WO2021230256A1 - 高レバウジオシドｄ含有ステビア植物 - Google Patents

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rebd
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plant
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正良 平井
一考 岩城
兼太郎 落合
沙織 竹山
克郎 宮川
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to stevia plants having a high content of useful steviol glycosides such as rebaugioside D, and screening methods thereof.
  • Patent Document 1 discloses a functional sweetening composition containing a vitamin, a high-sweetness sweetening agent, and a sweetness improving composition.
  • Steviol glycoside is known as a sweetening component contained in stevia extract.
  • Stevia extract is mainly extracted and purified from Stevia leaves.
  • Stevia is a perennial plant of the Asteraceae family that originates in Paraguay, South America, and its scientific name is Stevia Rebaudiana Bertoni. Since stevia contains a component having a sweetness of about 300 times or more that of sugar, this sweet component is extracted and cultivated for use as a natural sweetener.
  • rebaudioside A hereinafter “Rebaudioside” may be abbreviated as "Reb”
  • RebB RebC
  • RebD RevE
  • RevM RevM
  • Patent Document 2 It has been reported (Patent Document 2).
  • RebA has been evaluated as a sweetener having a high degree of sweetness and a high-quality sweetness, and is widely used.
  • Other steviol glycosides are also being found to have their own sweetness and associated taste.
  • Patent Document 3 a stevia plant containing 3.57% of RebD per dried leaf is known.
  • RebD is said to have the best taste among steviol glycosides, but it is not possible to obtain much from natural Stevia plants, and its acquisition is a problem.
  • the present invention provides a Stevia plant having a higher content than a wild-type Stevia species and containing a useful steviol glycoside such as RebD, and a method for producing and screening the plant.
  • the invention provides: [1-1] A stevia plant having at least one of the following chemical characteristics (1) to (7).
  • the content of rebaugioside (Reb) D is 3.6% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of dried leaves.
  • the mass ratio of RebD to the total steviol glycoside is 32.0% or more.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 38.2% or more.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • A) It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 1 is C.
  • B) Heterozygous for alleles where the base at position 21 corresponding to SEQ ID NO: 2 is T
  • C Heterozygous for alleles where the base corresponding to position 28 of SEQ ID NO: 3 is T
  • D It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 59 of SEQ ID NO: 4 is C.
  • A It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 1 is C.
  • B Heterozygous for alleles where the base at position 21 corresponding to SEQ ID NO: 2 is T
  • C Heterozygous for alleles where the base corresponding to position 28 of SEQ ID NO: 3 is T
  • D It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 59 of SEQ ID NO: 4 is C.
  • E It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 64 of SEQ ID NO: 5 is T.
  • [1-6] The seed, tissue, dried leaf, tissue culture or cell of the plant according to any one of [1-1] to [1-5].
  • [1-7] The tissue, tissue culture or cell according to [1-6], selected from embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections and callus.
  • [1-8] The following chemical features (1) to include the step of crossing the plant according to any one of [1-1] to [1-5] with the second Stevia plant.
  • the content of RebD is 3.6% or more per unit mass of dried leaves.
  • (2) The total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of dried leaves.
  • the mass ratio of RebD to the total steviol glycoside is 32.0% or more.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 38.2% or more.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • [1-10] The plant according to any one of [1-1] to [1-5], which comprises at least one of RebD, RebM and RebN, [1-6] or [1-7].
  • a seed, tissue, dried leaf, tissue culture or cell extract according to. [1-11] The plant according to any one of [1-1] to [1-5], and the seed, tissue, dried leaves, and tissue culture according to [1-6] or [1-7].
  • a method for producing an extract containing at least one of RebD, RebM and RebN which comprises the step of obtaining an extract from a substance or cell.
  • a method for producing RebD, RebM and / or RebN which comprises a step of purifying at least one of RebD, RebM and RebN from the extract according to [1-10].
  • [1-13] The plant extract according to any one of [1-1] to [1-5], and the seeds, tissues, and dried leaves according to [1-6] or [1-7]. , Tissue culture or cell extract, or the step of providing the extract according to [1-10], and the step of adding the extract to foods and drinks, sweetening compositions, flavors or pharmaceutical raw materials.
  • a method for producing a food or drink, a sweetening composition, a flavor or a pharmaceutical product which comprises.
  • [1-14] [1-1] to [1-] comprising the step of detecting the presence and / or absence of at least one of the following genetic features (A) to (G) from the genome of the test Stevia plant. 5] The method for screening a Stevia plant according to any one of the following items.
  • (A) It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 1 is C.
  • [1-17] The stevia according to any one of [1-1] to [1-5], which comprises a reagent for detecting the presence and / or absence of at least one of the following genetic features (A) to (G). Plant screening kit.
  • A It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 1 is C.
  • B Heterozygous for alleles where the base at position 21 corresponding to SEQ ID NO: 2 is T
  • C Heterozygous for alleles where the base corresponding to position 28 of SEQ ID NO: 3 is T
  • D It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 59 of SEQ ID NO: 4 is C.
  • H It is heterozygous for alleles in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 130 is C.
  • the plant according to [2-1] which has at least one of the following chemical characteristics (1) to (7).
  • the content of RebD is 3.6% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of dried leaves.
  • the mass ratio of RebD to the total steviol glycoside is 32.0% or more.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 38.2% or more.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • [2-3] The plant according to [2-1] or [2-2], which is a non-genetically modified plant.
  • [2-5] The seed, tissue, dried leaf, tissue culture or cell of the plant according to any one of [2-1] to [2-4].
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • [2-13] Includes a step of detecting from the genome of a test Stevia plant the presence and / or absence of a genetic feature (H) that is heterozygous for an allele whose base at position 40 of SEQ ID NO: 130 is C. , A method for screening a Stevia plant having at least one of the following chemical characteristics (1) to (7).
  • the content of RebD is 3.6% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of dried leaves.
  • the mass ratio of RebD to the total steviol glycoside is 32.0% or more.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 38.2% or more.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • a screening kit for Stevia plants having at least one of (1) to (7).
  • the content of RebD is 3.6% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of dried leaves.
  • the mass ratio of RebD to the total steviol glycoside is 32.0% or more.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 38.2% or more.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • the content of RebD is 3.6% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of dried leaves.
  • the mass ratio of RebD to the total steviol glycoside is 32.0% or more.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 38.2% or more.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • FIG. 1 is a diagram showing the position of the mutation (A) in the base sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (A).
  • FIG. 2 is a diagram showing the positions of the bases related to the mutation (B) in the base sequence of SEQ ID NO: 26.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (B).
  • FIG. 3 is a diagram showing the positions of the bases related to the mutation (C) in the base sequence of SEQ ID NO: 30.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (C).
  • FIG. 4 is a diagram showing the positions of the bases related to the mutation (D) in the base sequence of SEQ ID NO: 34.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (D).
  • FIG. 5 is a diagram showing the positions of the bases related to the mutation (E) in the base sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (E).
  • FIG. 6 is a diagram showing the positions of the bases related to the mutation (F) in the base sequence of SEQ ID NO: 42.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (F).
  • FIG. 7 is a diagram showing the positions of the bases related to the mutation (G) in the base sequence of SEQ ID NO: 46.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (G).
  • FIG. 8 is a diagram showing the positions of the bases related to the mutation (H) in the base sequence of SEQ ID NO: 133.
  • the base enclosed in the frame is the base related to the mutation (H).
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of analysis by the dCAPS method as to whether or not the Stevia plant has the genetic feature (A).
  • Lane 1 is homozygous for alleles with mutation (A)
  • lane 2 is heterozygous for alleles with mutation (A)
  • lane 3 is homozygous for alleles without mutation (A).
  • the electrophoretic images of the samples obtained by treating the DNA of an individual with the limiting enzyme RsaI are shown.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of analysis of whether or not a Stevia plant has a genetic feature (H) by the dCAPS method.
  • the present invention relates to a Stevia plant having at least one of the following chemical characteristics (1) to (7) (hereinafter, "Plant A of the present invention” or “Stevia plant of the present invention”. (Sometimes collectively referred to as “body A”).
  • Plant A of the present invention or “Stevia plant of the present invention”.
  • body A The content of rebaugioside (Reb) D is 3.6% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of dried leaves.
  • the mass ratio of RebD to the total steviol glycoside is 32.0% or more.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 38.2% or more.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of dried leaves.
  • Total steviol glycoside is a general term for measurable steviol glycosides, and does not contain unknown steviol glycosides or steviol glycosides present in an amount below the detection limit.
  • the TSGs are RebA, RebB, RebC, RebD, RebE, RebF, RebG, RebI, RebJ, RebK, RebM, RebN, RebO, RebQ, RebR, Zulcoside A, Rubusoside, Steviolmonoside, Steviolbioside and Stevioside. Any combination of two or more selected from the group consisting of.
  • the TSG consists of RebA, RebB, RebC, RebD, RebE, RebF, RebG, RebM, RevN and stevioside.
  • the content of RebD is 3.6% or more per unit mass of dried leaves, for example, 3 in a predetermined mass of dried leaves (for example, 50 mg). It means that RebD (for example, 1.8 mg or more) is contained in a proportion of 6.6% by mass or more.
  • the ratio of RebD per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 3.6% or more, 3.7% or more, 3.8% or more, 3.9% or more, 4.0%.
  • the upper limit of the ratio of RebD per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 20%, 15%, 10% or the like.
  • the dried leaf means a leaf having a water content reduced to 3 to 4% by weight by drying the fresh leaf of the Stevia plant of the present invention.
  • the total content of RebD and RebM is 4.9% or more per unit mass of the dry leaf, for example, a dry leaf having a predetermined mass (for example, 50 mg). It means that the total mass of RebD and RebM contained in is 4.9% by mass or more (for example, 2.45 mg or more).
  • the total ratio of RebD and RebM per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 4.9% or more, 5.0% or more, 5.1% or more, 5.2% or more, and the like. 5.3% or more, 5.4% or more, 5.5% or more, 5.6% or more, 5.7% or more, 5.8% or more, 5.9% or more, 6.0% or more, 6.
  • the upper limit of the total ratio of RebD and RebM per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 25%, 20%, 15% or the like.
  • the mass ratio of RebD to TSG is 32.0% or more, for example, the mass of RebD contained in a leaf (for example, dried leaf or fresh leaf).
  • the value of RebD / TSG in this embodiment is not limited, for example, 32.0% or more, 32.2% or more, 32.4% or more, 32.6% or more, 32.8% or more, 33.0% or more.
  • the upper limit of the mass ratio of RebD to TSG is not particularly limited, but may be, for example,
  • the total mass ratio of RebD and RebM to TSG is 38.2% or more, for example, in leaves (for example, dried leaves or fresh leaves).
  • leaves for example, dried leaves or fresh leaves.
  • the value of (RebD + RevM) / TSG is 38.2% or more. It means that there is.
  • the value of (RebD + RevM) / TSG in this embodiment is not limited, and is, for example, 38.2% or more, 38.5% or more, 38.7% or more, 39.0% or more, 39.2% or more, 39.
  • the content of RevN is 1.0% or more per unit mass of dried leaves, for example, 1 in a predetermined mass of dried leaves (for example, 50 mg). It means that RebN (for example, 0.5 mg or more) is contained in a proportion of 0.0% by mass or more.
  • the ratio of RevN per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 1.00% or more, 1.01% or more, 1.02% or more, 1.03% or more, 1.04%.
  • the upper limit of the ratio of RevN per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 15%, 10%, 5% or the like.
  • the total content of RebD and RebN is 4.0% or more per unit mass of dried leaves, for example, a predetermined mass of dried leaves (for example, 50 mg). It means that the total mass of RebD and RebN contained in is 4.0% by mass or more (for example, 2 mg or more).
  • the total ratio of RebD and RebN per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 4.0% or more, 4.1% or more, 4.2% or more, 4.3% or more. 4.4% or more, 4.5% or more, 4.6% or more, 4.7% or more, 4.8% or more, 4.9% or more, 5.0% or more, 5.1% or more, 5.
  • the upper limit of the total ratio of RebD and RebN per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 25%, 20%, 15% or the like.
  • the total content of RebD, RebM and RebN is 4.4% or more per unit mass of the dried leaf, for example, a dry leaf having a predetermined mass (for example, for example). It means that the total mass of RebD, RebM and RebN contained in 50 mg) is 4.4% by mass or more (for example, 2.2 mg or more).
  • the total ratio of RebD, RebM and RebN per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 4.4% or more, 4.5% or more, 4.6% or more, 4.7%.
  • the plant A of the present invention may have a plurality of the above chemical characteristics.
  • the number of chemical features may be any of 2 to 7, ie 2, 3, 4, 5, 6 or 7.
  • the combination of chemical features is not particularly limited and includes, for example, each combination in parentheses below: (1, 2), (1, 3), (1, 4), (1, 5), (1, 6).
  • the present invention is a Stevia plant having at least one of the following genetic characteristics (A) to (G) (hereinafter, "Plant B of the present invention” or “Stevia plant B of the present invention”. May be collectively referred to as).
  • Plant B of the present invention It is heterozygous for an allele (see FIG. 1) in which the base at the position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1 is C.
  • B It is heterozygous for an allele (see FIG. 2) in which the base at the position corresponding to the 21st position of SEQ ID NO: 2 is T.
  • C Heterozygous for alleles (see FIG. 3) where the base at the position corresponding to position 28 of SEQ ID NO: 3 is T.
  • the present invention refers to a Stevia plant having the following genetic characteristics (H) (hereinafter, may be collectively referred to as “the plant D of the present invention” or “the Stevia plant D of the present invention”). offer.
  • H It is heterozygous for the allele (see FIG. 8) in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 130 is C.
  • the "position corresponding to” means a position in the sequence (for example, the 40th position) existing in the genome when the same sequence as the reference sequence (for example, SEQ ID NOs: 1 to 8 etc.) exists in the genome. , 21st, 28th, 59th, 64th, 290th, 33rd, etc.), and if the same sequence as the reference sequence does not exist in the genome, the sequence corresponding to the reference sequence in the genome , Means a position corresponding to a position in the reference sequence. Whether or not a sequence equal to or equivalent to the reference sequence exists in the genome is determined by, for example, amplifying the genomic DNA of the target Stevia plant with a primer capable of amplifying the reference sequence by PCR and sequencing the amplification product.
  • Non-limiting examples of the sequence corresponding to the reference sequence include, for example, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more with respect to the reference sequence.
  • the position corresponding to the position in the reference sequence in the sequence corresponding to the reference sequence in the genome can be determined in consideration of the base sequences before and after the position in the reference sequence. For example, by aligning the reference sequence with the sequence corresponding to the reference sequence in the genome, the position corresponding to the position in the reference sequence in the sequence corresponding to the reference sequence in the genome can be determined.
  • the genome of the Stevia plant has a portion having the same base sequence as SEQ ID NO: 1. If so, the "position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1" is the 40th position from the 5'side of the portion having the same base sequence as SEQ ID NO: 1 in the genome.
  • the genome of the Stevia plant is not the same as SEQ ID NO: 1 but has a portion having a base sequence corresponding to this, the genome does not have a portion having the same base sequence as SEQ ID NO: 1.
  • the "position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1" does not necessarily correspond to the 40th position from the 5'side of the portion corresponding to the SEQ ID NO: 1, but the base sequence before and after the 40th position of the SEQ ID NO: 1 is used. With consideration, it is possible to identify the "position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1" in the genome of such a Stevia plant. For example, by aligning the base sequence of the portion corresponding to SEQ ID NO: 1 in the genome of the Stevia plant with the base sequence of SEQ ID NO: 1, the "position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1" in the genome of the Stevia plant is specified. can do.
  • each position of the above (A) to (G) is referred to as “polymorphic site (A)", “polymorphic site (B)", or “mutant site (A)", “mutant site (B)”, or the like. May be called.
  • the position corresponding to the 40th position of (H) SEQ ID NO: 130 may be referred to as “polymorphism site (H)” or “mutation site (H)”.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1" is, for example, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 1. 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.1% or more, 98.4% or more, 98.7% or more, 99% or more, 99.2% or more, 99.5% or more or 99. It means a portion consisting of a base sequence having 8% or more sequence identity.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1" includes the mutation site (A) from the 5'end to the 39th position of SEQ ID NO: 1 (that is, from the 5'end of SEQ ID NO: 1). ), A forward primer that hybridizes to the complementary sequence of the portion of 1 base (up to the base on the 5'end side), and positions 1 to 163 from the 3'end side of SEQ ID NO: 1 (that is, from the 3'end of SEQ ID NO: 1). It contains a portion of the Stevia plant genome that can be amplified by PCR with a reverse primer that hybridizes to the portion of the mutation site (A) up to the 1st base 3'end side base).
  • the genetic feature (A) of the present invention has been described as an example, but the same applies to the genetic feature (B) to (H) of the present invention.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 2" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 10 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 3" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 12 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 13. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 4" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 14 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 15. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 5" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 17. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 6" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 18 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 19. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 7" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 20 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 21. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 130" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 131 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 132. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 1 is C” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 22, 23, 24 or 25.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 21 of SEQ ID NO: 2 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 26, 27, 28 or 29.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 28 of SEQ ID NO: 3 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 30, 31, 32 or 33.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 59 of SEQ ID NO: 4 is C” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 34, 35, 36 or 37.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 64 of SEQ ID NO: 5 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 38, 39, 40 or 41.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 290 of SEQ ID NO: 6 is C” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 42, 43, 44 or 45.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 33 of SEQ ID NO: 7 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 46, 47, 48 or 49.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 130 is C” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 133, 134, 135 or 136.
