CN110114459B - 瑞鲍迪苷c高含量的甜菊植物 - Google Patents

瑞鲍迪苷c高含量的甜菊植物 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供一种瑞鲍迪苷C含有量高的甜菊植物。本发明提供一种植物体，为瑞鲍迪苷C高含有型非基因重组甜菊植物体，以更高于野生型甜菊种的含量，更详细而言以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C。本发明还提供一种生产这种瑞鲍迪苷C高含有型非基因重组甜菊植物体的方法，以及由这种植物体获得的干叶。

Description

瑞鲍迪苷C高含量的甜菊植物
技术领域
本发明涉及瑞鲍迪苷C含有量高的甜菊植物。
背景技术
为了应对多样化的消费者需求，开发上市了各种饮料。蔗糖等糖类是以赋予甜味等目的而通常配合于饮料中的成分，但已被指出过量摄取对健康的影响，而对于更低卡路里且源自天然的甜味料的需求日益增长。例如专利文献1公开了含有维生素、高甜度甜味料以及甜味改善组合物的机能性甜味料组合物。
瑞鲍迪苷(Rebaudioside，以下也称“Reb”)作为甜菊萃取物中所含的甜味成分已为公知。甜菊萃取物由甜菊干叶萃取、精制而成。甜菊是以南美巴拉圭为原产地的菊科多年生植物，学名为Stevia Rebaudiana Bertoni。因甜菊含有持有约砂糖300倍以上甜味的成分，故而被栽培，以便萃取该甜味成分而用作天然甜味料。作为Reb，被报道存在RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebM等各种糖苷(特表2012-504552)。各种Reb中，例如RebA被评价为具有高甜度和优质甜味的甜味料而被广泛应用。关于其他的Reb也正在判明具有其独特的甜度及附带的味道。
在这种情况下，每干叶含3～8重量％的瑞鲍迪苷C的甜菊植物体已为公知(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2009-517043号说明书
专利文献2:日本特表2016-515814号说明书
专利文献3:国际申请公开公报WO2016/090460
发明内容
虽然这些甜菊植物的甜味成分呈现适度的甜味，但与蔗糖相比，发现了甜味的余味问题。针对该问题，本发明者们发现该余味的程度因甜菊萃取物的组成而不同，尤其发现甜菊萃取物中所含的瑞鲍迪苷C(以下有时也称“RebC”)可改善甜味的余味。
因此，期望提供一种含瑞鲍迪苷C更多的甜菊植物体的获得及生产此种植物体的方法，以及由此种植物体所获得的干叶及含有由该干叶获得的瑞鲍迪苷C的食物和饮料等。
本申请提供一种植物体以及该植物体的生产方法及筛选方法，所述植物体为瑞鲍迪苷C高含有型非基因重组甜菊植物体，其以高于野生型甜菊种的含有量含有瑞鲍迪苷C。
根据本发明，可提供含瑞鲍迪苷C更多的甜菊植物体的获得及生产此种植物体的方法，以及由此种植物体所获得的干叶及含有由该干叶获得的瑞鲍迪苷C的食物和饮料等。
具体实施方式
以下详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，但本发明的宗旨并非仅限于此种实施方式。本发明在不脱离其主旨的范围内，可以以各种方式实施。
1.本发明的瑞鲍迪苷C高含有型非基因重组甜菊植物体
本发明提供一种植物体，其为瑞鲍迪苷C高含有型非基因重组甜菊植物体(以下称“本发明的植物体”)，其以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C，且瑞鲍迪苷C在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上。
本发明的甜菊植物体是由野生种甜菊植物体衍生而来的种类，但发生了瑞鲍迪苷C增高的基因变异。且该基因变异由非基因重组产生(后述)。
“以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C”，是指以由野生型甜菊植物体的新鲜叶(非干叶)获得的萃取液的每单位量(例如10ml)所含的瑞鲍迪苷C的量为标准(浓度)时，由本发明的甜菊植物体的新鲜叶(非干叶)获得的萃取液的每同一单位量(与由上述野生型甜菊植物体的叶获得的萃取液相同的量)所含的瑞鲍迪苷C的量(浓度)高20％以上。在此，本发明的甜菊植物体也可以以高于野生型甜菊种20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上、40％以上、42％以上、44％以上、46％以上、48％以上、50％以上、52％以上、54％以上、56％以上、58％以上、60％以上、62％以上、64％以上、66％以上、68％以上、70％以上的含量含有瑞鲍迪苷C。
