WO2020209266A1 - 花粉形成能の低いステビア植物 - Google Patents

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正良 平井
一考 岩城
兼太郎 落合
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Definitions

  • the present invention relates to a Stevia plant having a low pollen-forming ability, a method for producing the same, a method for screening, and the like.
  • Stevia is a perennial plant of the Asteraceae family that originates in Paraguay, South America. Stevia contains various sweetening components having a sweetness of several tens to several hundred times that of sugar, and these sweetening components are extracted and used as a natural sweetener (Patent Document 1). However, there are still many unknowns about the genetic information of Stevia and what kind of genes are involved in the control of in vivo events.
  • the present invention provides a Stevia plant having a low pollen-forming ability, a method for producing the plant, a method for screening, and the like.
  • the invention provides: [1] Stevia plant with lower pollen forming ability than wild type. [2] Heterozygous for alleles where the base at position 79 of SEQ ID NO: 151 is C, heterozygous for alleles where the base at position 65 of SEQ ID NO: 152 is T The plant according to [1], which is heterozygous or homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 24 of SEQ ID NO: 153 is T. [3] The plant according to [1] or [2], further having at least one of the following genetic features (1) to (7). (1) It is homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T.
  • [4] The plant according to [3], which has at least one of the following characteristics (1) and (2).
  • (1) Contains 3% or more RebD per unit mass of dried leaves.
  • (2) Contains 0.2% or more of RebM per unit mass of dried leaves.
  • [5] The plant according to any one of [1] to [4], which is a non-genetically modified plant.
  • [6] The plant according to any one of [1] to [5], which comprises a Stevia plant which has undergone mutagenesis treatment and a progeny plant thereof.
  • [7] The seed, tissue, tissue culture or cell of the plant according to any one of [1] to [6].
  • tissue, tissue culture or cell according to [7] selected from embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections and callus.
  • a method for producing a Stevia plant having a low pollen-forming ability which comprises a step of crossing the plant according to any one of [1] to [6] with a second Stevia plant.
  • Stevia extract comprising the step of obtaining an extract from the plant according to any one of [1] to [6], and the seed, tissue, tissue culture or cell according to [7] or [8].
  • Production method [13] A step of obtaining an extract from the plant according to any one of [1] to [6], and the seed, tissue, tissue culture or cell according to [7] or [8], and the obtained extract.
  • a method for producing a refined steviol glycoside product which comprises a step of purifying a steviol glycoside from the body.
  • Steviol glycosides include rebaugioside A, rebaugioside B, rebaugioside C, rebaugioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaugioside O, stevioside, steviolbioside, rubusoside, zulucoside A or a combination thereof.
  • Food and drink, sweetness composition including the step of providing the extract or the refined product thereof according to [11] and the step of adding the extract or the refined product to the raw material of the food or drink, the sweetness composition, the flavor or the pharmaceutical. Manufacturing method of goods, fragrances or pharmaceuticals.
  • Heterozygous or homozygous for alleles whose base at position 79 of SEQ ID NO: 151 is C, heterozygous or homozygous for alleles whose base at position 65 of SEQ ID NO: 152 is T Includes reagents for detecting the presence and / or absence of the genetic feature of being heterozygous or homozygous for an allele in which the base at position 24 of SEQ ID NO: 153 is T. , Low pollenogenic ability Stevia plant screening kit. [21] The kit according to [20], further comprising a reagent for detecting the presence and / or absence of the following genetic features (1) to (7).
  • a Stevia plant having a low pollen-forming ability acquisition of a Stevia plant having a low pollen-forming ability, a means for producing such a plant, leaves obtained from such a plant, foods and beverages containing an extract obtained from the leaves. Etc. can be provided.
  • the pollen-forming ability is low, nutrients that should be originally used for pollen formation are used for leaf growth, which can be expected to improve leaf productivity and eventually increase the content of steviol glycosides accumulated in the leaves.
  • FIG. 1 is a diagram showing a frequency distribution of sweetness component content in M1 generation individuals.
  • the vertical axis shows the number of individuals, and the horizontal axis shows the sweetness component concentration (%) in the dried leaves.
  • FIG. 2 is a diagram showing the distribution of the sweetness component content in the mutant C49A positive individual (C49A + ) and the negative individual (C49A ⁇ ) of the isolated population A.
  • the vertical axis shows the sweetness component concentration (%) in the dried leaves, and the dotted line shows the average value of the sweetness component concentration of all the individuals belonging to the isolated group A.
  • FIG. 3 is a diagram showing the distribution of the sweetness component content in the mutant C49A positive individual (C49A + ) and the negative individual (C49A ⁇ ) of the isolated population B.
  • the vertical axis shows the sweetness component concentration (%) in the dried leaves, and the dotted line shows the average value of the sweetness component concentration of all the individuals belonging to the isolated group B.
  • the present invention is a Stevia plant with low pollen-forming ability as compared with the wild type (hereinafter, may be collectively referred to as "plant of the present invention” or "stevia plant of the present invention”). I will provide a. Stevia is a plant with the scientific name of Stevia Rebaudiana Bertoni.
  • “Lower pollen-forming ability than wild-type” means, for example, that the number of pollen produced is smaller than that of wild-type Stevia plants when cultivated under the same cultivation conditions. More specifically, for example, when cultivated under the same cultivation conditions, the number of pollen contained in a fully bloomed flower is 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, as compared with the wild-type Stevia plant.
  • the pollen contained in a fully bloomed flower is 50 or less, for example, 45 or less, 40 or less, 35 or less, 30 or less. , 25 or less, 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 10 or less, 9 It may be used that the number is 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1 or less.
  • "fully bloomed” means a state in which the stigma is extended to the extent that at least one stigma can be visually recognized when the flower is viewed from the side.
  • the stevia plant of the present invention is genetically characterized by being homozygous or heterozygous for an allele in which the base at position 79 of SEQ ID NO: 151 is C (hereinafter, “the present invention”.
  • the present invention a genetic feature that is homozygous or heterozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 65 of SEQ ID NO: 152 is T (hereinafter, “this” (Sometimes referred to as “genetic feature X-2" of the invention) and the genetic feature that the allele in which the base at the position corresponding to the 24th position of SEQ ID NO: 153 is T is homozygous or heterozygous (hereinafter referred to as heterozygous).
  • it has at least one genetic feature (hereinafter sometimes referred to as "genetic feature X of the present invention") of "genetic feature X-3 of the present invention”).
  • the stevia plant of the present invention is homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1 is A (hereinafter, "genetic feature A of the present invention”). May be referred to as).
  • the Stevia plant of the present invention may be referred to as at least one of the following genetic features (B-1) to (B-4) (hereinafter, “genetic feature B of the present invention”). ).
  • B-1) It is homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T (hereinafter, may be referred to as "genetic feature B-1 of the present invention”).
  • (B-2) It is homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T (hereinafter, may be referred to as "genetic feature B-2 of the present invention”).
  • (B-3) It is homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 48 of SEQ ID NO: 4 is C (hereinafter, may be referred to as "genetic feature B-3 of the present invention”).
  • (B-4) Homozygous for alleles lacking the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 (hereinafter, may be referred to as "genetic feature B-4 of the present invention”). ..
  • the stevia plant of the present invention is heterozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6 is A (hereinafter, "genetic feature of the present invention”). It may be referred to as "C”).
  • the stevia plant of the present invention is homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6 is A (hereinafter, “genetic feature of the present invention”). It may be referred to as "D").
  • the Stevia plant of the present invention means the genetic feature X of the present invention (hereinafter, unless otherwise specified, means at least one of the genetic features X-1 to X-3 of the present invention). And genetic feature A.
  • the Stevia plant of the present invention comprises the genetic features X and B of the present invention (hereinafter, unless otherwise specified, the genetic features B-1 to B-4 of the present invention. Means at least one).
  • the Stevia plant of the present invention has the genetic feature X and the genetic feature C or D of the present invention.
  • the Stevia plant of the present invention has the genetic feature X, the genetic feature A and the genetic feature B of the present invention.
  • the Stevia plant of the present invention has a genetic feature X, a genetic feature A and a genetic feature C or D of the present invention.
  • the Stevia plant of the present invention has the genetic feature X, the genetic feature B, and the genetic feature C or D of the present invention.
  • the Stevia plant of the present invention has all of the genetic features X, A, B and C or D of the present invention.
  • the "position (or part) corresponding to” means a sequence existing in the genome when the same sequence as the reference sequence (for example, SEQ ID NOs: 1 to 6, 151 to 153, etc.) exists in the genome. It means a position or part in the middle (for example, 201st, 40th, 44th, 41st, 55-72th, 49th, 79th, 65th, 24th, etc.) and is the same as the reference sequence in the genome. When the sequence does not exist, it means a position or a part corresponding to a position or a part in the reference sequence in the sequence corresponding to the reference sequence in the genome.
  • Whether or not a sequence equal to or equivalent to the reference sequence exists in the genome is determined by, for example, amplifying the genomic DNA of the target Stevia plant with a primer capable of amplifying the reference sequence by PCR and sequencing the amplification product. It can be determined by performing an alignment analysis between the obtained sequence and the reference sequence.
  • Non-limiting examples of the sequence corresponding to the reference sequence include, for example, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more with respect to the reference sequence.
  • a base sequence having the above can be mentioned.
  • the position or portion corresponding to the position or portion in the reference sequence in the sequence corresponding to the reference sequence in the genome can be determined in consideration of the base sequences before and after the position or portion in the reference sequence. For example, by aligning the reference sequence with the sequence corresponding to the reference sequence in the genome, the position or part corresponding to the position or part in the reference sequence in the sequence corresponding to the reference sequence in the genome can be determined. it can.
  • the genome of the Stevia plant has a portion having the same base sequence as SEQ ID NO: 1.
  • the "position corresponding to the 201st position of SEQ ID NO: 1" is the 201st position from the 5'side of the portion having the same base sequence as SEQ ID NO: 1 in the genome.
  • the genome of the Stevia plant is not the same as SEQ ID NO: 1 but has a portion consisting of a base sequence corresponding thereto, the genome does not have a portion consisting of the same base sequence as SEQ ID NO: 1.
  • the "position corresponding to the 201st position of SEQ ID NO: 1" does not necessarily correspond to the 201st position from the 5'side of the portion corresponding to the SEQ ID NO: 1, but the base sequence before and after the 201st position of the SEQ ID NO: 1 is used. With consideration, the "position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1" in the genome of such a Stevia plant can be identified. For example, by aligning the base sequence of the portion corresponding to SEQ ID NO: 1 in the genome of the Stevia plant with the base sequence of SEQ ID NO: 1, the "position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1" in the genome of the Stevia plant is specified. can do.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1" is, for example, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, etc. 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.1% or more, 98.4% or more, 98.7% or more, 99% or more, 99.2% or more, 99.5% or more or 99.4% or more. It means a portion consisting of a base sequence having 8% or more sequence identity.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1" includes a forward primer that hybridizes to the complementary sequence of the portion 15 to 25 bases long from the 5'end of SEQ ID NO: 1 and a SEQ ID NO: It contains a portion of the Stevia plant genome that can be amplified by PCR with a reverse primer that hybridizes to a portion 15-25 bases long from the 3'end side of 1.
  • the genetic feature A of the present invention has been described as an example, but the genetic features X (including the genetic features X-1 to X-3) and B (genetic features B-1 to B-1 to 3) of the present invention have been described. The same applies to C and D) (including B-4).
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 151" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 154 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 155. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "part consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 152" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 156 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 157. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 153" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 158 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 159. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 8. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 2" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 10. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 3" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 12. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 4" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 14. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 5" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 16. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 6" includes, for example, PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 17 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 18. Contains parts of the Stevia plant genome that can be amplified by.
  • the "allele in which the base at position 79 of SEQ ID NO: 151 is C” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 160, 161 or 162.
  • the "allele in which the base at position 65 of SEQ ID NO: 152 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 163, 164 or 165.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 24 of SEQ ID NO: 153 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 166, 167 or 168.
  • the "allele in which the base at position 201 of SEQ ID NO: 1 is A” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 19, 20 or 21.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 22, 23 or 24.
  • the "allele in which the base at position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 25, 26 or 27.
  • the "allele in which the base at position 48 of SEQ ID NO: 4 is C” comprises the base sequence of SEQ ID NO: 28, 29 or 30.
  • the "allele lacking the portion corresponding to positions 55-72 of SEQ ID NO: 5" comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, 32 or 33.
  • the "allele in which the base at position 49 of SEQ ID NO: 6 is A" comprises the base sequence of SEQ ID NO: 34, 35 or 36.
  • the above genetic features are PCR method, TaqMan PCR method, sequencing method, microarray method, invader method, TILLING method, RAD (random amplified polymorphic DNA) method, restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) method, PCR-SCSP method.
  • AFLP amplified fragment length polymorphism
  • SSLP simple sequence length polymorphism
  • CAPS cleaved amplified polymorphic sequence
  • dCAPS derived cleaved amplified polymorphic sequence
  • ASO allele-specific oligonucleotide
  • ARMS Modulator concentration gradient gel electrophoresis
  • CCM chemical cleavage of mismatch
  • DOL DOL method
  • MALDI-TOF / MS method MALDI-TOF / MS method
  • TDI method padlock probe method
  • molecular beacon method DASH (dynamic allele specific hybridization) Method
  • UCAN method ECA method
  • PINPOINT method PROBE (primer oligonucleotide) method
  • VSET very short extension
  • the genetic features of the invention can be detected with the following primer set and restriction enzyme combinations.
  • a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 170 are used for the genomic DNA of the candidate plant.
  • the obtained PCR product about 166 bp length, for example, SEQ ID NO: 171
  • the restriction enzyme AluI the length was about 120 bp (for example, SEQ ID NO: 172) and about 46 bp length (for example, SEQ ID NO: 171).
  • the band of SEQ ID NO: 173 is generated.
  • PCR amplification gives, for example, a PCR product of SEQ ID NO: 174 (about 166 bp long), whereas even if AluI restriction enzyme treatment is performed on it, only a band of about 166 bp long (eg, SEQ ID NO: 174) can be obtained. If so, the candidate plant does not have the genetic feature X-1.
  • a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 175 are used for the genomic DNA of the candidate plant.
  • the obtained PCR product about 340 bp length, for example, SEQ ID NO: 176
  • the restriction enzyme Tsp45I the length was about 225 bp (for example, SEQ ID NO: 177) and about 115 bp length (for example, SEQ ID NO: 176).
  • the band of SEQ ID NO: 178) is generated.
  • PCR amplification gives, for example, a PCR product of SEQ ID NO: 179 (about 340 bp length), whereas Tsp45I restriction enzyme treatment gives only a band of about 340 bp length (eg, SEQ ID NO: 179). If so, the candidate plant does not have the genetic feature X-2.
  • a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 169 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 180 are used for the genomic DNA of the candidate plant.
  • the obtained PCR product (about 293 bp length, for example, SEQ ID NO: 181) was treated with the restriction enzyme NlaIII, the length was about 259 bp (for example, SEQ ID NO: 182) and about 34 bp length (for example, SEQ ID NO: 181).
  • the band of SEQ ID NO: 183 is generated.
  • PCR amplification gives, for example, a PCR product of SEQ ID NO: 184 (about 293 bp length), whereas Nla III restriction enzyme treatment gives only a band of about 293 bp length (eg, SEQ ID NO: 184). If so, the candidate plant does not have the genetic feature X-3.
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 38.
  • amplification was performed and the obtained PCR product (about 196 bp length, for example, SEQ ID NO: 39) was treated with the restriction enzyme HPy188I, a band having a length of about 96 bp (for example, SEQ ID NO: 41) and a band having a length of about 100 bp (eg, SEQ ID NO: 41) were treated.
  • SEQ ID NO: 42 occurs.