  • C to T mutation at position corresponding to position 28 of
  • From the mutation from C to T (F) the mutation from T to C at the position corresponding to position 290 of SEQ ID NO: 6, and (G) the mutation from A to T at the position corresponding to position 33 of SEQ ID NO: 7.
  • Mutations selected from the group may be collectively referred to as “polymorphism of the present invention” or “mutation of the present invention”.
  • each of the above mutations (A) to (G) is referred to as “polymorphism (A) of the present invention”, “polymorphism (B) of the present invention”, or “variation (A) of the present invention", “the present invention”. It may be referred to as “mutation of invention (B)”.
  • the mutation from G to C at the position corresponding to the 40th position of (H) SEQ ID NO: 130 may be referred to as “polymorphism (H) of the present invention” or “mutation (H) of the present invention”.
  • the above genetic features are PCR method, TaqMan PCR method, sequencing method, microarray method, invader method, TILLING method, RAD (random amplified polymorphic DNA) method, restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) method, PCR-SCSP method.
  • AFLP amplified fragment length polymorphism
  • SSLP simple sequence length polymorphism
  • CAPS cleaved amplified polymorphic sequence
  • dCAPS derived cleaved amplified polymorphic sequence
  • ASO allele-specific oligonucleotide
  • ARMS Modifier concentration gradient gel electrophoresis
  • DGGE Modifier concentration gradient gel electrophoresis
  • CCM chemical clairavage of mismatch
  • DOL method MALDI-TOF / MS method
  • TDI method Padlock probe method
  • molecular beacon method DASH (dynamic allele specific hybridization) Method
  • UCAN method ECA method
  • PINPOINT method PROBE (primer oligonucleotide base extension) method
  • VSET very short extension
  • Survivor assay Sniper assay
  • Luminex asset GOOD method
  • LCx method LCx method
  • SNAPshot method Mass ARRAY method. It can be detected by the py
  • the genetic features of the invention can be detected by the dCAPS method with a combination of the following primer sets and restriction enzymes.
  • the candidate plant has the mutation (A)
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 50 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 51. Even if amplification is performed and the obtained PCR product (about 203 bp length, for example, SEQ ID NO: 52) is treated with the restriction enzyme RsaI, only a band with a length of about 203 bp (for example, SEQ ID NO: 52) is obtained.
  • the candidate plant does not have the mutation (A) (the base at the position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1 is T)
  • PCR amplification is performed in the same manner as above, and the obtained PCR product (about 203 bp) is performed.
  • Treatment of the length, eg, SEQ ID NO: 53) with the restriction enzyme RsaI gives a band with a length of about 40 bp (eg, SEQ ID NO: 54) and a band with a length of about 163 bp (eg, SEQ ID NO: 55).
  • FIG. 8 shows an example in which the genetic feature (A) is detected by the above method.
  • Lane 1 has a homozygous Stevia individual for the allele with the mutation (A), and lane 2 has the heterozygous Stevia individual for the allele with the mutation (A) (ie, the genetic feature (A) of the present invention.
  • Individuals) and lane 3 were loaded with samples of homozygous Stevia individual DNA treated with the limiting enzyme RsaI for alleles without mutation (A).
  • lane 2 a band having a length of about 40 bp and a band having a length of about 163 bp decomposed by an enzyme, and a band having a length of about 203 bp not decomposed by an enzyme are observed.
  • the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has the characteristic (A).
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 57.
  • amplification was performed and the resulting PCR product (approximately 364 bp length, eg, SEQ ID NO: 58) was treated with the restriction enzyme AclI, a band approximately 18 bp long (eg, SEQ ID NO: 60) and a band approximately 346 bp long (eg, sequence). The number 61) and is obtained.
  • PCR amplification may be performed in the same manner as described above, and the obtained PCR product (about 364 bp length, for example, SEQ ID NO: 59) may be treated with the restriction enzyme AclI. Only a band with a length of 364 bp (eg, SEQ ID NO: 59) can be obtained.
  • the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has the characteristic (B).
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 62 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 63.
  • amplification was performed and the resulting PCR product (approximately 353 bp long, eg, SEQ ID NO: 64) was treated with the restriction enzyme AluI, a band approximately 19 bp long (eg, SEQ ID NO: 66) and a band approximately 334 bp long (eg, sequence). The number 67) and is obtained.
  • PCR amplification may be performed in the same manner as described above, and the obtained PCR product (about 353 bp length, for example, SEQ ID NO: 65) may be treated with the restriction enzyme AluI. Only a band with a length of 353 bp (eg, SEQ ID NO: 65) can be obtained. Therefore, when the above-mentioned dCAPS method finds a band having a length of about 19 bp and / or a band having a length of about 334 bp derived from a decomposition product and a band having a length of about 353 bp derived from a non-degraded product, the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has the characteristic (C).
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 68 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 69.
  • amplification was performed and the obtained PCR product (approximately 349 bp length, eg, SEQ ID NO: 70) was treated with the restriction enzyme AluI, a band approximately 21 bp long (eg, SEQ ID NO: 72) and a band approximately 328 bp long (eg, sequence). The number 73) and is obtained.
  • PCR amplification may be performed in the same manner as described above, and the obtained PCR product (about 349 bp length, for example, SEQ ID NO: 71) may be treated with the restriction enzyme AluI. Only a band with a length of 349 bp (eg, SEQ ID NO: 71) can be obtained.
  • the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has the characteristic (D).
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 74 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 75.
  • amplification was performed and the obtained PCR product (approximately 349 bp length, eg, SEQ ID NO: 76) was treated with the restriction enzyme AluI, a band approximately 21 bp long (eg, SEQ ID NO: 78) and a band approximately 328 bp long (eg, sequence). The number 79) and is obtained.
  • PCR amplification may be performed in the same manner as described above, and the obtained PCR product (about 349 bp length, for example, SEQ ID NO: 77) may be treated with the restriction enzyme AluI. Only a band with a length of 349 bp (eg, SEQ ID NO: 77) can be obtained.
  • the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has a characteristic (E).
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 80 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 81. Even if amplification is performed and the obtained PCR product (about 326 bp length, for example, SEQ ID NO: 82) is treated with the restriction enzyme RsaI, only a band with a length of about 326 bp (for example, SEQ ID NO: 82) is obtained.
  • the candidate plant does not have the mutation (F) (the base at the position corresponding to position 290 of SEQ ID NO: 6 is T)
  • PCR amplification is performed in the same manner as above, and the obtained PCR product (about 326 bp) is performed.
  • Treatment of the length, eg, SEQ ID NO: 83) with the restriction enzyme RsaI gives a band with a length of about 290 bp (eg, SEQ ID NO: 84) and a band with a length of about 36 bp (eg, SEQ ID NO: 85).
  • the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has a characteristic (F).
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 86 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 87. Even if amplification is performed and the obtained PCR product (about 196 bp length, for example, SEQ ID NO: 88) is treated with the restriction enzyme MseI, only a band with a length of about 196 bp (for example, SEQ ID NO: 88) is obtained.
  • the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has a characteristic (G).
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 137 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 138.
  • amplification was performed and the obtained PCR product (about 500 bp long, eg, SEQ ID NO: 139) was treated with the restriction enzyme EcoRV, a band with a length of about 37 bp (eg, SEQ ID NO: 141) and a band with a length of about 463 bp (eg, a sequence) were treated. The number 142) and is obtained.
  • PCR amplification may be performed in the same manner as described above, and the obtained PCR product (about 500 bp length, for example, SEQ ID NO: 140) may be treated with the restriction enzyme EcoRV. Only a band with a length of 500 bp (eg, SEQ ID NO: 140) can be obtained. Therefore, when the above-mentioned dCAPS method finds a band having a length of about 37 bp and / or a band having a length of about 463 bp derived from a decomposition product and a band having a length of about 500 bp derived from a non-degraded product, the inheritance of the present invention has been observed. It can be determined that it has a characteristic (H). With respect to the bp length, "about” means ⁇ 5 bp.
  • the restriction enzyme treatment can be performed according to the conditions recommended by the distributor of each restriction enzyme to be used.
  • the plant B of the present invention may have a plurality of the above-mentioned genetic features (A) to (G).
  • the number of genetic features may be any of 2 to 7, ie 2, 3, 4, 5, 6 or 7.
  • the combination of genetic features is not particularly limited and includes, for example, each combination in parentheses below: (A, B), (A, C), (A, D), (A, E), (A, F).
  • the plant D of the present invention may further have a plurality of the above-mentioned genetic features (A) to (G).
  • the number of genetic features may be any of 2-8, ie 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
  • the combination of genetic features is not particularly limited and includes, for example, each combination in parentheses below: (A, H), (B, H), (C, H), (D, H), (E, H).
  • the mutation sites (A) to (E) of the present invention are in a state of linkage disequilibrium because their positions on the genome are close to each other within 173 bp. Therefore, if the plant B of the present invention has any of the genetic features (A) to (E), it tends to have other genetic features (A) to (E) as well. be.
  • the presence of the genetic features (A) to (H) of the present invention is highly related to the presence of the chemical features (1) to (7) of the present invention. Therefore, a Stevia plant having at least one of the genetic characteristics (A) to (H) of the present invention is likely to have the chemical characteristics (1) to (7) of the present invention, and the present invention has a high possibility of having the chemical characteristics (1) to (7). It is also possible to screen Stevia plants having at least one of the chemical characteristics (1) to (7) of the present invention using at least one of the genetic characteristics (A) to (H) as an index.
  • the present invention is a Stevia plant having at least one of the chemical characteristics (1) to (7) and at least one of the genetic characteristics (A) to (G) (hereinafter, "the present invention".
  • Plant C or “Stevia plant C of the present invention” may be collectively referred to).
  • the plant C of the present invention has at least one of the chemical features (1)-(7) and at least one of the genetic features (A)-(E).
  • the plant C of the present invention has at least one of the chemical features (1)-(7) and the genetic feature (F).
  • the plant C of the present invention has at least one of the chemical features (1)-(7) and the genetic feature (G).
  • the plant C of the present invention comprises at least one of the chemical features (1)-(7), at least one of the genetic features (A)-(E), and the genetic feature (F).
  • the plant C of the present invention comprises at least one of the chemical features (1)-(7), at least one of the genetic features (A)-(E), and the genetic feature (G).
  • the plant C of the present invention comprises at least one of the chemical features (1)-(7), at least one of the genetic features (A)-(E), the genetic features (F) and (G) and.
  • the plants A to C of the present invention may be collectively referred to as "plants of the present invention".
  • the present invention is a Stevia plant having at least one of the chemical characteristics (1) to (7) and a genetic characteristic (H) (hereinafter, "plant E of the present invention” or “the present invention”.
  • the Stevia plant E of the invention may be collectively referred to).
  • the plant E of the present invention may further have at least one of the genetic features (A) to (G).
  • the plant E of the present invention comprises at least one of the chemical features (1)-(7), the genetic feature (H), and at least one of the genetic features (A)-(E). It has a heredity.
  • the plant C of the present invention has at least one of the chemical features (1)-(7), a genetic feature (H), and a genetic feature (F).
  • the plant C of the present invention has at least one of the chemical features (1)-(7), a genetic feature (H), and a genetic feature (G).
  • the plant E of the present invention comprises at least one of the chemical features (1)-(7), the genetic feature (H), and at least one of the genetic features (A)-(E). , Has genetic characteristics (F).
  • the plant E of the present invention comprises at least one of the chemical features (1)-(7), the genetic feature (H), and at least one of the genetic features (A)-(E). , With genetic characteristics (G).
  • the plant E of the present invention comprises at least one of the chemical features (1)-(7), the genetic feature (H), and at least one of the genetic features (A)-(E). , With genetic features (F) and (G).
  • Steviol glycosides such as RebD, RebM and RebN react with a suitable solvent (aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone) on the fresh or dried leaves of the plants A to E of the present invention.
  • a suitable solvent aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • it can be extracted in the state of an extract.
  • aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • ethyl acetate and other organic solvents water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass analysis (Time-).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • time-of-flight mass analysis time-of-flight mass analysis
  • Purify individual steviol glycosides, such as RebD and M, by using known methods such as of-Flight mass spectrometry (TOF-MS), Ultra (High) Performance Liquid Chromatography (UPLC), etc. can do.
  • the content of steviol glycosides such as RebD, RebM, and RebN can be measured by the method described in Ohta et al. Or WO2010 / 038911 described above, or by the method described in Examples described later. Specifically, for example, fresh leaves can be sampled from the Stevia plants A to E of the present invention and measured by performing LC-MS / MS.
  • the plants A to E of the present invention may be obtained by a genetically recombinant method or their progeny (hereinafter, may be referred to as "genetically recombinant plant"), but may be a non-genetically recombinant method. It may be the one obtained by the above-mentioned plant or its progeny (hereinafter, may be referred to as "non-genetically recombinant plant”).
  • Examples of the "non-genetically recombinant method” include a method of inducing a mutation in a gene of a host cell (or a host plant) without introducing a foreign gene, in addition to crossing and self-fertilization.
  • Examples of such a method include a method in which a mutagen of plant cells is allowed to act.
  • mutagens include ethyl methanesulfonic acid (EMS) and sodium azide.
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • sodium azide ethyl methanesulfonic acid
  • Plant cells can be treated at a concentration such as 1.0%.
  • the processing time is 1 to 48 hours, 2 to 36 hours, 3 to 30 hours, 4 to 28 hours, 5 to 26 hours, and 6 to 24 hours.
  • the treatment procedure itself it can be carried out by immersing the water-absorbing seeds that have undergone the water absorption process in a treatment solution containing a mutagen at the above concentration for the above treatment time.
  • a method of irradiating plant cells with radiation such as X-rays, ⁇ -rays, and ultraviolet rays or light rays can be used.
  • cells irradiated with an appropriate ultraviolet irradiation amount can be cultured in a selective medium or the like, and then cells, curls, or plants having the desired trait can be selected. ..
  • the irradiation intensity at that time was 0.01 to 100 Gr, 0.03 to 75 Gr, 0.05 to 50 Gr, 0.07 to 25 Gr, 0.09 to 20 Gr, 0.1 to 15 Gr, 0.1 to 10 Gr, 0.
  • the irradiation distance is 1 cm to 200 m, 5 cm to 100 m, 7 cm to 75 m, 9 cm to 50 m, 10 cm to 30 m, 10 cm to 20 m, 10 cm to 10 m, and the irradiation time is 1 minute to 2 minutes.
  • the intensity, distance and time of irradiation vary depending on the radiation type and the state to be irradiated (cells, curls, plants), but can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • plant cells may be mutated during culture, so it is preferable to return them to individual plants for more stable trait maintenance.
  • Gene recombination using the plants A to E of the present invention as a host and a plant obtained by performing gene recombination (for example, by genome editing or the like) ex post facto for example, using the plants A to E of the present invention as a host. Plants to which another trait has been added) are not excluded from the scope of the present invention.
  • the plants A to E of the present invention include not only the whole plant but also plant organs (for example, leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.) and plant tissues (for example, epidermis, phloem, soft tissue, wood, tube bundle). , Phloem tissue, spongy tissue, etc.) or various forms of plant cells (eg, suspended cultured cells), protoplasts, leaf sections, callus, etc. may be included.
  • the leaves may be dry leaves.
  • plants A to E of the present invention may also contain tissue cultures or plant culture cells. This is because plants can be regenerated by culturing such tissue cultures or plant culture cells. Examples of reproducible forms of plants A to E of the present invention include embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections and callus. Not limited.
  • the present invention comprises a step of crossing a Stevia plant of the present invention with a second Stevia plant, according to chemical features (1) to (7).
  • a method for producing a Stevia plant having at least one hereinafter, may be referred to as “method A for producing the present invention”.
  • the Stevia plant produced by this method may have the same phenotype and genetic characteristics as the plant of the present invention.
  • the present invention also has at least one of the chemical characteristics (1) to (7), which comprises, in another embodiment, the step of crossing the Stevia plant D or E of the present invention with the second Stevia plant.
  • a method for producing a Stevia plant hereinafter, may be referred to as “method B for producing the present invention”.
  • the Stevia plant produced by this method may have the same phenotype and genetic characteristics as the plant D or E of the present invention.
  • the amount of RebD with respect to the amount of TSG, the range of the ratio of the total amount of RebD and RebM, the combination of each feature (chemical feature and / or genetic feature), etc. are as described above for the plant of the present invention.
  • crossing means that any one of the plants A to E of the present invention (first generation (S1)) and the second plant body (S1) are used. By mating, it means to obtain a child plant body (a plant body (second generation (S2)) produced by the production method of the present invention).
  • a crossing method return crossing is preferable.
  • a hybrid plant (S2) born between the plant of the present invention and the second plant, and further the plant of the present invention (that is, a plant having the genetic characteristics of the present invention) (. It is a method of producing a plant having the genetic characteristics of the present invention by crossing with S1).
