JP7225183B2 - 新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物 - Google Patents
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Description
本発明者らは、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を初めて特定した。本発明の新規ステビオール配糖体(以下、「本発明の配糖体」ともいう)は、式(1):
(式中、
Rは、式(2)または式(3):
の糖鎖を表し、
glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す)
で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物である。
式(11)で示される配糖体Aは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、式(12)で示される配糖体Aは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがαグルコシド結合している。
式(13)で示される配糖体Bは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、式(14)で示される配糖体Bは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがαグルコシド結合している。
本発明の一態様によれば、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む甘味料組成物(以下、「本発明の甘味料組成物」ともいう)が提供される。本発明の甘味料組成物は、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物を含む組成物であってもよい。
本発明の一態様によれば、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む飲食品(以下、「本発明の飲食品」ともいう)が提供される。本発明の飲食品は、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物や甘味料組成物を含む飲食品であってもよい。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な飲料又は食品を提供し、また、当該飲料又は食品の製造方法を提供する。
本発明の一態様によれば、新規ステビオール配糖体を含む植物体およびその抽出物が提供される。また本発明の他の一態様によれば、本発明の植物体または植物体の抽出物を含む、飲食品、好ましくは飲料、が提供される。本発明の植物体に含まれる本発明の配糖体の量は、特に限定されないが、0.001%~1.000%であるのが好ましく、0.01%~0.80%であることがより好ましい。
本発明の新規ステビオール配糖体は、ステビア抽出物の中に微量しか含まれていないものの、該ステビア抽出物の風味に影響を与えているものと考えられる。理論に拘束されるものではないが、本発明のステビオール配糖体を少量添加することで、飲食品の風味を調整できるものと考えられる。したがって、本発明の一態様によれば、上記式(1)で示される化合物またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む風味調整剤が提供される。
上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、(A)植物体からの単離・精製、(B)化学合成、または(C)生合成によって製造することができる。それぞれについて以下に説明する。
本発明の植物体は本発明の新規ステビオール配糖体を含むものであるため、該植物体から新規ステビオール配糖体を単離・精製することができる。新規ステビオール配糖体は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒(水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒)を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はWO2016/090460に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
本発明のステビオール配糖体の化学合成による製造方法について、以下に詳細に説明する。
(A)下記式(4):
(式中、glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す)
で示されるレバウディオサイドCから、下記式(5):
(式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す。)
で示される中間体1を調製する工程と
(B)グルコピラノシド誘導体から式(6):
で示される中間体2、または式(7):
(式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
で示される中間体3を調製する工程と、
(C)前記中間体1と、前記中間体2または3とを、ホスフィン試薬及びアゾ化合物の存在下で反応させ、下記式(8):
(式中、
R1は、式(9)または式(10):
の糖鎖を表し、
p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
で示される中間体4を得る工程を含む、方法が提供される。
2糖ヘミアセタールと3糖ヘミアセタールは、例えば、市販されているグルコピラノシド誘導体を原料として得ることができる。2糖ヘミアセタール体の合成(第2a工程)をスキーム3に示し、3糖ヘミアセタール体の合成(第2b工程)をスキーム4に示す。
式(1)で示される化合物の合成は、例えば、上記工程1および2(2aまたは2b)から得られた化合物3(中間体1)および化合物8または13(中間体2または3)を用いて、下記スキーム5または6に従って得ることができる。
本発明のステビオール配糖体は、所定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して、ステビオールやステビオール配糖体、UDP-グルコースおよび/またはUDP-ラムノースを基質として生成することもできる。基質であるステビオール、ステビオール配糖体、UDP-グルコース、UDP-ラムノースは、与えてもよいし、細胞内で生合成させてもよい。所定のタンパク質の例としては、ステビア由来のUGT85C2(アミノ酸配列は配列番号2)、UGT74G1(アミノ酸配列は配列番号4)、UGT91D2(アミノ酸配列は配列番号6)、UGT76G1(アミノ酸配列は配列番号8)、及びシロイヌナズナ由来のUDP-ラムノース合成酵素AtRHM2(アミノ酸配列は配列番号10)、が挙げられるが同等の活性を有するものであればこれに限定されない。
(a)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、UDP-グルコースからUDP-ラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(i)宿主細胞内で転写可能なプロモーター;
