JP7128117B2 - 高レバウジオシドc含有ステビア植物 - Google Patents
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Description
そこで、レバウジオシドCをさらにより多く含むステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる乾燥葉、この乾燥葉より得られたレバウジオシドCを含む食物や飲料などの提供が望まれている。
本発明は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドCを20%以上高い含量で含む高レバウジオシドC含有型非遺伝子組み換えステビア植物体であって、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドCの割合が40%以上である、前記植物体(以下、「本発明の植物体」)を提供する。
本発明のステビア植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であるが、レバウジオシドCが高くなるように遺伝子に変異が生じたものである。かつ当該遺伝子の変異は非遺伝子組換え的に生じるものである(後述)。
(1)野生型ステビア種と比べレバウジオシドAの含量(産生量)が低い。より具体的には、野生型ステビア種と比べレバウジオシドAの含量(例えば乾燥葉などにおける重量濃度)が、約40%以上、約50%以上、約60%以上、約70%以上、または、約80%以上低い。
(2)野生型ステビア種と比べステビオシドの含量(産生量)が低い。より具体的には、野生型ステビア種と比べステビオシドの含量(例えば乾燥葉などにおける重量濃度)が、約50%以上、約60%以上、約70%以上、または、約80%以上低い。
(3)野生型ステビア種と比べレバウジオシドFの含量(産生量)が高い。より具体的には、野生型ステビア種と比べレバウジオシドFの含量(例えば乾燥葉などにおける重量濃度)が、約2倍以上、約3倍以上、約4倍以上、約5倍以上、または、約6倍以上高い。
(5)野生型ステビア種と比べ、総ステビオール配糖体に占めるステビオシドの割合が低い。より具体的には、野生型ステビア種と比べ(例えば乾燥葉などにおける)総ステビオール配糖体に占めるステビオシドの割合が約30%以上、約40%以上、約50%以上、約60%以上、または、約70%以上低い。
(6)野生型ステビア種と比べ、総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドFの割合が高い。より具体的には、野生型ステビア種と比べ(例えば乾燥葉などにおける)総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドFの割合が約3倍以上、約4倍以上、約5倍以上、または、約6倍以上高い。
一部の態様において、本発明の植物体は、レバウジオシドCに係る上記特性に加え、野生型ステビア種と比べレバウジオシドAおよびステビオシドの含量(産生量)が低く、かつ、レバウジオシドFの含量(産生量)が高く、および/または、野生型ステビア種と比べ、総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドAおよびステビオシドの割合が低く、かつ、総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドFの割合が高い。
したがって、本発明のステビア植物体は、配列番号1に示す多型をゲノム中に有することを特徴とする。これらの多型は、高レバウジオシドC含有という表現型と統計学上の相関関係を有することが実施例において確認されている。
本発明のステビア植物体は前記遺伝子多型をヘテロ接合型で有していてもよく、あるいはホモ接合型で有していてもよい。一般に前記遺伝子多型をホモ接合型で有する植物体はヘテロ接合型と比べてレバウジオシドC含有量が高くなる傾向がある。
これらの遺伝子多型は、PCR法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。遺伝子多型の検出方法の詳細については後述する。
あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてX線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量(紫外線ランプ強さ、距離、時間)を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は0.01~100Gr、0.03~75Gr、0.05~50Gr、0.07~25Gr、0.09~20Gr、0.1~15Gr、0.1~10Gr、0.5~10Gr、1~10Grであり、照射距離は1cm~200m、5cm~100m、7cm~75m、9cm~50m、10cm~30m、10cm~20m、10cm~10mであり、照射時間は1分~2年、2分~1年、3分~0.5年、4分~1か月、5分~2週間、10分~1週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態(細胞、カルス、植物体)により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
また、細胞融合、葯培養(半数体育成)、遠縁交雑(半数体育成)などの手法も公知である。
一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
なお、本発明の植物体は非遺伝子組み換えステビア植物体であるが、本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換えを行って得られた植物体(例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体)も、本発明の範囲から除外されるものではない。
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析(Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS)、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra (High)Performance Liquid chromatography:UPLC) 等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドCを精製することができる。
本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型ステビア種と比べレバウジオシドCを20%以上高い含量で含む高レバウジオシドC含有型ステビア植物体を作出する方法(以下、「本発明の作出方法」という)を提供する。