  • the second plant (S1) used in the production method of the present invention has the same expression as the plant of the present invention. If it has a type and genetic characteristics, it is substantially a return cross. It is preferable that the crossing is carried out for two or more generations, but if the genetic characteristics are heterozygous, the desired inheritance is carried out in one generation. Plants with a combination of characteristics may be obtained.
  • the plants A to E of the present invention can be produced by self-fertilization.
  • Self-propagation can be carried out by self-pollinating the pollen of the stamens of the plant of the present invention to the pistils of the plants A to E of the present invention.
  • the plant produced by the production method of the present invention has the same phenotype and genetic characteristics as the plant of the present invention, the plant produced by the production method of the present invention is further referred to as a third Stevia plant. It is also possible to produce a Stevia plant having a phenotype equivalent to that of the plant of the present invention by crossing with.
  • the plants A to E of the present invention can also be produced by regenerating the plant body by culturing the tissue culture or the plant culture cell described above.
  • the culture conditions are the same as those for culturing wild-type stevia plant tissue cultures or plant culture cells, and are known (Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vol. 1391, pp113-123).
  • the plant of the present invention can be produced by introducing the mutation of the present invention into the genome of the Stevia plant.
  • the Stevia plant having at least one of the plants D to E and the chemical characteristics (1) to (7) of the present invention is to introduce the mutation (H) of the present invention into the genome of the Stevia plant. It is also possible to create with.
  • the introduction of the mutation may be carried out by a genetically recombinant method or a non-genetically recombinant method.
  • the non-genetically modified method is as described above for the plant body of the present invention.
  • a plant of the present invention and a plant having the same phenotype and / or genetic characteristics as the plant of the present invention detect the genetic characteristics of the present invention from the tissue of the plant. This can be screened.
  • screening means distinguishing between a plant of the present invention and a plant other than the present, and selecting the plant of the present invention. Accordingly, the invention screens Stevia plants, comprising the step of detecting, in another aspect, the presence and / or absence of at least one of the genetic features (A)-(G) of the invention from the genome of the test plant. (Hereinafter, it may be referred to as "screening method A of the present invention").
  • the genetic feature to be detected is at least one of the genetic feature (A) to (E) (particularly the genetic feature (A)).
  • the genetic feature to be detected is the genetic feature (F).
  • the genetic feature to be detected is the genetic feature (G).
  • the genetic feature to be detected is at least one of the genetic feature (A)-(E) and the genetic feature (F).
  • the genetic feature to be detected is at least one of the genetic feature (A)-(E) and the genetic feature (G).
  • the genetic features to be detected are the genetic feature (F) and the genetic feature (G).
  • the genetic features to be detected are the genetic features (A), (F) and (G).
  • the mutations related to the genetic characteristics (A) to (E) are in a state of linkage disequilibrium, the remaining genetic characteristics can be detected by detecting any one of these genetic characteristics. It is possible to estimate the existence or nonexistence of.
  • the invention comprises a step of detecting the presence and / or absence of a genetic feature (H) from the genome of a test Stevia plant, a stevia plant having a genetic feature (H) or a chemical.
  • a method for screening a Stevia plant having at least one of the characteristics (1) to (7) hereinafter, may be referred to as “screening method B of the present invention”.
  • the genetic feature to be detected is the genetic feature (H). In some embodiments, the genetic feature to be detected is at least one of the genetic features (A)-(E) and the genetic feature (H). In some embodiments, the genetic features to be detected are the genetic feature (F) and the genetic feature (H). In some embodiments, the genetic features to be detected are the genetic feature (G) and the genetic feature (H). In some embodiments, the genetic feature to be detected is at least one of the genetic feature (A)-(E), the genetic feature (F), and the genetic feature (H). In some embodiments, the genetic feature to be detected is at least one of the genetic feature (A)-(E), the genetic feature (G), and the genetic feature (H).
  • the genetic features to be detected are the genetic feature (F), the genetic feature (G), and the genetic feature (H). In some embodiments, the genetic features to be detected are the genetic features (A), (F), (G) and (H).
  • the screening methods A to B of the present invention may further include a step of selecting a plant in which the presence of at least one of the above genetic features is detected from among the test plants.
  • genetic features of the invention is, for example, (I) An allele in which the base corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 22, 23, 24 or 25, hereinafter may be referred to as "allele a”. ) And an allele in which the base corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 1 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 1, 92, 93 or 94, hereinafter may be referred to as "allele A”.
  • SEQ ID NO: 7 is T
  • SEQ ID NO: 46, 47, 48 or 49 hereinafter
  • allerg g an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 46, 47, 48 or 49
  • A for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 7, 110, 111 or 112, hereinafter, It can be determined by detecting the presence of both (sometimes referred to as "allergen G").
  • the existence of the genetic feature (H) of the present invention is, for example, an allele in which the base corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 130 is C (for example, the base sequence of SEQ ID NO: 133, 134, 135 or 136).
  • An allele containing the allele (hereinafter, may be referred to as "allele h") and an allele in which the base corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 130 is G (for example, the base sequence of SEQ ID NO: 130, 143, 144 or 145). It can be determined by detecting the presence of both an allele containing, hereinafter sometimes referred to as "allele H").
  • the absence of genetic features of the invention is, for example, (I) Existence of only one of allele A or allele a, (Ii) Existence of only one of allele B or allele b, (Iii) Existence of only one of allele C or allele c, (Iv) Existence of only one of allele D or allele d, (V) Existence of only one of allele E or allele e, It can be determined by detecting the presence of only one of (vi) allele F or allele f and / or the presence of only one of (vi) allele G or allele g. Further, the absence of the genetic feature (H) of the present invention can be determined, for example, by detecting the presence of only one of allele H and allele h.
  • Specific examples of the method for detecting genetic features of the present invention include PCR method, TaqMan PCR method, sequencing method, microarray method, invader method, TILLING method, RAD method, RFLP method, PCR-SSCP method, AFLP method, and SSLP method.
  • a primer such that the 3'end portion has a sequence complementary to any one of the mutation sites (A) to (H) of the present invention.
  • the primer designed in this way when the sample to be a template has the above-mentioned mutation, the primer completely hybridizes to the template, so that the polymerase extension reaction proceeds, but when the template does not have the above-mentioned mutation. Since the nucleotide at the 3'end of the primer mismatches with the template, no extension reaction occurs.
  • the amplification product is analyzed by agarose gel electrophoresis or the like, and an amplification product of a predetermined size can be confirmed, the sample template has a mutation. If the amplification product is absent, it can be determined that the template does not have a mutation.
  • the primer sequence is designed so that the mutation sites (A) to (H) of the present invention do not overlap with the primer sequence and the mutation site can be PCR amplified, and the base of the amplified nucleotide fragment is used. By sequencing the sequence, the genetic features (A)-(H) of the present invention can be detected.
  • PCR and agarose gel electrophoresis see: Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the TaqMan PCR method is a method that utilizes a fluorescently labeled allele-specific oligo and a PCR reaction with Taq DNA polymerase (Livak, KJ Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. . Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)).
  • the sequencing method is a method of analyzing the presence or absence of mutation by amplifying the region containing the mutation by PCR and sequencing the DNA sequence using Dye Terminator or the like (Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning:". A Laboratory Manual ”2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • a DNA microarray is one in which one end of a nucleotide probe is fixed in an array on a support, and includes a DNA chip, a Gene chip, a microchip, a bead array, and the like.
  • a probe containing a sequence complementary to the mutation sites (A) to (H) of the present invention By using a probe containing a sequence complementary to the mutation sites (A) to (H) of the present invention, the presence or absence of the mutations (A) to (H) of the present invention can be comprehensively detected.
  • DNA microarray assays such as DNA chips include GeneChip assays (see Affymetrix; US Pat. Nos. 6,045,996, 5,925,525, and 5,858,659). GeneChip technology utilizes a miniaturized, high-density microarray of oligonucleotide probes attached to the chip.
  • the invader method is a special end in which two types of reporter probes specific to each allele of a mutation such as SNP and one type of invader probe are hybridized to the template DNA, and the structure of the DNA is recognized and cleaved.
  • a combination of DNA cleavage by a Cleavase enzyme with nuclease activity (Livak, KJ Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 ( 1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993), etc.).
  • the TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) method is a method for screening mutation mismatches in the genome of a mutant population into which a mutation has been introduced by PCR amplification and CEL I nuclease treatment.
  • the genetic feature (A) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set Complementary to a forward primer containing a contiguous sequence 15-39 bases long from the 3'end of SEQ ID NO: 50 and any contiguous 15 or more bases sequence located 3'from position 41 of SEQ ID NO: 1 or 22
  • a primer set containing a reverse primer comprising a single sequence eg, SEQ ID NO: 51
  • a forward primer comprising a contiguous sequence 15-20 bases long from the 3'end of SEQ ID NO: 113 or 114 and SEQ ID NO: 115 or
  • a primer set comprising a reverse primer containing a sequence complementary to any contiguous sequence of 15 or more bases located 3'from position 22 of 116 (eg, SEQ ID NO: 117).
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 50 contains RsaI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 113 contains Tsp45I, and the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 114 contains AciI.
  • the genetic feature (B) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing a contiguous sequence 15-20 bases long from the 3'end of SEQ ID NO: 56, 118 or 119 and any contiguous 15 or more bases located 3'from position 22 of SEQ ID NO: 2 or 26.
  • a primer set comprising a reverse primer comprising a sequence complementary to the sequence (eg, SEQ ID NO: 57).
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 56 contains AclI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 118 contains AluI, and the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 119 contains PacI.
  • the genetic feature (C) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing a contiguous sequence 15-20 bases long from the 3'end of SEQ ID NO: 62, 120 or 121 and any contiguous 15 or more bases located 3'from position 22 of SEQ ID NO: 64 or 65.
  • a primer set comprising a reverse primer comprising a sequence complementary to the sequence (eg, SEQ ID NO: 63).
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 62 contains AluI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 120 contains BglI, and the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 121 contains ScaI.
  • the genetic feature (D) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing a contiguous sequence 15-21 bases long from the 3'end of SEQ ID NO: 68, 122 or 123, and any contiguous 15 or more bases located 3'from position 23 of SEQ ID NO: 70 or 71.
  • a primer set comprising a reverse primer comprising a sequence complementary to the sequence (eg, SEQ ID NO: 69).
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 62 contains AluI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 122 contains MboI, and the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 123 contains BglII.
  • the genetic feature (E) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing a contiguous sequence 15-22 bases long from the 3'end of SEQ ID NO: 74, 124 or 125 and any contiguous 15 or more bases located 3'from position 24 of SEQ ID NO: 76 or 77.
  • a primer set comprising a reverse primer comprising a sequence complementary to the sequence (eg, SEQ ID NO: 75).
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 74 contains AluI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 124 contains MboI, and the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 125 contains BglII.
  • the genetic feature (F) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing any contiguous 15 or more base sequence (eg, SEQ ID NO: 80) located 5'from position 289 of SEQ ID NO: 6 or 42 and 15 from the 3'end of SEQ ID NO: 81, 126 or 127.
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 81 contains RsaI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 126 contains SnaI, and the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 127 contains AluI.
  • the genetic feature (G) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing a contiguous sequence 15-32 bases long from the 3'end of the sequence selected from SEQ ID NOs: 86, 128 and 129, and any contiguous sequence located 3'from position 34 of SEQ ID NO: 88 or 89.
  • a primer set containing a reverse primer containing a sequence complementary to a sequence of 15 or more bases eg, SEQ ID NO: 87).
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 86 contains MseI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 128 contains NlaIII, and the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 129 contains Tsp45I.
  • the genetic feature (H) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing a contiguous sequence 15-39 bases long from the 3'end of the sequence selected from SEQ ID NOs: 137, 146, 147 and 148, and any located 3'from position 41 of SEQ ID NO: 130 or 133.
  • a primer set comprising a reverse primer comprising a sequence complementary to a sequence of 15 or more consecutive bases (eg, SEQ ID NO: 138).
  • Restriction enzymes The restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 137 is EcoRV, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 146 is BaeI, the restriction enzyme corresponding to the primer set based on SEQ ID NO: 147 is BclI, Ksp22I or FbaI, and the sequence. Restriction enzymes corresponding to the primer set based on No. 148 include HindII, HincII, MjaIV or Hpy166II, respectively.
  • the primer sequence can be optimized within the range that satisfies the above conditions.
  • optimization of primer design refer to, for example, Sambrook and Russell, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.
  • Each of the above primers may have a length of 15 to 50 bases, a length of 18 to 48 bases, a length of 20 to 45 bases, a length of 30 to 40 bases, or the like.
  • Restriction enzymes corresponding to each primer set also include other enzymes that recognize the same sequence as the above enzyme and cleave the same site, or isoschizomers of the above enzymes. It is also possible to design a primer set other than the above based on the genetic characteristics of the present invention and select a restriction enzyme corresponding to the primer set.
  • the genetic features (A)-(G) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using a primer set having the following sequence and a restriction enzyme.
  • the genetic feature (H) of the present invention can be detected, for example, by the dCAPS method using a primer set having the following sequence and a restriction enzyme.
  • a primer set having the following sequence and a restriction enzyme can be detected, for example, by the dCAPS method using a primer set having the following sequence and a restriction enzyme.
  • the combination of the above primer set and the restriction enzyme is only an example, and a person skilled in the art can find a combination of another primer set and the restriction enzyme capable of detecting the genetic feature of the present invention.
  • the content of RebD, RebM and / or RebN in the tissue (for example, leaves) of the test Stevia plant in which at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention is detected. May further include the step of measuring. Measurements of RebD, RebM or RebN content are as described in the Plant section of the invention. Further, in this embodiment, among the test Stevia plants in which at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention is detected, an individual having a high content of RebD, RevM and / or RevN is selected. , This may be crossed with another Stevia plant, and the screening methods A to B of the present invention may be applied to the obtained offspring.
  • the screening methods A to B of the present invention may include one or more of the following steps.
  • (I) A step of detecting at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention from the genome of a test Stevia plant.
  • (Ii) A step of measuring the content of RevD, RevM and / or RevN in a test Stevia plant tissue in which at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention is detected.
  • (Iv) Mating an individual with a high content of selected RevD, RevM and / or RevN with another Stevia plant,
  • (V) A step of detecting at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention from the genome of a child plant obtained by mating.
  • (Vi) A step of measuring the content of RevD, RevM and / or RevN in a child plant tissue in which at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention is detected.
  • (Vii) A step of selecting an individual having a high content of RebD, RebM and / or RebN from among the seedlings in which at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention is detected.
  • Individuals with a high content of RebD, RebM and / or RebN to be selected are, for example, among the test Stevia plants in which at least one of the genetic features (A) to (H) of the present invention is detected, RebD, RebM and / or RebM. / Or regarding the high content of RevN, up to the top 50%, up to the top 40%, up to the top 30%, up to the top 20%, up to the top 10%, up to the top 5%, up to the top 4%, up to the top 3%, It may be an individual up to the top 2% or the top 1%.
  • other Stevia plants to be crossed may or may not contain the genetic features (A) to (H) of the present invention.
  • the steps (iv) to (vii) can be repeated a plurality of times. In this way, Stevia plants with higher contents of RebD, RebM and / or RebN can be screened.
  • the test Stevia plant may be a natural plant or a non-genetically recombinant plant.
  • the non-genetically modified plant is as described in the section of the plant of the present invention.
  • the test Stevia plant may include the Stevia plant subjected to the mutagenesis treatment and its progeny plants.
  • the induction of the mutation is as described in the section of the plant body of the present invention, and includes treatment with a mutagen, treatment with radiation or light irradiation, and the like.
  • the present invention also includes the primer sets and combinations thereof described above, for example, the primer sets shown in Tables 1 to 8 above, and combinations of these primer sets, for example, SEQ ID NO: 50 shown in Table 1.
  • Table 1 includes a primer set of a forward primer containing SEQ ID NO: 51 and a reverse primer containing SEQ ID NO: 51, and a combination of a primer set of a forward primer containing SEQ ID NO: 80 and a reverse primer containing SEQ ID NO: 81 shown in Table 6.
  • a combination of at least one primer set described in each of 8 to 8 is provided.
  • the present invention further relates to a primer set capable of amplifying a region having a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 130 and 133 by PCR.