(ii)該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド;および
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー(LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ura5、niaD)、薬剤耐性マーカー(ハイグロマイシン、ゼオシン)、ジェネチシン耐性遺伝子(G418r)、銅耐性遺伝子(CUP1)(Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,vol. 81,p.337,1984)、セルレニン耐性遺伝子(fas2m, PDR4)(それぞれ、猪腰淳嗣ら,生化学,vol.64,p.660,1992;Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991)などが利用可能である。
サントリーグローバルイノベーションセンター株式会社(SIC)で開発した、4系統の新規ステビア植物体(サンプル1(EM3-4)、サンプル2(EM2-27-8)、サンプル3(EM2-27-15)、およびサンプル4(EM2-11))の葉から得られた抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離-質量分析(MS)を行い、D-グルコピラノシル(Glc)、L-ラムノピラノシル(Rha)、キシロピラノシル(Xyl)が糖鎖で構成されたステビオール配糖体の分子量をもとに、ステビア植物体に含有されるステビオール配糖体のスクリーニング分析を行った。ここで、サンプル1はゲノムに配列番号11に示す塩基配列の第60番目の塩基配列が野生型のAからTに変異した多型を有する高Reb.C植物体である。なお、高Reb.C濃度の表現型と配列番号11の多型との相関関係について統計解析を行ったところ、当該多型は高Reb.C濃度の表現型と統計学上の相関関係を有することが明らかになった。
本発明において、レバウディオサイドC高含有率品種から検出された新規ステビオール配糖体1および2の構造解析は次の手順で行った。
(i)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)- 高分解能質量分析(MS)およびMS/MS、3段階までのイオンの断片化(MS3断片化)のフラグメント化解析による構造推定、
(ii)化学反応による推定ステビオール配糖体標準品の化学合成、
(iii)化学合成標準品のHPLC- 高分解能MSおよびMS3断片化の保持時間と断片化パターンの一致による構造確認
検液の調製は、凍結乾燥処理を行ったステビア乾燥葉それぞれ10.0mgをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒として水/メタノール(1/1 vol/vol) を1.0 mL添加し、その後超音波洗浄器(AS ONE, AS52GTU)にて20分間、25°Cの設定温度にて超音波を照射し、ステビア葉からステビオール配糖体の抽出液を得た。さらにHPLC-MSに供するために、水/メタノールで10倍希釈を行い、細孔サイズ0.45 μmのフィルター(ナカライテスク、コスモナイスフィルターS(溶媒系))にてろ過を行った。
[新規ステビオール配糖体1の合成]
(1)合成経路の概要
スキーム7に示したように、新規ステビオール配糖体1 (化合物15) の合成では、ステビオールグリコシド (化合物3) と2糖ヘミアセタール体 (化合物8) を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体 1(化合物15) の骨格を得る事とした。ステビオールグリコシドの合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドC (化合物1) をArk Pharm社から購入し、ステビオール19位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖の水酸基をアセチル (Ac) 基で保護することで、ステビオールグリコシドを得た。2糖ヘミアセタール体 の合成では、適切に保護されたグルコースアクセプター (化合物4) とラムノースドナー (化合物5) の縮合反応によって、2糖骨格を作り、還元末端1位の保護基を脱保護することで、2糖ヘミアセタール体を得た。得られたステビオールグリコシドと2糖ヘミアセタール体を、光延反応で縮合したところ、75% (α/β= 1/20) と良好な収率且つ高いβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体1(15) を得た。
次に、各合成工程について説明する。
スキーム8に示したように、ステビオールグリコシド (化合物3) の合成では、Ark Pharm社から購入したレバウディオサイドC (化合物1) (1.0g、1.05 mmol) を、メタノール (10mL) と水 (10mL) に溶解させ、4 mol/L水酸化ナトリウム (2.6mL、10.5mmol) を室温で加え、100 ℃にて20時間還流した。反応終了をTLC (クロロホルム/メタノール/水 = 5/4/0.1、Rf値 = 0.9) で確認後、反応液を陽イオン交換樹脂Dowex MAC-3水素フォーム (SIGMA-ALDRICH社) で中和 (pH 7) し、樹脂を濾別後、減圧濃縮して得られたシラップを真空ポンプで18時間乾燥させ、化合物2 (828mg、quant.)を得た。
[化合物3]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.81 (m, 2H), 0.83-1.45 (complex, 19H), 1.39-1.91 (complex, 24H), 1.91-2.35 (s, 30H), 3.58 (m, 1H), 3.71-3.81 (complex, 4H), 3.95-4.12 (complex, 7H), 4.34-4.46 (complex, 3H), 4.56-4.66 (complex, 4H), 4.69-4.92 (complex, 7H), 5.05-5.14 (complex, 5H), 5.23-5.38 (complex, 6H), 5.45 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 15.9, 17.3, 19.1, 20.5, 20.7, 20.8, 20.9, 21.1, 21.5, 21.7, 29.1, 37.8, 38.0, 39.5, 40.7, 41.4, 42.2, 43.8, 48.4, 53.8, 56.8, 61.6, 63.0, 65.5, 66.8, 68.0, 68.6, 69.3, 69.6, 69.8, 70.5, 70.9, 71.6, 71.9, 72.4, 72.8, 73.9, 74.9, 81.3, 87.3, 96.6, 96.8, 99.2, 99.4, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9, 151.9, 168.9, 169.2, 169.5, 169.6, 169.8, 170.1, 170.2, 170.3, 170.6, 170.9, 176.8, 183.4.