  • PCR amplification gives, for example, a PCR product of SEQ ID NO: 40 (about 196 bp in length), and restriction enzymes Hpy188I use restriction enzymes of about 43 bp (eg, SEQ ID NO: 43) and about 57 bp (eg, SEQ ID NO: 44).
  • restriction enzymes Hpy188I use restriction enzymes of about 43 bp (eg, SEQ ID NO: 43) and about 57 bp (eg, SEQ ID NO: 44).
  • a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 46 are used for the genomic DNA of the candidate plant. Even if the obtained PCR product (about 297 bp length, for example, SEQ ID NO: 47) is treated with a KpnI restriction enzyme, only a band with a length of about 297 bp (for example, SEQ ID NO: 47) can be obtained.
  • PCR amplification yields, for example, a PCR product of SEQ ID NO: 48 (approximately 297 bp in length) and restriction enzyme KpnI produces a restriction enzyme-treated product of approximately 258 bp (eg, SEQ ID NO: 49), the candidate plant. Does not have the genetic feature B-1.
  • a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 50 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 51 are used for the genomic DNA of the candidate plant. Even if the obtained PCR product (about 383 bp length, for example, SEQ ID NO: 52) is treated with an XbaI restriction enzyme, only a band with a length of about 383 bp (for example, SEQ ID NO: 52) can be obtained.
  • the PCR product of SEQ ID NO: 53 (for example, about 297 bp length) is obtained by PCR amplification and the restriction enzyme treatment product of about 344 bp length (for example, SEQ ID NO: 54) is produced by the restriction enzyme XbaI, the candidate plant thereof.
  • the body does not have the genetic feature B-2.
  • a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 56 are used for the genomic DNA of the candidate plant. Even if PCR amplification is performed and the obtained PCR product (about 390 bp length, for example, SEQ ID NO: 57) is treated with an AflII restriction enzyme, only a band with a length of about 390 bp (for example, SEQ ID NO: 57) is obtained.
  • the candidate plant is used. Does not have the genetic feature B-3.
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 60 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 61.
  • Amplification yields only about 140 bp of PCR product (eg, SEQ ID NO: 62).
  • the candidate plant does not have the genetic feature B-4.
  • a forward primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 64 and a reverse primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 65 are used for the genomic DNA of the candidate plant.
  • the obtained PCR product (about 367 bp length, for example, SEQ ID NO: 66) was treated with the restriction enzyme SpeI, it was about 367 bp length (for example, SEQ ID NO: 66) and about 321 bp length (for example, sequence).
  • the band number 68) is obtained.
  • PCR amplification yields, for example, a PCR product of SEQ ID NO: 67 (approximately 367 bp in length) and restriction enzyme SpI produces only a restriction enzyme-treated product of approximately 367 bp in length (eg, SEQ ID NO: 67), the candidate plant.
  • the body has no genetic features C and D. With respect to the bp length, "about” means ⁇ 5 bp.
  • the restriction enzyme treatment can be performed according to the conditions recommended by the distributor of each restriction enzyme used.
  • the pollen-forming ability can be evaluated, for example, by any known method or the method described in Example 6.
  • Non-limiting examples of the pollen forming ability evaluation method include, for example, the following methods. (1) Flower the test Stevia plant. (2) Count the number of pollen contained in the flowered flower.
  • the test Stevia plant may be cultivated alone or together with the wild-type Stevia plant (control) in the same environment. When cultivated alone, the number of pollen formed on the test Stevia plant and the number of pollen formed on the wild-type Stevia plant cultivated under the same conditions (for example, in the literature and It may include a step of comparing with (based on data obtained in separate experiments).
  • the above evaluation method compares the number of pollen formed on the test Stevia plant with the number of pollen formed on the wild-type Stevia plant cultivated together.
  • the process may be included.
  • Flowering can be induced under short-day conditions.
  • the short-day condition is that the dark period is more than 10 hours, preferably 11 hours or more.
  • the specific length of the dark period may be, for example, 11 hours, 12 hours, 13 hours, 14 hours, 15 hours, 16 hours, 17 hours, 18 hours, and the like.
  • pollen counting is performed with the flowers fully bloomed.
  • the plants of the invention contain 3% or more RebD per unit mass of dried leaves.
  • a predetermined mass of dried leaves eg, 50 mg
  • the ratio of RebD per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 3.0% or more, 3.1% or more, 3.2% or more, 3.3% or more, 3.4%. Above, 3.5% or more, 3.6% or more, 3.7% or more, 3.8% or more, 3.9% or more, 4.0% or more, 4.1% or more, 4.2% or more, 4.3% or more, 4.4% or more, 4.5% or more, 4.6% or more, 4.7% or more, 4.8% or more, 4.9% or more, 5.0% or more, 5.
  • the dried leaf means a leaf having a water content reduced to 3 to 4% by weight by drying the fresh leaf of the Stevia plant of the present invention.
  • the plant of the present invention contains 2.6% or more RebD and 0.4% or more RebM per unit mass of dried leaves.
  • the ratio of RebD and RebM per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited when (Ratio of RebD: Ratio of RebM) is defined as, for example, (2.6% or more: 0.4% or more).
  • the upper limit of the ratio of RebD per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 20%, 15%, 10%, etc., and the upper limit of the ratio of RebM is also not particularly limited, but 10%, 5%. It may be 3% or the like. As shown in the examples, genetic features A to D are highly relevant to this aspect.
  • the plant of the present invention contains RebD and RevM in total of 3.7% or more per unit mass of dried leaves.
  • the total mass of RebD and RevM contained in a predetermined mass of dried leaves is 3.7% by mass or more (for example, 1.85 mg or more).
  • the total ratio of RebD and RevM per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 3.7% or more, 3.8% or more, 3.9% or more, 4.0% or more. 4.1% or more, 4.2% or more, 4.3% or more, 4.4% or more, 4.5% or more, 4.6% or more, 4.7% or more, 4.8% or more, 4.
  • the plant of the present invention has a total mass ratio of RebD and RebM of 37.8% or more with respect to total steviol glycoside (TSG).
  • TSG total steviol glycoside
  • the total mass of RebD and RevM contained in a leaf for example, dried leaf or fresh leaf
  • RebD + RebM / TSG% as a ratio to the total mass of steviol glycosides obtained from the leaf, it is RebD + RebM.
  • the value of / TSG is 37.8% or more.
  • the values of RebD + RebM / TSG in this embodiment are not limited, for example, 37.8% or more, 37.9% or more, 38.0% or more, 38.1% or more, 38.2% or more, 38.3.
  • the upper limit of the mass ratio of RebD + RevM to the total steviol glycoside is not particularly limited, but may be, for example, 85%, 75%, 65%, 55% or the like. As shown in the examples, genetic features A to D are highly relevant to this aspect.
  • TSG is a general term for measurable steviol glycosides, and does not include unknown steviol glycosides or steviol glycosides present in an amount below the detection limit.
  • the total steviol glycosides are RebA, RebB, RebD, RebE, RebF, RebI, RebJ, RebK, RebM, RebN, RebO, RebQ, RebR, Zulcoside A, Rubusoside, Steviolmonoside, Steviolbioside and Any combination of two or more selected from the group consisting of steviosides.
  • the total steviol glycoside comprises RebA, RebB, RebM, RebD, RevF, RebM and stevioside
  • the total steviol glycoside is RebA, RebB, RebM, RebD, It may consist of RebF, RebM, RebN, RebO and stevioside.
  • the total steviol glycoside comprises RebA, RebB, RebC, RebD, RebF, RebM, RebN and RebO.
  • the plant of the present invention contains 0.2% or more of RebM per unit mass of dried leaves.
  • the ratio of RevM per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 0.20% or more, 0.25% or more, 0.30% or more, 0.35% or more, 0.40%.
  • 0.45% or more 0.50% or more, 0.55% or more, 0.60% or more, 0.65% or more, 0.70% or more, 0.75% or more, 0.80% or more, 0.85% or more, 0.90% or more, 0.95% or more, 1.00% or more, 1.05% or more, 1.10% or more, 1.15% or more, 1.20% or more 1. It may be 25% or more, 1.30% or more, 1.35% or more, 1.40% or more, 1.45% or more, preferably 0.4% or more.
  • the upper limit of the ratio of RevM per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 15%, 10%, 5% or the like. As shown in the examples, genetic feature B is highly relevant to this aspect.
  • the plant of the present invention has a mass ratio of RevM to total steviol glycoside of 2% or more.
  • a mass ratio of RevM to total steviol glycoside of 2% or more.
  • This is, for example, when the mass of RebM contained in a leaf (for example, dried leaf or fresh leaf) is expressed in RebM / TSG% as a ratio to the total mass of steviol glycosides obtained from the leaf, it is RebM / TSG. It means that the value is 2% or more.
  • the value of RebM / TSG in this embodiment is not limited, for example, 2% or more, 2.5% or more, 3% or more, 3.5% or more, 4% or more, 4.5% or more, 5% or more.
  • the upper limit of the mass ratio of RevM to the total steviol glycoside is not particularly limited, but may be, for example, 50%, 45%, 40%, 35% or the like. As shown in the examples, genetic feature B is highly relevant to this aspect.
  • the plant of the present invention is a wild-type Stevia species when the amount (g) of rebaugioside M contained in 100 g of leaves (for example, dried leaves or fresh leaves) of a wild-type Stevia plant is 100%.
  • a wild-type Stevia species when the amount (g) of rebaugioside M contained in 100 g of leaves (for example, dried leaves or fresh leaves) of a wild-type Stevia plant is 100%.
  • the plant of the present invention contains 1% or more of RebD per unit mass of dried leaves.
  • the ratio of RebD per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited, for example, 1.00% or more, 1.05% or more, 1.10% or more, 1.15% or more, 1.20%.
  • 1.25% or more 1.30% or more, 1.35% or more, 1.40% or more, 1.45% or more, 1.50% or more, 1.55% or more, 1.60% or more, 1.65% or more, 1.70% or more, 1.75% or more, 1.80% or more, 1.85% or more, 1.90% or more, 1.95% or more, 2.00% or more, 2.
  • the plant of the present invention has a lower limit of the value of RevM / RevD of 0.2 or more when the content of RevM and RevD in the leaves (for example, dried leaves or fresh leaves) is expressed by the ratio of RevM / RevD. , 0.3 or more, 0.4 or more, 0.5 or more, 0.6 or more, 0.8 or more, 1.0 or more.
  • the upper limit of the RebM / RebD value is 0.3 or less, 0.4 or less, 0.5 or less, 0.6 or less, 0.8 or less, 1.0 or less, 1.1 or less, 1.2 or less. Is.
  • the combination of the lower limit and the upper limit is not particularly limited as long as the upper limit value exceeds the lower limit value, but is preferably 0.2 or more and 1.2 or less, or 0.6 or more and 1.1 or less. As shown in the examples, genetic feature B is highly associated with this aspect.
  • the plant of the present invention is (RebD + RevM) when the content of RevM and RevD in leaves (eg, dried or fresh leaves) is expressed as (RebD + RevM) / TSG% as a ratio to the total amount of steviol glycosides. ) /
  • the lower limit of the TSG value is 14% or more, 16% or more, 18% or more, 20% or more, 22% or more, 24% or more, 26% or more, 28% or more, 30% or more, 32% or more, 34%. These are 36% or more and 38% or more.
  • the upper limit of the value of (RebD + RevM) / TSG is 18% or less, 20% or less, 22% or less, 24% or less, 26% or less, 28% or less, 30% or less, 32% or less, 34% or less, 36. % Or less, 38% or less, 40% or less.
  • the combination of the lower limit and the upper limit is not particularly limited as long as the upper limit value exceeds the lower limit value, but is preferably 14% or more and 40% or less, or 16% or more and 40% or less.
  • genetic feature B is highly associated with this aspect.
  • RevD and RevM are extracted in the form of an extract by reacting the fresh or dried leaves of the plant of the present invention with an appropriate solvent (aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone).
  • aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • ethyl acetate and other organic solvents water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass analysis (Time-).
  • RebD can be purified by using known methods such as of-Flight mass spectrometry (TOF-MS) and ultra (High) Performance Liquid Chromatography (UPLC).
  • RevD or RevM can be measured by the method described in Ohta et al. Or WO2010 / 038911 described above, or by the method described in Examples described later. Specifically, it can be measured by sampling fresh leaves from the Stevia plant of the present invention and performing LC / MS-MS.
  • the plant body of the present invention includes not only the whole plant body but also plant organs (for example, leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (for example, epidermis, phloem, parenchyma, xylem, vascular bundle, fence shape). It may include tissues, spongy tissues, etc.) or various forms of plant cells (eg, suspended cultured cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like. Further, the leaves may be the dried leaves described above.
  • the plant body of the present invention may also include tissue culture or plant culture cells. This is because plants can be regenerated by culturing such tissue cultures or plant culture cells.
  • tissue culture or plant culture cell of the plant body of the present invention include embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections and callus. It is not limited.
  • the present invention comprises a step of crossing the Stevia plant of the present invention with a second Stevia plant, which has a lower pollen forming ability than the wild type. (Hereinafter, it may be referred to as "the method for producing the present invention").
  • the “Stevia plant having a lower pollen-forming ability than the wild type” produced by this method has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention.
  • the pollen-forming ability, the range of RebD and RevM contents, etc. in the plant obtained by the production method of the present invention are as described above for the plant of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature X of the present invention. In one aspect, the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature A of the present invention. In another aspect, the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature B of the present invention. In another aspect, the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic features C or D of the present invention. In a preferred embodiment, the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature X and the genetic feature A of the present invention. In another preferred embodiment, the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature X and the genetic feature B of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature X and the genetic feature C or D of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature X, the genetic feature A, and the genetic feature B of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature X, the genetic feature A, and the genetic feature C or D of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic feature X, the genetic feature B, and the genetic feature C or D of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has all of the genetic features X, A, B and C or D of the present invention.
  • crossing means that the plant body (first generation (S1)) of the present invention is crossed with the second plant body (S1), and the child plant body (the present invention) is crossed. It means to obtain a plant body (second generation (S2)) produced by the production method of.
  • second generation (S2)) produced by the production method of.
  • Back crossing means the plant body of the present invention and the second.
  • the offspring plant (S2) born between the plant and the plant is further crossed with the plant of the present invention (that is, the plant having the genetic characteristics of the present invention) (S1) to carry out the genetic characteristics of the present invention. It is a method of producing a plant having the same.
  • the second plant (S1) used in the production method of the present invention has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention, it is substantially. It becomes a crossing back to.
  • the plant of the present invention can be produced by self-fertilization.
  • Self-propagation can be carried out by self-pollinating the stamen pollen of the plant of the present invention to the pistil of the plant of the present invention.
  • the plant produced by the production method of the present invention has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention, the plant produced by the production method of the present invention is further referred to as a third Stevia plant. It is also possible to produce a Stevia plant having a phenotype equivalent to that of the plant of the present invention by crossing with.
  • the plant body of the present invention can also be produced by regenerating the plant body by culturing the tissue culture or plant culture cells described above.
  • the culture conditions are the same as those for culturing wild-type stevia plant tissue cultures or plant culture cells, and are known (Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medical plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123).
  • the plant of the present invention can be produced by introducing a mutation of the present invention into the genome of a Stevia plant.
  • the mutation may be introduced by a gene recombination method or a non-genetically recombinant method.
  • An example of a "non-genetically modified method" is a method of inducing a mutation in a gene of a host cell (or a host plant) without introducing a foreign gene.
  • Such a method includes a method of acting a mutagen of plant cells. Examples of such mutagens include ethyl methanesulfonic acid (EMS) and sodium azide.
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • ethyl methanesulfonic acid is 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%. , 0.9%, 1.0% and the like can be treated with plant cells.
  • the processing time is 1 to 48 hours, 2 to 36 hours, 3 to 30 hours, 4 to 28 hours, 5 to 26 hours, and 6 to 24 hours.