  • a primer set containing a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 8 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9, a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 10, and a reverse containing the base sequence of SEQ ID NO: 11.
  • Primer set with primer primer, primer set with forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 12, reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 13, forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 14, and base of SEQ ID NO: 15.
  • a primer set with a reverse primer containing a sequence a primer set with a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 16 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 17, a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 18, and a sequence.
  • a primer set of a primer and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 132 is provided.
  • the present invention provides a probe (hereinafter, may be referred to as "probe of the present invention") capable of detecting the presence and / or absence of a genetic feature of the present invention.
  • the probe of the present invention may have a structure suitable for various detection methods (for example, real-time PCR method such as TaqMan PCR method) in which the genetic features of the present invention are present and / or absent.
  • the probe of the present invention may contain a base sequence having complementarity to a portion of the genome containing the mutation site of the present invention.
  • Non-limiting examples of such probes are complementary to a base sequence selected from SEQ ID NOs: 23-25, 27-29, 31-33, 35-37, 39-41, 43-45, 47-49, 92-112.
  • SEQ ID NOs: 23-25, 27-29, 31-33, 35-37, 39-41, 43-45, 47-49 are specific for alleles containing the mutations of the present invention and are sequences. Numbers 92-112 are specific for alleles that do not contain the mutations of the invention. Further, SEQ ID NOs: 23 to 25 are specific to allele a, SEQ ID NOs: 27 to 29 are specific to allele b, SEQ ID NOs: 31 to 33 are specific to allele c, and SEQ ID NOs: 35 to 37 are specific to allele c.
  • SEQ ID NOs: 39 to 41 are specific to allele d
  • SEQ ID NOs: 43 to 45 are specific to allele f
  • SEQ ID NOs: 47 to 49 are specific to allele g.
  • SEQ ID NOs: 92 to 94 are specific to allele A
  • SEQ ID NOs: 95 to 97 are specific to allele B
  • SEQ ID NOs: 98 to 100 are specific to allele C
  • SEQ ID NOs: 101 to 103 are specific.
  • Allele D is specific
  • SEQ ID NOs: 104 to 106 are specific to Allele E
  • SEQ ID NOs: 107 to 109 are specific to Allele F
  • SEQ ID NOs: 110 to 112 are specific to Allele G.
  • the presence of the genetic features of the invention can be detected by detection of both alleles containing the mutations of the invention and alleles not containing the mutations of the invention, and the absence of the genetic features of the invention is the absence of the genetic features of the invention. It can be detected by detecting only alleles containing mutations or detecting only alleles not containing mutations of the present invention.
  • the probe of the present invention preferably has a label. Non-limiting examples of such labels include fluorescent labels, luminescent labels, radioactive labels, dyes, enzymes, quenchers, binding moieties with detectable labels, and the like.
  • the probe of the present invention has a base sequence selected from SEQ ID NOs: 23-25, 27-29, 31-33, 35-37, 39-41, 43-45, 47-49, 92-112. It has a polynucleotide containing a base sequence complementary to the above and a label.
  • the present invention provides a probe (hereinafter, may be referred to as "probe H of the present invention") capable of detecting the presence and / or absence of the genetic feature (H) of the present invention.
  • the probe (H) of the present invention may have a structure suitable for various detection methods (for example, real-time PCR method such as TaqMan PCR method) in which the genetic feature (H) of the present invention is present and / or is absent.
  • the probe (H) of the present invention may contain a base sequence having complementarity to a portion of the genome containing the mutation site (H) of the present invention.
  • Non-limiting examples of such probes include those containing a sequence complementary to the base sequence selected from SEQ ID NOs: 134 to 136 and 143 to 145.
  • SEQ ID NOs: SEQ ID NOs: are specific for alleles comprising the mutation (H) of the present invention
  • SEQ ID NOs: 143 to 145 are specific for alleles containing no mutation (H) of the present invention.
  • those containing a sequence complementary to the base sequence selected from SEQ ID NOs: 134 to 136 and 143 to 145 can be mentioned. This is specific to allele h
  • SEQ ID NOs: 143 to 145 are specific to allele H.
  • the presence of the genetic feature (H) of the present invention can be detected by detection of both the allele containing the mutation (H) of the present invention and the allele not containing the mutation (H) of the present invention, and the inheritance of the present invention can be detected.
  • the absence of the characteristic feature (H) can be detected by detecting only the allele containing the mutation (H) of the present invention or detecting only the allele containing the mutation (H) of the present invention.
  • the probe H of the present invention preferably has a label.
  • the probe of the invention comprises a polynucleotide comprising a base sequence complementary to a base sequence selected from SEQ ID NOs: 134-136, 143-145, and a label.
  • the present invention further provides a kit comprising the above primer set and a corresponding restriction enzyme.
  • the kit of the invention comprises the primer sets set forth in Tables 1-8 above and the corresponding restriction enzymes.
  • the present invention is also a primer set capable of amplifying a region having a base sequence selected from the group consisting of the above SEQ ID NOs: 1 to 7, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 130 and 133 by PCR. And the corresponding probe of the present invention are provided.
  • primer sets, probes and kits can be used for detecting the genetic features (A) to (H) of the present invention, and can be used for the screening methods A to B of the present invention.
  • these primer sets and kits include instructions including the detection of the genetic features (A) to (H) of the present invention and explanations of the screening methods A to B of the present invention, such as instructions for use and use.
  • Includes site information eg, URL, 2D code
  • media recording information about usage eg, flexible discs, CDs, DVDs, Blu-ray discs, memory cards, USB memory
  • the invention provides a screening kit for Stevia plants of the invention, comprising a reagent for detecting the presence and / or absence of at least one of the genetic features (A)-(G).
  • Reagents may include primers and / or probes used in the CAPS, dCAPS or TaqMan PCR methods.
  • the reagent for detecting the presence and / or absence of at least one of the genetic features (A) to (G) dCAPS at least one of the above genetic features (A) to (G).
  • a combination of a primer set and a restriction enzyme for detection by a method for example, a combination of a primer set and a restriction enzyme shown in Tables 1 to 7, or a mutation site of the present invention that can be used in the TaqMan PCR method or the like.
  • a primer set for amplifying for example, a site containing a sequence selected from SEQ ID NOs: 22 to 49
  • a site related to at least one of the genetic features (A) to (G) for example, SEQ ID NOs: 23 to 25
  • Includes a combination with a probe having a complementary base sequence site containing a sequence selected from 27-29, 31-33, 35-37, 39-41, 43-45, 47-49).
  • the invention provides a screening kit for Stevia plant D or E of the invention, comprising a reagent for detecting the presence and / or absence of genetic feature (H).
  • Reagents may include primers and / or probes used in the CAPS, dCAPS or TaqMan PCR methods.
  • the reagent for detecting the presence and / or absence of the genetic feature (H) is a combination of a primer set and a restriction enzyme for detecting the genetic feature (H) by the dCAPS method.
  • a combination of the primer set shown in Table 8 and a restriction enzyme, or a sequence selected from the mutation site (H) of the present invention (for example, SEQ ID NOs: 133 to 136) that can be used in the TaqMan PCR method or the like.
  • a method for producing a plant-derived extract and a product using the extract In a further aspect of the present invention, the plant body of the present invention, the Stevia plant selected by the screening method A of the present invention, or the production method A of the present invention is used. Contains RebD, RebM and / or RebN, comprising the step of obtaining an extract from the produced Stevia plant or seeds, leaves (eg, dried or fresh leaves), tissues, tissue cultures or cells of the plant.
  • a method for producing an extract (hereinafter, may be referred to as "method A for producing an extract of the present invention") is provided.
  • the plant of the present invention the stevia plant selected by the screening method A of the present invention, the stevia plant produced by the production method A of the present invention, or the seeds, leaves (for example, dried leaves or) of the plant.
  • An extract containing RebD, RevM and / or RebN from a tissue, tissue culture or cell (hereinafter sometimes referred to as "Extract A of the present invention") is provided.
  • the extract A of the present invention is preferably produced by the method A for producing the extract of the present invention.
  • a method for producing RebD, RevM and / or RevN which comprises a step of purifying RevD, RevM and / or RebN from the extract A of the present invention (hereinafter, "method A for producing a steviol glycoside of the present invention"). May be referred to as) is provided.
  • the method A for producing a steviol glycoside of the present invention is RebD, RebM from a plant of the present invention, a stevia plant selected by the screening method A of the present invention, or a stevia plant produced by the production method A of the present invention. And / or may further include the step of obtaining an extract containing RevN.
  • the plants D to E of the present invention the Stevia plant selected by the screening method B of the present invention, the Stevia plant produced by the production method B of the present invention, or the seeds of the plant.
  • a method for producing an extract containing RebD, RevM and / or RebN which comprises the step of obtaining an extract from a leaf (eg, dried or fresh leaf), tissue, tissue culture or cell (hereinafter, “the present invention”. (Sometimes referred to as "method B for producing an extract”) is provided.
  • the plants D to E of the present invention the Stevia plants selected by the screening method B of the present invention, the Stevia plants produced by the production method B of the present invention, or the seeds and leaves of the plants (for example, An extract containing RebD, RevM and / or RebN from tissues, tissue cultures or cells (hereinafter sometimes referred to as "extract B of the present invention") is provided.
  • the extract B of the present invention is preferably produced by the method B for producing the extract of the present invention.
  • a method for producing RebD, RevM and / or RevN which comprises a step of purifying RevD, RevM and / or RebN from the extract B of the present invention (hereinafter, "method B for producing a steviol glycoside of the present invention”).
  • the method B for producing a steviol glycoside of the present invention is derived from the plants D to E of the present invention, the stevia plant selected by the screening method B of the present invention, or the stevia plant produced by the production method B of the present invention. Further may include the step of obtaining an extract containing RebD, RebM and / or RebN.
  • the extract containing RebD, RebM and / or RebN reacts with a suitable solvent (aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone) on the fresh or dried leaves of the plants A to E of the present invention. It can be obtained by letting it.
  • a suitable solvent aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • Extracts containing RebD, RebM and / or RebN are also subjected to ethyl acetate and other organic solvents: water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass analysis (Time-).
  • RebD, RevM and / or RebN can be purified by using known methods such as of-Flight mass spectrometry (TOF-MS), Ultra (High) Performance Liquid Chromatography (UPLC), etc. ..
  • the extracts A to B of the present invention contain higher contents of RebD, RebM and / or RebN as compared with Stevia species having none of the genetic features (A) to (H) of the present invention.
  • the extracts A to B of the present invention have about 50 RebD, RebM and / or RebN as compared to the extracts obtained from Stevia plants having none of the genetic features (A) to (H) of the present invention.
  • % Or more about 100% or more, about 150% or more, about 200% or more, about 250% or more, about 300% or more, about 350% or more, about 400% or more, about 450% or more, about 500% or more, about 550.
  • % Or more about 600% or more, about 650% or more, about 700% or more, about 750% or more, about 800% or more, about 850% or more, about 900% or more, about 950% or more, about 1000% or more, about 1050. % Or more, about 1100% or more, about 1150% or more, about 1200% or more, about 1250% or more, about 1300% or more, about 1350% or more, about 1400% or more, about 1450% or more, about 1500% or more, about 1550.
  • the extracts A to B of the present invention and the extracts obtained from Stevia plants having neither of the genetic features (A) to (H) of the present invention were obtained by the same method. May be.
  • RebD, RebM and / or RebN obtained by the extracts A to B and / or the methods A to B for producing the steviol glycoside of the present invention thus obtained are mixed with other components. Allows the production of novel foods and drinks, sweetening compositions, flavors or pharmaceuticals with increased contents of RebD, RebM and / or RebN. Therefore, another embodiment of the present invention is RebD, RebM and / or RebN and other components obtained by the extracts A to B of the present invention and / or the methods A to B for producing the steviol glycoside of the present invention.
  • a method for producing a food or drink, a sweetening composition, a fragrance or a pharmaceutical product which comprises a step of mixing with.
  • the present invention provides novel foods and drinks, sweetening compositions, flavors or pharmaceuticals obtained by the above-mentioned production method and having an increased content of RebD, RevM and / or RevN.
  • food and drink include beverages and foods.
  • the present invention provides a novel beverage, food, sweetening composition, flavor or pharmaceutical, and also provides a method for producing the beverage, food, sweetening composition, flavor or pharmaceutical.
  • the present invention provides, in another embodiment, the nucleotide sequence of the plant of the present invention.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (A) includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 22 to 25.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (B) includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 26 to 29.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (C) includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 30 to 33.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (D) includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 34 to 37.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (E) includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 38 to 41.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (F) contains or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 42 to 45.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (G) includes or consists of the base sequence selected from SEQ ID NOs: 46 to 49.
  • the base sequence relating to the Stevia plant having the genetic feature (H) includes or consists of a base sequence selected from SEQ ID NOs: 133 to 136.
  • Example 1 Preparation of high RebD Stevia plant 1.
  • test line Wild-type Stevia seeds (commercially available varieties) were treated with ethyl methanesulfonic acid (EMS) and sown and cultivated in the greenhouse in the Suntory World Research Center.
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • An appropriate amount of fresh leaves were sampled from each grown individual, and the concentration of RebD was quantified by LC-MS / MS (Shimadzu LCMS8050). Specifically, 0.25 g of fresh leaves were dried by freeze-drying, and 0.05 g of the crushed dried product was put into 100 times the amount (5 mL) of pure water.
  • Example 2 Detection of genetic features peculiar to high RebD Stevia plants (1) Genomic DNA was extracted from the fresh leaves of some of the individuals tested in Example 1 and analyzed for genetic characteristics peculiar to high RebD Stevia plants using a sequencer (HiSeq 2500, Illumina). As a result, there was a tendency for genetic features (A) to (G) to be detected in strains with a high RebD content. Therefore, in order to streamline the detection of genetic features, dCAPS primers for detecting genetic features (A), (F) and (G) were prepared, and the presence or absence of these genetic features was dCAPS for the remaining individuals. Evaluated by law.
  • each genetic feature was detected as follows. First, genomic DNA was extracted from the fresh leaves of each individual tested in Example 1, PCR was performed using the above dCAPS primer corresponding to each genetic feature, and the PCR product was subjected to the above restriction enzyme corresponding to each genetic feature. Was added, and an enzymatic reaction was carried out at 37 ° C.
  • the microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT (PerkinElmer) was used to perform electrophoresis of the restriction enzyme-treated product, and the presence or absence of genetic features was determined based on the obtained band pattern.
  • the strains having the genetic characteristics of the present invention not only have a high RebD content (average about 4.46%, maximum 6.28%), but also the total content of RebD and RevM (average about about 4.46%). 5.71%, maximum 7.81%), mass ratio of RebD to TSG (average about 31.28%, maximum 39.70%), total mass ratio of RebD to RebM to TSG (average about 40.15%, Up to 49.47%), RebN content (mean about 0.90%, up to 1.23%), total content of RebD and RebN (mean about 5.36%, up to 7.39%) and RebD, RebM and RebN The total content (average about 6.61%, maximum 8.91%) also tended to be high.
  • Example 3 Detection of genetic features peculiar to high RebD Stevia plants (2) Genomic DNA was extracted from fresh leaves of individuals of the S4 generation strain different from those tested in Example 1, and genetic characteristics peculiar to high RebD Stevia plants were analyzed by a sequencer (HiSeq 2500, Illumina). .. As a result, there was a tendency for genetic characteristics (H) to be detected in strains with a high RebD content. Therefore, in order to improve the efficiency of the detection of the genetic feature, a dCAPS primer for detecting the genetic feature (H) was prepared, and the presence or absence of the genetic feature (H) was evaluated for the remaining individuals by the dCAPS method. In addition, the concentration of steviol glycoside was quantified in the same manner as in Example 1.
  • dCAPS primers and restriction enzymes were used.
  • Forward primer AATCAGTCCAATTTAAACGTGCTCTACTTACAGAGATAT (SEQ ID NO: 137)
  • Reverse primer CACTTCTCTTCATCAGAGTAACTCAATTC (SEQ ID NO: 138)
  • Restriction enzyme EcoRV The detection of each genetic feature by the dCAPS method was performed as follows. First, genomic DNA was extracted from the fresh leaves of the S4 generation strain, PCR was performed using the dCAPS primer, the restriction enzyme was added to the PCR product, and an enzymatic reaction was performed at 37 ° C.
  • the restriction enzyme-treated product was electrophoresed using a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT (PerkinElmer), and the presence or absence of genetic features (H) was determined based on the obtained band pattern. Specifically, since the genetic feature (H) is heterozygous, individuals with both degradation product and non-degradable bands have genetic feature (H) ( ⁇ ) and are degraded or non-degraded. Individuals in which only one of the degradation products was observed were judged to have no genetic characteristics (H) (x). In addition, the presence or absence of genetic features (A) and (F) was also evaluated for the same individual in the same manner as in Example 2.
  • steviol glycoside properties related to other chemical characteristics ie, RebD content, mass ratio of RebD to TSG, total mass ratio of RebD to RebM to TSG, RebN content, total content of RebD and RebN, and RebD.
  • the total content of RebM and RebN was also superior in the population having the genetic characteristics (H) to the population having the genetic characteristics (A) and (F).
  • the present invention makes it possible to more efficiently provide useful steviol glycosides such as RebD, it is possible to provide high-quality foods and drinks, sweetening compositions, flavors or pharmaceuticals containing such steviol glycosides. Can be promoted.