此外，“瑞鲍迪苷C在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上”，是指相对于由本发明的甜菊植物体的新鲜叶(非干叶)获得的萃取液中存在的总甜菊醇糖苷量，瑞鲍迪苷C以40％以上的比例存在。在此，总甜菊醇糖苷不包含未知的甜菊醇糖苷，且不包含以小于检出限存在的甜菊醇糖苷。优选总甜菊醇糖苷为选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷E、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷I、瑞鲍迪苷J、瑞鲍迪苷K、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷O、瑞鲍迪苷Q、瑞鲍迪苷R、杜克苷A、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷以及甜菊苷中的2个以上的任意组合。例如，在一种实施方式中，总甜菊醇糖苷由瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷M及甜菊醇组成，在另一种实施方式中，总甜菊醇糖苷也可由瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、瑞鲍迪苷M、瑞鲍迪苷N、瑞鲍迪苷O以及甜菊醇组成。
瑞鲍迪苷C在本发明的植物体中所占的含有量如上所述，但由本发明的植物体获得干叶时，相对于该干叶的重量，瑞鲍迪苷C也可以以7重量％以上、8重量％以上、9重量％以上、10重量％以上、11重量％以上、12重量％以上、13重量％以上、14重量％以上、15重量％以上、16重量％以上、17重量％以上、18重量％以上、19重量％以上、20重量％以上的量存在。
在此，本发明的植物体的干叶，是指通过将本发明的甜菊植物体的新鲜叶烘干而使含水量减至10重量％以下、7重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下、2重量％以下、1重量％以下的叶子。优选本发明的植物体的干叶的含水量为3～4重量％。
本发明的植物体，除了与瑞鲍迪苷C相关的上述特性外，还可具有以下特性中的至少一种。
(1)瑞鲍迪苷A的含量(产生量)比野生型甜菊种低。更具体而言，瑞鲍迪苷A的含量(例如干叶等中的重量浓度)比野生型甜菊种低约40％以上、约50％以上、约60％以上、约70％以上或约80％以上。
(2)甜菊苷的含量(产生量)比野生型甜菊种低。更具体而言，甜菊苷的含量(例如干叶等中的重量浓度)比野生型甜菊种低约50％以上、约60％以上、约70％以上或约80％以上。
(3)瑞鲍迪苷F的含量(产生量)比野生型甜菊种高。更具体而言，瑞鲍迪苷F的含量(例如干叶等中的重量浓度)比野生型甜菊种高约2倍以上、约3倍以上、约4倍以上、约5倍以上或约6倍以上。
(4)瑞鲍迪苷A在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种低。更具体而言，瑞鲍迪苷A在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种(例如干叶等中)低约8％以上、约20％以上、约30％以上、约40％以上、约50％以上、约60％以上或约70％以上。
(5)甜菊苷在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种低。更具体而言，甜菊苷在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种(例如干叶等中)低约30％以上、约40％以上、约50％以上、约60％以上或约70％以上。
(6)瑞鲍迪苷F在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种高。更具体而言，瑞鲍迪苷F在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种(例如干叶等中)高约3倍以上、约4倍以上、约5倍以上或约6倍以上。
上述(1)～(6)的特性，可以以本发明的植物体的特定的1个个体与野生型甜菊种的特定的1个个体的比较为标准，也可以以本发明的植物体的多个个体组成的组中的算术平均值与野生型甜菊种的多个个体组成的组中的算术平均值的比较为标准。
一部分方式中，本发明的植物体除了与瑞鲍迪苷C相关的上述特性外，瑞鲍迪苷A及甜菊苷的含量(产生量)比野生型甜菊种低，且瑞鲍迪苷F的含量(产生量)比野生型甜菊种高及/或瑞鲍迪苷A及甜菊苷在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种低，且瑞鲍迪苷F在总甜菊醇糖苷中所占的比例比野生型甜菊种高。