  • the treatment procedure itself is known, it can be carried out by immersing the water-absorbed seeds that have undergone the water-absorbing process in a treatment solution containing a mutagen at the above concentration for the above-mentioned treatment time.
  • a method of irradiating plant cells with radiation such as X-rays, ⁇ -rays, and ultraviolet rays or light rays can be used.
  • cells irradiated with an appropriate ultraviolet irradiation amount can be cultured in a selective medium or the like, and then cells, callus, or plants having the desired trait can be selected. ..
  • the irradiation intensity at that time was 0.01 to 100 Gr, 0.03 to 75 Gr, 0.05 to 50 Gr, 0.07 to 25 Gr, 0.09 to 20 Gr, 0.1 to 15 Gr, 0.1 to 10 Gr, 0.
  • the irradiation distance is 1 cm to 200 m, 5 cm to 100 m, 7 cm to 75 m, 9 cm to 50 m, 10 cm to 30 m, 10 cm to 20 m, 10 cm to 10 m, and the irradiation time is 1 minute to 2 Year, 2 minutes to 1 year, 3 minutes to 0.5 years, 4 minutes to 1 month, 5 minutes to 2 weeks, 10 minutes to 1 week.
  • the intensity, distance and time of irradiation vary depending on the radiation type and the state (cell, callus, plant) to be irradiated, but can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • plant cells may be mutated during culture, so it is preferable to return them to individual plants for more stable trait maintenance.
  • Plants having a plurality of different genetic characteristics of the present invention can also be produced by crossing plants having different genetic characteristics of the present invention.
  • a plant having the genetic features X and A of the present invention can be obtained by crossing a plant having the genetic features X of the present invention with a plant having the genetic features A of the present invention. Can be done.
  • a plant having the genetic features A and C or D, a plant having the genetic features B and C or D of the present invention, and the like can also be obtained by the same crossing.
  • the plant having the genetic features X, A, and B of the present invention includes a plant having the genetic features X and A of the present invention and a plant having the genetic features B of the present invention.
  • a plant having the genetic features X, B and C or D of the present invention, a plant having the genetic features A, B and C or D of the present invention, and the like can also be obtained by the same crossing.
  • the crossing is preferably carried out for two or more generations, but when the genetic characteristics are heterozygous or the like, a plant having a desired combination of genetic characteristics may be obtained in one generation.
  • the present invention comprises the step of detecting the presence and / or absence of at least one of the genetic features X, A, B, C and D of the present invention from the genome of a test plant.
  • the screening method of the present invention is a method for screening a Stevia plant having a low level.
  • the genetic feature to be detected is the genetic feature X of the present invention. In another embodiment, the genetic feature to be detected is the genetic feature A of the present invention. In another embodiment, the genetic feature to be detected is the genetic feature B of the present invention. In another embodiment, the genetic feature to be detected is the genetic feature C of the present invention. In another embodiment, the genetic feature to be detected is the genetic feature D of the present invention. In a preferred embodiment, the genetic features to be detected are the genetic features X and A of the present invention. In another preferred embodiment, the genetic features to be detected are the genetic features X and B of the present invention. In another preferred embodiment, the genetic features to be detected are the genetic features X and the genetic features C or D of the present invention.
  • the genetic features to be detected are the genetic feature X, the genetic feature A, and the genetic feature B of the present invention. In another preferred embodiment, the genetic features to be detected are the genetic feature X, the genetic feature A, and the genetic feature C or D of the present invention. In another preferred embodiment, the genetic features to be detected are the genetic feature X, the genetic feature B, and the genetic feature C or D of the present invention. In a more preferred embodiment, the genetic features to be detected are all of the genetic features X, A, B and C or D of the present invention.
  • the screening method of the present invention may further include a step of selecting a plant from which the presence of at least one of the above genetic features has been detected from among the test plants.
  • X-1 An allele in which the base at the position corresponding to position 79 of SEQ ID NO: 151 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 160, 161 or 162).
  • X-2) An allele in which the base at the position corresponding to position 65 of SEQ ID NO: 152 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 163, 164 or 165).
  • X-3) An allele in which the base at the position corresponding to the 24th position of SEQ ID NO: 153 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 166, 167 or 168).
  • (B-3) An allele in which the base at the position corresponding to position 48 of SEQ ID NO: 4 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 72).
  • (B-4) An allele in which the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 is deleted (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 73), and (C) Corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6.
  • An allele in which the base at the position is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 74) Detection of the presence of an allele selected from the group consisting of and / or (X-1) An allele in which the base at the position corresponding to position 79 of SEQ ID NO: 151 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 185, 186 or 187). (X-2) An allele in which the base at the position corresponding to position 65 of SEQ ID NO: 152 is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 188, 189 or 190).
  • (X-3) An allele in which the base at the position corresponding to the 24th position of SEQ ID NO: 153 is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 191, 192 or 193).
  • (B-2) An allele in which the base at the position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 3 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 3).
  • (B-3) An allele in which the base at the position corresponding to the 48th position of SEQ ID NO: 4 is G (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 4).
  • (B-4) An allele in which the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 is not deleted (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 5), and (c) Corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6.
  • An allele in which the base at the position is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 6) It can be determined by the detection of the absence of an allele selected from the group consisting of.
  • (B-3) An allele in which the base at the position corresponding to position 48 of SEQ ID NO: 4 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 72).
  • (B-4) An allele in which the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 is deleted (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 73), and (C) Corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6.
  • An allele in which the base at the position is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 74) Detection of the absence of alleles selected from the group consisting of and / or (X-1) An allele in which the base at the position corresponding to position 79 of SEQ ID NO: 151 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 185, 186 or 187). (X-2) An allele in which the base at the position corresponding to position 65 of SEQ ID NO: 152 is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 188, 189 or 190).
  • (X-3) An allele in which the base at the position corresponding to the 24th position of SEQ ID NO: 153 is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 191, 192 or 193).
  • (B-2) An allele in which the base at the position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 3 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 3).
  • (B-3) An allele in which the base at the position corresponding to the 48th position of SEQ ID NO: 4 is G (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 4).
  • (B-4) An allele in which the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 is not deleted (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 5), and (c) Corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6.
  • An allele in which the base at the position is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 6) It can be determined by detecting the presence of an allele selected from the group consisting of.
  • Specific examples of the method for detecting the genetic features of the present invention include PCR method, TaqMan PCR method, sequencing method, microarray method, invader method, TILLING method, RAD method, RFLP method, PCR-SCSP method, AFLP method, and SSLP method.
  • a primer such that the 3'end portion has a sequence complementary to the polymorphic site of the present invention.
  • the primer designed in this way when the sample to be the template has a polymorphism, the primer completely hybridizes to the template, so that the polymerase extension reaction proceeds, but the template has the mutation of the present invention. Otherwise, the nucleotide at the 3'end of the primer will mismatch with the template and no extension reaction will occur. Therefore, if PCR amplification is performed using such a primer, the amplification product is analyzed by agarose gel electrophoresis or the like, and an amplification product of a predetermined size can be confirmed, the template as a sample has a mutation.
  • the primer sequence is designed so that the polymorphism of the present invention and the primer sequence do not overlap and the gene mutation of the present invention can be PCR-amplified, and the base sequence of the amplified nucleotide fragment is sequenced. Therefore, the genetic features of the present invention can be detected.
  • PCR and agarose gel electrophoresis see: Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the TaqMan PCR method is a method that utilizes a fluorescently labeled allele-specific oligo and a PCR reaction with Taq DNA polymerase (Livak, KJ Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. . Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)).
  • the sequencing method is a method of analyzing the presence or absence of mutation by amplifying a region containing a mutation by PCR and sequencing a DNA sequence using a Dye Terminator or the like (Sambrook, Fritsch and Maniatis described above).
  • a DNA microarray is one in which one end of a nucleotide probe is fixed in an array on a support, and includes a DNA chip, a Gene chip, a microchip, a bead array, and the like. By using a probe containing a sequence complementary to the polymorphism of the present invention, the presence or absence of the polymorphism of the present invention can be comprehensively detected.
  • DNA microarray assays such as DNA chips include the GeneChip assay (see Affymetrix; US Pat. Nos. 6,045,996, 5,925,525, and 5,858,659). GeneChip technology utilizes a miniaturized, high-density microarray of oligonucleotide probes attached to the chip.
  • the invader method is a special method in which two types of reporter probes specific to each allele of a polymorphism such as SNP and one type of invader probe are hybridized to template DNA, and the structure of the DNA is recognized and cleaved.
  • a combination of DNA cleavage by a Cleavase enzyme with endonuclease activity (Livak, KJ Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933). (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993), etc.).
  • the TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) method is a method for screening mutation mismatches in the genome of a mutated mutant population by PCR amplification and CEL I nuclease treatment.
  • the genetic features X-1 of the invention are a primer set capable of amplifying a region containing the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 160-162, and SEQ ID NOs: 160-162, without limitation. Does not cleave the polynucleotides of SEQ ID NOs: 185 to 187 but not restriction enzymes (eg, AluI) or the polynucleotides of SEQ ID NOs: 160 to 162, but does not cleave the polynucleotides of SEQ ID NOs: 185 to 187. It can be detected by the CAPS method using a restriction enzyme.
  • Non-limiting examples of primer sets include the following. Forward primer: ACGGTTTACACTCTCAGTCATTCC (SEQ ID NO: 169) Reverse primer: GCCAGTCATCATATAATCATCCACAA (SEQ ID NO: 170)
  • the genetic features X-2 of the invention are a primer set capable of amplifying a region containing the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 163 to 165 and SEQ ID NOs: 163 to 165, without limitation. Does not cleave the polynucleotides of SEQ ID NOs: 188-190 but not restriction enzymes (eg, Tsp45I) or the polynucleotides of SEQ ID NOs: 163-165, but does not cleave the polynucleotides of SEQ ID NOs: 188-190. It can be detected by the CAPS method using a restriction enzyme.
  • Non-limiting examples of primer sets include the following. Forward primer: ACGGTTTACACTCTCAGTCATTCC (SEQ ID NO: 169) Reverse primer: GTCGAGCTTACAAACCATTTACCA (SEQ ID NO: 175)
  • the genetic feature X-3 of the present invention can be detected, without limitation, by the dCAPS method using the following primer sets and restriction enzymes.
  • ⁇ Primer set A forward primer containing any contiguous 15 or more base sequences (eg, SEQ ID NO: 169) located 5'from position 257 of SEQ ID NO: 181 or 184, and a sequence selected from SEQ ID NOs: 180, 194 to 201.
  • a primer set comprising a reverse primer containing a contiguous sequence 15-29 bases long from the 3'end.
  • the primer sequence can be optimized within the range satisfying the above conditions.
  • each of the above primers may have a length of 15 to 50 bases, a length of 18 to 48 bases, a length of 20 to 45 bases, a length of 30 to 65 bases, or the like.
  • Restriction enzymes The restriction enzymes corresponding to each of SEQ ID NOs: 180 and 194 to 201 are shown below.
  • the genetic feature X-3 of the present invention can be detected by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzymes.
  • the genetic feature A of the invention is a primer set capable of amplifying a region containing the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 19-21 and a poly of SEQ ID NOs: 19-21, without limitation.
  • Restriction enzymes that cleave nucleotides but not polynucleotides of SEQ ID NOs: 75-77 or restriction enzymes that do not cleave polynucleotides of SEQ ID NOs: 19-21 but cleave polynucleotides of SEQ ID NOs: 75-77 (eg, Hpy188I) ) And can be detected by the CAPS method.
  • Non-limiting examples of primer sets include the following. Forward primer: ATGGTTTGGGAATAGCTCTGTTGTT (SEQ ID NO: 37)
  • Reverse primer AGAACTTTGTTCTTGAACCCTTG (SEQ ID NO: 38)
  • the genetic feature B of the present invention can be detected without limitation by the dCAPS method or the like using the following primer set and restriction enzyme.
  • B-1 A primer set containing a forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 46.
  • B-2) A primer set containing a forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 50 and a reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 51.
  • (B-3) A primer set containing a forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 56, or (B-4) Forward containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 60.
  • the primer set is not limited to the one having the sequence of SEQ ID NO: 45, 46, 50, 51, 55, 56, 60 or 61.
  • the primer set of SEQ ID NO: 45, 50, 55 or 60 Any sequence that has a sequence from the 3'end to 15 bases upstream (see the table below) may be used as a reverse primer from the 3'end to 15 bases upstream of SEQ ID NO: 46, 51, 56 or 61. Any one having the sequence of (see the table below) at the 3'end.
  • Such primers may have a length of 15 to 50 bases and a length of 20 to 45 bases.
  • the primer set is not limited to those having the sequence of SEQ ID NO: 45, 46, 50, 51, 55, 56, 60 or 61, for example, as a forward primer, any of SEQ ID NOs: 45, 50, 55, or 60. It may have or contain a sequence of 15 or more consecutive bases, and the reverse primer may have or contain any consecutive sequence of 15 or more bases in SEQ ID NO: 46, 51, 56 or 61. .. (B-1'') Primer comprising a forward primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 45 and a reverse primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 46.
  • Primer comprising a forward primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 50 and a reverse primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 51.
  • set, (B-3'') Primer comprising a forward primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 55 and a reverse primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 56.
  • a set, or (B-4'') forward primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 60 and a reverse primer having or containing any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 61.
  • Such a primer may have a length of 15 to 50 bases, a length of 20 to 45 bases, or a length of 30 to 65 bases as long as the arbitrary continuous sequence of 15 bases or more is present at the 3'side terminal. Good.
  • restriction enzymes to be combined with the above primers include the following.
  • the genetic features C or D of the present invention can be detected by the dCAPS method using the following primer sets and restriction enzymes.
  • ⁇ Primer set A sequence selected from SEQ ID NOs: 86 to 109, 150 located at the 3'end, and any contiguous sequence following the 28th to 5'side of SEQ ID NO: 6 added to the 5'end of the sequence by arbitrary selection.
  • a sequence complementary to a forward primer containing eg, a contiguous sequence of arbitrary length
  • any contiguous sequence of 20 or more bases located 3'from position 50 of SEQ ID NO: 6 eg, sequence.
  • the primer sequence can be optimized within the range satisfying the above conditions.
  • each of the above primers may have a length of 15 to 50 bases, a length of 18 to 48 bases, a length of 20 to 45 bases, a length of 30 to 65 bases, or the like.
  • Restriction enzymes The restriction enzymes corresponding to each of SEQ ID NOs: 86 to 109 and 150 are shown below. In the following sequence, “R” represents A or G and “Y” represents C or T.
  • the genetic features C or D of the present invention can be detected by the dCAPS method using the following primer sets and restriction enzymes.
  • the screening method of the present invention may further include a step of evaluating the pollen-forming ability of the test Stevia plant in which the genetic features of the present invention have been detected.
  • the evaluation of pollen forming ability is as described in the section of the plant body of the present invention.
  • an individual having a low pollen-forming ability is selected and crossed with another Stevia plant to obtain a child plant.
  • the screening method of the present invention may be applied to the body. Therefore, the screening method of the present invention may include one or more of the following steps.
  • (Ii) A step of evaluating the pollen-forming ability of a test Stevia plant tissue in which the genetic features of the present invention have been detected. (Iii) A step of selecting an individual having a low pollen-forming ability from among the test Stevia plants in which the genetic features of the present invention have been detected. (Iv) A step of mating a selected individual with low pollen-forming ability with another Stevia plant, (V) A step of detecting the genetic feature of the present invention (for example, the genetic feature X of the present invention) from the genome of a child plant obtained by mating.