当該方法により作出される「野生型ステビア種と比べレバウジオシドCを20%以上高い含量で含む高レバウジオシドC含有型ステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
本発明の植物体および本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝子多型を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
したがって、本発明は、別の実施形態として、被験植物のゲノムに配列番号1に示す多型を同定する工程を含む、高レバウジオシドC含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法(以下、「本発明のスクリーニング方法」という)を提供する。
(a) 本発明の遺伝子多型の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記遺伝子の塩基配列及びその相補配列の少なくとも一方を増幅したときの増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検ステビア植物体のゲノム又はcDNAライブラリーについて増幅処理及び/又はハイブリダイゼーション処理を行う工程、及び、
(b) 前記処理物を分析することにより変異部位を検出する工程
を含む、方法が挙げられる。
PCR法の場合、3’末端部分が本発明のSNPに相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが変異を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明のSNPを有しない場合には、プライマーの3’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてPCR増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
あるいは、本発明のSNPとプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子多型をPCR増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝子多型を検出することができる。
PCR及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照:Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてDNA配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である(Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
DNAマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を含むものである。本発明の遺伝子多型と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の遺伝子多型の有無を検出することができる。DNAチップなどのDNAマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる(Affymetrix社;米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照)。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
インベーダー法とは、SNP等の遺伝子多型のそれぞれのアレルに特異的な2種類のレポータープローブ及び1種類のインベーダープローブの鋳型DNAへのハイブリダイゼーションと、DNAの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるDNAの切断を組み合わせた方法である(Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等)。
TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをPCR増幅とCEL Iヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、または当該植物体の種子若しくは乾燥葉から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドC含有抽出物の製造方法(以下、「本発明の抽出物の製造方法」という)が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からレバウジオシドCを精製する工程を含む、レバウジオシドCの製造方法(以下、「本発明のレバウジオシドCの製造方法」という)が提供される。
レバウジオシドC含有抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒(水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒)を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はWO2016/090460に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
また、レバウジオシドC含有抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析(Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS)、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra (High)Performance Liquid chromatography:UPLC) 等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドCを精製することができる。