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Abstract

本発明は、既知のステビア種と比べレバウジオシドＤ等の有用なステビオール配糖体をより高い含量で含むステビア植物体を提供する。本発明はまた、そのようなステビア植物体を作出する方法、そのような植物体から得られる乾燥葉や抽出物も提供する。

Description

高レバウジオシドＤ含有ステビア植物
　本発明は、レバウジオシドＤ等の有用なステビオール配糖体の含有量が高いステビア植物及びそのスクリーニング方法等に関する。
　多様化する消費者ニーズに対応すべく、様々な飲料が開発され、市販されている。ショ糖等の糖類は、甘味を与える等の目的で飲料にごく普通に配合される成分であるが、過剰摂取による健康への影響が指摘されてきており、より低カロリーであり、かつ天然由来の甘味料に対するニーズが高まりつつある。例えば特許文献１は、ビタミン、高甘味度甘味料、及び甘味改善組成物を含有する機能性甘味料組成物を開示している。
　ステビオール配糖体は、ステビア抽出物に含まれる甘味成分として知られている。ステビア抽出物は、主にステビアの葉から抽出、精製される。ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Stevia Rebaudiana Bertoni）という。ステビアは砂糖の約３００倍以上の甘味を持つ成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。ステビオール配糖体としては、レバウジオシドＡ（Rebaudioside A、以下「レバウジオシド」（Rebaudioside）を「Ｒｅｂ」と略すことがある）、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ等、様々な配糖体の存在が報告されている（特許文献２）。様々なステビオール配糖体の中で、例えばＲｅｂＡは、高甘味度と良質甘味を有する甘味料として評価されており、広く用いられている。その他のステビオール配糖体についても、その独自の甘さ及び付随する味を有することが判明しつつある。
　そのような状況において、ＲｅｂＤを乾燥葉あたり３．５７％含むステビア植物体が知られている（特許文献３）。
ＷＯ２００７／０７０２２４ ＷＯ２０１０／０３８９１１ ＷＯ２０１９／０７４０８９
　ＲｅｂＤはステビオール配糖体の中では味質が良いとされているが、天然のステビア植物体からは多くを得ることができず、その入手が問題とされている。
　本発明は、野生型ステビア種と比べて高含有量でＲｅｂＤ等の有用なステビオール配糖体を含むステビア植物体並びに当該植物体の作出方法及びスクリーニング方法を提供する。
　一態様において、本発明は以下を提供する。

［１－１］　以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体。
（１）レバウジオシド（Ｒｅｂ）Ｄの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
［１－２］
　以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つを有する、［１－１］に記載の植物体。
（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
［１－３］
　以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つを有するステビア植物体。
（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。

（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
［１－４］
　非遺伝子組換植物体である、［１－１］～［１－３］のいずれか一項に記載の植物体。［１－５］
　変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［１－１］～［１－４］のいずれか一項に記載の植物体。

［１－６］　［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞。

［１－７］　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［１－６］に記載の組織、組織培養物又は細胞。

［１－８］　［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体を作出する方法。
（１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。

［１－９］　第２の植物体が［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載の植物体である、［１－８］に記載の方法。

［１－１０］　ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを含む、［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載の植物体、［１－６］又は［１－７］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物。

［１－１１］　［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載の植物体、［１－６］又は［１－７］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを含む抽出物の製造方法。

［１－１２］　［１－１０］に記載の抽出物からＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを精製する工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの製造方法。

［１－１３］　［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載の植物体の抽出物、［１－６］又は［１－７］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物、或いは、［１－１０］に記載の抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法。

［１－１４］　被験ステビア植物体のゲノムから、以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程を含む、［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載のステビア植物体をスクリーニングする方法。
（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。

（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
［１－１５］
　遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、［１－１４］に記載の方法。
［１－１６］　被験ステビア植物組織のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量を測定する工程をさらに含む、［１－１４］又は［１－１５］に記載の方法。

［１－１７］
　以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載のステビア植物体のスクリーニングキット。（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。

（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
［１－１８］
　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、［１－１７］に記載のキット。［１－１９］
　以下の（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの変異を導入する工程を含む、［１－１］～［１－５］のいずれか一項に記載のステビア植物体を作出する方法。
（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置におけるＴからＣへの変異。
（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置におけるＡからＴへの変異。
（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置におけるＣからＴへの変異。
（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置におけるＡからＣへの変異。
（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置におけるＣからＴへの変異。
（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置におけるＴからＣへの変異。
（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置におけるＡからＴへの変異。
［１－２０］
　変異の導入が、変異誘発処理によって行われる、［１－１９］に記載の方法。
［２－１］
　以下の遺伝的特徴（Ｈ）を有するステビア植物体。

（Ｈ）配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
［２－２］　以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有する［２－１］に記載の植物体。
（１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。

（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
［２－３］
　非遺伝子組換植物体である、［２－１］又は［２－２］に記載の植物体。［２－４］
　変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［２－１］～［２－３］のいずれか一項に記載の植物体。

［２－５］　［２－１］～［２－４］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞。

［２－６］　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［２－５］に記載の組織、組織培養物又は細胞。

［２－７］　［２－１］～［２－４］のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体を作出する方法。
（１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。

［２－８］　第２の植物体が［２－１］～［２－４］のいずれか一項に記載の植物体である、［２－７］に記載の方法。

［２－９］　ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを含む、［２－１］～［２－４］のいずれか一項に記載の植物体、［２－５］又は［２－６］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物。

［２－１０］　［２－１］～［２－４］のいずれか一項に記載の植物体、［２－５］又は［２－６］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを含む抽出物の製造方法。

［２－１１］　［２－９］に記載の抽出物からＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを精製する工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの製造方法。

［２－１２］　［２－１］～［２－４］のいずれか一項に記載の植物体の抽出物、［２－５］又は［２－６］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物、或いは、［２－９］に記載の抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法。

［２－１３］
　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体をスクリーニングする方法。（１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。

［２－１４］
　遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、［２－１３］に記載の方法。
［２－１５］　被験ステビア植物組織のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量を測定する工程をさらに含む、［２－１３］又は［２－１４］に記載の方法。

［２－１６］
　配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体のスクリーニングキット。（１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。

（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
［２－１７］
　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、［２－１６］に記載のキット。［２－１８］

　配列番号１３０の４０位に相当する位置におけるＧからＣへの変異を導入する工程を含む、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体を作出する方法。（１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
［２－１９］
　変異の導入が、変異誘発処理によって行われる、［２－１８］に記載の方法。
　本発明によって、有用なステビオール配糖体をより多く含むステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる葉、この葉より得られた有用なステビオール配糖体を含む食物や飲料等の提供が可能になる。
図１は、配列番号２２の塩基配列における、変異（Ａ）の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ａ）に係る塩基である。 図２は、配列番号２６の塩基配列における、変異（Ｂ）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ｂ）に係る塩基である。 図３は、配列番号３０の塩基配列における、変異（Ｃ）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ｃ）に係る塩基である。 図４は、配列番号３４の塩基配列における、変異（Ｄ）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ｄ）に係る塩基である。 図５は、配列番号３８の塩基配列における、変異（Ｅ）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ｅ）に係る塩基である。 図６は、配列番号４２の塩基配列における、変異（Ｆ）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ｆ）に係る塩基である。 図７は、配列番号４６の塩基配列における、変異（Ｇ）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ｇ）に係る塩基である。 図８は、配列番号１３３の塩基配列における、変異（Ｈ）に係る塩基の位置を示した図である。枠で囲った塩基が変異（Ｈ）に係る塩基である。 図９は、ステビア植物体が遺伝的特徴（Ａ）を有するか否かをｄＣＡＰＳ法で分析した結果を示した図である。レーン１は変異（Ａ）を有するアレルについてホモ接合性の個体、レーン２は変異（Ａ）を有するアレルについてヘテロ接合性の個体、レーン３は変異（Ａ）を有しないアレルについてホモ接合性の個体のＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで処理したサンプルの電気泳動像をそれぞれ示す。 図１０は、ステビア植物体が遺伝的特徴（Ｈ）を有するか否かをｄＣＡＰＳ法で分析した結果を示した図である。各個体のＤＮＡを配列番号１３７のフォワードプライマーと配列番号１３８のリバースプライマーで増幅後、制限酵素EcoRVで処理したサンプルの電気泳動像を示す。バンドが１本のレーンは、変異（Ｈ）を有しないアレルについてホモ接合性の個体（G/G）、バンドが２本のレーンは、変異（Ｈ）を有するアレルについてヘテロ接合性の個体（C/G）である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０２０年５月１２日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０２０－０８４１２６号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．ステビア植物体
　一態様において、本発明は、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体（以下、「本発明の植物体Ａ」又は「本発明のステビア植物体Ａ」と総称する場合がある）を提供する。
（１）レバウジオシド（Ｒｅｂ）Ｄの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
（２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
（３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
（５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
（６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
（７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
　総ステビオール配糖体（Total Steviol Glycoside：ＴＳＧ）とは、測定可能なステビオール配糖体の総称であり、未知のステビオール配糖体や、検出限界未満の量で存在するステビオール配糖体を含まない。好ましくは、ＴＳＧは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群より選択される２つ以上の任意の組み合わせである。特定の態様において、ＴＳＧは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びステビオシドからなる。
　化学的特徴（１）を有する本発明の植物体Ａにおいて、ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上とは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、３．６質量％以上の割合のＲｅｂＤ（例えば、１．８ｍｇ以上）が含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合は、限定されずに、例えば、３．６％以上、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上、６．１％以上、６．２％以上、６．３％以上等であってよく、４．０％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％等であってよい。
　ここで乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を３～４重量％にまで減らしたものをいう。
　化学的特徴（２）を有する本発明の植物体Ａにおいて、ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上とは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計質量が、４．９質量％以上（例えば、２．４５ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の割合は、限定されずに、例えば、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上、６．１％以上、６．２％以上、６．３％以上、６．４％以上、６．５％以上、６．６％以上、６．７％以上、６．８％以上、６．９％以上、７．０％以上、７．１％以上、７．２％以上、７．３％以上、７．４％以上、７．５％以上、７．６％以上、７．７％以上、７．８％以上、７．９％以上等であってよく、５．４％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計の割合の上限は特に限定されないが、例えば、２５％、２０％、１５％等であってよい。
　化学的特徴（３）を有する本発明の植物体Ａにおいて、ＴＳＧに対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上であるとは、例えば葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれるＲｅｂＤの質量を、葉から得られたステビオール配糖体の総質量に対する比率としてＲｅｂＤ／ＴＳＧ％で表した場合、ＲｅｂＤ／ＴＳＧの値が３２．０％以上であることを意味する。この態様におけるＲｅｂＤ／ＴＳＧの値は、限定されずに、例えば、３２．０％以上、３２．２％以上、３２．４％以上、３２．６％以上、３２．８％以上、３３．０％以上、３３．２％以上、３３．４％以上、３３．６％以上、３３．８％以上、３４．０％以上、３４．２％以上、３４．４％以上、３４．６％以上、３４．８％以上、３５．０％以上、３５．２％以上、３５．４％以上、３５．６％以上、３５．８％以上、３６．０％以上、３６．２％以上、３６．４％以上、３６．６％以上、３６．８％以上、３７．０％以上、３７．２％以上、３７．４％以上、３７．６％以上、３７．８％以上、３８．０％以上、３８．２％以上、３８．４％以上、３８．６％以上、３８．８％以上、３９．０％以上、３９．２％以上、３９．４％以上、３９．６％以上、３９．８％以上、４０．０％以上等であってよく、３４．０％以上が好ましい。ＴＳＧに対するＲｅｂＤの質量比の上限は特に限定されないが、例えば、８５％、７５％、６５％、５５％等であってよい。
　化学的特徴（４）を有する本発明の植物体Ａにおいて、ＴＳＧに対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計質量比が合計で３８．２％以上であるとは、例えば葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計質量を、葉から得られたステビオール配糖体の総質量に対する比率として(ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ)／ＴＳＧ％で表した場合、(ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ)／ＴＳＧの値が３８．２％以上であることを意味する。この態様における(ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ)／ＴＳＧの値は、限定されずに、例えば、３８．２％以上、３８．５％以上、３８．７％以上、３９．０％以上、３９．２％以上、３９．５％以上、３９．７％以上、４０．０％以上、４０．２％以上、４０．５％以上、４０．７％以上、４１．０％以上、４１．２％以上、４１．５％以上、４１．７％以上、４２．０％以上、４２．２％以上、４２．５％以上、４２．７％以上、４３．０％以上、４３．２％以上、４３．５％以上、４３．７％以上、４４．０％以上、４４．２％以上、４４．５％以上、４４．７％以上、４５．０％以上、４５．２％以上、４５．５％以上、４５．７％以上、４６．０％以上、４６．２％以上、４６．５％以上、４６．７％以上、４７．０％以上、４７．２％以上、４７．５％以上、４７．７％以上、４８．０％以上、４８．２％以上、４８．５％以上、４８．７％以上、４９．０％以上、４９．２％以上、４９．５％以上等であってよく、３９．２％以上が好ましい。ＴＳＧに対するＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭの質量比の上限は特に限定されないが、例えば、８５％、７５％、６５％、５５％等であってよい。
　化学的特徴（５）を有する本発明の植物体Ａにおいて、ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上とは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、１．０質量％以上の割合のＲｅｂＮ（例えば、０．５ｍｇ以上）が含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＮの割合は、限定されずに、例えば、１．００％以上、１．０１％以上、１．０２％以上、１．０３％以上、１．０４％以上、１．０５％以上、１．０６％以上、１．０７％以上、１．０８％以上、１．０９％以上、１．１０％以上、１．１１％以上、１．１２％以上、１．１３％以上、１．１４％以上、１．１５％以上、１．１６％以上、１．１７％以上、１．１８％以上、１．１９％以上、１．２０％以上、１．２１％以上、１．２２％以上、１．２３％以上、１．２４％以上、１．２５％以上等であってよく、１．１０％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＮの割合の上限は特に限定されないが、例えば、１５％、１０％、５％等であってよい。
　化学的特徴（６）を有する本発明の植物体Ａにおいて、ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上とは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＮとの合計質量が、４．０質量％以上（例えば、２ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計の割合は、限定されずに、例えば、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上、６．１％以上、６．２％以上、６．３％以上、６．４％以上、６．５％以上、６．６％以上、６．７％以上、６．８％以上、６．９％以上、７．０％以上、７．１％以上、７．２％以上、７．３％以上、７．４％以上、７．５％以上等であってよく、５．２％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＮとの合計の割合の上限は特に限定されないが、例えば、２５％、２０％、１５％等であってよい。
　化学的特徴（７）を有する本発明の植物体Ａにおいて、ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上とは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮとの合計質量が、４．４質量％以上（例えば、２．２ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計の割合は、限定されずに、例えば、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上、６．１％以上、６．２％以上、６．３％以上、６．４％以上、６．５％以上、６．６％以上、６．７％以上、６．８％以上、６．９％以上、７．０％以上、７．１％以上、７．２％以上、７．３％以上、７．４％以上、７．５％以上、７．６％以上、７．７％以上、７．８％以上、７．９％以上、８．０％以上、８．１％以上、８．２％以上、８．３％以上、８．４％以上、８．５％以上、８．６％以上、８．７％以上、８．８％以上、８．９％以上、９．０％以上等であってよく、６．３％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮとの合計の割合の上限は特に限定されないが、例えば、２５％、２０％、１５％等であってよい。
　一部の態様において、本発明の植物体Ａは、上記の化学的特徴を複数有していてもよい。この態様において、化学的特徴の数は２～７種のいずれか、すなわち、２、３、４、５、６又は７種であってよい。化学的特徴の組合せは特に限定されず、例えば以下の括弧内の各組合せを含む：（１、２）、（１、３）、（１、４）、（１、５）、（１、６）、（１、７）、（２、３）、（２、４）、（２、５）、（２、６）、（２、７）、（３、４）、（３、５）、（３、６）、（３、７）、（４、５）、（４、６）、（４、７）、（５、６）、（５、７）、（６、７）、（１、２、３）、（１、２、４）、（１、２、５）、（１、２、６）、（１、２、７）、（１、３、４）、（１、３、５）、（１、３、６）、（１、３、７）、（１、４、５）、（１、４、６）、（１、４、７）、（１、５、６）、（１、５、７）、（１、６、７）、（２、３、４）、（２、３、５）、（２、３、６）、（２、３、７）、（２、４、５）、（２、４、６）、（２、４、７）、（２、５、６）、（２、５、７）、（２、６、７）、（３、４、５）、（３、４、６）、（３、４、７）、（３、５、６）、（３、５、７）、（３、６、７）、（４、５、６）、（４、５、７）、（４、６、７）、（５、６、７）、（１、２、３、４）、（１、２、３、５）、（１、２、３、６）、（１、２、３、７）、（１、２、４、５）、（１、２、４、６）、（１、２、４、７）、（１、２、５、６）、（１、２、５、７）、（１、２、６、７）、（１、３、４、５）、（１、３、４、６）、（１、３、４、７）、（１、３、５、６）、（１、３、５、７）、（３、６、７）、（４、５、６）、（４、５、７）、（４、６、７）、（５、６、７）、（２、３、４、５）、（２、３、４、６）、（２、３、４、７）、（２、３、５、６）、（２、３、５、７）、（２、３、６、７）、（２、４、５、６）、（２、４、５、７）、（２、４、６、７）、（２、５、６、７）、（３、４、５、６）、（３、４、５、７）、（３、４、６、７）、（３、５、６、７）、（４、５、６、７）、（１、２、３、４、５）、（１、２、３、４、６）、（１、２、３、４、７）、（１、２、３、５、６）、（１、２、３、５、７）、（１、２、３、６、７）、（１、２、４、５、６）、（１、２、４、５、７）、（１、２、４、６、７）、（１、２、５、６、７）、（１、３、４、５、６）、（１、３、４、５、７）、（１、３、４、６、７）、（１、３、５、６、７）、（１、４、５、６、７）、（２、３、４、５、６）、（２、３、４、５、７）、（２、３、４、６、７）、（２、３、５、６、７）、（２、４、５、６、７）、（３、４、５、６、７）、（１、２、３、４、５、６）、（１、２、３、４、５、７）、（１、２、３、４、６、７）、（１、２、３、５、６、７）、（１、２、４、５、６、７）、（１、３、４、５、６、７）、（２、３、４、５、６、７）及び（１、２、３、４、５、６、７）。上記において、例えば（１、２）は化学的特徴（１）と化学的特徴（２）の組合せを意味する。
　一態様において、本発明は、以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つを有するステビア植物体（以下、「本発明の植物体Ｂ」又は「本発明のステビア植物体Ｂ」と総称する場合がある）を提供する。
（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（図１参照）についてヘテロ接合性である。
（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（図２参照）についてヘテロ接合性である。
（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（図３参照）についてヘテロ接合性である。
（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（図４参照）についてヘテロ接合性である。
（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（図５参照）についてヘテロ接合性である。
（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（図６参照）についてヘテロ接合性である。
（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（図７参照）についてヘテロ接合性である。
　一態様において、本発明は、以下の遺伝的特徴（Ｈ）を有するステビア植物体（以下、「本発明の植物体Ｄ」又は「本発明のステビア植物体Ｄ」と総称する場合がある）を提供する。