  • the genetic feature of the present invention for example, the genetic feature X of the present invention
  • the selected individuals with low pollen-forming ability are, for example, the top 50%, the top 40%, and the top 30% of the test Stevia plants in which the genetic features of the present invention have been detected, regarding the low pollen-forming ability. , Top 20%, Top 10%, Top 5%, Top 4%, Top 3%, Top 2%, Top 1%, and the like.
  • other Stevia plants to be mated may or may not contain the genetic features of the present invention.
  • steps (iv) to (vii) can be repeated a plurality of times. In this way, Stevia plants with lower pollen-forming ability can be screened.
  • the test Stevia plant may be a natural plant or a non-genetically modified plant.
  • the non-genetically modified plant is as described in the section of the plant of the present invention.
  • the test Stevia plant may include a Stevia plant that has undergone mutagenesis treatment and a progeny plant thereof.
  • the mutagenesis treatment is as described in the section of the plant body of the present invention, and includes treatment with a mutagenesis agent, treatment with radiation or light irradiation, and the like.
  • the present invention also includes the primer set described above, for example, a primer set containing the forward primer of SEQ ID NO: 169 and the reverse primer of SEQ ID NO: 170, the forward primer of SEQ ID NO: 169 and the reverse primer of SEQ ID NO: 175.
  • Primer set including, the primer set shown in Table 2, the primer set containing the forward primer of SEQ ID NO: 37 and the reverse primer of SEQ ID NO: 38, (B-1) to (B-4), (B).
  • the primer set described in the above is provided.
  • the present invention further relates to a primer set capable of amplifying a region having a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 151 to 153, 202 to 204, 1 to 6, 69 to 74 by PCR, for example, SEQ ID NO: 154.
  • Primer set a primer set containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, a reverse primer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, a forward primer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12
  • the present invention provides a probe (hereinafter, may be referred to as "probe of the present invention") capable of detecting the presence and / or absence of a genetic feature of the present invention.
  • the probe of the present invention may have a structure suitable for various detection methods in the presence and / or absence of the genetic features of the present invention.
  • the probe of the present invention may contain a base sequence complementary to a portion of the genome containing the mutation site of the present invention.
  • Non-limiting examples of such probes include those containing a base sequence selected from SEQ ID NOs: 160 to 168, 185 to 193, 19 to 36, 75 to 77, and 135 to 149.
  • SEQ ID NOs: 160-168 and 19-36 are specific for alleles containing the mutations of the present invention, and SEQ ID NOs: 185-193, 75-77 and 135-149 contain the mutations of the present invention. Not specific to alleles.
  • the presence of genetic features of the invention can be detected by detection of alleles containing mutations of the invention and / or non-detection of alleles not containing mutations of the invention, and the absence of genetic features of the invention is It can be detected by non-detection of alleles containing mutations of the present invention and / or detection of alleles not containing mutations of the present invention.
  • the probe of the present invention preferably has a label.
  • the probe of the present invention comprises a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 160-168, 185-193, 19-36, 75-77, 135-149 and a label. Have.
  • the present invention further comprises a primer set capable of amplifying a region containing the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 160 to 162, for example, a forward primer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 169 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 170.
  • a restriction enzyme eg, AluI
  • a restriction enzyme eg, AluI
  • Kits are provided that contain restriction enzymes that do not cleave the polynucleotides, but the polynucleotides of SEQ ID NOs: 185 to 187, such as screening kits.
  • the present invention further comprises a primer set capable of amplifying a region containing the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 163 to 165, for example, a forward primer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 169 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 175.
  • a restriction enzyme eg, Tsp45I
  • Kits are provided that contain restriction enzymes that do not cleave the polynucleotides, but the polynucleotides of SEQ ID NOs: 188-190, such as screening kits.
  • the present invention is further selected from a forward primer containing any contiguous 15 or more base sequences (eg, SEQ ID NO: 169) located 5'from position 257 of SEQ ID NO: 181 and SEQ ID NOs: 180, 194 to 201.
  • a forward primer containing any contiguous 15 or more base sequences eg, SEQ ID NO: 169 located 5'from position 257 of SEQ ID NO: 181 and SEQ ID NOs: 180, 194 to 201.
  • a kit containing a reverse primer containing a contiguous sequence 15 to 25 bases long from the 3'end of the sequence, eg, the primer set shown in Table 2, and a corresponding restriction enzyme, eg, screening. Provide a kit for.
  • the present invention further comprises a primer set capable of amplifying a region containing the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 19 to 21, such as a forward primer containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • Primer sets containing a combination with reverse primers and polynucleotides of SEQ ID NOs: 19-21 are cleaved, but polynucleotides of SEQ ID NOs: 75-77 are not cleaved. Restriction enzymes or polynucleotides of SEQ ID NOs: 19-21 are not cleaved.
  • a kit containing a restriction enzyme eg, Hpy188I that cleaves the polynucleotides of SEQ ID NOs: 75 to 77, such as a screening kit, is provided.
  • the present invention further comprises a group consisting of (B-1) to (B-4), (B-1') to (B-4') and (B-1'') to (B-4'') described above.
  • Kits comprising any one or more primer sets selected from the above and optionally restriction enzymes, such as screening kits, are provided.
  • the restriction enzyme used is KpnI.
  • the restriction enzyme used is XbaI.
  • the kit includes the kit.
  • the restriction enzyme used is AflII.
  • the present invention further follows the sequence selected from SEQ ID NOs: 86 to 109, 150 located at the 3'end and the 28th to 5'sides of SEQ ID NO: 6 optionally added to the 5'end of the sequence.
  • a forward primer containing any contiguous sequence (eg, a contiguous sequence of any length) and any contiguous sequence of 20 or more bases located 3'from position 50 of SEQ ID NO: 6.
  • a kit containing a primer set comprising a reverse primer containing the sequence (eg, SEQ ID NOs: 65, 110), eg, the primer set shown in Table 6 above, and a corresponding limiting enzyme, eg, a screening kit. provide.
  • the restriction enzyme comprises KpnI. If the primer set contains a forward primer that has or contains any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 50, the restriction enzyme comprises XbaI. If the primer set contains a forward primer that has or contains any contiguous 15 or more bases sequence in SEQ ID NO: 55, the restriction enzyme comprises AflII.
  • the present invention is also a primer set capable of amplifying a region having a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 160 to 168, 185 to 193, 1 to 6, 19 to 36, 69 to 77, 135 to 149 by PCR. And a screening kit including the probe of the present invention.
  • primer sets, probes and kits can be used for detecting the genetic features of the present invention, used for the screening method of the present invention, and the like.
  • these primer sets and kits include instructions including detection of genetic features of the present invention and explanations of the screening method of the present invention, such as instructions for use and media on which information about the method of use is recorded, for example.
  • Flexible discs, CDs, DVDs, Blu-ray discs, memory cards, USB memory sticks and the like may be included.
  • a method for producing a plant-derived extract and a product using the extract is obtained from the plant of the present invention or the seeds or leaves (for example, dried leaves or fresh leaves) of the plant.
  • a method for producing a stevia extract (hereinafter, may be referred to as "method for producing an extract of the present invention") including a step of obtaining the extract is provided.
  • a method for producing a steviol glycoside refined product which comprises a step of purifying a steviol glycoside from the extract obtained by the method for producing an extract of the present invention (hereinafter, "the steviol glycoside refined product of the present invention”). (Sometimes referred to as "manufacturing method”) is provided.
  • a method for producing a refined steviol glycoside product comprises a step of purifying a steviol glycoside from the obtained extract.
  • the extract containing the steviol glycoside can be obtained by reacting the fresh or dried leaves of the plant of the present invention with an appropriate solvent (an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone). It can.
  • an appropriate solvent an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • an appropriate solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • an appropriate solvent an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • extracts containing steviol glycosides are mixed with ethyl acetate and other organic solvents: water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight.
  • Individual steviol glycosides can be purified by using known methods such as mass spectrometry (TOF-MS) and ultra (High) Performance Liquid Chromatography (UPLC).
  • steviol glycosides examples include RebA, RebB, RebC, RebD, RebE, RebF, RebI, RebJ, RebK, RebM, RebNRebO, RebQ, RebR, Zulcoside A, Rubusoside, Steviolmonoside, Steviolbioside, Stevioside and the like. Be done.
  • the steviol glycoside comprises RebA, RebB, RebC, RebD, RebE, RebF, RebM, RebN, RebO, stevioside, steviolbioside, rubusoside, zulucoside A or a combination thereof.
  • the steviol glycoside comprises RebD, RevM, or a combination thereof.
  • the extract obtained by the method for producing the extract of the present invention contains RebD, RevM or both in a higher content as compared with the wild-type Stevia species.
  • the extract of the present invention contains 300% or more, 400% or more, 500% or more, 600% or more, 700% or more, 800% or more of RebD, RebM or both as compared with the extract obtained from the wild-type Stevia species.
  • the present invention is a step of mixing the steviol glycoside refined product obtained by the extract of the present invention and / or the method for producing the steviol glycoside refined product of the present invention with other components.
  • the present invention provides pharmaceuticals, flavors or foods and drinks containing steviol glycosides obtained by the above-mentioned production method.
  • food and drink means beverages and foods. Therefore, in certain embodiments, the present invention provides pharmaceuticals, flavors, beverages or foods, and also provides methods for producing such pharmaceuticals, flavors, beverages or foods.
  • the present invention provides a nucleotide sequence of the Stevia plant of the present invention.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic feature X-1 contains or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 160-162, 202.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic feature X-2 comprises or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 163 to 165, 203.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic feature X-3 comprises or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 166 to 168, 204.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having genetic feature A comprises or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 19-21, 69.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic feature B-1 contains or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 22 to 24 and 70.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic feature B-2 contains or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 25 to 27, 71.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic feature B-3 contains or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 28-30 and 72.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic feature B-4 comprises or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 31-33, 62, 73.
  • the nucleotide sequence of a Stevia plant having the genetic characteristics C or D comprises or consists of a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 34-36, 74.
  • Example 1 Verification of the relationship between RevM content and genetic feature B (1) Based on commercially available Stevia seeds, individuals are selected based on growth conditions, leaf morphology, total steviol glycoside (TSG), RebA, RebD, and RevM contents, etc., and two isolated populations, I and II populations. Got Verification was performed using 62 individuals from the I population and 109 individuals from the II population. Each individual was divided into 3 groups of 0.2% or more, 0.1% or more to less than 0.2%, and 0% or more to less than 0.1% based on the RevM content, and the presence or absence of genetic feature B-1 was observed. investigated.
  • TSG total steviol glycoside
  • RebA RebA
  • RebD RevM contents
  • PCR was carried out using the following primers, a restriction enzyme (KpnI) was added to the PCR product, an enzymatic reaction was carried out at 37 ° C., and a treatment with the restriction enzyme was carried out. After the restriction enzyme treatment, electrophoresis was performed with a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • the primer sequence is as follows.
  • Fw primer 5'-TAATCATCCAAACCCTAATCTCGCCAAACAAACCGGGTAC-3'(SEQ ID NO: 45)
  • Rv primer 5'-GAGAGACATTGGCAACTC-3'(SEQ ID NO: 46)
  • the obtained PCR product (about 297 bp in length) was treated with a KpnI restriction enzyme, and those that did not produce a restriction enzyme-treated product of about 260 bp (for example, SEQ ID NO: 49) were regarded as B-1 positive.
  • SEQ ID NO: 49 for example, SEQ ID NO: 49
  • the group containing 0.2% or more was preferentially detected by this genetic feature, and it was proved that the frequency of occurrence of positive individuals was statistically significantly different between the groups (by chi-square test).
  • the goodness-of-fit test and null hypothesis assume that the marker test results and phenotypes are not linked and the frequency distribution is even. See the table below for the test results).
  • Example 2 Verification of the relationship between RevM content and genetic feature B (2)
  • individuals with a RevM ratio of 2% or more could be selected even in isolated populations other than the verification population as shown in the table below, which is a practical selection. It was confirmed that it could be a marker.
  • the selection results of high RevM plants are shown in the table below. " ⁇ " in the table indicates that the test result of genetic feature B is positive.
  • the genetic feature B-1 was detected in the same manner as in Example 1, and the genetic features B-2 to B-4 were detected as follows.
  • PCR was performed using the following primers, a restriction enzyme (XbaI) was added to the PCR product, an enzymatic reaction was performed at 37 ° C., and treatment with the restriction enzyme was performed. After the restriction enzyme treatment, electrophoresis was performed with a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • XbaI restriction enzyme
  • electrophoresis was performed with a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • Fw primer 5'-AAGGTTCTTTATTTTTAAACTTATTGTTAATTTTATTGTATTTAG-3'(SEQ ID NO: 50)
  • Rv primer 5'-CCTTAGTACACATGCTACAC-3'(SEQ ID NO: 51)
  • the obtained PCR product (about 383 bp in length) was treated with an XbaI restriction enzyme, and those that did not produce a restriction enzyme-treated product of about 344 bp (for example, SEQ ID NO: 54) were regarded as B-2 positive.
  • PCR was performed using the following primers, a restriction enzyme (AflII) was added to the PCR product, an enzymatic reaction was performed at 37 ° C., and treatment with the restriction enzyme was performed. After the restriction enzyme treatment, electrophoresis was performed with a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • the primer sequence is as follows.
  • Fw primer 5'-CGATGGTTTTTGCTACATGAAAACCTAGAAGACGAAAACCCGCTTAA-3'(SEQ ID NO: 55)
  • Rv primer 5'-ACCAGCAATAATCCTTGAATTGA3'(SEQ ID NO: 56)
  • the obtained PCR product (about 390 bp in length) was treated with an AflII restriction enzyme, and those that did not produce a restriction enzyme-treated product of about 347 bp (for example, SEQ ID NO: 59) were regarded as B-3 positive.
  • PCR was performed using the following primers to detect genetic feature B-4.
  • the PCR product was electrophoresed on a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • the primer sequence is as follows. Fw primer: 5'-CGCAAAACCGTATATAC-3'(SEQ ID NO: 60)
  • Those producing only about 140 bp of PCR product (eg, SEQ ID NO: 62) were considered B-4 positive.
  • Example 3 Verification of association between high TSG Stevia plants and genetic feature C (1) Isolation of individuals with high sweetness component (M0 generation) Approximately 2000 wild-type stevia seeds (commercially available, introduced in August 2014) (weight equivalent) are divided into three, and 0.1%, 0.2% or 0.3% ethylenemethane is used for each. Genetic modification was performed by treating with sulfonic acid (EMS). The EMS-treated seeds and untreated seeds were sown in a greenhouse in the Suntory Research Center to obtain EMS-treated current generation (M0 generation) seedlings. No difference in germination rate was observed between the treatment concentrations.
  • EMS sulfonic acid
  • LC / MS-MS analysis was performed on this extract in LCMS8050 ion mode (Shimadzu LCMS8050) to quantify the concentrations of RebA, RebB, RebC, RebD, RebF, RebM, RebN and RebO, and the total was the concentration of the sweetening component. And said.
  • An individual having a sweetness component concentration of about 20% was designated as a parent individual 1 (P1).
  • P2 an individual derived from another Stevia plant population having a sweetness component concentration of 5% in the dried leaves was selected.
  • which of the 306 mutations has sufficient genomic information (sequence coverage is x5 or more), is not continuous, and has no sequence insertions or deletions? It was examined whether it exists in the individual. As a result, it was clarified that the mutation from C to A (C49A) at position 49 of SEQ ID NO: 1 is present in the individual having a high content of the sweetness component but not in the individual having a low content of the sweetness component.
  • Example 4 Verification of the relationship between high RevD Stevia plants and genetic features A to C 1. Preparation of test line A male strain (P1) having a high TSG-containing genetic characteristic and a female strain (P2) having a high RebM-containing genetic characteristic were crossed to produce a F1 hybrid (S1 generation) seed. Was sown and sown in the greenhouse in the Suntory Research Center to obtain S1 generation seedlings.