スキーム9に示したように、2糖ヘミアセタール体 (化合物8) の合成では、東京化成から購入した4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine-β-D-glucopyranoside (化合物4) (3.0g、6.46mmol) と化合物5 (3.3g、7.10mmol)、モレキュラーシーブス4Å (6.0g) をジクロロメタン(136mL) に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸 (114μL、1.29mmol) を室温で加え、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/2、Rf値 = 0.5) にて確認後、トリエチルアミン (100μL) で中和 (pH 8) し、モレキュラーシーブス4Åを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液(酢酸エチル/ヘキサン = 1/1.5) にて化合物6 (3.9g、81%) を得た。
[化合物6]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.18 (d, J = 6.4 Hz, 3H, H-6 of Rha), 1.96 (s, 3H, OAc), 1.98 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 3.51 (m, 1H, H-5), 3.73-3.81 (complex, 5H, H-4, H-6, OMe), 3.83-3.96 (complex, 2H, H-2, H-3), 4.28 (m, 1H, H-5 of Rha), 4.36 (m, 1H, H-6’), 4.70 (d, 1H, CH2Ph), 4.95 (d, 1H, CH2Ph), 4.99 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H-1), 5.03 (t, 1H, H-4 of Rha), 5.20 (dd, 1H, H-3 of Rha), 5.32 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.34 (m, 1H, H-2 of Rha), 5.57 (s, 1H, CHPh), 6.90 (dd, 4H, OMePh), 7.21-7.49 (complex, 10H, Ph); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.2, 17.4, 20.8, 20.9, 21.0, 22.8, 31.7, 55.8, 66.2, 66.7, 68.8, 69.4, 69.5, 71.0, 75.2, 76.7, 77.5, 81.7, 81.8, 98.4, 100.8, 101.4, 114.8, 118.3, 126.1, 127.9, 128.4, 128.5×2, 129.2, 137.2, 137.9, 150.8, 155.7, 169.9, 170.1, 170.2.
[化合物8]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.16-1.19 (complex, 4.5H, H-6α of Rha, H-6β of Rha), 1.97-2.34 (complex, 27 H, OAc), 3.58 (t, 0.5H, H-2β), 3.72-3.75 (complex, 1.5H, H-2α, H-5β), 4.00 (m, 1H, H-4α of Rha), 4.05-4.16 (complex, 1.5H), 4.21-4.27 (complex, 3H), 4.76 (d, J = 7.6 Hz, 0.5H, H-1β), 4.86 (s, 1H, H-1α of Rha), 4.91 (s, 0.5H, H-1β of Rha), 4.98-5.08 (complex, 4.6H), 5.23-5.26 (complex, 2H), 5.34 (d, J = 3.2 Hz, 1H, H-1α), 5.48 (t, 1H, H-3α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 17.2, 17.5, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×2, 21.0, 21.6, 62.1, 62.2, 67.2, 67.3, 67.5, 68.5, 68.6, 68.7, 70.0, 70.4, 71.0, 74.2, 77.4, 77.9, 79.3, 92.0, 75.7, 98.4, 99.2, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9, 169.8, 169.9×2, 170.0, 170.1×2, 170.2, 170.4, 170.9×2.