（Ｈ）配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（図８参照）についてヘテロ接合性である。
　「～に相当する位置」とは、ゲノム中に基準配列（例えば、配列番号１～８等）と同一の配列が存在する場合は、ゲノム中に存在するその配列中の位置（例えば、４０位、２１位、２８位、５９位、６４位、２９０位、３３位等）を意味し、ゲノム中に基準配列と同一の配列が存在しない場合は、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置に相当する位置を意味する。ゲノム中に基準配列と同一又はそれに相当する配列が存在するかどうかは、例えば、基準配列をＰＣＲで増幅し得るプライマーで、対象となるステビア植物のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物のシーケンシングを行い、得られた配列と基準配列とのアラインメント解析を行うことで決定することができる。基準配列に相当する配列の非限定例としては、例えば、基準配列に対し６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置に相当する位置は、基準配列中の位置の前後の塩基配列等を考慮して決定することができる。例えば、基準配列とゲノム中の基準配列に相当する配列とのアライメント解析により、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置に相当する位置を決定することができる。
　例えば、本発明の遺伝的特徴（Ａ）の「配列番号１の４０位に相当する位置」を例にとると、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有している場合、「配列番号１の４０位に相当する位置」はゲノム中の配列番号１と同一の塩基配列からなる部分の５’側から４０位である。一方、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一ではないがこれに相当する塩基配列からなる部分を有している場合、ゲノムは配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、「配列番号１の４０位に相当する位置」は、必ずしも配列番号１に相当する部分の５’側から４０位に該当するわけではないが、配列番号１の４０位の前後の塩基配列等を考慮し、かかるステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の４０位に相当する位置」を特定することができる。例えば、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１に相当する部分の塩基配列と、配列番号１の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の４０位に相当する位置」を特定することができる。
　ここで、（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置、（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置、（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置、（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置、（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置、（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置、及び（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置からなる群から選択される位置を、「本発明の多型部位」又は「本発明の変異部位」と総称することがある。また、上記（Ａ）～（Ｇ）の各位置を、「多型部位（Ａ）」、「多型部位（Ｂ）」、又は「変異部位（Ａ）」、「変異部位（Ｂ）」などと称することがある。さらに、（Ｈ）配列番号１３０の４０位に相当する位置を「多型部位（Ｈ）」又は「変異部位（Ｈ）」と称することがある。
　「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」は、例えば、配列番号１の塩基配列に対し、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる部分を意味する。
　一部の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、配列番号１の５’末端から１～３９位（すなわち、配列番号１の５’末端から、変異部位（Ａ）の１塩基５’末端側の塩基まで）の部分の相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマーと、配列番号１の３’末端側から１～１６３位（すなわち、配列番号１の３’末端から、変異部位（Ａ）の１塩基３’末端側の塩基まで）の部分にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。
　ここでは簡潔のため本発明の遺伝的特徴（Ａ）を例に説明したが、本発明の遺伝的特徴（Ｂ）～（Ｈ）についても同様である。
　特定の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号８の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号２に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１０の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号３に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１２の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号４に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１４の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号５に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１６の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１７の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号６に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１８の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１９の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号７に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号２０の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号１３０に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１３１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１３２の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号２２、２３、２４又は２５の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２６、２７、２８又は２９の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号３０、３１、３２又は３３の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号３４、３５、３６又は３７の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号３８、３９、４０又は４１の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号４２、４３、４４又は４５の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号４６、４７、４８又は４９の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号１３３、１３４、１３５又は１３６の塩基配列を含む。
　また、（Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置におけるＴからＣへの変異、（Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置におけるＡからＴへの変異、（Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置におけるＣからＴへの変異、（Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置におけるＡからＣへの変異、（Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置におけるＣからＴへの変異、（Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置におけるＴからＣへの変異、及び（Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置におけるＡからＴへの変異からなる群から選択される変異を、「本発明の多型」又は「本発明の変異」と総称することがある。また、上記（Ａ）～（Ｇ）の各変異を、「本発明の多型（Ａ）」、「本発明の多型（Ｂ）」、又は「本発明の変異（Ａ）」、「本発明の変異（Ｂ）」などと称することがある。さらに、（Ｈ）配列番号１３０の４０位に相当する位置におけるＧからＣへの変異を「本発明の多型（Ｈ）」、又は「本発明の変異（Ｈ）」と称することがある。
　上記の遺伝的特徴は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシーケンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴は、以下のプライマーセット及び制限酵素の組合せによるｄＣＡＰＳ法で検出することが可能である。
　候補植物体が変異（Ａ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２０３ｂｐ長、例えば、配列番号５２）を制限酵素ＲｓａＩで処理しても約２０３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５２）しか得られない。一方、候補植物体が変異（Ａ）を有しない（配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＴである）場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２０３ｂｐ長、例えば、配列番号５３）を制限酵素ＲｓａＩで処理すると、約４０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５４）と約１６３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５５）が得られる。上記手法により遺伝的特徴（Ａ）を検出した例を図８に示す。レーン１には変異（Ａ）を有するアレルについてホモ接合性のステビア個体、レーン２には変異（Ａ）を有するアレルについてヘテロ接合性のステビア個体（すなわち本発明の遺伝的特徴（Ａ）を有する個体）、レーン３には変異（Ａ）を有しないアレルについてホモ接合性のステビア個体のＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで処理したサンプルをそれぞれ負荷した。レーン２には、酵素により分解された約４０ｂｐ長のバンドと約１６３ｂｐ長のバンド、及び、酵素により分解されなかった約２０３ｂｐ長のバンドが認められる。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約４０ｂｐ長のバンド及び／または約１６３ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約２０３ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ａ）を有すると決定することができる。
　候補植物体が変異（Ｂ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５６に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５７に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３６４ｂｐ長、例えば、配列番号５８）を制限酵素ＡｃｌＩで処理すると、約１８ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号６０）と約３４６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号６１）とが得られる。一方、候補植物体が変異（Ｂ）を有しない場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３６４ｂｐ長、例えば、配列番号５９）を制限酵素ＡｃｌＩで処理しても約３６４ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５９）しか得られない。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約１８ｂｐ長のバンド及び／または約３４６ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約３６４ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ｂ）を有すると決定することができる。
　候補植物体が変異（Ｃ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６２に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６３に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３５３ｂｐ長、例えば、配列番号６４）を制限酵素ＡｌｕＩで処理すると、約１９ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号６６）と約３３４ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号６７）とが得られる。一方、候補植物体が変異（Ｃ）を有しない場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３５３ｂｐ長、例えば、配列番号６５）を制限酵素ＡｌｕＩで処理しても約３５３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号６５）しか得られない。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約１９ｂｐ長のバンド及び／または約３３４ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約３５３ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ｃ）を有すると決定することができる。
　候補植物体が変異（Ｄ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６８に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６９に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３４９ｂｐ長、例えば、配列番号７０）を制限酵素ＡｌｕＩで処理すると、約２１ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号７２）と約３２８ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号７３）とが得られる。一方、候補植物体が変異（Ｄ）を有しない場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３４９ｂｐ長、例えば、配列番号７１）を制限酵素ＡｌｕＩで処理しても約３４９ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号７１）しか得られない。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約２１ｂｐ長のバンド及び／または約３２８ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約３４９ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ｄ）を有すると決定することができる。
　候補植物体が変異（Ｅ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号７４に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号７５に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３４９ｂｐ長、例えば、配列番号７６）を制限酵素ＡｌｕＩで処理すると、約２１ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号７８）と約３２８ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号７９）とが得られる。一方、候補植物体が変異（Ｅ）を有しない場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３４９ｂｐ長、例えば、配列番号７７）を制限酵素ＡｌｕＩで処理しても約３４９ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号７７）しか得られない。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約２１ｂｐ長のバンド及び／または約３２８ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約３４９ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ｅ）を有すると決定することができる。
　候補植物体が変異（Ｆ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号８０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号８１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３２６ｂｐ長、例えば、配列番号８２）を制限酵素ＲｓａＩで処理しても約３２６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号８２）しか得られない。一方、候補植物体が変異（Ｆ）を有しない（配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＴである）場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３２６ｂｐ長、例えば、配列番号８３）を制限酵素ＲｓａＩで処理すると、約２９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号８４）と約３６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号８５）とが得られる。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約３６ｂｐ長のバンド及び／または約２９０ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約３２６ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ｆ）を有すると決定することができる。
　候補植物体が変異（Ｇ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号８６に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号８７に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約１９６ｂｐ長、例えば、配列番号８８）を制限酵素ＭｓｅＩで処理しても約１９６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号８８）しか得られない。一方、候補植物体が変異（Ｇ）を有しない（配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＡである）場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約１９６ｂｐ長、例えば、配列番号８９）を制限酵素ＭｓｅＩで処理すると、約３０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号９０）と約１６６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号９１）とが得られる。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約３０ｂｐ長のバンド及び／または約１６６ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約１９６ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ｇ）を有すると決定することができる。
　候補植物体が変異（Ｈ）を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号１３７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１３８に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約５００ｂｐ長、例えば、配列番号１３９）を制限酵素ＥｃｏＲＶで処理すると、約３７ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号１４１）と約４６３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号１４２）とが得られる。一方、候補植物体が変異（Ｈ）を有しない場合、上記と同様にＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約５００ｂｐ長、例えば、配列番号１４０）を制限酵素ＥｃｏＲＶで処理しても約５００ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号１４０）しか得られない。したがって、上記のｄＣＡＰＳ法により、分解物に由来する約３７ｂｐ長のバンド及び／または約４６３ｂｐ長のバンドと、非分解物に由来する約５００ｂｐ長のバンドとが認められた場合、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）を有すると決定することができる。
　上記ｂｐ長に関し、「約」とは、±５ｂｐを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
　一部の態様において、本発明の植物体Ｂは、上記の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）を複数有していてもよい。この態様において、遺伝的特徴の数は２～７種のいずれか、すなわち、２、３、４、５、６又は７種であってよい。遺伝的特徴の組合せは特に限定されず、例えば以下の括弧内の各組合せを含む：（Ａ、Ｂ）、（Ａ、Ｃ）、（Ａ、Ｄ）、（Ａ、Ｅ）、（Ａ、Ｆ）、（Ａ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ）、（Ｂ、Ｄ）、（Ｂ、Ｅ）、（Ｂ、Ｆ）、（Ｂ、Ｇ）、（Ｃ、Ｄ）、（Ｃ、Ｅ）、（Ｃ、Ｆ）、（Ｃ、Ｇ）、（Ｄ、Ｅ）、（Ｄ、Ｆ）、（Ｄ、Ｇ）、（Ｅ、Ｆ）、（Ｅ、Ｇ）、（Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ）、（Ａ、Ｂ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ）、（Ａ、Ｃ、Ｆ）、（Ａ、Ｃ、Ｇ）、（Ａ、Ｄ、Ｅ）、（Ａ、Ｄ、Ｆ）、（Ａ、Ｄ、Ｇ）、（Ａ、Ｅ、Ｆ）、（Ａ、Ｅ、Ｇ）、（Ａ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ）、（Ｂ、Ｃ、Ｆ）、（Ｂ、Ｃ、Ｇ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ）、（Ｂ、Ｄ、Ｇ）、（Ｂ、Ｅ、Ｆ）、（Ｂ、Ｅ、Ｇ）、（Ｂ、Ｆ、Ｇ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ）、（Ｃ、Ｄ、Ｆ）、（Ｃ、Ｄ、Ｇ）、（Ｃ、Ｅ、Ｆ）、（Ｃ、Ｅ、Ｇ）、（Ｃ、Ｆ、Ｇ）、（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）、（Ｃ、Ｆ、Ｇ）、（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）及び（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）。上記において、例えば（Ａ、Ｂ）は遺伝的特徴（Ａ）と遺伝的特徴（Ｂ）の組合せを意味する。
　一部の態様において、本発明の植物体Ｄは、さらに上記の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）を複数有していてもよい。この態様において、遺伝的特徴の数は２～８種のいずれか、すなわち、２、３、４、５、６、７又は８種であってよい。遺伝的特徴の組合せは特に限定されず、例えば以下の括弧内の各組合せを含む：（Ａ、Ｈ）、（Ｂ、Ｈ）、（Ｃ、Ｈ）、（Ｄ、Ｈ）、（Ｅ、Ｈ）、（Ｆ、Ｈ）、（Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｈ）、（Ａ、Ｄ、Ｈ）、（Ａ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｈ）、（Ｂ、Ｅ、Ｈ）、（Ｂ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｈ）、（Ｃ、Ｅ、Ｈ）、（Ｃ、Ｆ、Ｈ）、（Ｃ、Ｇ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）、（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）及び（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）。
　本発明の変異部位（Ａ）～（Ｅ）は、ゲノム上の互いの位置が１７３ｂｐ以内と近接しており、連鎖不平衡の状態にある。したがって、本発明の植物体Ｂが遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）のいずれかを有していれば、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の他のものも有している傾向がある。
　本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の存在は、本発明の化学的特徴（１）～（７）の存在と関連性が高い。このため、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つを有するステビア植物体は、本発明の化学的特徴（１）～（７）を有する可能性が高く、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つを指標にして、本発明の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体をスクリーニングすることも可能である。
　特定の態様において、本発明は、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つとを有するステビア植物体（以下、「本発明の植物体Ｃ」又は「本発明のステビア植物体Ｃ」と総称する場合がある）を提供する。
　一部の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つとを有する。一部の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｆ）とを有する。一部の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｇ）とを有する。特定の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｆ）とを有する。特定の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｇ）とを有する。特定の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｆ）及び（Ｇ）とを有する。
　なお、本発明の植物体Ａ～Ｃを「本発明の植物体」と総称することがある。
　特定の態様において、本発明は、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｈ）とを有するステビア植物体（以下、「本発明の植物体Ｅ」又は「本発明のステビア植物体Ｅ」と総称する場合がある）を提供する。本発明の植物体Ｅは、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つをさらに有していてもよい。
　一部の態様において、本発明の植物体Ｅは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｈ）と、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つとを有する。一部の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｈ）と、遺伝的特徴（Ｆ）とを有する。一部の態様において、本発明の植物体Ｃは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｈ）と、遺伝的特徴（Ｇ）とを有する。特定の態様において、本発明の植物体Ｅは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｈ）と、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｆ）とを有する。特定の態様において、本発明の植物体Ｅは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｈ）と、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｇ）とを有する。特定の態様において、本発明の植物体Ｅは、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｈ）と、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと、遺伝的特徴（Ｆ）及び（Ｇ）とを有する。
　ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ等のステビオール配糖体は、本発明の植物体Ａ～Ｅの新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はOhta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3, 199-209 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることにより個々のステビオール配糖体、例えばＲｅｂＤ及びＭを精製することができる。
　ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ等のステビオール配糖体の含量は、上記Ohta et al.又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には、例えば、本発明のステビア植物体Ａ～Ｅから新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行うこと等により測定することができる。
　本発明の植物体Ａ～Ｅは、遺伝子組換的手法により得られたもの又はその子孫（以下、「遺伝子組換植物体」と称することがある）であっても、非遺伝子組換的手法により得られたもの又はその子孫（以下、「非遺伝子組換植物体」と称することがある）であってもよい。「非遺伝子組換的手法」の例としては、交雑や自殖等のほか、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、ＥＭＳは、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％等の濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１～４８時間、２～３６時間、３～３０時間、４～２８時間、５～２６時間、６～２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
　或いは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線等の放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地等で培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１～１００Ｇｒ、０．０３～７５Ｇｒ、０．０５～５０Ｇｒ、０．０７～２５Ｇｒ、０．０９～２０Ｇｒ、０．１～１５Ｇｒ、０．１～１０Ｇｒ、０．５～１０Ｇｒ、１～１０Ｇｒであり、照射距離は１ｃｍ～２００ｍ、５ｃｍ～１００ｍ、７ｃｍ～７５ｍ、９ｃｍ～５０ｍ、１０ｃｍ～３０ｍ、１０ｃｍ～２０ｍ、１０ｃｍ～１０ｍであり、照射時間は１分～２年、２分～１年、３分～０．５年、４分～１か月、５分～２週間、１０分～１週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
　また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）等の手法も公知である。
　一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
　本発明の植物体Ａ～Ｅを宿主として事後的に遺伝子組換（例えばゲノム編集等により）を行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体Ａ～Ｅを宿主として遺伝子組換を行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
　本発明の植物体Ａ～Ｅには植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）或いは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等が含まれ得る。葉は乾燥葉であってもよい。
　また、本発明の植物体Ａ～Ｅには、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体Ａ～Ｅの再生可能な形態の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
２．本発明の植物体の作出方法
　本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法Ａ」と称する場合がある）を提供する。　当該方法により作出されるステビア植物体は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的特徴を有し得る。
　本発明はまた、別の態様において、本発明のステビア植物体Ｄ又はＥと第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法Ｂ」と称する場合がある）を提供する。
　当該方法により作出されるステビア植物体は、本発明の植物体Ｄ又はＥと同じ表現型と遺伝的特徴を有し得る。
　本発明の作出方法Ａ～Ｂによって得られる植物体におけるＲｅｂＤの量、ＲｅｂＮの量、ＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計量、ＲｅｂＤとＲｅｂＮとの合計量、ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮとの合計量の範囲、ＴＳＧ量に対するＲｅｂＤの量、ＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計量の比率の範囲、各特徴（化学的特徴及び／又は遺伝的特徴）の組合せ等は、本発明の植物体について上記したとおりである。
　本発明の作出方法Ａ～Ｂにおいて、「交雑させる」とは、本発明の植物体Ａ～Ｅのいずれか１つ（第一代（Ｓ１））と、第２の植物体（Ｓ１）とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体（第二代（Ｓ２））を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、例えば、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体（Ｓ２）を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝的特徴を有する植物体）（Ｓ１）と交雑させて、本発明の遺伝子的特徴を有する植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体（Ｓ１）が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的特徴を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。交雑は二代以上に亘って行うことが好ましいが、遺伝的特徴がヘテロ接合性等の場合は、一代で所望の遺伝的特徴の組合せを有する植物体が得られることがある。
　或いは、本発明の植物体Ａ～Ｅは自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体Ａ～Ｅのめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
　本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的特徴が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体と交雑させることにより、本発明の植物体と同等の表現型を有するステビア植物体を作出することも可能である。
　別の態様として、本発明の植物体Ａ～Ｅは、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vol. 1391, pp113-123）。
　さらに別の態様として、本発明の植物体は、ステビア植物体のゲノムに、本発明の変異を導入することで作出することも可能である。また、本発明の植物体Ｄ～Ｅおよび化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体は、ステビア植物体のゲノムに、本発明の変異（Ｈ）を導入することで作出することも可能である。変異の導入は、遺伝子組換的手法により行っても、非遺伝子組換的手法により行ってもよい。非遺伝子組換的手法については、本発明の植物体について上記したとおりである。
３．本発明の植物体のスクリーニング方法
　本発明の植物体及び本発明の植物体と同じ表現型及び／又は遺伝的特徴を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝的特徴を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
　したがって、本発明は、別の側面において、被験植物のゲノムから本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程を含む、ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法Ａ」と称する場合がある）を提供する。
　一態様において、検出対象となる遺伝的特徴は遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つ（特に遺伝的特徴（Ａ））である。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は遺伝的特徴（Ｆ）である。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は遺伝的特徴（Ｇ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと遺伝的特徴（Ｆ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと遺伝的特徴（Ｇ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ｆ）と遺伝的特徴（Ｇ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ａ）、（Ｆ）及び（Ｇ）である。なお、上記のとおり、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）に係る変異は連鎖不平衡の状態にあるため、これらの遺伝的特徴のいずれか１つを検出することにより、残りの遺伝的特徴の存否を推定し得る。
　別の側面において、本発明は、被験ステビア植物体のゲノムから、遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、遺伝的特徴（Ｈ）を有するステビア植物体又は化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法Ｂ」と称する場合がある）を提供する。
　一態様において、検出対象となる遺伝的特徴は遺伝的特徴（Ｈ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと遺伝的特徴（Ｈ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ｆ）と遺伝的特徴（Ｈ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ｇ）と遺伝的特徴（Ｈ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと遺伝的特徴（Ｆ）と遺伝的特徴（Ｈ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｅ）の少なくとも１つと遺伝的特徴（Ｇ）と遺伝的特徴（Ｈ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ｆ）と遺伝的特徴（Ｇ）と遺伝的特徴（Ｈ）である。一部の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、遺伝的特徴（Ａ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）である。
　本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂは、上記の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
　本発明の遺伝的特徴の存在は、例えば、
（Ｉ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号２２、２３、２４又は２５の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルａ」と称することがある）と、配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１、９２、９３又は９４の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＡ」と称することがある）の両方の存在、
（ＩＩ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号２６、２７、２８又は２９の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルｂ」と称することがある）と、配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２、９５、９６又は９７の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＢ」と称することがある）の両方の存在、
（ＩＩＩ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号３０、３１、３２又は３３の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルｃ」と称することがある）と、配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３、９８、９９又は１００の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＣ」と称することがある）の両方の存在、
（ＩＶ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３４、３５、３６又は３７の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルｄ」と称することがある）と、配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号４、１０１、１０２又は１０３の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＤ」と称することがある）の両方の存在、
（Ｖ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号３８、３９、４０又は４１の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルｅ」と称することがある）と、配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号５、１０４、１０５又は１０６の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＥ」と称することがある）の両方の存在、
（ＶＩ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号４２、４３、４４又は４５の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルｆ」と称することがある）と、配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号６、１０７、１０８又は１０９の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＦ」と称することがある）の両方の存在、及び／又は
（ＶＩＩ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号４６、４７、４８又は４９の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルｇ」と称することがある）と、配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号７、１１０、１１１又は１１２の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＧ」と称することがある）の両方の存在の検出
により決定することができる。
　また、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）の存在は、例えば、配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１３３、１３４、１３５又は１３６の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルｈ」と称することがある）と、配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＧであるアレル（例えば、配列番号１３０、１４３、１４４又は１４５の塩基配列を含むアレル、以下、「アレルＨ」と称することがある）の両方の存在の検出