  • the genetic characteristics of the high RevM-containing form have at least one of the following characteristics: B-1: Homozygous for alleles where the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T.
  • B-2 Homozygous for alleles whose base is T at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3.
  • B-3 Homozygous for alleles whose base is C at the position corresponding to position 48 of SEQ ID NO: 4.
  • B-4 Homozygous for alleles lacking the portion corresponding to positions 55-72 of SEQ ID NO: 5.
  • these genetic features relate to high RevM content characteristics.
  • the genetic characteristics of the high TSG-containing type have the following characteristics.
  • C Heterozygous for alleles whose base is A at the position corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6.
  • the above genetic characteristics relate to high TSG-containing characteristics.
  • P1 and P2 are both progeny of individuals whose genes have been modified by ethyl methanesulfonic acid (EMS) treatment.
  • EMS ethyl methanesulfonic acid
  • Genomic DNA was extracted from the fresh leaves of each individual tested in Example 4 and the possession status of genetic characteristics B-1 and C was investigated. ..
  • PCR was carried out using the following primers, a restriction enzyme (KpnI) was added to the PCR product, an enzymatic reaction was carried out at 37 ° C., and treatment with the restriction enzyme was carried out. After the restriction enzyme treatment, electrophoresis was performed with a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • KpnI restriction enzyme
  • electrophoresis was performed with a microchip-type electrophoresis device LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • the primer sequence is as follows.
  • Fw primer 5'-TAATCATCCAAACCCTAATCTCGCCAAACAAACCGGGTAC-3'(SEQ ID NO: 45)
  • Rv primer 5'-GAGAGACATTGGCAACTC-3'(SEQ ID NO: 46)
  • the obtained PCR product (about 297 bp in length) was treated with a KpnI restriction enzyme, and those that did not produce a restriction enzyme-treated product of about 260 bp (for example, SEQ ID NO: 49) were regarded as genetic feature B-1 positive.
  • PCR was carried out using the following primers, a restriction enzyme (SpeI) was added to the PCR product, and an enzymatic reaction was carried out at 37 ° C. After the restriction enzyme treatment, electrophoresis was performed with a microchip-type electrophoresis apparatus LabChip GX Touch HT (PerkinElmer), and markers were identified by the band pattern after electrophoresis.
  • SpeI restriction enzyme
  • LabChip GX Touch HT LabChip GX Touch HT
  • the present invention makes it possible to provide a stevia plant having a high yield of leaves and steviol glycosides, so that the production of steviol glycosides can be made more efficient. Further, according to the present invention, individuals having a low pollen-forming ability can be selected before pollen is formed, so that breeding efficiency can be improved.

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Abstract

本発明は、野生型ステビア種と比べ花粉形成能が低いステビア植物体を提供する。本発明はまた、そのような花粉形成能の低いステビア植物体を作出する方法、そのような植物体から得られる抽出物やステビオール配糖体精製品も提供する。

Description

花粉形成能の低いステビア植物
　本発明は、花粉形成能が低いステビア植物、その作出方法及びスクリーニング方法等に関する。
　ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物である。ステビアは、砂糖の数十～数百倍の甘味を有する様々な甘味成分を含んでおり、これらの甘味成分は抽出され天然甘味料として用いられている（特許文献１）。しかしながら、ステビアの遺伝子情報や、生体内事象の制御にどのような遺伝子が関与しているか等についてはまだ未知の部分が多い。
WO2018/124142
　ステビアの遺伝子情報のさらなる解明が求められている。
　本発明は、花粉形成能が低いステビア植物体並びに当該植物体の作出方法及びスクリーニング方法等を提供する。
　一態様において、本発明は以下を提供する。

［１］
　野生型に比べ花粉形成能が低いステビア植物体。
［２］
　配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、［１］に記載の植物体。
［３］
　以下の（１）～（７）の遺伝的特徴の少なくとも１つをさらに有する、［１］又は［２］に記載の植物体。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
（６）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である。
（７）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
［４］ 
　以下の（１）～（２）の特徴の少なくとも１つを有する［３］に記載の植物体。
（１）乾燥葉の単位質量当たり３％以上のＲｅｂＤを含む。
（２）乾燥葉の単位質量当たり０．２％以上のＲｅｂＭを含む。
［５］
　非遺伝子組換植物体である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の植物体。
［６］
　突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の植物体。
［７］
　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
［８］
　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［７］に記載の組織、組織培養物又は細胞。
［９］
　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、花粉形成能が低いステビア植物体を作出する方法。
［１０］
　第２の植物体が［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体である、［９］に記載の方法。
［１１］
　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体、［７］又は［８］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
［１２］
　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体、［７］又は［８］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ステビア抽出物の製造方法。
［１３］
　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体、［７］又は［８］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程と、得られた抽出物からステビオール配糖体を精製する工程とを含む、ステビオール配糖体精製品の製造方法。
［１４］
　ステビオール配糖体が、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ又はこれらの組合せを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
　［１１］に記載の抽出物又はその精製品を提供する工程、及び
前記抽出物又は精製品を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
［１６］
　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、という遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、低花粉形成能ステビア植物体をスクリーニングする方法。
［１７］
　被験ステビア植物体のゲノムから以下の（１）～（７）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、［１６］に記載の方法。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
（６）被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である。
（７）被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
［１８］
　遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、［１６］又は［１７］に記載の方法。
［１９］
　被験ステビア植物組織の花粉形成能を評価する工程をさらに含む、［１６］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
　配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、という遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、低花粉形成能ステビア植物体のスクリーニングキット。
［２１］
　以下の（１）～（７）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、［２０］に記載のキット。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
（６）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である。
（７）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
［２２］
　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、［２０］又は［２１］に記載のキット。
［２３］
　配列番号１５１の７９位に相当する位置にＴからＣへの変異を導入する工程、及び／又は、配列番号１５２の６５位に相当する位置にＡからＴへの変異を導入する工程、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置にＡからＴへの変異を導入する工程を含む、低花粉形成能ステビア植物体を作出する方法。
［２４］
　変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、［２３］に記載の方法。
　本発明によって、花粉形成能の低いステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる葉、この葉より得られた抽出物を含む食物や飲料などの提供が可能になる。花粉形成能が低いと、本来花粉形成に使用されるはずの養分が葉の成長に使用され、葉の生産性の向上、ひいては葉に蓄積されるステビオール配糖体含量の増大が期待できる。
図１はＭ１世代個体における甘味成分含有量の頻度分布を示した図である。縦軸は個体数、横軸は乾燥葉中の甘味成分濃度（％）を示す。 図２は分離集団Ａの変異Ｃ４９Ａ陽性個体（Ｃ４９Ａ＋）及び陰性個体(Ｃ４９Ａ－)における甘味成分含有量の分布を示した図である。縦軸は乾燥葉中の甘味成分濃度（％）を、点線は分離集団Ａに属する全個体の甘味成分濃度の平均値をそれぞれ示す。 図３は分離集団Ｂの変異Ｃ４９Ａ陽性個体（Ｃ４９Ａ＋）及び陰性個体(Ｃ４９Ａ－)における甘味成分含有量の分布を示した図である。縦軸は乾燥葉中の甘味成分濃度（％）を、点線は分離集団Ｂに属する全個体の甘味成分濃度の平均値をそれぞれ示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１９年４月１１日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１９－０７５６１１号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．花粉形成能の低いステビア植物体
　本発明は、野生型に比べ花粉形成能が低いステビア植物体（以下、「本発明の植物体」又は「本発明のステビア植物体」と総称する場合がある）を提供する。
　ステビアは、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ　Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔｏｎｉ）の学名を有する植物である。
　「野生型に比べ花粉形成能が低い」とは、例えば、同じ栽培条件で栽培した場合、生じる花粉の数が野生型ステビア植物体より少ないことを意味する。より具体的には、例えば、同じ栽培条件で栽培した場合、十分に開花した花に含まれる花粉の数が野生型ステビア植物体より２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９１．５％以上、９２％以上、９２．５％以上、９３％以上、９３．５％以上、９４％以上、９４．５％以上、９５％以上、９５．５％以上、９６％以上、９６．５％以上、９７％以上、９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上、又は１００％少ないことを意味する。１００％少ないとは、野生型ステビア植物体に１以上の花粉が形成されているときに、花粉が全く形成されていないこと（すなわち花粉の数が０であること）を意味する。また、「野生型に比べ花粉形成能が低い」の代替的な指標として、十分に開花した花に含まれる花粉が５０個以下、例えば４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下であること、を用いてもよい。なお、「十分に開花した」とは、花を横から見たときに少なくとも１つの柱頭が視認できる程度に柱頭が伸長した状態をいう。
　一態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｘ－１」と称する場合がある）、配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｘ－２」と称する場合がある）及び配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｘ－３」と称する場合がある）の少なくとも１つの遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｘ」と称する場合がある）を有する。
　一態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ａ」と称する場合がある）を有する。
　別の態様において、本発明のステビア植物体は、以下の（Ｂ－１）～（Ｂ－４）の少なくとも１つの遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ」と称する場合がある）を有する。
（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－１」と称する場合がある）。
（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－２」と称する場合がある）。
（Ｂ－３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－３」と称する場合がある）。
（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－４」と称する場合がある）。
　別の態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｃ」と称する場合がある）を有する。
　別の態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｄ」と称する場合がある）を有する。
　好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘ（以下、特段の記載がなければ、本発明の遺伝的特徴Ｘ－１～Ｘ－３の少なくとも１つを意味する）と遺伝的特徴Ａとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂ（以下、特段の記載がなければ、本発明の遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４の少なくとも１つを意味する）とを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｃ又はＤとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃ又はＤとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃ又はＤとを有する。より好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ及びＣ又はＤをすべて有する。
　「～に相当する位置（又は部分）」とは、ゲノム中に基準配列（例えば、配列番号１～６、１５１～１５３など）と同一の配列が存在する場合は、ゲノム中に存在するその配列中の位置又は部分（例えば、２０１位、４０位、４４位、４１位、５５～７２位、４９位、７９位、６５位、２４位など）を意味し、ゲノム中に基準配列と同一の配列が存在しない場合は、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を意味する。ゲノム中に基準配列と同一又はそれに相当する配列が存在するかどうかは、例えば、基準配列をＰＣＲで増幅し得るプライマーで、対象となるステビア植物のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物のシーケンシングを行い、得られた配列と基準配列とのアラインメント解析を行うことで決定することができる。基準配列に相当する配列の非限定例としては、例えば、基準配列に対し６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分は、基準配列中の位置又は部分の前後の塩基配列等を考慮して決定することができる。例えば、基準配列とゲノム中の基準配列に相当する配列とのアライメント解析により、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を決定することができる。
　例えば、本発明の遺伝的特徴Ａの「配列番号１の２０１位に相当する位置」を例にとると、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有している場合、「配列番号１の２０１位に相当する位置」はゲノム中の配列番号１と同一の塩基配列からなる部分の５’側から２０１位である。一方、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一ではないがこれに相当する塩基配列からなる部分を有している場合、ゲノムは配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、「配列番号１の２０１位に相当する位置」は、必ずしも配列番号１に相当する部分の５’側から２０１位に該当するわけではないが、配列番号１の２０１位の前後の塩基配列等を考慮し、かかるステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２０１位に相当する位置」を特定することができる。例えば、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１に相当する部分の塩基配列と、配列番号１の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２０１位に相当する位置」を特定することができる。
　「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」は、例えば、配列番号１の塩基配列に対し、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる部分を意味する。
　一部の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、配列番号１の５’末端から１５～２５塩基長の部分の相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマーと、配列番号１の３’末端側から１５～２５塩基長の部分にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。
　ここでは簡潔のため本発明の遺伝的特徴Ａを例に説明したが、本発明の遺伝的特徴Ｘ（遺伝的特徴Ｘ－１～Ｘ－３を含む）、Ｂ（遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４を含む）、Ｃ及びＤについても同様である。
　特定の態様において、「配列番号１５１に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１５４の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５５の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号１５２に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１５６の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５７の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号１５３に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１５８の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５９の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号２に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号３に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号４に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号５に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１６の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号６に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１８の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号１６０、１６１又は１６２の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号１６３、１６４又は１６５の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号１６６、１６７又は１６８の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」は、配列番号１９、２０又は２１の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２２、２３又は２４の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２５、２６又は２７の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号２８、２９又は３０の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレル」は、配列番号３１、３２又は３３の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」は、配列番号３４、３５又は３６の塩基配列を含む。
　ここで、（Ｘ－１）配列番号１５１の７９位に相当する位置、（Ｘ－２）配列番号１５２の６５位に相当する位置、（Ｘ－３）配列番号１５３の２４位に相当する位置、（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置、（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置、（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置、（Ｂ－３）配列番号４の４８位に相当する位置、（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分、及び（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置からなる群から選択される位置を、「本発明の多型部位」又は「本発明の変異部位」と総称することがある。
　また、（Ｘ－１）配列番号１５１の７９位に相当する位置におけるＴからＣへの変異、（Ｘ－２）配列番号１５２の６５位に相当する位置におけるＡからＴへの変異、（Ｘ－３）配列番号１５３の２４位に相当する位置におけるＡからＴへの変異、（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置におけるＣからＡへの変異、（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置におけるＡからＴへの変異、（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置におけるＣからＴへの変異、（Ｂ－３）配列番号４の４８位に相当する位置におけるＧからＣへの変異、（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分の欠失、及び（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置におけるＣからＡへの変異からなる群から選択される変異を、「本発明の多型」又は「本発明の変異」と総称することがある。