スキーム10に示したように、化合物15の合成では、化合物8(291mg、0.503mmol)と化合物3(391mg、0.335mmol) を1,4-ジオキサン (17mL) に溶解させ、トリブチルホスフィン (252 μL、1.01 mmol)、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) (173 mg、1.01 mmol) を室温で加え、60℃にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1.5/1) にて化合物14 (435mg、75%、α/β= 1/20) を得た。
[化合物14]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.50-1.18 (complex, 7H), 1.15 (d, 3H, H-6 of Rham), 1.24 (s, 3H), 1.40-2.32 (complex, 70H), 3.60 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.82-4.28 (complex, 10H), 4.40-4.48 (complex, 2H), 4.63 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.75-4.88 (complex, 3H), 4.98 (s, 1H), 5.01-5.18 (complex, 8H), 5.24-5.31 (complex, 4H), 5.32 (s, 1H), 5.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1β), 6.31 (d, J = 3.0 Hz, 0.05H, H-1α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.6, 17.4, 17.6, 20.5, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×3, 21.6, 29.0, 39.5, 42.5, 44.1, 53.8, 57.9, 61.7, 66.6, 67.4, 68.0, 68.3, 68.5, 68.7, 69.7, 69.8, 70.8, 71.1, 71.4, 71.9×2, 72.4, 72.9, 74.2, 75.1, 86.6, 92.2, 96.4, 96.9, 97.7, 99.3, 125.4, 128.3, 129.1, 152.9, 169.0, 169.5, 169.8×2, 169.9, 170.0, 170.1, 170.2×2, 170.3, 170.5, 170.6, 170.9×2, 174.6.
[化合物15(β体)]
1H-NMR (pyridine-d5, 800 MHz) δ 0.68 (m, 1H), 0.86 (m, 1H), 0.98 (m, 1H), 1.11-1.15 (complex, 4H), 1.24 (m, 2H), 1.39 (m, 2H), 1.49 (s, 3H), 1.62 (m, 3H), 1.71 (d, 3H), 1.75 (d, 3H), 1.88 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 2.00 (m, 2H), 2.11 (m, 2H), 2.19 (m, 2H), 2.46 (m, 1H), 2.66 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.97-4.10 (complex, 5H), 4.17-4.42 (complex, 11H), 4.49 (m, 1H), 4.51-4.59 (complex, 3H), 4.73 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.87 (m, 1H), 4.98 (d, J = 8.0 Hz,1H), 5.08 (s, 1H), 5.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 6.26 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.41 (s, 1H), 6.47 (s, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 200 MHz) δ 17.1, 19.2×2, 20.1, 20.9, 22.3, 29.6, 37.9, 38.2, 39.9, 40.9, 41.9, 42.8, 43.7, 44.5, 48.4, 54.1, 58.3, 62.3, 62.4, 62.5, 69.8×2, 70.2, 71.2, 71.6, 72.4, 72.5, 72.6, 74.0, 74.1, 75.2, 76.4, 76.8, 77.4, 78.5, 78.8, 79.0, 79.5, 86.9, 89.8, 94.0, 98.4, 101.8, 101.9, 104.4, 105.3, 154.5, 176.2.
[α]D = -46.3°(c 0.05, MeOH)
MALDI-TOF-MS m/z found [M + Na]+1119.5, C50H80O26calcd for [M + Na]+1119.5.