如前所述，本发明的甜菊植物体是由野生种的甜菊植物体衍生而来的种类，其发生了瑞鲍迪苷C增高的基因变异。此外，该基因的变异在天然条件下产生或通过非基因重组的方法产生。该基因变异如序列号1所示(以下称“本发明的基因多态性”)。序列号1的碱基序列具有单碱基多态性(SNP：以下称“本发明的SNP”)，即对应于野生型等位基因的碱基序列(序列号2)的第60位碱基序列由野生型的A变异为T。
因此，本发明的甜菊植物体，其特征在于，在基因组中具有序列号1所示的多态性。这个多态性与所谓的瑞鲍迪苷C高含有的表现型在统计学上具有相关性，其已在实施例中被确认。
本发明的甜菊植物体可以以杂合型或纯合型具有上述基因多态性。通常，与杂合型相比，以纯合型具有上述基因多态性的植物体具有瑞鲍迪苷C含有量高的倾向。
这些基因多态性可通过PCR法、TaqMan PCR法、测序法、微阵列法、Invader法(インベーダー法)、TILLING法等检出，但检出方法并不限于此。关于基因多态性的检出方法详见后述。
作为本说明书中“非基因重组的方法”的例子，可列举在不导入外来基因的情况下，诱导宿主细胞(或宿主植物体)的基因变异的方法。作为此种方法，可列举使用植物细胞的变异诱导剂的方法。作为此种变异诱导剂，可列举甲磺酸乙酯(EMS)及叠氮钠等。例如可以以0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等浓度的甲磺酸乙酯(EMS)处理植物细胞。处理时间为1～48小时、2～36小时、3～30小时、4～28小时、5～26小时、6～24小时。处理的步骤本身已为公知，可通过将经由吸水过程的给水种子在以上述浓度含有变异诱导剂的处理液中浸泡上述处理时间而进行。
或者，作为非基因重组的方法的例子，可以是对植物细胞照射X射线、γ射线、紫外线等放射线或光线的方法。此时，用适当的紫外线照射量(紫外线灯强度、距离、时间)照射细胞，并将其用选择培养基等培养后，可选择具有目标性状的细胞、愈伤组织、植物体。此时的照射强度为0.01～100Gr、0.03～75Gr、0.05～50Gr、0.07～25Gr、0.09～20Gr、0.1～15Gr、0.1～10Gr、0.5～10Gr、1～10Gr，照射距离为1cm～200m、5cm～100m、7cm～75m、9cm～50m、10cm～30m、10cm～20m、10cm～10m，照射时间为1分钟～2年、2分钟～1年、3分钟～0.5年、4分钟～1个月、5分钟～2周、10分钟～1周。照射的强度、距离及时间因放射线的线型或照射对象的情况(细胞、愈伤组织、植物体)而不同，本领域技术人员可适当调整。
此外，细胞融合、花药培养(单倍体育种)、远缘杂交(单倍体育种)等方法已为公知。
通常而言，由于植物细胞在培养期间可能伴随变异，因此为了更稳定的性状维持，优选将其返回到植物个体。
此外，本发明的植物体为非基因重组甜菊植物体，但以本发明的植物体作为宿主进行随后的基因重组而获得的植物体(例如以本发明的植物体作为宿主进行基因重组而进一步附加了其他性状的植物体)也未超出本发明的范围之外。
瑞鲍迪苷C可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂)进行反应，而以萃取液的状态进行萃取。萃取条件等可参照WO2016/090460中记载的方法或后述实施例中记载的方法。
此外，针对此种方式获得的萃取液，可通过采用以下公知方法来精制瑞鲍迪苷C：乙酸乙酯和其他有机溶剂:水的梯度、高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography：HPLC)、气相色谱、飞行时间质谱(Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS)、超高效液相色谱(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC))等。
本发明所涉及的瑞鲍迪苷C含量可用WO2016/090460中记载的方法或后述实施例中记载的方法来测定。具体而言，可通过由本发明的甜菊植物体取样新鲜叶并进行LC/MS-MS来测定。
本发明的植物体不仅仅是整株植物体，还可包括植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵组织等)或各种形态的植物细胞(例如悬浮培养细胞)、原生质体、叶切片、愈伤组织等。
此外，本发明的植物体还可包括组织培养物或植物培养细胞。因为通过培养此种组织培养物或植物培养细胞，可以使植物体再生。作为本发明的植物体的组织培养物或植物培养细胞的例子，可列举胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根端、花瓣、原生质体、叶切片及愈伤组织等，但不限于此。
2.本发明的植物体的生产方法
本发明在其他实施方式中，提供一种方法，其为生产以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C的瑞鲍迪苷C高含有型甜菊植物体的方法(以下称“本发明的生产方法”)，其特征在于，包括使本发明的甜菊植物体与第2甜菊植物体进行杂交的步骤。