　上記の遺伝的特徴は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴は、以下のプライマーセット及び制限酵素の組合せで検出することが可能である。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｘ－１を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号１６９に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１７０に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約１６６ｂｐ長、例えば、配列番号１７１）に対し制限酵素ＡｌｕＩによる処理を行うと、約１２０ｂｐ長（例えば、配列番号１７２）及び約４６ｂｐ長（例えば、配列番号１７３）のバンドが生じる。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号１７４のＰＣＲ産物（約１６６ｂｐ長）が得られ、これに対しＡｌｕＩ制限酵素処理を行っても約１６６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号１７４）しか得られない場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｘ－１を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｘ－２を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号１６９に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１７５に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３４０ｂｐ長、例えば、配列番号１７６）に対し制限酵素Ｔｓｐ４５Ｉによる処理を行うと、約２２５ｂｐ長（例えば、配列番号１７７）及び約１１５ｂｐ長（例えば、配列番号１７８）のバンドが生じる。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号１７９のＰＣＲ産物（約３４０ｂｐ長）が得られ、これに対しＴｓｐ４５Ｉ制限酵素処理を行っても約３４０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号１７９）しか得られない場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｘ－２を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｘ－３を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号１６９に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１８０に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２９３ｂｐ長、例えば、配列番号１８１）に対し制限酵素ＮｌａＩＩＩによる処理を行うと、約２５９ｂｐ長（例えば、配列番号１８２）及び約３４ｂｐ長（例えば、配列番号１８３）のバンドが生じる。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号１８４のＰＣＲ産物（約２９３ｂｐ長）が得られ、これに対しＮｌａＩＩＩ制限酵素処理を行っても約２９３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号１８４）しか得られない場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｘ－３を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ａを有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号３７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号３８に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約１９６ｂｐ長、例えば、配列番号３９）に対し制限酵素Ｈｐｙ１８８Ｉによる処理を行うと、約９６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４１）と約１００ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４２）が生じる。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号４０のＰＣＲ産物（約１９６ｂｐ長）が得られ、制限酵素Ｈｐｙ１８８Ｉにより、約４３ｂｐ（例えば、配列番号４３）及び約５７ｂｐ（例えば、配列番号４４）の制限酵素処理産物を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ａを有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－１を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号４５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長、例えば、配列番号４７）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行っても約２９７ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４７）しか得られない。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号４８のＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）が得られ、制限酵素ＫｐｎＩにより、約２５８ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４９）を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－１を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－２を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長、例えば、配列番号５２）にＸｂａＩ制限酵素処理を行っても約３８３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５２）しか得られない。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号５３のＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）が得られ、制限酵素ＸｂａＩにより約３４４ｂｐ長の制限酵素処理産物（例えば、配列番号５４）を生じた場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－２を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－３を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長、例えば、配列番号５７）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行っても約３９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５７）しか得られない。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号５８のＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）が得られ、制限酵素ＡｆｌＩＩにより約３４７ｂｐ長の制限酵素処理産物（例えば、配列番号５９）を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－３を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－４を有する場合、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うと約１４０ｂｐのＰＣＲ産物（例えば、配列番号６２）のみを生じる。一方、１４０ｂｐ長（例えば、配列番号６２）及び１５８ｂｐ長（例えば、配列番号６３）のＰＣＲ産物を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－４を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｃ又はＤを有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６４に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６５に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３６７ｂｐ長、例えば、配列番号６６）に対し制限酵素ＳｐｅＩで処理を行うと約３６７ｂｐ長（例えば、配列番号６６）及び約３２１ｂｐ長（例えば、配列番号６８）のバンドが得られる。一方、ＰＣＲ増幅により、例えば、配列番号６７のＰＣＲ産物（約３６７ｂｐ長）が得られ、制限酵素ＳｐｅＩにより約３６７ｂｐ長の制限酵素処理産物（例えば、配列番号６７）のみを生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｃ及びＤを有しない。
　上記ｂｐ長に関し、「約」とは、±５ｂｐを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
　花粉形成能は、例えば、既知の任意の手法又は実施例６に記載の手法で評価することができる。花粉形成能評価法の非限定例としては、例えば、以下の手法が挙げられる。
（１）被験ステビア植物体を開花させる。
（２）開花した花に含まれる花粉の数をカウントする。
　被験ステビア植物体は単独で栽培してもよいし、野生型ステビア植物体（対照）と同一環境下で一緒に栽培してもよい。単独で栽培する場合は、上記評価手法に、被験ステビア植物体に形成された花粉の数と、同様の条件下で栽培された野生型ステビア植物体に形成される花粉の数（例えば、文献や別個の実験で得られたデータに基づくもの）とを比較する工程が含まれてもよい。野生型ステビア植物体と一緒に栽培する場合、上記評価手法に、被験ステビア植物体に形成された花粉の数と、一緒に栽培した野生型ステビア植物体に形成された花粉の数とを比較する工程が含まれてもよい。
　開花は短日条件下で誘導することができる。短日条件は、暗期が１０時間超、好ましくは１１時間以上である。具体的な暗期の長さは、例えば、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間などであってよい。
　特定の態様において、花粉のカウントは花が十分開花した状態で行う。
　一態様において、本発明の植物体は乾燥葉の単位質量当たり３％以上のＲｅｂＤを含む。これは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、３質量％以上の割合のＲｅｂＤ（例えば、１．５ｍｇ以上）が含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合は、限定されずに、例えば、３．０％以上、３．１％以上、３．２％以上、３．３％以上、３．４％以上、３．５％以上、３．６％以上、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上等であってよく、３．３％以上が好ましく、３．６％以上がより好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％などであってよい。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ａ～Ｄがこの態様との関連性が高い。
　ここで乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を３～４重量％にまで減らしたものをいう。
　一態様において、本発明の植物体は乾燥葉の単位質量当たり２．６％以上のＲｅｂＤと０．４％以上のＲｅｂＭとを含む。これは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、２．６質量％以上の割合のＲｅｂＤ（例えば、乾燥葉５０ｍｇ当たり１．３ｍｇ以上）と、０．４質量％以上のＲｅｂＭ（例えば、乾燥葉５０ｍｇ当たり０．２ｍｇ以上）とが含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭの割合は、（ＲｅｂＤの割合：ＲｅｂＭの割合）とした場合、限定されずに、例えば、（２．６％以上：０．４％以上）、（２．８％以上：０．４％以上）、（３％以上：０．４％以上）、（３．２％以上：０．４％以上）、（３．４％以上：０．４％以上）、（３．６％以上：０．４％以上）、（３．８％以上：０．４％以上）、（４％以上：０．４％以上）、（４．２％以上：０．４％以上）、（４．４％以上：０．４％以上）、（４．６％以上：０．４％以上）、（４．８％以上：０．４％以上）、（５％以上：０．４％以上）、（２．６％以上：０．５％以上）、（２．８％以上：０．５％以上）、（３％以上：０．５％以上）、（３．２％以上：０．５％以上）、（３．４％以上：０．５％以上）、（３．６％以上：０．５％以上）、（３．８％以上：０．５％以上）、（４％以上：０．５％以上）、（４．２％以上：０．５％以上）、（４．４％以上：０．５％以上）、（４．６％以上：０．５％以上）、（４．８％以上：０．５％以上）、（５％以上：０．５％以上）、（２．６％以上：０．６％以上）、（２．８％以上：０．６％以上）、（３％以上：０．６％以上）、（３．２％以上：０．６％以上）、（３．４％以上：０．６％以上）、（３．６％以上：０．６％以上）、（３．８％以上：０．６％以上）、（４％以上：０．６％以上）、（４．２％以上：０．６％以上）、（４．４％以上：０．６％以上）、（４．６％以上：０．６％以上）、（４．８％以上：０．６％以上）、（５％以上：０．６％以上）、（２．６％以上：０．７％以上）、（２．８％以上：０．７％以上）、（３％以上：０．７％以上）、（３．２％以上：０．７％以上）、（３．４％以上：０．７％以上）、（３．６％以上：０．７％以上）、（３．８％以上：０．７％以上）、（４％以上：０．７％以上）、（４．２％以上：０．７％以上）、（４．４％以上：０．７％以上）、（４．６％以上：０．７％以上）、（４．８％以上：０．７％以上）、（５％以上：０．７％以上）、（２．６％以上：０．８％以上）、（２．８％以上：０．８％以上）、（３％以上：０．８％以上）、（３．２％以上：０．８％以上）、（３．４％以上：０．８％以上）、（３．６％以上：０．８％以上）、（３．８％以上：０．８％以上）、（４％以上：０．８％以上）、（４．２％以上：０．８％以上）、（４．４％以上：０．８％以上）、（４．６％以上：０．８％以上）、（４．８％以上：０．８％以上）、（５％以上：０．８％以上）等であってよく、（３．６％以上：０．４％以上）が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％等であってよく、ＲｅｂＭの割合の上限も特に限定されないが、１０％、５％、３％等であってよい。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ａ～Ｄがこの態様との関連性が高い。
　一態様において、本発明の植物体は乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＤとＲｅｂＭを合計で３．７％以上含む。これは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計質量が、３．７質量％以上（例えば、１．８５ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の割合は、限定されずに、例えば、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上、６．１％以上、６．２％以上、６．３％以上、６．４％以上、６．５％以上、６．６％以上、６．７％以上、６．８％以上、６．９％以上、７．０％以上等であってよく、４．９％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計の割合の上限は特に限定されないが、例えば、２５％、２０％、１５％などであってよい。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ａ～Ｄがこの態様との関連性が高い。
　一態様において、本発明の植物体は総ステビオール配糖体（Ｔｏｔａｌ　Ｓｔｅｖｉｏｌ　Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ：ＴＳＧ）に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの質量比が合計で３７．８％以上である。これは、例えば葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計質量を、葉から得られたステビオール配糖体の総質量に対する比率としてＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧ％で表した場合、ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値が３７．８％以上であることを意味する。この態様におけるＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値は、限定されずに、例えば、３７．８％以上、３７．９％以上、３８．０％以上、３８．１％以上、３８．２％以上、３８．３％以上、３８．４％以上、３８．５％以上、３８．６％以上、３８．７％以上、３８．８％以上、３８．９％以上、３９．０％以上、３９．２％以上、３９．４％以上、３９．６％以上、３９．８％以上、４０．０％以上、４０．２％以上、４０．４％以上、４０．６％以上、４０．８％以上、４１．０％以上、４１．２％以上、４１．４％以上、４１．６％以上、４１．８％以上、４２．０％以上、４２．４％以上、４２．８％以上、４３．２％以上、４３．６％以上、４４．０％以上、４４．４％以上、４４．８％以上、４５．２％以上、４５．６％以上、４６．０％以上等であってよく、３８．１％以上が好ましい。総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭの質量比の上限は特に限定されないが、例えば、８５％、７５％、６５％、５５％などであってよい。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ａ～Ｄがこの態様との関連性が高い。
　ＴＳＧとは、測定可能なステビオール配糖体の総称であり、未知のステビオール配糖体や、検出限界未満の量で存在するステビオール配糖体を含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群より選択される２つ以上の任意の組み合わせである。例えば、ある実施形態では、総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ及びステビオシドからなり、別の実施形態では総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ及びステビオシドからなるものであってもよい。特定の実施形態において、総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びＲｅｂＯからなる。
　一態様において、本発明の植物体は乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＭを０．２％以上含む。これは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＭの質量が、０．２質量％以上（例えば、０．１ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＭの割合は、限定されずに、例えば、０．２０％以上、０．２５％以上、０．３０％以上、０．３５％以上、０．４０％以上、０．４５％以上、０．５０％以上、０．５５％以上、０．６０％以上、０．６５％以上、０．７０％以上、０．７５％以上、０．８０％以上、０．８５％以上、０．９０％以上、０．９５％以上、１．００％以上、１．０５％以上、１．１０％以上、１．１５％以上、１．２０％以上、１．２５％以上、１．３０％以上、１．３５％以上、１．４０％以上、１．４５％以上等であってよく、０．４％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＭの割合の上限は特に限定されないが、例えば、１５％、１０％、５％などであってよい。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ｂがこの態様との関連性が高い。
　一態様において、本発明の植物体は総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＭの質量比が２％以上である。これは、例えば葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれるＲｅｂＭの質量を、葉から得られたステビオール配糖体の総質量に対する比率としてＲｅｂＭ／ＴＳＧ％で表した場合、ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値が２％以上であることを意味する。この態様におけるＲｅｂＭ／ＴＳＧの値は、限定されずに、例えば、２％以上、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、７％以上、７．５％以上、８％以上、８．５％以上、９％以上、９．５％以上、１０％以上、１０．５％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、１６％以上、１７％以上、１８％以上、１９％以上、２０％以上等であってよく、３．５％以上が好ましい。総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＭの質量比の上限は特に限定されないが、例えば、５０％、４５％、４０％、３５％などであってよい。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ｂがこの態様との関連性が高い。
　一態様において、本発明の植物体は野生型ステビア植物体の葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）１００ｇ当たりに含まれるレバウジオシドＭの量（ｇ）を１００％とした場合に、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＭを３００％以上、４００％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１１００％以上、１２００％以上、１３００％以上、１４００％以上、１５００％以上、１６００％以上、１７００％以上、１８００％以上、１９００％以上、２０００％以上、２１００％以上、２２００％以上、２３００％以上、２４００％以上、２５００％以上、２６００％以上、２７００％以上、２８００％以上、２９００％以上、３０００％以上高い含量で含んでいる。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ｂがこの態様との関連性が高い。
　一態様において、本発明の植物体は乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＤを１％以上含む。これは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＤの質量が、１質量％以上（例えば、０．５ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合は、限定されずに、例えば、１．００％以上、１．０５％以上、１．１０％以上、１．１５％以上、１．２０％以上、１．２５％以上、１．３０％以上、１．３５％以上、１．４０％以上、１．４５％以上、１．５０％以上、１．５５％以上、１．６０％以上、１．６５％以上、１．７０％以上、１．７５％以上、１．８０％以上、１．８５％以上、１．９０％以上、１．９５％以上、２．００％以上、２．０５％以上、２．１０％以上、２．１５％以上、２．２０％以上、２．２５％以上、２．３０％以上、２．３５％以上、２．４０％以上、２．４５％以上、２．５０％以上、２．５５％以上、２．６０％以上、２．６５％以上、２．７０％以上、２．７５％以上、２．８０％以上、２．８５％以上、２．９０％以上、２．９５％以上、３．００％以上、３．０５％以上、３．１０％以上、３．１５％以上、３．２０％以上、３．２５％以上、３．３０％以上、３．３５％以上、３．４０％以上、３．４５％以上、３．５０％以上、３．５５％以上又は３．５７％以上等であってよく、０．４％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂDの割合の上限は特に限定されないが、例えば、１５％、１０％、５％などであってよい。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ｂがこの態様との関連が高い。
　一態様において、本発明の植物体は葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）中のＲｅｂＭ及びＲｅｂＤの含量をＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの比率で表した場合、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの値の下限が０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．８以上、１．０以上である。一方、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの値の上限は、０．３以下、０．４以下、０．５以下、０．６以下、０．８以下、１．０以下、１．１以下、１．２以下である。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは０．２以上かつ１．２以下、あるいは０．６以上かつ１．１以下である。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ｂがこの態様との関連が高い。
　一態様において、本発明の植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）中のＲｅｂＭ及びＲｅｂＤの含量をステビオール配糖体総量に対する比率として（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧ％で表した場合、（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の下限が１４％以上、１６％以上、１８％以上、２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上である。一方、（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の上限は、１８％以下、２０％以下、２２％以下、２４％以下、２６％以下、２８％以下、３０％以下、３２％以下、３４％以下、３６％以下、３８％以下、４０％以下である。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは１４％以上かつ４０％以下、あるいは１６％以上かつ４０％以下である。実施例に示すとおり、遺伝的特徴Ｂがこの態様との関連が高い。
　ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭは、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はOhta et al., J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3, 199-209 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりＲｅｂＤを精製することができる。
　ＲｅｂＤ又はＲｅｂＭの含量は、上記Ohta et al.又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳを行うことにより測定することができる。
　本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。また、葉は先に述べた乾燥葉であってもよい。
　また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
２．本発明の植物体の作出方法
　本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型より花粉形成能が低いステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」と称する場合がある）を提供する。
　当該方法により作出される「野生型より花粉形成能が低いステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
　本発明の作出方法によって得られる植物体における花粉形成能、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭ含量の範囲等は、本発明の植物体について上記したとおりである。
　一態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘを有する。一態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａを有する。別の態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｂを有する。別の態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｃ又はＤを有する。好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｃ又はＤとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃ又はＤとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃ又はＤとを有する。より好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ及びＣ又はＤをすべて有する。
　本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体（第一代（Ｓ１））と、第２の植物体（Ｓ１）とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体（第二代（Ｓ２））を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体（Ｓ２）を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝的特徴を有する植物体）（Ｓ１）と交雑させて、本発明の遺伝子的特徴を有する植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体（Ｓ１）が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。
　あるいは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
　本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的性質が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体とを交雑させることにより、本発明の植物体と同等の表現型を有するステビア植物体を作出することも可能である。
　別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123）。
　さらに別の態様として、本発明の植物体は、ステビア植物体のゲノムに、本発明の変異を導入することで作出することも可能である。変異の導入は、遺伝子組換え的手法により行っても、非遺伝子組換え的手法により行ってもよい。「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１～４８時間、２～３６時間、３～３０時間、４～２８時間、５～２６時間、６～２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
　あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１～１００Ｇｒ、０．０３～７５Ｇｒ、０．０５～５０Ｇｒ、０．０７～２５Ｇｒ、０．０９～２０Ｇｒ、０．１～１５Ｇｒ、０．１～１０Ｇｒ、０．５～１０Ｇｒ、１～１０Ｇｒであり、照射距離は１ｃｍ～２００ｍ、５ｃｍ～１００ｍ、７ｃｍ～７５ｍ、９ｃｍ～５０ｍ、１０ｃｍ～３０ｍ、１０ｃｍ～２０ｍ、１０ｃｍ～１０ｍであり、照射時間は１分～２年、２分～１年、３分～０．５年、４分～１か月、５分～２週間、１０分～１週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
　また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）などの手法も公知である。
　一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
　本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換え（例えばゲノム編集等により）を行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
　複数の異なる本発明の遺伝的特徴を有する植物体は、互いに異なる本発明の遺伝的特徴を有する植物体を交雑させることによって作出することもできる。例えば、本発明の遺伝的特徴ＸとＡとを有する植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘを有する植物体と、本発明の遺伝的特徴Ａを有する植物体とを交雑させることによって得ることができる。本発明の遺伝的特徴ＸとＢとを有する植物体、本発明の遺伝的特徴ＸとＣ又はＤとを有する植物体、本発明の遺伝的特徴ＡとＢとを有する植物体、本発明の遺伝的特徴ＡとＣ又はＤとを有する植物体、本発明の遺伝的特徴ＢとＣ又はＤとを有する植物体なども同様の交雑により得ることができる。また、例えば本発明の遺伝的特徴ＸとＡとＢとを有する植物体は、本発明の遺伝的特徴ＸとＡとを有する植物体と、本発明の遺伝的特徴Ｂを有する植物体とを交雑させること、本発明の遺伝的特徴ＸとＢとを有する植物体と、本発明の遺伝的特徴Ａを有する植物体とを交雑させること、本発明の遺伝的特徴Ｘを有する植物体と、本発明の遺伝的特徴ＡとＢとを有する植物体とを交雑させること等によって得ることができる。本発明の遺伝的特徴ＸとＢとＣ又はＤとを有する植物体、本発明の遺伝的特徴ＡとＢとＣ又はＤとを有する植物体なども同様の交雑により得ることができる。交雑は二代以上に亘って行うことが好ましいが、遺伝的特徴がヘテロ接合性などの場合は、一代で所望の遺伝的特徴の組合せを有する植物体が得られることがある。
３．本発明の植物体のスクリーニング方法
　本発明の植物体及び本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝的特徴を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