(1)合成経路の概要
スキーム11に示したように、新規ステビオール配糖体2(化合物17)の合成では、ステビオールグリコシド (化合物3) と3糖ヘミアセタール体 (化合物13) を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体2の骨格を得る事とした。ステビオールグリコシド の合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドC (化合物1) をArk Pharm社から購入し、ステビオール19位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖の水酸基をアセチル (Ac) 基で保護することで、ステビオールグリコシドを得た。3糖ヘミアセタール体の合成では、適切に保護されたグルコースアクセプター (化合物4) とラムノースドナー (化合物5) の縮合反応から2糖アクセプター(化合物9)を合成し、グルコースドナー(化合物10)との縮合反応によって、3糖骨格とした。得られた3糖の還元末端1位の保護基を脱保護することで、3糖ヘミアセタール体を得た。ステビオールグリコシドと3糖ヘミアセタール体を、光延反応で縮合したところ、44% (α/β= 1/10) と良好な収率且つ高いβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体2を得た。
次に、各合成工程について説明する。
ステビオールグリコシドの合成は、「新規ステビオール配糖体1の合成」の場合と同様の方法で行った。
[化合物11]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.16 (d, J = 6.0 Hz, 1H, H-6 of Rha), 1.94-2.19 (complex, 21H, OAc), 3.43-3.52 (complex, 2H), 3.62-3.81 (complex, 5H, OMe), 3.96-4.04 (complex, 2H), 4.07-4.18 (complex, 3H), 4.28-4.35 (complex, 2H), 4.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.94-4.98 (complex, 2H, H-1), 5.01-5.11 (complex, 2H), 5.16-5.21 (complex, 2H), 5.28 (s, 2H, H-1 of Rha), 5.52 (s, 1H, PhCH), 6.90 (dd, 4H, PhOMe), 7.31-7.49 (complex, 5H, Ph); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.3, 17.3, 20.4, 20.7, 20.9×3, 21.0, 21.1, 55.8, 60.5, 62.0, 66.3, 66.9, 68.3, 68.7, 69.3, 69.4, 70.7, 71.6, 71.9, 72.9, 78.9, 81.0, 97.7, 99.3, 100.7, 101.6, 114.8, 118.4, 126.2, 128.4, 129.4, 137.1, 150.7, 155.8, 169.4, 169.5, 170.0, 170.2, 170.4, 170.5, 170.8, 171.2.
[化合物13]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.18 (d, J = 6.4 Hz, 1H, H-6 of Rha), 1.93-2.19 (complex, 27H, OAc), 3.60 (t, 1.6H, H-2β), 3.68 (m, 1.2H, H-5β), 3.78 (m, 1.4H, H-5’β), 3.97 (t, 1H, H-3β), 4.03 (dd, 1H, H-6’β), 4.15 (m, 2.3H, H-6β,H-6β), 4.22 (m, 1.2H, H-5β of Rha), 4.43 (dd, 1.2H, H-6’β), 4.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1β), 4.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1’β), 4.82-4.91 (complex, 2.4H, H-4β, H-2’β), 5.06-5.14 (complex, 2.3H, H-4’β, H-4β of Rha), 5.16 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.26-5.33 (complex, 2.4H, H-3’β, H-3β of Rha), 5.39 (m, 1.1H, H-2β of Rha); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 17.3, 17.5, 20.6, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×2, 21.6, 29.8, 31.1, 61.7, 61.8, 62.4, 67.4, 67.6, 67.9, 68.0, 68.1×2, 68.3, 68.8×2, 69.5, 69.9, 70.6×2, 71.5, 71.8, 71.9, 72.1, 72.3, 72.8, 73.0, 75.5, 79.9, 80.1, 80.5, 91.9, 95.8, 98.1, 98.9, 99.6, 99.8, 125.4, 128.4, 129.2, 169.1, 169.4, 169.5, 169.6, 169.7, 170.0×3, 170.1, 170.4, 170.5×2, 170.7.
スキーム13に示したように、化合物17の合成では、化合物13 (468mg、0.540mmol)と化合物3(420mg、0.360mmol) を1,4-ジオキサン (18mL) に溶解させ、トリブチルホスフィン (270μL、1.08mmol)、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) (186mg、1.08mmol) を室温で加え、60℃にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1.5/1) および (トルエン/アセトン = 3/1)にて化合物16(320mg、44%、α/β= 1/10) を得た。
[化合物16]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.45-1.18 (complex, 8H), 1.28 (d, 3H, H-6 of Rham), 1.40-1.81 (complex, 20H), 1.81-2.35 (complex, 54H, OAc), 3.60 (m, 1.2H), 3.71-3.78 (complex, 3H), 3.81-3.91 (complex, 2.4H), 3.98-4.20 (complex, 10H), 4.40-4.50 (complex, 3.4H), 4.62 (d, J = 8.0 Hz, 1.1H, H-1), 4.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.75-4.91 (complex, 7H), 4.96-5.12 (complex, 7H), 5.17 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.21-5.31 (complex, 6H), 5.32 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.38 (t, 1.1H), 5.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1β), 6.22 (d, J = 3.0 Hz, 0.1H, H-1α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.7, 17.5, 20.5, 20.7×2, 20.8×2, 20.9×2, 21.0, 21.6, 29.0, 39.6, 42.5, 44.0, 53.9, 58.1, 61.7, 66.7, 67.6, 68.0, 68.1, 68.3, 68.5, 69.8, 70.2, 70.7, 71.2, 71.4, 71.8, 71.9, 72.2, 72.4, 72.8, 72.9, 75.2, 80.3, 81.4, 86.6, 92.2, 96.4, 96.9, 99.3, 99.8, 125.4, 128.4, 129. 2, 138.0, 152.9, 169.0, 169.3, 169.5×2, 169.6×2, 169.8, 170.1×3, 170.2, 170.5, 170.6, 170.9×2, 174.7.