通过该方法生产的“以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C的瑞鲍迪苷C高含有型甜菊植物体”与本发明的植物体具有相同的表现型和遗传性能。
具体而言，通过本发明的生产方法生产的植物体的表现型，以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C，且瑞鲍迪苷C在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上。在此，“以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C”如前所述。且“瑞鲍迪苷C在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上”如前所述。
并且，由通过本发明的生产方法所生产的植物体获得干叶时，相对于该干叶的重量，瑞鲍迪苷C也可以以7重量％以上、8重量％以上、9重量％以上、10重量％以上、11重量％以上、12重量％以上、13重量％以上、14重量％以上、15重量％以上、16重量％以上、17重量％以上、18重量％以上、19重量％以上、20重量％以上的量存在。关于干叶的定义如前所述。
通过本发明的生产方法所生产的植物体的遗传性能，为具有序列号1所示的基因多态性。通过本发明的生产方法所生产的植物体，可以以杂合型具有上述基因多态性，或也可以以纯合型具有上述基因多态性。关于这些多态性的检出方法如前及如后所述。
本发明的生产方法中“使杂交”，是指通过使本发明的植物体与第2植物体交配而获得其子植物体(通过本发明的生产方法所生产的植物体)。作为杂交方法优选回交。“回交”是使本发明的植物体与第2植物体之间产生的子植物体与本发明的植物体(即具有本发明的基因多态性的植物体)进一步杂交，而生产本发明的基因多态性的纯合型植物体的方法。当本发明的生产方法所使用的第2植物体具有与本发明的植物体相同的表现型和遗传性能时，成为实质的回交。本发明的基因多态性遵循孟德尔定律遗传，与此同时，与该基因多态性相关的表现型，即所谓瑞鲍迪苷C高含有的表现型也遵循孟德尔定律遗传。
或者本发明的植物体也可通过自交生产。自交可通过使本发明的植物体的雄蕊花粉自花授粉给本发明的植物体的雌蕊而进行。
通过本发明的生产方法所生产的植物体的表现型及遗传性能与本发明的植物体相同，因此使通过本发明的生产方法所生产的植物体与第3甜菊植物体进一步杂交，由此可生产以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C的瑞鲍迪苷C高含有型甜菊植物体。
作为其他方式，本发明的植物体也可通过培养先前所述的组织培养物或植物培养细胞进行植物体再生，从而进行生产。关于培养条件，与培养野生型甜菊植物的组织培养物或植物培养细胞的条件相同，已为公知(Protocols for In Vitro cultures andsecondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants,Method inmolecular biology,vo.1391,pp113-123.)。
3.本发明的植物体的筛选方法
本发明的植物体以及具有与本发明的植物体相同的表现型和遗传性能的植物体，可通过由该植物体的组织检出本发明的基因多态性而进行筛选。在此，“筛选”是指将本发明的植物体与其以外的植物体进行识别从而选择本发明的植物体。
因此，本发明作为另一种方式，提供一种筛选方法，其为瑞鲍迪苷C高含有型甜菊植物体的筛选方法(以下称“本发明的筛选方法”)，其特征在于，包括鉴定被检植物的基因组中序列号1所示的多态性的步骤。
作为本发明的筛选方法，可列举包括如下步骤的方法：
(a)使用寡核苷酸引物，针对被检甜菊植物体的基因组或cDNA文库进行扩增处理及/或杂交处理的步骤，该寡核苷酸引物以如下方式制造：将含有本发明的基因多态性的碱基序列的寡核苷酸探针及/或上述基因的碱基序列及其互补序列中的至少一个进行扩增，并使扩增时的扩增片段中含有上述变异部位；以及
(b)通过分析上述处理物来检出变异部位的步骤。
作为此种检出方法的具体例，可列举PCR法、TaqMan PCR法、测序法、微阵列法、Invader法或TILLING法，但不限于此。
PCR法时，优选制作3’末端部分具有与本发明的SNP互补的序列的引物。采用由此种方式设计的引物时，当作为模板的样本有变异的情况下，由于引物完全与模板杂交，因此聚合酶延伸反应进行；当模板不具有本发明的SNP的情况下，由于引物的3’末端核苷酸与模板发生错配，因此延伸反应不发生。所以，使用此种引物进行PCR扩增，并将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳等进行分析，只要能确认指定大小的扩增产物，即可判断作为样本的模板有变异，而当扩增产物不存在时，即可判断模板没有变异。