により決定することができる。
　本発明の遺伝的特徴の不在は、例えば、
（ｉ）アレルＡかアレルａのいずれか一方のみの存在、
（ｉｉ）アレルＢかアレルｂのいずれか一方のみの存在、
（ｉｉｉ）アレルＣかアレルｃのいずれか一方のみの存在、
（ｉｖ）アレルＤかアレルｄのいずれか一方のみの存在、
（ｖ）アレルＥかアレルｅのいずれか一方のみの存在、
（ｖｉ）アレルＦかアレルｆのいずれか一方のみの存在、及び／又は
（ｖｉｉ）アレルＧかアレルｇのいずれか一方のみの存在の検出
により決定することができる。
　また、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）の不在は、例えば、アレルＨかアレルｈのいずれか一方のみの存在の検出により決定することができる。
　本発明の遺伝的特徴の検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、ＡＳＯ法、ＡＲＭＳ法、ＤＧＧＥ法、ＣＣＭ法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ法、ＶＳＥＴ法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシーケンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が本発明の変異部位（Ａ）～（Ｈ）のいずれか１つに相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが前記変異を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が前記変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動等によって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
　或いは、本発明の変異部位（Ａ）～（Ｈ）とプライマー配列とは重複させず、かつ前記変異部位をＰＣＲ増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）を検出することができる。
　ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
　TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
　シーケンス法とは、変異を含む領域をＰＣＲにて増幅させ、Dye Terminator等を用いてＤＮＡ配列をシーケンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
　ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の変異部位（Ａ）～（Ｈ）と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の変異（Ａ）～（Ｈ）の有無を検出することができる。ＤＮＡチップ等のＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
　インベーダー法とは、ＳＮＰ等の変異のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
　TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ａ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号５０の３’末端から１５～３９塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１又は２２の４１位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号５１）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット、又は、配列番号１１３又は１１４の３’末端から１５～２０塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１１５又は１１６の２２位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号１１７）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号５０に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＲｓａＩ、配列番号１１３に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＴｓｐ４５Ｉ、配列番号１１４に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｃｉＩをそれぞれ含む。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｂ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号５６、１１８又は１１９の３’末端から１５～２０塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２又は２６の２２位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号５７）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号５６に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｃｌＩ、配列番号１１８に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｌｕＩ、配列番号１１９に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＰａｃＩをそれぞれ含む。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｃ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号６２、１２０又は１２１の３’末端から１５～２０塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号６４又は６５の２２位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号６３）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号６２に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｌｕＩ、配列番号１２０に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＢｇｌＩ、配列番号１２１に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＳｃａＩをそれぞれ含む。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｄ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号６８、１２２又は１２３の３’末端から１５～２１塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７０又は７１の２３位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号６９）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号６２に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｌｕＩ、配列番号１２２に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＭｂｏＩ、配列番号１２３に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＢｇｌＩＩをそれぞれ含む。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｅ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号７４、１２４又は１２５の３’末端から１５～２２塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７６又は７７の２４位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号７５）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号７４に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｌｕＩ、配列番号１２４に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＭｂｏＩ、配列番号１２５に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＢｇｌＩＩをそれぞれ含む。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｆ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号６又は４２の２８９位より５’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列（例えば、配列番号８０）を含むフォワードプライマーと、配列番号８１、１２６又は１２７の３’末端から１５～３６塩基長の連続する配列を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号８１に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＲｓａＩ、配列番号１２６に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＳｎａＩ、配列番号１２７に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＡｌｕＩをそれぞれ含む。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｇ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号８６、１２８及び１２９から選択される配列の３’末端から１５～３２塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８８又は８９の３４位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号８７）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号８６に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＭｓｅＩ、配列番号１２８に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＮｌａＩＩＩ、配列番号１２９に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＴｓｐ４５Ｉをそれぞれ含む。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）は、例えば、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号１３７、１４６、１４７及び１４８から選択される配列の３’末端から１５～３９塩基長の連続する配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１３０又は１３３の４１位より３’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号１３８）を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット。
・制限酵素：
　配列番号１３７に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＥｃｏＲＶ、配列番号１４６に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＢａｅＩ、配列番号１４７に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＢｃｌＩ、Ｋｓｐ２２Ｉ又はＦｂａＩ、配列番号１４８に基づくプライマーセットに対応する制限酵素はＨｉｎｄＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＭｊａＩＶ又はＨｐｙ１６６ＩＩをそれぞれ含む。
　プライマーの配列は、上記の条件を満たす範囲で最適化することができる。プライマー設計の最適化については、例えば、Sambrook and Russell, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press等を参照のこと。上記各プライマーは、１５～５０塩基長、１８～４８塩基長、２０～４５塩基長、３０～４０塩基長等であってよい。各プライマーセットに対応する制限酵素には、上記酵素と同じ配列を認識し、同じ個所を切断する他の酵素、又は上記酵素のアイソシゾマーも含まれる。また、本発明の遺伝的特徴に基づき、上記以外のプライマーセットを設計し、それに対応する制限酵素を選択することも可能である。
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）は、例えば、以下の配列を有するプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）は、例えば、以下の配列を有するプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　なお、上記プライマーセットと制限酵素との組合せは一例にすぎず、当業者であれば、本発明の遺伝的特徴を検出し得る他のプライマーセットと制限酵素との組合せを見出すことができる。
　本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂは、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つが検出された被験ステビア植物の組織（例えば葉）のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量を測定する工程をさらに含んでもよい。ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はＲｅｂＮ含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つが検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量が高い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂを適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂは、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物のゲノムから、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つを検出する工程、
（ｉｉ）本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つが検出された被験ステビア植物組織のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つが検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量が高い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択したＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つを検出する工程、
（ｖｉ）本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つが検出された子植物組織のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つが検出された子植物体のうち、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量が高い個体を選択する工程。
　選択するＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量が高い個体は、例えば、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の少なくとも１つが検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量の高さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体等であってよい。また、交配する他のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）を含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）～（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量がより高いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
　本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂにおいて、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
　本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂにおいて、被験ステビア植物体は、変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。変異の誘発については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
　また、本発明は、上記に記載されたプライマーセット及びその組合せ、例えば、上記表１～８に記載のプライマーセット、及び、これらのプライマーセット同士の組合せ、例えば、表１に記載の配列番号５０を含むフォワードプライマーと配列番号５１を含むリバースプライマーとのプライマーセット、及び、表６に記載の配列番号８０を含むフォワードプライマーと配列番号８１を含むリバースプライマーとのプライマーセットの組合せ等の、表１～８の各々に記載の少なくとも１つのプライマーセット同士の組合せを提供する。本発明は、さらに、配列番号１～７、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、１３０及び１３３からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセット、例えば、配列番号８の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１０の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１２の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１３の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１４の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１６の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１７の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１８の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１９の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号２０の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号２１の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１３１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１３２の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット等を提供する。
　さらに、本発明は、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブは、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在の各種検出方法（例えば、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等のリアルタイムＰＣＲ法）に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブは、本発明の変異部位を含むゲノムの部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、３９～４１、４３～４５、４７～４９、９２～１１２から選択される塩基配列に相補的な配列を含むものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、３９～４１、４３～４５、４７～４９は本発明の変異を含むアレルに特異的であり、配列番号９２～１１２は、本発明の変異を含まないアレルに特異的である。また、配列番号２３～２５はアレルａに特異的であり、配列番号２７～２９はアレルｂに特異的であり、配列番号３１～３３はアレルｃに特異的であり、配列番号３５～３７はアレルｄに特異的であり、配列番号３９～４１はアレルｅに特異的であり、配列番号４３～４５はアレルｆに特異的であり、配列番号４７～４９はアレルｇに特異的である。一方、配列番号９２～９４はアレルＡに特異的であり、配列番号９５～９７はアレルＢに特異的であり、配列番号９８～１００はアレルＣに特異的であり、配列番号１０１～１０３はアレルＤに特異的であり、配列番号１０４～１０６はアレルＥに特異的であり、配列番号１０７～１０９はアレルＦに特異的であり、配列番号１１０～１１２はアレルＧに特異的である。本発明の遺伝的特徴の存在は、本発明の変異を含むアレルと本発明の変異を含まないアレルの両方の検出により検出することができ、本発明の遺伝的特徴の不在は、本発明の変異を含むアレルのみの検出又は本発明の変異を含まないアレルのみの検出により検出することができる。本発明のプローブは、好ましくは標識を有する。かかる標識の非限定例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、色素、酵素、クエンチャー、検出可能な標識との結合部分等が挙げられる。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、３９～４１、４３～４５、４７～４９、９２～１１２から選択される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、標識とを有する。
　さらにまた、本発明は、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブＨ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブ（Ｈ）は、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在の各種検出方法（例えば、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等のリアルタイムＰＣＲ法）に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブ（Ｈ）は、本発明の変異部位（Ｈ）を含むゲノムの部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号１３４～１３６、１４３～１４５から選択される塩基配列に相補的な配列を含むものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号は本発明の変異（Ｈ）を含むアレルに特異的であり、配列番号１４３～１４５は、本発明の変異（Ｈ）を含まないアレルに特異的である。また、配列番号１３４～１３６、１４３～１４５から選択される塩基配列に相補的な配列を含むものが挙げられる。こはアレルｈに特異的であり、配列番号１４３～１４５はアレルＨに特異的である。本発明の遺伝的特徴（Ｈ）の存在は、本発明の変異（Ｈ）を含むアレルと本発明の変異（Ｈ）を含まないアレルの両方の検出により検出することができ、本発明の遺伝的特徴（Ｈ）の不在は、本発明の変異（Ｈ）を含むアレルのみの検出又は本発明の変異（Ｈ）を含まないアレルのみの検出により検出することができる。本発明のプローブＨは、好ましくは標識を有する。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号１３４～１３６、１４３～１４５から選択される塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドと、標識とを有する。
　本発明はさらに、上記のプライマーセットとこれに対応する制限酵素とを含むキットを提供する。特定の態様において、本発明のキットは前記表１～８に記載のプライマーセットと、これに対応する制限酵素とを含む。
　本発明はまた、上記の配列番号１～７、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、１３０及び１３３からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、それに対応する上記の本発明のプローブとを含むキットを提供する。
　これらのプライマーセット、プローブ及びキットは、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）を検出するために用いること、本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂに用いることなどが可能である。また、これらのプライマーセット及びキットには、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）の検出や、本発明のスクリーニング方法Ａ～Ｂに関する説明を含む指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を含むサイトの情報（例えば、ＵＲＬ、二次元コード）、使用方法に関する情報を記録した媒体（例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー）等が含まれていてもよい。
　一部の態様において、本発明は、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、本発明のステビア植物体のスクリーニングキットを提供する。試薬は、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含み得る。特定の態様において、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出するための試薬は、上記の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つをｄＣＡＰＳ法で検出するためのプライマーセットと制限酵素との組合せ、例えば表１～７に記載のプライマーセットと制限酵素との組合せ、又は、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等で使用することができる、本発明の変異部位（例えば、配列番号２２～４９から選択される配列を含む部位）を増幅するプライマーセットと、遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つに係る部位（例えば、配列番号２３～２５、２７～２９、３１～３３、３５～３７、３９～４１、４３～４５、４７～４９から選択される配列を含む部位）に相補的な塩基配列を有するプローブとの組合せを含む。
　別の態様において、本発明は、遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、本発明のステビア植物体ＤまたはＥのスクリーニングキットを提供する。試薬は、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含み得る。特定の態様において、遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出するための試薬は、上記の遺伝的特徴（Ｈ）をｄＣＡＰＳ法で検出するためのプライマーセットと制限酵素との組合せ、例えば表８に記載のプライマーセットと制限酵素との組合せ、又は、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法等で使用することができる、本発明の変異部位（Ｈ）（例えば、配列番号１３３～１３６から選択される配列を含む部位）を増幅するプライマーセットと、遺伝的特徴（Ｈ）に係る部位（例えば、配列番号１３３～１３６から選択される配列を含む部位）に相補的な塩基配列を有するプローブとの組合せを含む。
４．植物体由来抽出物の製造方法及び当該抽出物を用いた製品
　本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、本発明のスクリーニング方法Ａにより選別されたステビア植物体若しくは本発明の作出方法Ａにより製造されたステビア植物体、又は当該植物体の種子、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）、組織、組織培養物若しくは細胞から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含有する抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法Ａ」と称する場合がある）が提供される。
　さらに、本発明の植物体、本発明のスクリーニング方法Ａにより選別されたステビア植物体若しくは本発明の作出方法Ａにより製造されたステビア植物体、又は当該植物体の種子、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）、組織、組織培養物若しくは細胞からのＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含有する抽出物（以下、「本発明の抽出物Ａ」と称する場合がある）が提供される。本発明の抽出物Ａは、好適には、本発明の抽出物の製造方法Ａにより製造されたものである。さらにまた、本発明の抽出物ＡからＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを精製する工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの製造方法（以下、「本発明のステビオール配糖体の製造方法Ａ」と称する場合がある）が提供される。本発明のステビオール配糖体の製造方法Ａは、本発明の植物体、本発明のスクリーニング方法Ａにより選別されたステビア植物体又は本発明の作出方法Ａにより製造されたステビア植物体からＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含む抽出物を得る工程をさらに含んでもよい。
　本発明のさらなる態様において、本発明の植物体Ｄ～Ｅ、本発明のスクリーニング方法Ｂにより選別されたステビア植物体若しくは本発明の作出方法Ｂにより製造されたステビア植物体、又は当該植物体の種子、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）、組織、組織培養物若しくは細胞から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含有する抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法Ｂ」と称する場合がある）が提供される。
　さらに、本発明の植物体Ｄ～Ｅ、本発明のスクリーニング方法Ｂにより選別されたステビア植物体若しくは本発明の作出方法Ｂにより製造されたステビア植物体、又は当該植物体の種子、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）、組織、組織培養物若しくは細胞からのＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含有する抽出物（以下、「本発明の抽出物Ｂ」と称する場合がある）が提供される。本発明の抽出物Ｂは、好適には、本発明の抽出物の製造方法Ｂにより製造されたものである。さらにまた、本発明の抽出物ＢからＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを精製する工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの製造方法（以下、「本発明のステビオール配糖体の製造方法Ｂ」と称する場合がある）が提供される。本発明のステビオール配糖体の製造方法Ｂは、本発明の植物体Ｄ～Ｅ、本発明のスクリーニング方法Ｂにより選別されたステビア植物体又は本発明の作出方法Ｂにより製造されたステビア植物体からＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含む抽出物を得る工程をさらに含んでもよい。
　ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含む抽出物は、本発明の植物体Ａ～Ｅの新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等は上記Ohta et al.又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　また、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを精製することができる。
　本発明の抽出物Ａ～Ｂは、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）のいずれをも有しないステビア種と比べＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮをより高い含量で含む。
　本発明の抽出物Ａ～Ｂは、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）のいずれをも有しないステビア植物体から得られた抽出物と比べＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮを約５０％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上、約３００％以上、約３５０％以上、約４００％以上、約４５０％以上、約５００％以上、約５５０％以上、約６００％以上、約６５０％以上、約７００％以上、約７５０％以上、約８００％以上、約８５０％以上、約９００％以上、約９５０％以上、約１０００％以上、約１０５０％以上、約１１００％以上、約１１５０％以上、約１２００％以上、約１２５０％以上、約１３００％以上、約１３５０％以上、約１４００％以上、約１４５０％以上、約１５００％以上、約１５５０％以上、約１６００％以上、約１６５０％以上、約１７００％以上、約１７５０％以上、約１８００％以上、約１８５０％以上、約１９００％以上、約１９５０％以上、約２０００％以上、約２０５０％以上、約２１００％以上、高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物Ａ～Ｂと、本発明の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｈ）のいずれをも有しないステビア植物体から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
　このようにして得られた本発明の抽出物Ａ～Ｂ及び／又は本発明のステビオール配糖体の製造方法Ａ～Ｂにより得られるＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮと他の成分とを混合することにより、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含量を高めた新規な飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物Ａ～Ｂ及び／又は本発明のステビオール配糖体の製造方法Ａ～Ｂにより得られるＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮと他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含量を高めた新規な飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を含む。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な飲料、食品、甘味料組成物、香料又は医薬品を提供し、また、当該飲料、食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法を提供する。
５．本発明の植物体に係る塩基配列
　本発明は、別の態様において、本発明の植物体に係る塩基配列を提供する。
　遺伝的特徴（Ａ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号２２～２５から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（Ｂ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号２６～２９から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（Ｃ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号３０～３３から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（Ｄ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号３４～３７から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（Ｅ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号３８～４１から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（Ｆ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号４２～４５から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（Ｇ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号４６～４９から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴（Ｈ）を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号１３３～１３６から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。
　以下に本発明に関する実施例を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。
［実施例１］高ＲｅｂＤステビア植物の作製
１．試験系統の作製
　野生型ステビア種子（市販品種）に対してエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理を行い、これをサントリーワールドリサーチセンター内温室にて播種、栽培した。成長した各個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（島津LCMS8050）にてＲｅｂＤの濃度を定量した。具体的には、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕乾物０．０５ｇを１００倍量（５ｍＬ）の純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後、３２％アセトニトリルで６０倍希釈したものをサンプル液とした。このサンプル液１ｍＬをLCMS8050のＭＲＭモードにてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＤの濃度を定量し、その濃度が２％以上の個体を選別して交配し、種子を得た。このような選別を４世代にわたって繰り返し、雑種第４代（Ｓ４世代）を得た。
２．各個体に含まれるステビオール配糖体の測定
　上記で得たＳ４世代の複数の系統の個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、上記１．と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びステビオシド（ＳＴＶ）の濃度（乾燥葉に対する質量％）を定量し、その合計を総ステビオール配糖体（ＴＳＧ）濃度とした。結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　上記結果が示すとおり、高ＲｅｂＤ個体の選抜により、ＲｅｂＤ含量が乾燥葉ベースで３．５質量％を超える高ＲｅｂＤ含有系統が得られた（Ｓ４－１～Ｓ４－１８）。
［実施例２］高ＲｅｂＤステビア植物体に特有の遺伝的特徴の検出（１）
　実施例１で試験した一部の個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、シーケンサー（HiSeq 2500、Illumina）により高ＲｅｂＤステビア植物体に特有の遺伝的特徴の分析を行った。その結果、ＲｅｂＤ含量の高い系統で遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）が検出される傾向がみられた。そこで、遺伝的特徴の検出を効率化すべく、遺伝的特徴（Ａ）、（Ｆ）及び（Ｇ）を検出するためのｄＣＡＰＳプライマーを作製し、残りの個体についてこれらの遺伝的特徴の有無をｄＣＡＰＳ法により評価した。なお、遺伝的特徴（Ｂ）～（Ｅ）については、変異部位が遺伝的特徴（Ａ）のものとゲノム上の位置が近く、連鎖不平衡の状態にあると考えられたため、ｄＣＡＰＳ法による検討は省略した。
　ｄＣＡＰＳプライマー及び制限酵素は、以下のものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
　ｄＣＡＰＳ法による各遺伝的特徴の検出は以下のように行った。まず、実施例１で試験した各個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、各遺伝的特徴に対応する上記ｄＣＡＰＳプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に各遺伝的特徴に対応する上記制限酵素を添加し、３７℃で酵素反応を行った。マイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HT（PerkinElmer）により制限酵素処理物の電気泳動を行い、得られたバンドパターンに基づいて遺伝的特徴の有無を判定した。具体的には、遺伝的特徴（Ａ）、（Ｆ）及び（Ｇ）はいずれもヘテロ接合性であるため、分解産物と非分解物の両方のバンドが認められた個体を遺伝的特徴あり（〇）、分解産物か非分解物のいずれか一方のみしか認められなかった個体を遺伝的特徴なし（×）と判定した。
　下表に示すとおり、ＲｅｂＤ含量の高い系統は、いずれも遺伝的特徴（Ａ）、（Ｆ）及び（Ｇ）を有していた。一方、ＲｅｂＤ含量のが１．６％未満の系統は遺伝的特徴（Ａ）、（Ｆ）及び（Ｇ）のいずれも有していなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
　上記結果から明らかなように、本発明の遺伝的特徴を有する系統は、ＲｅｂＤ含量が高いだけでなく（平均約４．４６％、最大６．２８％）、ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量（平均約５．７１％、最大７．８１％）、ＴＳＧに対するＲｅｂＤの質量比（平均約３１．２８％、最大３９．７０％）、ＴＳＧに対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計質量比（平均約４０．１５％、最大４９．４７％）、ＲｅｂＮ含量（平均約０．９０％、最大１．２３％）、ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量（平均約５．３６％、最大７．３９％）及びＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量（平均約６．６１％、最大８．９１％）も高い傾向にあった。
［実施例３］高ＲｅｂＤステビア植物体に特有の遺伝的特徴の検出（２）
　実施例１で試験したのとは別のＳ４世代系統の個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、シーケンサー（HiSeq 2500、Illumina）により高ＲｅｂＤステビア植物体に特有の遺伝的特徴の分析を行った。その結果、ＲｅｂＤ含量の高い系統で遺伝的特徴（Ｈ）が検出される傾向がみられた。そこで、遺伝的特徴の検出を効率化すべく、遺伝的特徴（Ｈ）を検出するためのｄＣＡＰＳプライマーを作製し、残りの個体について遺伝的特徴（Ｈ）の有無をｄＣＡＰＳ法により評価した。また、実施例１と同様にステビオール配糖体の濃度を定量した。
　ｄＣＡＰＳプライマー及び制限酵素は、以下のものを使用した。
フォワードプライマー：AATCAGTCCAATTTAAACGTGCTCTACTTACAGAGATAT（配列番号１３７）
リバースプライマー：CACTTCTCTTCATCAGAGTAACTCAATTC（配列番号１３８）
制限酵素：ＥｃｏＲＶ
　ｄＣＡＰＳ法による各遺伝的特徴の検出は以下のように行った。まず、前記Ｓ４世代系統の個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、上記ｄＣＡＰＳプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に上記制限酵素を添加し、３７℃で酵素反応を行った。マイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HT（PerkinElmer）により制限酵素処理物の電気泳動を行い、得られたバンドパターンに基づいて遺伝的特徴（Ｈ）の有無を判定した。具体的には、遺伝的特徴（Ｈ）はヘテロ接合性であるため、分解産物と非分解物の両方のバンドが認められた個体を遺伝的特徴（Ｈ）あり（〇）、分解産物か非分解物のいずれか一方のみしか認められなかった個体を遺伝的特徴（Ｈ）なし（×）と判定した。また、同じ個体について、実施例２と同様にして遺伝的特徴（Ａ）及び（Ｆ）の有無についても評価した。
　表１２～１３に示すとおり、遺伝的特徴（Ｈ）を有する個体はいずれも遺伝的特徴（Ａ）及び（Ｆ）をも有していたが、ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が低い個体の一部は、遺伝的特徴（Ａ）及び（Ｆ）を有するが、遺伝的特徴（Ｈ）を有していなかった。このことから、遺伝的特徴（Ｈ）を有する個体を選別することで、遺伝的特徴（Ａ）及び（Ｆ）有する個体のうちＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が低い一部の個体が除外され、ＲｅｂＤとＲｅｂＭの平均合計含量がより高い集団が得られることが明らかとなった（表１４）。また、その他の化学的特徴に係るステビオール配糖体特性（すなわち、ＲｅｂＤ含量、ＴＳＧに対するＲｅｂＤの質量比、ＴＳＧに対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計質量比、ＲｅｂＮ含量、ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量、およびＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量）についても、遺伝的特徴（Ｈ）を有する集団の方が、遺伝的特徴（Ａ）及び（Ｆ）を有する集団よりも優れていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
　本発明によってＲｅｂＤ等の有用なステビオール配糖体がより効率的に提供可能になるので、こうしたステビオール配糖体を含む上質な味質の飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品等の提供を促進することができる。