[化合物17(β体)]
1H-NMR (pyridine-d5, 800 MHz) δ 0.67 (m, 1H), 0.86 (m, 1H), 0.96 (m, 1H), 1.07 (m, 1H), 1.14 (s, 3H), 1.26 (m, 1H), 1.36 (m, 1H), 1.41 (m, 1H), 1.48 (s, 3H), 1.61 (m, 3H), 1.70 (m, 6H), 1.87-2.21 (complex, 11H), 2.46 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.95-4.09 (complex, 8H), 4.14-4.31 (complex, 14H), 4.33 (m, 1H), 4.45 (m, 2H), 4.55 (m, 3H), 4.78 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.05-5.11 (complex, 3H), 5.66 (s, 1H), 6.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 6.46 (s, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 200 MHz) δ 17.0, 19.2, 20.1, 20.9, 22.3, 29.6, 37.8, 38.3, 39.9, 40.8, 41.9, 42.7, 43.7, 44.5, 48.4, 54.2, 58.4, 61.9, 62.4, 62.5, 69.1, 69.8×2, 70.5, 71.6, 71.7, 72.3, 72.4, 72.5×2, 73.9, 74.1, 75.2, 76.4, 76.5, 77.5, 78.3, 78.4, 78.5, 78.8×2, 86.9, 88.8, 89.8, 93.8, 98.4, 101.8, 101.9, 104.4, 104.5, 105.3, 154.4, 176.0.
[α]D = -44.5°(c 0.1, MeOH)
MALDI-TOF-MS m/z found [M + Na]+1281.4, C56H90O31calcd for [M + Na]+1281.5.
(i)と同条件で、HPLC- 高分解能MS/MSおよびMS3断片化による新規ステビオール配糖体1の化学合成品(化合物15のβ体)とステビア葉抽出液の比較を行った結果、保持時間29.1分のピークで化学合成品とステビア葉抽出液からのピークが検出された(図14)。また、それぞれのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトル(図15)も一致した。この結果から、植物体の抽出液から得られた新規ステビオール配糖体1は化合物15のβ体と同じ構造を有することが確認された。
酵母において、ステビオールから新規ステビオール配糖体を生成させた。まず、ステビア由来の配糖化酵素遺伝子UGT85C2、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1の4種と、シロイヌナズナ由来UDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2を同時に発現させる酵母を育種した。
UGT85C2遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw(下線部NdeI認識部位):
5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’(配列番号12)
BglII-SrUGT85C2-Rv(下線部BglII認識部位):
5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’(配列番号13)
UGT91D2遺伝子増幅用プライマーセット
SrUGT91D2-pET15b-FW
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’(配列番号35)
SrUGT91D2-pET15b-RV
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’(配列番号36)
UGT74G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw(下線部NdeI認識部位):
5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’ (配列番号14)
BamHI-SrUGT74G1-Rv(下線部BamHI認識部位):
5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’ (配列番号15)
UGT76G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw(下線部NdeI認識部位):
5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’ (配列番号16)
BamHI-SrUGT76G1-Rv(下線部BamHI認識部位):
5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’ (配列番号17)
このPCR産物はpENTR-TOPO Directionalベクター(Invitrogen)に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子、すなわちUGT85C2、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1の全てのUGT遺伝子がクローニングできたことを確認した。
これらのUGT遺伝子、およびシロイヌナズナ由来のUDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2(J Biol Chem 2007 Oka et. al)を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
SrUGT85C2セット
Bgl2-UGT85C2-F(下線部BglII認識部位):
5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’ (配列番号18)
Sal-UGT85C2-R(下線部SalI認識部位):
5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’ (配列番号19)
SrUGT91D2セット
NotI-UGT91DIL3-F(下線部NotI認識部位):
5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ (配列番号20)
Pac-UGT91D1L3-R(下線部PacI認識部位):