食品は任意の加工食品を包含する。加工食品の例としては、限定されずに、パン、麺類、パスタ、ごはん、菓子類(ケーキ、アイスクリーム、アイスキャンデー、ドーナツ、焼き菓子、キャンデー、飴、氷菓、チューインガム、グミ、錠菓、スナック、米菓、コーンカップ、並びに団子及びまんじゅう等の和菓子)、豆腐及びその加工品、フルーツ缶詰等の農産食品、料理酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ、塩辛、バーモント酢、甘酢らっきょ漬け、甘酢生姜、酢レンコン、漬物等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん、しめ鯖等の水産食品、スープ、ポタージュ、ゼリー、佃煮、ドレッシング、麺つゆ、天ぷらのタレ、カバ焼きのタレ、冷やし中華のタレ、焼肉のタレ、ソース、歯磨きペースト、さつま揚げ、だし巻き、焼きそばソース、練り製品、味付け海苔、天カス、ふりかけなどが挙げられる。一態様において、加工食品は天然物を原料とするが、天然物とはその特性(例えば、弾力性、粘性、硬度などの物理的特性、味、匂い、食感などの官能的特性)が異なる。別の態様において、加工食品は非天然成分を含む。
野生型ステビア種子(タイ国での市販品種、2014年8月に導入)約2000個(重量換算)を3つに分けて、各々に対して0.1%、0.2%又は0.3%のエチレンメタンスルホン酸(EMS)処理を行って遺伝子改変を行った。
このEMS処理済み種子及び無処理の種子を、サントリー研究センター内温室にて播種し、EMS処理当代(M0世代)苗および無処理苗を得た。処理濃度間での発芽率差異は見られなかった。
EMS処理当代(M0世代)および無処理個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、LC/MS-MS(島津LCMS8050)にて各ステビオール配糖体の濃度を定量した。具体的には、0.25gの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物0.05gを純水中に投入した。超音波処理20分にて抽出し、遠心・濾過した後に0.33mlの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード(島津LCMS8050)にてLC/MS-MS分析を行ったところ、以下の分析結果が得られた。分析結果を以下の表に示す(表1-1、表1-2)。表中、EMの後の数字が処理濃度を示す(すなわち、EM1=0.1%処理)。
各植物体のスクリーニングの結果、乾燥葉中のレバウジオシドC(RebC)の濃度が5.68~9.96重量%であり、かつ総ステビオール配糖体に占める割合が40%以上のRebC含有系統(高RebC型系統)を複数得た。なお、これら高RebC型系統は共通してRebA生産量が低下していた。(表中「STV」はステビオシドを表す)。
[乾燥葉中の重量濃度]
[総ステビオール配糖体中の割合]
上記M0世代全個体の自殖により処理第一代(M1世代)種子を採種した。3種EMS処理合計で115集団を作製した。
上記M1世代種子をサントリー研究センター内の温室内で播種し、M1世代苗を得た。上記M1世代個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、LC/MS-MS(島津LCMS8050)にてステビオール配糖体を定量した。
具体的には、0.25gの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物0.05gを純水中に投入した。超音波処理20分にて抽出し、遠心・濾過した後に0.33mlの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード(島津LCMS8050)にてLC/MS-MS分析を行ったところ、以下の分析結果が得られた(表2-1、表2-2)。
表中、EMの後の数字は処理濃度を表す(すなわち、EM1=0.1%処理)。
分析結果に基づき、高RebC個体を複数選抜した。
○高RebC型系統
[乾燥葉中の重量濃度]
[総ステビオール配糖体中の割合]
○低RebC型もしくは通常濃度の系統
[乾燥葉中の重量濃度]
[総ステビオール配糖体中の割合]
高RebC型系統についてさらにRebOおよびRebN濃度を定量した。定量条件は上記と同じである。RebC、RebO、RebNは共通して、分子内にラムノース残基を有するため、糖の転移に関与する同一の酵素がこれらの含有比率に影響しているのではないかと仮定し、各成分の濃度が比例関係にある場合に本仮説を支持できると考え実施したものである。
[乾燥葉中の重量濃度]
[総ステビオール配糖体中の割合]
本発明の遺伝子多型の有無を調査したいステビア葉からゲノムDNAを抽出し、抽出したゲノムDNAを鋳型にPCRを行った。PCRはBlend Taq(東洋紡)を使用しBlend Taqの説明書に従い反応液を作製した。PCRによるDNA断片の増幅にはFwプライマーとして 5’-TGGTCACCCTCTAATCATGCTACCG-3’ (配列番号3)とRvとして 5’-TTAACTCTCATGATCGATGGCAACCGCACGCGCATTCTTTTCCAAC-3’ (配列番号4)を用いてPCRを行った。PCRの条件は95℃ 2分、55℃ 30秒、72℃ 30秒の3段階の反応を35回繰り返した。PCRで増幅したDNA断片は制限酵素(SpeI:東洋紡)で切断した。PCR後の反応液12μLにH buffer 2μL、SpeI 1μL、純水5μLの酵素反応液を作製した。酵素反応液は37℃で16時間静置し酵素反応させた。制限酵素反応後の酵素反応液はLabChip GX Touch HT(Perkin elmer社)を使って行った。微量の酵素反応液をDNA 5k/RNA CZE LabChip上で電気泳動を行い、UVにより移動相内のDNAの含量を検出し疑似的な電気泳動像を作製しマーカーの検出を行った。
各バンドのポリヌクレオチドについて塩基配列を解析した。EM3-16-24、EM2-14-11、EM2-14-18、EM2-14-30のバンドの塩基配列(ヘテロ接合)を配列番号5に示し、EM-3-45-1のバンドの塩基配列(ホモ接合)を配列番号6に示し、及びEM2-14-38、EM1-11、EM2-2-4のバンドの塩基配列を配列番号7(ホモ接合)に示す。
つまり、検定交雑の結果、高RebC型:低RebC型は1:1に分離したため、マーカー検定結果と表現型は一定の関係にあり、本SNPによってRebC遺伝子型を規定できることが判明した。
以上の結果から、本発明の遺伝子多型の有無について本手順を用いると、RebC濃度が高い個体を遺伝子レベルで検出することが可能であることが判明した。
Claims (15)
- 乾燥葉として15重量%以上のレバウジオシドC含量を有し、かつ、配列番号1に示す多型をゲノム中に有する、ステビア植物体。
- 配列番号1に示す多型をゲノム中に有する、ステビア植物体。
- 請求項1又は2に記載の植物体の種子。
- 請求項1又は2に記載の植物体の乾燥葉。
- 請求項1又は2に記載の植物体の組織培養物又は植物培養細胞。
- 胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片およびカルスである請求項5記載の組織培養物又は植物培養細胞。