Claims (24)

  1. 以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体。
    （１）レバウジオシド（Ｒｅｂ）Ｄの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
    （２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
    （３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
    （４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
    （５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
    （６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
    （７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
  2. 　以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つを有する、請求項１に記載の植物体。
    （Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
  3. 　以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つを有するステビア植物体。
    （Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。

    （Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
  4. 以下の遺伝的特徴（Ｈ）を有するステビア植物体。

    （Ｈ）配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
  5. 　非遺伝子組換植物体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の植物体。
  6. 　変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の植物体。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞。
  8. 胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、請求項７に記載の組織、組織培養物又は細胞。
  9. 請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体を作出する方法。
    （１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
    （２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
    （３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
    （４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
    （５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
    （６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
    （７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
  10. 第２の植物体が請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体である、請求項９に記載の方法。
  11. ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体、請求項７又は８に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物。
  12. 請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体、請求項７又は８に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを含む抽出物の製造方法。
  13. 請求項１１に記載の抽出物からＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＮの少なくとも１つを精製する工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの製造方法。
  14. 請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体の抽出物、請求項７又は８に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞の抽出物、或いは、請求項１１に記載の抽出物を提供する工程、及び
    前記抽出物を、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
    を含む、飲食品、甘味料組成物、香料又は医薬品の製造方法。
  15. 被験ステビア植物体のゲノムから、以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程を含む、請求項１～３、５および６のいずれか一項に記載のステビア植物体をスクリーニングする方法。
    （Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。

    （Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
  16. 　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の植物体又は以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体をスクリーニングする方法。
    （１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
    （２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
    （３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
    （４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
    （５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
    （６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
    （７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
  17. 　遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 被験ステビア植物組織のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ及び／又はＲｅｂＮの含有量を測定する工程をさらに含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　以下の遺伝的特徴（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、請求項１～３、５及び６のいずれか一項に記載のステビア植物体のスクリーニングキット。
    （Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である
    （Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性である。

    （Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ接合性である。
  20. 　配列番号１３０の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（Ｈ）の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の植物体又は以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体のスクリーニングキット。
    （１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
    （２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
    （３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
    （４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
    （５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
    （６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。

    （７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
  21. 　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、請求項１９又は２０に記載のキット。
  22. 　以下の（Ａ）～（Ｇ）の少なくとも１つの変異を導入する工程を含む、請求項１～３、５及び６のいずれか一項に記載のステビア植物体を作出する方法。
    （Ａ）配列番号１の４０位に相当する位置におけるＴからＣへの変異。
    （Ｂ）配列番号２の２１位に相当する位置におけるＡからＴへの変異。
    （Ｃ）配列番号３の２８位に相当する位置におけるＣからＴへの変異。
    （Ｄ）配列番号４の５９位に相当する位置におけるＡからＣへの変異。
    （Ｅ）配列番号５の６４位に相当する位置におけるＣからＴへの変異。
    （Ｆ）配列番号６の２９０位に相当する位置におけるＴからＣへの変異。
    （Ｇ）配列番号７の３３位に相当する位置におけるＡからＴへの変異。

  23. 　配列番号１３０の４０位に相当する位置におけるＧからＣへの変異を導入する工程を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の植物体、又は、以下の化学的特徴（１）～（７）の少なくとも１つを有するステビア植物体を作出する方法。
    （１）ＲｅｂＤの含量が乾燥葉の単位質量当たり３．６％以上。
    （２）ＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．９％以上。
    （３）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤの質量比が３２．０％以上。
    （４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の質量比が３８．２％以上。
    （５）ＲｅｂＮの含量が乾燥葉の単位質量当たり１．０％以上。
    （６）ＲｅｂＤとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．０％以上。
    （７）ＲｅｂＤとＲｅｂＭとＲｅｂＮの合計含量が乾燥葉の単位質量当たり４．４％以上。
  24. 　変異の導入が、変異誘発処理によって行われる、請求項２２又は２３に記載の方法。
     
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