5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ (配列番号21)
SrUGT74G1セット
Not-UGT74G1-F(下線部NotI認識部位):
5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’ (配列番号22)
Pac-UGT74G1-R(下線部PacI認識部位):
5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’ (配列番号23)
SrUGT76G1セット
Bam-UGT76G1-F(下線部BamHI認識部位):
5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’ (配列番号24)
Sal-UGT76G1-R(下線部SalI認識部位):
5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA-3’ (配列番号25)
AtRHM2セット
Bam-AtRHM2-F(下線部BamHI認識部位):
5’-GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3’ (配列番号26)
Xho-AtRHM2-R(下線部XhoI認識部位):
5’-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3’ (配列番号27)
(1)プラスミドpESC-URA-UGT56の構築
UGT85C2を制限酵素BglIIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-URA(ストラタジーン)を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-URA-UGT-5を得た。このプラスミドpESC-URA-UGT-5を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT91D2を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切り出したものを連結し、pESC-URA-UGT56を得た。
(2)プラスミドpESC-HIS-UGT78の構築
UGT76G1を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-HIS(ストラタジーン)を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-HIS-UGT-8を得た。このプラスミドpESC-HIS-UGT-8を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT74G1をNotIとPacIで切り出したものを連結し、pESC-HIS-UGT78を得た。
(3)プラスミドpESC-TRP-AtRHM2の構築
AtAHM2を制限酵素BamHIと制限酵素XhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP(ストラタジーン)を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-TRP-AtAHM2を得た。
Saccharomyces cerevisiae YPH499株(ura3-52 lys2-801amberade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a)を宿主として、酢酸リチウム法で、表2のプラスミドを導入した。形質転換株として、SC-Trp&Ura&His寒天培地(1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g、Bacto agar 20g)で生育するものを選抜した。
得られた形質転換株を以下の通り培養した。
まず、前培養としてSC-Trp&Ura&His液体培地(SC- Trp&Ura&His寒天培地のBacto agarを除く)10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp&Ura&His液体培地(1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g)に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。
UGT85C2発現確認用
UGT85C2-r1:
5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ (配列番号28)
UGT91D2発現確認用
UGT91D1L3-r1:
5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ (配列番号29)
UGT74G1発現確認用
UGT74G1-r1:
5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ (配列番号30)
UGT76G1発現確認用
UGT76G1-r1:
5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ (配列番号31)
AtAHM2 発現確認用
AtAHM2-r1
5’-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3’ (配列番号32)
GAL10p領域 (プロモーター領域)
PGAL10-f3:
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ (配列番号33)
GAL1p領域(プロモーター領域)
PGAL1-f3:
5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ (配列番号34)
UGT85C2:UGT85C2-r1(配列番号28)とPGAL1-f3(配列番号34)
UGT91D2またはUGT91D2L3:UGT91D1L3-r1(配列番号29)とPGAL10-f3(配列番号33)
UGT74G1:UGT74G1-r1(配列番号30)とPGAL1-f3(配列番号34)
UGT76G1:UGT76G1-r1(配列番号31)とPGAL10-f3(配列番号33)
AtAHM2:AtAHM2-r1(配列番号32)とPGAL10-f3(配列番号33)
これにより、形質転換株で、導入した遺伝子が発現していることが確認できた。
培養は、本培養用の液体培地に培地1 mlあたり0.5μgまたは2μgのステビオール(ChromaDex Inc.)を添加した以外は、上記実施例と同様の条件で行った。培養終了後、培養液を遠心分離により、上清と菌体に分離した。培養上清を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-Pak C18カラムに供し、20% アセトニトリルで洗浄後、80%アセトニトリルで溶出し、乾固後、少量の80% アセトニトリルに溶解して配糖体サンプルを調製した。この配糖体サンプルを以下の分析に供した。