　したがって、本発明は、別の側面において、被験植物のゲノムから本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程を含む、花粉形成能の低いステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称する場合がある）を提供する。
　一態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｘである。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ａである。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｂである。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｃである。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｄである。好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｃ又はＤである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃ又はＤである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃ又はＤである。より好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ及びＣ又はＤのすべてである。
　本発明のスクリーニング方法は、上記の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
　本発明の遺伝的特徴の存在は、
（Ｘ－１）配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１６０、１６１又は１６２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｘ－２）配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１６３、１６４又は１６５の塩基配列を含むアレル）、
（Ｘ－３）配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１６６、１６７又は１６８の塩基配列を含むアレル）、
（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号６９の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７０の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７１の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号７２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレル（例えば、配列番号７３の塩基配列を含むアレル）、及び
（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号７４の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの存在の検出、及び／又は、
（ｘ－１）配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１８５、１８６又は１８７の塩基配列を含むアレル）、
（ｘ－２）配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号１８８、１８９又は１９０の塩基配列を含むアレル）、
（ｘ－３）配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号１９１、１９２又は１９３の塩基配列を含むアレル）、
（ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－１）配列番号２の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－２）配列番号３の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＧであるアレル（例えば、配列番号４の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失していないアレル（例えば、配列番号５の塩基配列を含むアレル）、及び
（ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号６の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの不在の検出
により決定することができる。
　本発明の遺伝的特徴の不在は、
（Ｘ－１）配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１６０、１６１又は１６２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｘ－２）配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１６３、１６４又は１６５の塩基配列を含むアレル）、
（Ｘ－３）配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１６６、１６７又は１６８の塩基配列を含むアレル）、
（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号６９の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７０の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７１の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号７２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレル（例えば、配列番号７３の塩基配列を含むアレル）、及び
（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号７４の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの不在の検出、及び／又は、
（ｘ－１）配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１８５、１８６又は１８７の塩基配列を含むアレル）、
（ｘ－２）配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号１８８、１８９又は１９０の塩基配列を含むアレル）、
（ｘ－３）配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号１９１、１９２又は１９３の塩基配列を含むアレル）、
（ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－１）配列番号２の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－２）配列番号３の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＧであるアレル（例えば、配列番号４の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失していないアレル（例えば、配列番号５の塩基配列を含むアレル）、及び
（ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号６の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの存在の検出
により決定することができる。
　本発明の遺伝的特徴の検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、ＡＳＯ法、ＡＲＭＳ法、ＤＧＧＥ法、ＣＣＭ法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ法、ＶＳＥＴ法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が本発明の多型部位に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが多型を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明の変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
　あるいは、本発明の多型とプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子変異をＰＣＲ増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝的特徴を検出することができる。
　ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
　TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
　シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてＤＮＡ配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（上記Sambrook, Fritsch and Maniatis）。
　ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の多型と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の多型の有無を検出することができる。ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
　インベーダー法とは、ＳＮＰ等の多型のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
　TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｘ－１は、限定されずに、配列番号１６０～１６２のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセットと、配列番号１６０～１６２のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号１８５～１８７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素（例えば、ＡｌｕＩ）又は配列番号１６０～１６２のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号１８５～１８７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素とを用いたＣＡＰＳ法により検出することができる。プライマーセットの非限定例としては、以下のものが挙げられる。
フォワードプライマー：ＡＣＧＧＴＴＴＡＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＴＣ（配列番号１６９）
リバースプライマー：ＧＣＣＡＣＧＴＣＡＴＴＡＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡ（配列番号１７０）
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｘ－２は、限定されずに、配列番号１６３～１６５のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセットと、配列番号１６３～１６５のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号１８８～１９０のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素（例えば、Ｔｓｐ４５Ｉ）又は配列番号１６３～１６５のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号１８８～１９０のポリヌクレオチドは切断する制限酵素とを用いたＣＡＰＳ法により検出することができる。プライマーセットの非限定例としては、以下のものが挙げられる。
フォワードプライマー：ＡＣＧＧＴＴＴＡＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＴＣ（配列番号１６９）
リバースプライマー：ＧＴＣＧＡＧＣＴＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＣＣＡ（配列番号１７５）
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｘ－３は、限定されずに、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　配列番号１８１又は１８４の２５７位より５’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列（例えば、配列番号１６９）を含むフォワードプライマーと、配列番号１８０、１９４～２０１から選択される配列の３’末端から１５～２９塩基長の連続する配列を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。プライマーの配列は、上記の条件を満たす範囲で最適化することができる。プライマー設計の最適化については、例えば、上記Sambrook and Russell, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press等を参照のこと。また、上記各プライマーは、１５～５０塩基長、１８～４８塩基長、２０～４５塩基長、３０～６５塩基長等であってよい。
・制限酵素：
　配列番号１８０、１９４～２０１の各々に対応する制限酵素を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴Ｘ－３は、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ａは、限定されずに、配列番号１９～２１のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセットと、配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素又は配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）とを用いたＣＡＰＳ法により検出することができる。プライマーセットの非限定例としては、以下のものが挙げられる。
フォワードプライマー：ＡＴＧＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴ（配列番号３７）
リバースプライマー：ＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＧ（配列番号３８）
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｂは、限定されずに、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法等により検出することができる。

（Ｂ－１）配列番号４５に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号４６に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－２）配列番号５０に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号５１に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－３）配列番号５５に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号５６に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、又は
（Ｂ－４）配列番号６０に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号６１に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。
　但し、プライマーセットは配列番号４５、４６、５０、５１、５５、５６、６０又は６１の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号４５、５０、５５又は６０の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよくリバースプライマーとしては配列番号４６、５１、５６又は６１の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよい。このようなプライマーは、１５～５０塩基長、２０～４５塩基長の長さにあってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　プライマーセットは配列番号４５、４６、５０、５１、５５、５６、６０又は６１の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号４５、５０、５５、又は６０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよく、リバースプライマーとしては配列番号４６、５１、５６又は６１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよい。

（Ｂ－１’’）配列番号４５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号４６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－２’’）配列番号５０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号５１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－３’’）配列番号５５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号５６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは（Ｂ－４’’）配列番号６０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号６１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。
　このようなプライマーは、前記任意の連続する１５塩基以上の配列が３‘側末端に存在すれば、１５～５０塩基長、２０～４５塩基長、３０～６５塩基長の長さにあってもよい。
　上記プライマーと組み合わせる制限酵素としては、以下のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｃ又はＤは、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　３’末端に位置する配列番号８６～１０９、１５０から選択される配列と、任意選択で前記配列の５’末端に付加される配列番号６の２８位から５’側に続く任意の連続する配列（例えば、任意の長さの連続する配列）とを含むフォワードプライマーと、配列番号６の５０位より３’側に位置する任意の連続する２０塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号６５、１１０）を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。プライマーの配列は、上記の条件を満たす範囲で最適化することができる。プライマー設計の最適化については、例えば、上記Sambrook and Russell等を参照のこと。また、上記各プライマーは、１５～５０塩基長、１８～４８塩基長、２０～４５塩基長、３０～６５塩基長等であってよい。
・制限酵素：
　配列番号８６～１０９、１５０の各々に対応する制限酵素を以下に示す。なお、下記配列において、「Ｒ」はＡ又はＧを、「Ｙ」はＣ又はＴを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴Ｃ又はＤは、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物の花粉形成能を評価する工程をさらに含んでもよい。花粉形成能の評価は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、花粉形成能が低い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物のゲノムから、本発明の遺伝的特徴（例えば、本発明の遺伝的特徴Ｘ）を検出する工程、
（ｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物組織の花粉形成能を評価する工程、
（ｉｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、花粉形成能が低い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択した花粉形成能が低い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴（例えば、本発明の遺伝的特徴Ｘ）を検出する工程、
（ｖｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物組織の花粉形成能を評価する工程、
（ｖｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物体のうち、花粉形成能が低い個体を選択する工程。
　選択する花粉形成能が低い個体は、例えば、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、花粉形成能の低さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体などであってよい。また、交配する他のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴を含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）～（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、花粉形成能がより低いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
　本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
　本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
　また、本発明は、上記に記載されたプライマーセット、例えば、上記配列番号１６９のフォワードプライマーと配列番号１７０のリバースプライマーとを含むプライマーセット、上記配列番号１６９のフォワードプライマーと配列番号１７５のリバースプライマーとを含むプライマーセット、上記表２に記載のプライマーセット、上記配列番号３７のフォワードプライマーと配列番号３８のリバースプライマーとを含むプライマーセット、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－４）、（Ｂ－１’）～（Ｂ－４’）及び（Ｂ－１’’）～（Ｂ－４’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセット、及び／又は、上記表６に記載のプライマーセットを提供する。本発明は、さらに、配列番号１５１～１５３、２０２～２０４、１～６、６９～７４からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセット、例えば、配列番号１５４の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５５の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１５６の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５７の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１５８の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５９の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１６の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１８の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセットを提供する。
　さらに、本発明は、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブは、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在の各種検出方法に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブは、本発明の変異部位を含むゲノムの部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号１６０～１６８、１８５～１９３、１９～３６、７５～７７、１３５～１４９から選択される塩基配列を含むものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号１６０～１６８、１９～３６は本発明の変異を含むアレルに特異的であり、配列番号１８５～１９３、７５～７７、１３５～１４９は、本発明の変異を含まないアレルに特異的である。本発明の遺伝的特徴の存在は、本発明の変異を含むアレルの検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの非検出により検出することができ、本発明の遺伝的特徴の不在は、本発明の変異を含むアレルの非検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの検出により検出することができる。本発明のプローブは、好ましくは標識を有する。かかる標識の非限定例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、色素、酵素、クエンチャー、検出可能な標識との結合部分等が挙げられる。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号１６０～１６８、１８５～１９３、１９～３６、７５～７７、１３５～１４９から選択される塩基配列に相補性を有する塩基配列と、標識とを有する。
　本発明はさらに、配列番号１６０～１６２のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセット、例えば、配列番号１６９の塩基配列を含むフォワードプライマーと配列番号１７０の塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、配列番号１６０～１６２のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号１８５～１８７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素（例えば、ＡｌｕＩ）又は配列番号１６０～１６２のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号１８５～１８７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　本発明はさらに、配列番号１６３～１６５のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセット、例えば、配列番号１６９の塩基配列を含むフォワードプライマーと配列番号１７５の塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、配列番号１６３～１６５のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号１８８～１９０のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素（例えば、Ｔｓｐ４５Ｉ）又は配列番号１６３～１６５のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号１８８～１９０のポリヌクレオチドは切断する制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　本発明はさらに、配列番号１８１の２５７位より５’側に位置する任意の連続する１５塩基以上の配列（例えば、配列番号１６９）を含むフォワードプライマーと、配列番号１８０、１９４～２０１から選択される配列の３’末端から１５～２５塩基長の連続する配列を含むリバースプライマーとを含むプライマーセット、例えば表２に記載のプライマーセット、及び、これに対応する制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　本発明はさらに、配列番号１９～２１のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセット、例えば、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素又は配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　本発明はさらに、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－４）、（Ｂ－１’）～（Ｂ－４’）及び（Ｂ－１’’）～（Ｂ－４’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　当該キットにおいて、（Ｂ－１）、（Ｂ－１’）及び（Ｂ－１’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＫｐｎＩである。
　当該キットにおいて、（Ｂ－２）、（Ｂ－２’）及び（Ｂ－２’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＸｂａＩである。
　当該キットにおいて、（Ｂ－３）、（Ｂ－３’）及び（Ｂ－３’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＡｆｌＩＩである。
　本発明はさらに、３’末端に位置する配列番号８６～１０９、１５０から選択される配列と、任意選択で前記配列の５’末端に付加される配列番号６の２８位から５’側に続く任意の連続する配列（例えば、任意の長さの連続する配列）とを含むフォワードプライマーと、配列番号６の５０位より３’側に位置する任意の連続する２０塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号６５、１１０）を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット、例えば、前記表６に記載のプライマーセット、及び、これに対応する制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　当該キットの別の態様において、
　前記プライマーセットが配列番号４５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＫｐｎＩを含み、
　前記プライマーセットが配列番号５０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＸｂａＩを含み、
　前記プライマーセットが配列番号５５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＡｆｌＩＩを含む
　本発明はまた、配列番号１６０～１６８、１８５～１９３、１～６、１９～３６、６９～７７、１３５～１４９からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、本発明のプローブとを含む、スクリーニング用キットを提供する。
　これらのプライマーセット、プローブ及びキットは、本発明の遺伝的特徴を検出するために用いること、本発明のスクリーニング方法に用いることなどが可能である。また、これらのプライマーセット及びキットには、本発明の遺伝的特徴の検出や、本発明のスクリーニング方法に関する説明を含む指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが含まれていてもよい。