或者，通过使本发明的SNP与引物序列不重叠，且设计引物序列以使本发明的基因多态性可PCR扩增，并对扩增的核苷酸片段的碱基序列进行测序，可检出本发明的基因多态性。
关于PCR及琼脂糖凝胶电泳，可参照以下：Sambrook,Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring HarborLaboratory Press。
TaqMan PCR法，是利用荧光标记的等位基因特异的寡核苷酸，和Taq DNA聚合酶引起的PCR反应的方法(Livak,K.J.Genet.Anal.14,143(1999)；Morris T.et al.,J.Clin.Microbiol.34,2933(1996))。
测序法，是通过使含变异的区域用PCR扩增，并用Dye Terminator等对DNA序列进行测序来分析变异的有无的方法(Sambrook,Fritsch and Maniatis,“MolecularCloning:A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。
DNA微阵列，是将核苷酸探针的一端以阵列状固定于支持体上而成，包括DNA芯片、基因芯片、微芯片、珠阵列等。通过使用含有与本发明的基因多态性互补的序列的探针，可全面地检出本发明的基因多态性的有无。作为DNA芯片等DNA微阵列分析，可列举GeneChip分析(Affymetrix公司；参照美国专利第6,045,996号、美国专利第5,925,525号以及美国专利第5,858,659号)。GeneChip技术是利用了贴敷于芯片上的寡核苷酸探针的小型化高密度微阵列的技术。
Invader法，是使2种报告基因探针及1种Invader探针与模板DNA的杂交，和由Cleavase酶引起的DNA切割进行组合的方法(Livak,K.J.Biomol.Eng.14,143-149(1999)；Morris T.et al.,J.Clin.Microbiol.34,2933(1996)；Lyamichev,V.et al.,Science,260,778-783(1993)等)，其中，所述探针对SNP等基因多态性的各等位基因特异；所述Cleavase酶具有识别DNA结构并进行切割等特殊的核酸内切酶活性。
TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)法，是由PCR扩增和CEL I核酸酶处理来进行筛选的方法，其中，所述PCR扩增是将变异导入的突变体组的基因组中的变异错配进行扩增。
4.源自本发明的植物体的萃取物及使用其的制品
本发明的进一步方式中，提供一种含有瑞鲍迪苷C的萃取物的制造方法(以下称“本发明的萃取物的制造方法”)，其特征在于，包括由本发明的植物体或该植物体的种子或干叶获得萃取物的步骤。且提供一种瑞鲍迪苷C的制造方法(以下称“本发明的瑞鲍迪苷C的制造方法”)，其特征在于，包括由通过本发明的萃取物的制造方法所获得的萃取物来精制瑞鲍迪苷C的步骤。
含有瑞鲍迪苷C的萃取物，可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂)进行反应而制得。萃取条件等可参照WO2016/090460中记载的方法或后述实施例中记载的方法。
此外，含有瑞鲍迪苷C的萃取物可通过使用以下公知方法来精制瑞鲍迪苷C：乙酸乙酯和其他有机溶剂:水的梯度、高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography：HPLC)、气相色谱、飞行时间质谱(Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS)、超高效液相色谱(Ultra(High)Performance Liquid chromatography：UPLC)等。
通过本发明的萃取物的制造方法制得的萃取物(以下称“本发明的萃取物”)，其特征在于，以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C，且瑞鲍迪苷C在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上。在此，“以高于野生型甜菊种20％以上的含量含有瑞鲍迪苷C”如前所述。且“瑞鲍迪苷C在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上”如前所述。本发明的萃取物与同样从野生型甜菊种中萃取的萃取物相比，至少瑞鲍迪苷C在总甜菊醇糖苷中所占的比例不同，因此认为，味觉特性等特性与同样从野生型甜菊种中萃取的萃取物不同。
