttg cgaagcgagt cggggcaagg 420

attttgctta cctcaacatc tgaggtatac ggtgatcctc ttgtgcatcc gcaaccagag 480

agttactggg gtaatgtcaa cccgattgga gttcggagtt gctatgatga aggaaaacgt 540

gtggcagaga ctctgatgtt tgattatcac aggcaacatg gaatagaaat aagaattgcg 600

cgtattttca acacatatgg accccggatg aatattgatg acgggcgtgt tgttgatggg 660

cttgttaaac taatggaagg tgaaaacact ggaccaatca acatcggtaa tccaggtgaa 720

ttcacaatga tcgaactcgc tgagatggtt aaggagctta ttaatccgaa aatagagatt 780

aagatggtgg aaaacacacc cgatgatcca cgacaaagaa aacccgacat cacaaatgcg 840

aagaagatgc ttggatggga gccgaagatc aaactgcgcg atggacttcc gctcatggaa 900

gctgatttta ggctgaggct tggagttgcc aagaag 936

<210> 63

<211> 313

<212> PRT

<213> 甜菊

<400> 63

Met Ala Asn Asn Ala Ser Asn Gly Glu His Lys Val Thr Lys Pro Pro

1 5 10 15

Pro Thr Pro Ser Pro Leu Arg Asn Ser Lys Phe Leu Gln Ser Asn Met

20 25 30

Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser His Leu Val

35 40 45

Asp Lys Leu Met Glu Asn Glu Lys Asn Glu Val Ile Val Ala Asp Asn

50 55 60

Tyr Phe Thr Gly Ser Lys Asp Asn Leu Arg Lys Trp Ile Gly His Pro

65 70 75 80

Arg Phe Glu Leu Ile Arg His Asp Val Thr Glu Lys Leu Leu Val Glu

85 90 95

Val Asp Gln Ile Tyr His Leu Ala Cys Pro Ala Ser Pro Ile Phe Tyr

100 105 110

Lys Tyr Asn Pro Val Lys Thr Ile Lys Thr Asn Val Ile Gly Thr Leu

115 120 125

Asn Met Leu Gly Leu Ala Lys Arg Val Gly Ala Arg Ile Leu Leu Thr

130 135 140

Ser Thr Ser Glu Val Tyr Gly Asp Pro Leu Val His Pro Gln Pro Glu

145 150 155 160

Thr Tyr Trp Gly Asn Val Asn Pro Ile Gly Val Arg Ser Cys Tyr Asp

165 170 175

Glu Gly Lys Arg Val Ala Glu Thr Leu Met Phe Asp Tyr His Arg Gln

180 185 190

His Gly Ile Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro

195 200 205

Arg Met Asn Ile Asp Asp Gly Arg Val Val Asp Gly Leu Ile Arg Leu

210 215 220

Met Glu Gly Glu Asn Thr Gly Pro Ile Asn Ile Gly Asn Pro Gly Glu

225 230 235 240

Phe Thr Met Ile Glu Leu Ala Glu Thr Val Lys Glu Leu Ile Asn Pro

245 250 255

Lys Ile Glu Ile Lys Met Val Glu Asn Thr Pro Asp Asp Pro Arg Gln

260 265 270

Arg Lys Pro Asp Ile Thr Asn Ala Lys Lys Met Leu Gly Trp Glu Pro

275 280 285

Lys Ile Lys Leu Arg Asp Gly Leu Pro Leu Met Glu Ala Asp Phe Arg

290 295 300

Leu Arg Leu Gly Val Ala Lys Lys Ile

305 310

<210> 64

<211> 942

<212> DNA

<213> 甜菊

<400> 64

atggcaaata acgcttcaaa tggtgaacat aaagttacaa aaccacctcc aaccccatct 60

cctctgcgta attctaaatt cttgcagtca aatatgagga tattggttac tggtggtgct 120

ggatttatcg gatctcacct agtggataaa ctgatggaaa atgaaaagaa tgaggtgatt 180

gttgctgata attattttac tggttcaaaa gacaacctta gaaagtggat tggtcatcca 240

agatttgagc ttattcgaca tgatgtcaca gaaaagttgc tggttgaagt tgatcagata 300

taccatcttg catgtcctgc ttcacccatt ttttataaat acaatcctgt taaaacgata 360

aagactaatg ttattggcac actaaatatg cttggtcttg ccaagcgagt tggagcaagg 420

attttgctta cctcgacctc ggaggtatat ggtgatcctc tcgtgcatcc acaacctgag 480

acctactggg gtaatgtcaa cccaattgga gttaggagtt gctatgatga aggaaaacgc 540

gtggcagaga ctttgatgtt tgattatcac agacaacatg gcatagaaat aagaattgct 600

cgtattttca acacatatgg accccggatg aacatcgatg acggacgtgt cgttgatggg 660

cttattcggc tgatggaagg tgagaacacc ggaccaatca acattggtaa tccgggtgaa 720

tttacaatga ttgaactcgc tgaaacagtc aaagagctta taaatccaaa aatagagatt 780

aagatggtgg aaaacacgcc tgatgatcca agacaaagaa aaccggatat tacaaatgct 840

aaaaagatgc ttggatggga gcctaagatt aaattgcgcg atggtcttcc gcttatggaa 900

gcagacttta ggttaaggct tggagttgca aagaagatat aa 942

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 65

atcagattta tcatcttgca tgccc 25

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 66

tgccaattac attcgtctta atcgt 25

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 67

aaaagttgct ggttgaagtt gatca 25

<210> 68

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 68

cacactaaat atgcttggtc ttgc 24

<210> 69

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 69

cgccatcctc cgtcttgatc ttgc 24

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 70

ccgttcggcg gtggtggtaa 20

<210> 71

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 71

tcactcttga agtggagagt tccga 25

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 72

gcctctgttg gtccggtggg 20

Claims

1.一种化合物，或其盐或其水合物，其特征在于，由式(1)所示，

[化学式1]

式中，

(i)R₁表示Xyl(1-2)Glc1-，且R₂表示Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-；或者，

(ii)R₁表示Glc(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-，且R₂表示Xyl(1-2)[Glc(1-3)]Glc1-，

Glc表示葡萄糖，Xyl表示木糖。

2.根据权利要求1所述的化合物，或其盐或其水合物，其特征在于，由下述式(2)或(3)所示，

[化学式2]

3.根据权利要求1或2所述的化合物，或其盐或其水合物，其特征在于，由下述式(4)或(5)所示，

[化学式3]

4.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物，其特征在于，为植物来源物、化学合成物或生物合成物。

5.一种饮食品，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的化合物。

6.根据权利要求5所述的饮食品，其特征在于，权利要求1～4中任一项所述的化合物的含量为1质量ppm～600质量ppm。

7.一种甜味剂组合物，其特征在于，含有权利要求1～4中任一项所述的化合物。

8.根据权利要求7所述的甜味剂组合物，其特征在于，权利要求1～4中任一项所述的化合物的含量为1重量％～99重量％。

9.根据权利要求7或8所述的甜味剂组合物，其特征在于，进一步含有选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷I、瑞鲍迪苷J、瑞鲍迪苷K、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷O、瑞鲍迪苷Q、瑞鲍迪苷R、杜克苷A、杜克苷C、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的一种以上的甜菊醇糖苷。

10.一种饮食品，其特征在于，含有权利要求7～9中任一项所述的甜味剂组合物。

11.根据权利要求10所述的饮食品，其特征在于，所述饮食品为饮料。

12.一种应用，其特征在于，将权利要求1～3中任一项所述的化合物用作甜味剂。