- 請求項1又は2に記載のステビア植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型ステビア種と比べレバウジオシドCを20%以上高い含量で含む高レバウジオシドC含有型ステビア植物体を作出する方法。
- 第2の植物体が請求項1又は2に記載のステビア植物体である、請求項7に記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の植物体、請求項3に記載の種子又は請求項4に記載の乾燥葉の抽出物。
- 請求項9に記載の抽出物を含む医薬品、香料又は飲食品。
- 請求項1又は2に記載の植物体、請求項3に記載の種子又は請求項4に記載の乾燥葉から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドC含有抽出物の製造方法。
- 請求項1又は2に記載の植物体、請求項3に記載の種子又は請求項4に記載の乾燥葉から抽出物を得る工程、及び、前記抽出物からレバウジオシドCを精製する工程を含む、レバウジオシドCの製造方法。
- 請求項1又は2に記載の植物体、請求項3に記載の種子又は請求項4に記載の乾燥葉から抽出物を得る工程、任意選択で前記抽出物からレバウジオシドCを精製する工程、及び、前記抽出物及び/又は前記レバウジオシドCと他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法。
- 被験植物のゲノムに配列番号1に示す多型を同定する工程を含む、高レバウジオシドC含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
- さらに、葉組織のレバウジオシドCの含有量を測定する工程を含む、請求項14に記載の方法。
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BR112022022789A2 (pt) * | 2020-05-12 | 2022-12-13 | Suntory Holdings Ltd | Método de triagem para uma planta de estévia com alto teor de glicosídeo de esteviol, kit de triagem, planta de estévia com alto teor de glicosídeo de esteviol, semente, tecido, folha seca, cultura de tecido ou célula, métodos para produzir uma planta de estévia com alto teor de glicosídeo de esteviol, um extrato, glicosídeo de esteviol e um alimento ou bebida, uma composição adoçante, um sabor ou um medicamento, e, extrato da planta ou da semente, do tecido, da folha seca, da cultura de tecido ou da célula |
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WO2024005142A1 (ja) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | サントリーホールディングス株式会社 | ステビア植物のスクリーニング方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130284164A1 (en) | 2011-01-14 | 2013-10-31 | Glg Life Tech Corporation | Processes of Purifying Steviol Glycosides Reb C |
WO2016090460A1 (en) | 2014-12-08 | 2016-06-16 | Qibin Wang | High rebaudioside-c plant varietal and compositions extracted therefrom with high rebaudioside-c and total steviol glycoside content |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5925525A (en) | 1989-06-07 | 1999-07-20 | Affymetrix, Inc. | Method of identifying nucleotide differences |
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US6045996A (en) | 1993-10-26 | 2000-04-04 | Affymetrix, Inc. | Hybridization assays on oligonucleotide arrays |
USPP10563P (en) * | 1996-05-29 | 1998-08-18 | Royal-Sweet International Technologies Ltd. Part. | Stevia plant named `RSIT 95-166-13` |
US8377491B2 (en) | 2005-11-23 | 2013-02-19 | The Coca-Cola Company | High-potency sweetener composition with vitamin and compositions sweetened therewith |
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---|---|---|---|---|
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WO2016090460A1 (en) | 2014-12-08 | 2016-06-16 | Qibin Wang | High rebaudioside-c plant varietal and compositions extracted therefrom with high rebaudioside-c and total steviol glycoside content |
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