将通过此种方式得到的本发明的萃取物及/或通过本发明的瑞鲍迪苷C的制造方法得到的瑞鲍迪苷C与其他成分混合，由此可制造瑞鲍迪苷C含量增高的新型医药品、香料或饮食品。因此，本发明作为其他实施方式提供一种医药品、香料或饮食品的制造方法，其特征在于，包括将本发明的萃取物及/或通过本发明的瑞鲍迪苷C的制造方法制得的瑞鲍迪苷C与其他成分混合的步骤。且本发明提供一种新型医药品、香料或饮食品，其为通过上述制造方法制得的使瑞鲍迪苷C含量增高的产品。在此，饮食品是指饮料及食品。因此，在某种实施方式中，本发明提供新型医药品、香料、饮料或食品，还提供该医药品、香料、饮料或食品的制造方法。
作为其他成分，只要可用于医药品、香料或饮食品则没有特别限定，可使用天然成分及非天然成分。作为非天然成分，可列举非天然存在的化合物，例如合成风味料、合成保护剂等合成添加物、发酵产品等。
医药品(医药组合物)的剂型没有特别限定，可制成溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意剂型。此外，本发明的医药品(医药组合物)除了可用于油、洗液、乳膏、乳液、凝胶、洗发水、润丝、护发素、指甲油、粉底、唇膏、香粉、面膜、软膏、爽身粉、牙膏、气雾剂、洁面膏等皮肤外用药，还可用于其他浴用剂、生发精、皮肤美容液、防晒剂等。本发明的医药品(医药组合物)根据需要，也可进一步含有其他医药活性成分(例如消炎成分)或辅助成分(例如润滑成分、载体成分)。医药活性成分或辅助成分既可为天然成分也可为非天然成分。
作为饮料的例子，没有特别限定，可列举果汁饮料、清涼饮料、运动饮料、茶饮料(例如绿茶等不发酵茶、乌龙茶等半发酵茶、红茶等全发酵茶、普洱茶等后发酵茶)、发酵饮料(例如乳酸饮料、清酒、葡萄酒、啤酒、药用酒等酒精饮料)、思慕雪、奶昔等。
食品包括任意加工食品。作为加工食品的例子，没有特别限定，可列举面包、面条类、意大利面、米饭、点心类(蛋糕、冰淇淋、冰棒、甜甜圈、烘焙点心、糖果、糖、冰点心、口香糖、软糖、咀嚼片、零食、米果、冰淇淋脆皮筒和团子及日式馒头等日本点心)、豆腐及其加工品、水果罐头等农产食品；料理酒、药用酒、料酒、食醋、酱油、日式大豆酱、腌制品、佛蒙特醋、糖醋藠头、糖醋姜、醋藕、酱菜等发酵食品；酸奶、火腿、腊肉、香肠等畜产食品；鱼糕、关西炸鱼饼、鱼肉山芋方形蒸饼、醋浸青花鱼等水产食品；汤、浓汤、果冻、佃煮、调味汁、面汤、天妇罗酱、烤鱼酱、凉面酱、烤肉酱、沙司、牙膏、炸鱼饼、鸡蛋卷、炒面沙司、鱼糜制品、调味海苔、油炸面块、拌饭料等。在一种方式中，加工食品以天然产品为原料，但与天然产品的特性(例如弹性、粘性、硬度等物理特性；味道、气味、口感等感官特性)不同。另一种方式中，加工食品含有非天然成分。
实施例
以下记载与本发明相关的实验例、实施例等，但本发明不限于这些具体方式。
(1)高RebC型株的个体分离(M0代)
将约2000个(重量换算)野生型甜菊种子(泰国市售品种，2014年8月引入)分成3份，分别进行0.1％、0.2％或0.3％的甲磺酸乙酯(EMS)处理，从而进行基因改变。
将这些EMS已处理的种子及未处理的种子在三得利研究中心内的温室中播种，获得EMS处理当代(M0代)苗及未处理苗。未发现处理浓度间的发芽率差异。
由EMS处理当代(M0代)及未处理个体取样适量的新鲜叶，用LC/MS-MS(岛津LCMS8050)定量各甜菊醇糖苷的浓度。具体而言，将0.25g新鲜叶冻干干燥，并将0.05g破碎干物质投入纯水中。用超声波处理20分钟进行萃取，离心、过滤后，获得0.33ml萃取液。将该萃取液用LCMS8050离子模式(岛津LCMS8050)进行LC/MS-MS分析时，得到以下分析结果。分析结果示于下表(表1-1、表1-2)。表中EM后的数字表示处理浓度(即EM1＝0.1％处理)。
各植物体的筛选结果，获得了多个RebC含有株(高RebC型株)，其干叶中的瑞鲍迪苷C(RebC)浓度为5.68～9.96重量％，且在总甜菊醇糖苷中所占比例为40％以上。此外，这些高RebC型株共通之处在于RebA生成量下降。(表中“STV”表示甜菊苷)。
[干叶中的重量浓度]
表1-1
○高RebC型株
○无处理株
[总甜菊醇糖苷中的比例]
表1-2
○高RebC型株
○无处理株
(2)高RebC型株的个体分离(M1代)
通过上述M0代整株自交来采种处理第一代(M1代)种子。3种EMS处理共计制作了115组。
将上述M1代种子在三得利研究中心内的温室中播种，获得M1代苗。由M1代个体取样适量新鲜叶，用LC/MS-MS(岛津LCMS8050)定量甜菊醇糖苷。
具体而言，将0.25g新鲜叶冻干干燥，并将0.05g破碎干物质投入纯水中。超声波处理20分钟进行萃取，离心、过滤后获得0.33ml萃取液。将该萃取液用LCMS8050离子模式(岛津LCMS8050)进行LC/MS-MS分析时，得到以下分析结果(表2-1、表2-2)。
表中EM后的数字表示处理浓度(即EM1＝0.1％处理)。
基于分析结果，选择了多个高RebC个体。
○高RebC型株
[干叶中的重量浓度]
表2-1