５．植物体由来抽出物の製造方法及び当該抽出物を用いた製品
　本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）から抽出物を得る工程を含む、ステビア抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある）が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、ステビオール配糖体精製品の製造方法（以下、「本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法」と称する場合がある）が提供される。
　具体的には、本発明のステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別されたステビア植物体又は本発明の方法により製造されたステビア植物体からステビオール配糖体を含む抽出物を得る工程、及び、得られた抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、ステビオール配糖体精製品の製造方法が提供される。
　ステビオール配糖体を含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等は上記Ohta et al.又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　また、ステビオール配糖体を含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることにより個々のステビオール配糖体を精製することができる。
　ステビオール配糖体としては、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド等が挙げられる。一態様において、ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ又はこれらの組合せを含む。好ましい態様において、ステビオール配糖体は、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、又はこれらの組合せを含む。
　本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）の一態様は、野生型ステビア種と比べＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方をより高い含量で含む。
　本発明の抽出物は、野生型ステビア種から得られた抽出物と比べＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方を３００％以上、４００％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１１００％以上、１２００％以上、１３００％以上、１４００％以上、１５００％以上、１６００％以上、１７００％以上、１８００％以上、１９００％以上、２０００％以上、２１００％以上、２２００％以上、２３００％以上、２４００％以上、２５００％以上、２６００％以上、２７００％以上、２８００％以上、２９００％以上、３０００％以上、３１００％以上、３２００％以上、３３００％以上、３４００％以上、３５００％以上、３６００％以上、３７００％以上、３８００％以上、３９００％以上、４０００％以上、４１００％以上、４２００％以上、４３００％以上、４４００％以上、４５００％以上、４６００％以上、４７００％以上、４８００％以上、４９００％以上、５０００％以上高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、野生型ステビア種から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
　このようにして得られた本発明の抽出物及び／又は本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法により得られるステビオール配糖体精製品（例えば、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ）と他の成分とを混合することにより、ステビオール配糖体を含む医薬品、香料又は飲食品を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物及び／又は本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法により得られるステビオール配糖体精製品と他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、ステビオール配糖体を含む医薬品、香料又は飲食品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は医薬品、香料、飲料又は食品を提供し、また、当該医薬品、香料、飲料又は食品の製造方法を提供する。
６．本発明の植物体に係る塩基配列
　本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体に係る塩基配列を提供する。
　遺伝的特徴Ｘ－１を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号１６０～１６２、２０２から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ｘ－２を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号１６３～１６５、２０３から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ｘ－３を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号１６６～１６８、２０４から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ａを有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号１９～２１、６９から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ｂ－１を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号２２～２４、７０から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ｂ－２を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号２５～２７、７１から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ｂ－３を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号２８～３０、７２から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ｂ－４を有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号３１～３３、６２、７３から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。遺伝的特徴Ｃ又はＤを有するステビア植物体に係る塩基配列は、配列番号３４～３６、７４から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。
　以下に本発明に関する実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。
［実施例１］ＲｅｂＭ含量と遺伝的特徴Ｂとの関連性の検証（１）
　市販ステビア種子をベースに、生育状況、葉形態、総ステビオール配糖体（ＴＳＧ）、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭの含量等を基準に個体選抜を行い、２つの分離集団、第Ｉ及び第ＩＩ個体群を得た。第Ｉ個体群からの６２個体、第ＩＩ個体群からの１０９個体を用い、検証を行った。各個体をＲｅｂＭ含量に基づいて０．２％以上、０．１％以上～０．２％未満、０％以上～０．１％未満の３群に分割し、遺伝的特徴Ｂ－１の有無を調査した。具体的には、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＫｐｎＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
　プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’－ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣ－３’（配列番号４５）
Ｒｖプライマー：５’－ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＣ－３’（配列番号４６）
　得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行い、約２６０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４９）を生じなかったものをＢ－１陽性とした。その結果、０．２％以上含有群が本遺伝的特徴により優先的に検出される結果となり、陽性個体の出現頻度が群間で統計的に有意に異なることが証明された（カイ二乗検定による適合度検定、帰無仮説はマーカー検定結果と表現型が紐づかず頻度分布が均等であると仮定。検定結果は下表を参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
［実施例２］ＲｅｂＭ含量と遺伝的特徴Ｂとの関連性の検証（２）
　遺伝的特徴Ｂを用いて高ＲｅｂＭ植物体の選抜を行ったところ、検証用集団以外の分離集団においても下表のとおりＲｅｂＭ比率が２％以上の個体を選抜することができ、実用的な選抜マーカーになり得ることを確認した。高ＲｅｂＭ植物体の選抜結果を以下の表に示す。表中の「○」は遺伝的特徴Ｂの検定結果が陽性であることを表す。
　なお、遺伝的特徴Ｂ－１は実施例１と同様に検出し、遺伝的特徴Ｂ－２～Ｂ－４は以下のようにして検出した。
　遺伝的特徴Ｂ－２の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＸｂａＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
　プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’－ＡＡＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴＧＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＡＴＣＴＡＧ－３’（配列番号５０）
Ｒｖプライマー：５’－ＣＣＴＴＡＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＣＴＡＣＡＣ－３’（配列番号５１）
　得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長）に対しＸｂａＩ制限酵素処理を行い、約３４４ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号５４）を生じなかったものをＢ－２陽性とした。
　遺伝的特徴Ｂ－３の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＡｆｌＩＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
　プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’－ＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡ－３’（配列番号５５）
Ｒｖプライマー：５’－ＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧ－３’（配列番号５６）
　得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行い、約３４７ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号５９）を生じなかったものをＢ－３陽性とした。
　遺伝的特徴Ｂ－４の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をマイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴで電気泳動させ、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
　プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’－ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＣ－３’（配列番号６０）
Ｒｖプライマー：５’－ＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＡＣＡＡＣ－３’（配列番号６１）
　約１４０ｂｐのＰＣＲ産物のみ（例えば、配列番号６２）を生じたものをＢ－４陽性とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
［実施例３］高ＴＳＧステビア植物と遺伝的特徴Ｃとの関連性の検証
（１）甘味成分高含有個体の単離（Ｍ０世代）
　野生型ステビア種子（市販品種、２０１４年８月に導入）約２０００個（重量換算）を３つに分けて、各々に対して０．１％、０．２％又は０．３％のエチレンメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理を行って遺伝子改変を行った。
　このＥＭＳ処理済み種子及び無処理の種子を、サントリー研究センター内温室にて播種し、ＥＭＳ処理当代（Ｍ０世代）苗を得た。処理濃度間での発芽率差異は見られなかった。
　ＥＭＳ処理当代（Ｍ０世代）及び無処理個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ（島津LCMS8050）にて甘味成分の濃度を定量した。具体的には、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物０．０５ｇを純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に０．３３ｍｌの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びＲｅｂＯの濃度を定量し、その合計を甘味成分の濃度とした。甘味成分濃度が約２０％の個体を親個体１（Ｐ１）とした。また、親個体２（Ｐ２）として、別のステビア植物体の集団に由来する、乾燥葉中の甘味成分濃度が５％の個体を選定した。
（２）甘味成分高含有型個体の単離（Ｍ１世代）及び遺伝子解析
　親個体１（Ｐ１）と親個体２（Ｐ２）との交配により処理第一代（Ｍ１世代）種子を採種し、サントリー研究センター内の温室内で播種し、Ｍ１世代苗を得た（１６０３個体の分離集団）。上記Ｍ１世代個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、上記（１）と同様にLC/MS-MS（島津LCMS8050）にて甘味成分を定量した。結果を図１に示す。
　甘味成分の含有量が最も高い３０個体（甘味成分高含有個体）と、最も低い３０個体（甘味成分低含有個体）の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、両個体群のいずれか一方のみに存在する変異について調査した。ゲノム解析で検出した変異のうち、ゲノム情報量が十分あり（シーケンスカバレッジが×５以上）、変異が連続しておらず、配列の挿入や欠失のない３０６ヵ所の変異について、各変異がどの個体に存在するかを検討した。その結果、配列番号１の４９位におけるＣからＡへの変異（Ｃ４９Ａ）が、甘味成分高含有個体には存在するが、低含有個体には存在しないことが明らかとなった。
（３）変異Ｃ４９Ａと甘味成分含有量との関係性の検証
　変異Ｃ４９Ａをヘテロで有するステビア植物体と、変異Ｃ４９Ａを有しないステビア植物体とを交配し、２つの分離集団（分離集団Ａ（４４３個体）及び分離集団Ｂ（４４６個体））を得た。両分離集団の各個体における変異Ｃ４９Ａの有無と、甘味成分含有量とを調査した。変異Ｃ４９Ａの有無の調査にはｄＣＡＰＳ法を用いた。各個体からゲノムＤＮＡを抽出し、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＳｐｅＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴ（PerkinElmer）により電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
フォワードプライマー：５’－ＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴ－３’（配列番号１１２）
リバースプライマー：５’－ＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧ－３’（配列番号６５）
　得られた約３６７ｂｐＰＣＲ産物（例えば、配列番号６６又は６７）に対しＳｐｅＩ制限酵素処理を行い、約３２１ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号６８）を生じたものを変異Ｃ４９Ａ陽性とした。
　甘味成分含有量の定量は（１）と同様に行った。
　各分離集団の変異Ｃ４９Ａ陽性個体及び陰性個体における甘味成分含有量の分布を図２～３に示す。これらの結果から、変異Ｃ４９Ａ陽性個体における甘味成分含有量は、各分離集団全体の甘味成分含有量の平均値より高いことが分かる。
　また、各分離集団の変異Ｃ４９Ａ陽性個体及び陰性個体における甘味成分含有量の平均値及び中央値を以下にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
［実施例４］高ＲｅｂＤステビア植物と遺伝的特徴Ａ～Ｃとの関連性の検証
１．試験系統の作製
　高ＴＳＧ含有型の遺伝的特徴を有する雄株（Ｐ１）と、高ＲｅｂＭ含有型の遺伝的特徴を有する雌株（Ｐ２）とを交配させ、雑種第１代（Ｓ１世代）種子を採種し、サントリー研究センター内の温室内で播種し、Ｓ１世代苗を得た。
　高ＲｅｂＭ含有型の遺伝的特徴は、以下の少なくとも１つの特徴を有する。
　Ｂ－１：配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
　Ｂ－２：配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
　Ｂ－３：配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
　Ｂ－４：配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
　実施例１～２に示すとおり、これらの遺伝的特徴は高ＲｅｂＭ含有特性に係る。
　高ＴＳＧ含有型の遺伝的特徴は、以下の特徴を有する。
　Ｃ：配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性。
　実施例３に示すとおり、上記の遺伝的特徴は高ＴＳＧ含有特性に係る。
　また、Ｐ１及びＰ２は、いずれもエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理により遺伝子が改変された個体の子孫である。
　Ｐ１、Ｐ２及びＳ１世代個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物０．０５ｇを純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に０．３３ｍｌの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びＲｅｂＯの濃度（乾燥葉に対する質量％）を定量し、その合計を総ステビオール配糖体（ＴＳＧ）濃度とした。結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
　上記結果が示すとおり、Ｐ１とＰ２との交配により、ＲｅｂＤ含量が乾燥葉ベースで３．３質量％を超える高ＲｅｂＤ含有個体が得られた（Ｓ１－１～Ｓ１－３）。
［実施例５］高ＲｅｂＤステビア植物体に特有の遺伝的特徴の検出
　実施例４で試験した各個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝的特徴Ｂ－１及びＣの保有状況を調査した。
　遺伝的特徴Ｂ－１の検出には、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＫｐｎＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
　プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’－ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣ－３’（配列番号４５）
Ｒｖプライマー：５’－ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＣ－３’（配列番号４６）
　得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行い、約２６０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４９）を生じなかったものを遺伝的特徴Ｂ－１陽性とした。
　遺伝的特徴Ｃの検出には、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＳｐｅＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴ（PerkinElmer）により電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
フォワードプライマー：５’－ＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴ－３’（配列番号１１２）
リバースプライマー：５’－ＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧ－３’（配列番号６５）
　得られた約３６７ｂｐＰＣＲ産物（例えば、配列番号６６又は６７）に対しＳｐｅＩ制限酵素処理を行い、約３２１ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号６８）を生じたものを遺伝的特徴Ｃ陽性とした。
　結果を下表１２に示す。表中、「〇」は、対応する変異が検出されたことを示し、「×」は検出されなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　上記結果が示すとおり、遺伝的特徴Ｂ－１を保有する個体は、そうでない個体に比べＲｅｂＭ含量が高い傾向が、遺伝的特徴Ｃを保有する個体は、そうでない個体に比べＴＳＧ含量が高い傾向が、それぞれみられた。これは、本出願人による上記先願で示された結果を確認するものである。
　高ＲｅｂＤ含有個体を識別するためのマーカーを見出すため、各個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ（HiSeq 2500、Illumina）によるシーケンシングを行った。その結果、以下の遺伝的特徴が高ＲｅｂＤ含有個体のみに見出された。
　Ａ：配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性。
　上記結果が示すとおり、高ＲｅｂＤ含有個体（Ｓ１－１～Ｓ１－３）はいずれも遺伝的特徴Ａ、Ｂ－１及びＣを保有しており、遺伝的特徴Ａを保有しない個体に比べ、ＲｅｂＤ含量が高い傾向がみられた。
［実施例６］花粉形成能と遺伝的特徴Ｘとの関連性の検証
　野生型ステビア植物系統２種（Ｗ２０１、Ｗ２０２）と、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）での変異誘発処理により遺伝子が改変された個体の子孫である変異型ステビア植物系統１種（Ｍ２０１）を挿し芽後、本葉８枚が展開した植物体を８時間照明のインキュベーターに移動し、花芽を誘導した。開花５～７日後の、花を横から見たときに柱頭が視認できる、十分に開花した花から花粉を採集し、花粉数をカウントした。結果を下表に示す（各処理区５つの花の平均値）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
　上記結果が示すとおり、Ｍ２０１の花粉形成能は野生型系統に比べ顕著に低い。この表現型に関連する遺伝的特徴を調査するため、各系統の遺伝子配列を決定し、比較した結果、Ｍ２０１のみに遺伝的特徴Ｘ－１～Ｘ－３が見出された。
 
　本発明によって葉やステビオール配糖体の収率が高いステビア植物が提供可能になるので、ステビオール配糖体の産生を効率化できる。また、本発明により、花粉が形成される前に花粉形成能の低い個体を選別することができるため、育種効率の向上が可能となる。

Claims (24)

  1. 　野生型に比べ花粉形成能が低いステビア植物体。
  2. 　配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、請求項１に記載の植物体。
  3. 　以下の（１）～（７）の遺伝的特徴の少なくとも１つをさらに有する、請求項１又は２に記載の植物体。
    （１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
    （４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
    （５）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
    （６）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （７）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
  4. 　以下の（１）～（２）の特徴の少なくとも１つを有する請求項３に記載の植物体。
    （１）乾燥葉の単位質量当たり３％以上のＲｅｂＤを含む。
    （２）乾燥葉の単位質量当たり０．２％以上のＲｅｂＭを含む。
  5. 　非遺伝子組換植物体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の植物体。
  6. 　突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の植物体。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
  8. 　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、請求項７に記載の組織、組織培養物又は細胞。
  9. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、花粉形成能が低いステビア植物体を作出する方法。
  10. 　第２の植物体が請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体である、請求項９に記載の方法。
  11. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体、請求項７又は８に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
  12. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体、請求項７又は８に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ステビア抽出物の製造方法。
  13. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体、請求項７又は８に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程と、得られた抽出物からステビオール配糖体を精製する工程とを含む、ステビオール配糖体精製品の製造方法。
  14. 　ステビオール配糖体が、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ又はこれらの組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 　請求項１１に記載の抽出物又はその精製品を提供する工程、及び
    前記抽出物又は精製品を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
    を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
  16. 　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、という遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、低花粉形成能ステビア植物体をスクリーニングする方法。
  17. 　被験ステビア植物体のゲノムから以下の（１）～（７）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
    （１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
    （４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
    （５）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
    （６）被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （７）被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
  18. 　遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 　被験ステビア植物組織の花粉形成能を評価する工程をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　配列番号１５１の７９位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、配列番号１５２の６５位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてヘテロ又はホモ接合性である、という遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、低花粉形成能ステビア植物体のスクリーニングキット。
  21. 　以下の（１）～（７）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
    （１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （３）配列番号４の４８位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
    （４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
    （５）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
    （６）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である。
    （７）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
  22. 　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、請求項２０又は２１に記載のキット。
  23. 　配列番号１５１の７９位に相当する位置にＴからＣへの変異を導入する工程、及び／又は、配列番号１５２の６５位に相当する位置にＡからＴへの変異を導入する工程、及び／又は、配列番号１５３の２４位に相当する位置にＡからＴへの変異を導入する工程を含む、低花粉形成能ステビア植物体を作出する方法。
  24. 　変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、請求項２３に記載の方法。 
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