LC-MSによる分析は、「新規ステビオール配糖体の単離」についての実施例に記載のとおり分析した。
新規ステビオール配糖体の甘味度を評価するため、Brix0.5から3まで0.5刻となるようショ糖を純水に添加したサンプルを調製した。新規ステビオール配糖体2と同じ構造を有する化合物17を1,700ppmとなるように純水に添加してサンプルを調製した。ここで、化合物17中に含まれるα体とβ体との比率(α:β、モル比)は1:10であった。
各種ステビオール配糖体の味質の評価を行うため、図20に示した添加量となるようにReb.Aと、Reb.Dと、新規ステビオール配糖体2と同じ構造を有する化合物17とをそれぞれ純水に添加して、飲料サンプルを調製した。飲料サンプルは全て、甘味度をReb.Aについては300、Reb.Dについては250、新規配糖体2(化合物17)については14.7として、ショ糖(スクロース)換算のBrixが最終的に2となるように調整した。
新規ステビオール配糖体1および2それぞれの粉体における香味を評価した。具体的には、化学合成によって得られた化合物15(新規ステビオール配糖体1に対応)と化合物17(新規ステビオール配糖体2に対応)を高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)を用いてβ体のみを単離し、粉体状としたものについて香味を評価した。甘味料の官能に関して訓練を受けた者(3名:サントリー食品インターナショナル株式会社)がパネラーとなって評価を行った。結果を表3に示す。
本発明は、以下の態様を含む。
[1]
式(1):
Rは、式(2)または式(3):
glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す)
で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物。
[2]
植物由来物、化学合成物、または生合成物である、[1]に記載の化合物。
[3]
[1]または[2]に記載の化合物を含む、飲食品。
[4]
[1]または[2]に記載の化合物を含む、甘味料組成物。
[5]
レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE,レバウディオサイドF、レバウディオサイドI、レバウディオサイドJ、レバウディオサイドK、レバウディオサイドN、レバウディオサイドM、レバウディオサイドO、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドR、ズルコサイドA、ズルコサイドC、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含む、[4]に記載の甘味料組成物。
[6]
[4]または[5]に記載の甘味料組成物を含む飲食品。
[7]
飲料である、[6]に記載の飲食品。
[8]
[1]に記載の化合物を含む植物体。
[9]
[8]に記載の植物体の、[1]に記載の化合物を含む抽出物。
[10]
[8]に記載の植物体または[9]に記載の植物体の抽出物を含む飲食品。
[11]
飲料である[10]に記載の飲食品。
[12]
[1]に記載の化合物の製造方法であって、
(A)下記式(4):
で示されるレバウディオサイドCから、下記式(5):
で示される中間体1を調製する工程と
(B)グルコピラノシド誘導体から式(6):
で示される中間体3を調製する工程と、
(C)前記中間体1と、前記中間体2または3とを、ホスフィン試薬およびアゾ化合物の存在下で反応させ、下記式(8):
R1は、式(9)または式(10):
p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
で示される中間体4を得る工程を含む、方法。
[13]
[1]または[2]に記載の化合物の甘味料としての使用。
[14]
[1]に記載の化合物の製造方法であって、下記(a)~(g):
(a)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および
(g)配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、UDP-グルコースからUDP-ラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
の少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いることを特徴とする方法。
[15]
前記非ヒト形質転換体が酵母である、[14]に記載の方法。
[16]
ステビオールを含む培地で前記非ヒト形質転換体の培養を行うことを特徴とする、[14]又は[15]に記載の方法。
Claims (9)
- レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE,レバウディオサイドF、レバウディオサイドI、レバウディオサイドJ、レバウディオサイドK、レバウディオサイドN、レバウディオサイドM、レバウディオサイドO、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドR、ズルコサイドA、ズルコサイドC、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上の他のステビオール配糖体をさらに含む、請求項2に記載の甘味料組成物。
- 前記式(11)、(12)、(13)または(14)で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物と、前記一種以上の他のステビオール配糖体との組成比が、質量比で0.01:9.99~6:4である、請求項3に記載の甘味料組成物。
- 請求項2~4のいずれか一項に記載の甘味料組成物を含む飲食品。
- 飲料である、請求項1または5に記載の飲食品。
- 前記式(1)で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物の量が、飲料の総質量に対して0.0004%~0.8%である、請求項6に記載の飲食品。
- 式(11)、(12)、(13)または(14)
(A)下記式(4):
で示されるレバウディオサイドCから、下記式(5):
で示される中間体1を調製する工程と
(B)グルコピラノシド誘導体から式(6):
で示される中間体3を調製する工程と、
(C)前記中間体1と、前記中間体2または3とを、ホスフィン試薬およびアゾ化合物の存在下で反応させ、下記式(8):
R1は、式(9)または式(10):
p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
で示される中間体4を得る工程を含む、方法。
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