[在总甜菊醇糖苷中的比例]
表2-2
○低RebC型或一般浓度的株
[干叶中的重量浓度]
表3-1
[在甜菊醇糖苷中的比例]
表3-2
(3)高RebC型株的个体分离(M2代)
针对高RebC型株进一步定量RebO及RebN浓度。定量条件同上。RebC、RebO、RebN的共通之处在于分子内具有鼠李糖残基，因此假定与糖转移相关的同一酶影响了它们的含有比例，认为当各成分的浓度呈比例关系时可支持本假设，因而进行了此实施。
[干叶中的重量浓度]
表4-1
[在总甜菊醇糖苷中的比例]
表4-2
(4)关于RebC高含量植物体的基因多态性
(5)关于RebC高含量植物体中特有的基因多态性的检出
从意欲调查本发明的基因多态性的有无的甜菊叶中萃取了基因组DNA，并以萃取的基因组DNA为模板进行了PCR。PCR使用Blend Taq(东洋纺)，并根据Blend Taq的说明书制作反应液。由PCR进行DNA片段扩增时，使用5’-TGGTCACCCTCTAATCATGCTACCG-3’(序列号3)作为Fw引物，使用5’-TTAACTCTCATGATCGATGGCAACCGCACGCGCATTCTTTTCCAAC-3’(序列号4)作为Rv进行PCR。PCR的条件为95℃2分钟、55℃30秒、72℃30秒的3阶段反应重复35次。将PCR扩增的DNA片段用限制酶(SpeI：东洋纺)切割。在12μL PCR后的反应液中，加入2μL Hbuffer、1μL SpeI、5μL纯水制作酶反应液。使酶反应液于37℃静置16小时进行酶反应。限制酶反应后的酶反应液用LabChip GX Touch HT(Perkin elmer公司)进行分析。将微量的酶反应液在DNA 5k/RNA CZE LabChip上进行电泳，由UV检出流动相内的DNA含量，并制作拟电泳像，以进行标记的检出。
上述检出结果为：当使用#8片段(1412、A>T)时，在RebC浓度非常高的个体(EM3-45-1、EM3-16-24、EM2-14-11、EM2-14-18、EM2-14-30)中于野生型的更上端检出扩增带。另一方面，在RebC浓度与野生型同水平或略高的个体(EM2-14、EM2-11、EM2-16、EM2-14-38、EM3-19-16、EM2-14-27、EM2-2-7、EM2-32-6、EM1-11、EM2-4-4、EM2-4-13)中，检出为纯型或杂型的与野生型相同大小或同程度大小的扩增带。
针对各扩增带的多核苷酸进行碱基序列分析。EM3-16-24、EM2-14-11、EM2-14-18、EM2-14-30的扩增带的碱基序列(杂合)示于序列号5，EM-3-45-1的扩增带的碱基序列(纯合)示于序列号6以及EM2-14-38、EM1-11、EM2-2-4的扩增带的碱基序列示于序列号7(纯合)。
所有高RebC表现型株，共通之处在于具有序列号1的碱基序列。这是对应的野生型序列(序列号2)的5’端的第60位碱基由A变异为T的多态性。进一步针对高RebC浓度的表现型与序列号1的多态性的相关性进行统计分析时，已明确该多态性与高RebC浓度的表现型具有统计学上的相关性。具体而言，基于零假设可推定：高RebC型(杂型A/T)×低RebC型(野生纯型A/A)的后代中的分离比例为高RebC型:低RebC型＝1∶1。由上述检定杂交所得的22个后代个体的RebC表现型中，观测值为高∶低＝7∶15，因此，期待值为高∶低＝11∶11。针对分离分析结果进行适合度检定时，χ2＝2.91，df＝1、α＝0.05中否定域为3.84，因此，观测值(实际的分离比)与期待值之间无统计学上的显著差异，判断为两者相适合。
总之，由于检定杂交的结果为高RebC型∶低RebC型以1∶1分离，因此判明标记检定结果与表现型存在一定的关联，通过本SNP可确定RebC基因型。
由以上结果判明：针对本发明的基因多态性的有无而采用本步骤时，可通过基因水平来检出RebC浓度高的个体。
产业上的可利用性
通过本发明可更有效地提供瑞鲍迪苷C，因此，通过以充分量含有瑞鲍迪苷C可提供改善了由甜菊引起的甜味的余味的医药品、香料或饮食品等。
序列表
<110> 三得利控股株式会社
<120> 瑞鲍迪苷C高含量的甜菊植物
<130> G1646WO
<150> JP 2016-253543
<151> 2016-12-27
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 1
gagtaaaatc tataacgaca ctaaggtgga aaaagaatat gtaagccaat tcgtagactt 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 2
gagtaaaatc tataacgaca ctaaggtgga aaaagaatat gtaagccaat tcgtagacta 60
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
tggtcaccct ctaatcatgc taccg 25
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ttaactctca tgatcgatgg caaccgcacg cgcattcttt tccaac 46
<210> 5
<211> 258
<212> DNA
<213> 甜菊
<220>
<221> 尚未定义的特性
<222> (258)..(258)
<223> 258位的“n”可以是“a”或 “t”。
<400> 5
tggtcaccct ctaatcatgc taccgctttt tggggaccaa cctctgaatg ctcgattact 60
ggaggacaaa caggtgggaa tcgagatacc aagaaatgag gaagatggtt gcttgaccaa 120
ggagtcggtt gctagatcac tgaggtccgt tgttgtggaa aacgaagggg agatctacaa 180
ggcgaacgcg agggagctga gtaaaatcta taacgacact aaggtggaaa aagaatatgt 240
aagccaattc gtagactn 258
<210> 6
<211> 258
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 6
tggtcaccct ctaatcatgc taccgctttt tggggaccaa cctctgaatg ctcgattact 60
ggaggacaaa caggtgggaa tcgagatacc aagaaatgag gaagatggtt gcttgaccaa 120
ggagtcggtt gctagatcac tgaggtccgt tgttgtggaa aacgaagggg agatctacaa 180
ggcgaacgcg agggagctga gtaaaatcta taacgacact aaggtggaaa aagaatatgt 240
aagccaattc gtagactt 258
<210> 7
<211> 258
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 7
tggtcaccct ctaatcatgc taccgctttt tggggaccaa cctctgaatg ctcgattact 60
ggaggacaaa caggtgggaa tcgagatacc aagaaatgag gaagatggtt gcttgaccaa 120
ggagtcggtt gctagatcac tgaggtccgt tgttgtggaa aacgaagggg agatctacaa 180
ggcgaacgcg agggagctga gtaaaatcta taacgacact aaggtggaaa aagaatatgt 240
aagccaattc gtagacta 258

Claims (8)

1.一种甜菊植物体的干叶，其特征在于，有15重量%以上的瑞鲍迪苷C含量，所述甜菊植物体在基因组中有序列号2所示的野生型等位基因的碱基序列的第60位的碱基由A变异为T的多态性。
2.一种作为干叶有15重量%以上的瑞鲍迪苷C含量的瑞鲍迪苷C高含有型甜菊植物体的生产方法，其特征在于，所述方法包括使作为干叶有15重量%以上的瑞鲍迪苷C含量且在基因组中有权利要求1所述的多态性的甜菊植物体与第2甜菊植物体进行杂交的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第2植物体为作为干叶有15重量%以上的瑞鲍迪苷C含量且在基因组中有权利要求1所述的多态性的甜菊植物体。
4.一种含瑞鲍迪苷C的萃取物的制造方法，其特征在于，包括由作为干叶有15重量%以上的瑞鲍迪苷C含量且在基因组中有权利要求1所述的多态性的甜菊植物体、其种子或权利要求1所述的干叶获得萃取物的步骤。
5.一种瑞鲍迪苷C的制造方法，其特征在于，包括由权利要求4所述的含瑞鲍迪苷C的萃取物精制瑞鲍迪苷C的步骤。
6.一种医药品、香料或饮食品的制造方法，其特征在于，包括将由权利要求4所述的方法获得的萃取物及/或由权利要求5所述的方法获得的瑞鲍迪苷C与其他成分混合的步骤。
7.一种瑞鲍迪苷C高含有型甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，所述方法包括鉴定被检植物的基因组中权利要求1所述的多态性的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括进一步测定叶片组织的瑞鲍迪苷C含有量的步骤。
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