WO2020138364A1 - 高レバウジオシドｄ含有ステビア植物 - Google Patents

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正良 平井
一考 岩城
宮川　克郎
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a stevia plant having a high content of rebaudioside D.
  • Patent Document 1 discloses a functional sweetener composition containing a vitamin, a high-potency sweetener, and a sweet taste improving composition.
  • Rebaudioside (hereinafter also referred to as “Reb”) is known as a sweet component contained in stevia extract.
  • Stevia extract is extracted and purified from Stevia leaves.
  • Stevia is a chrysanthemum family perennial plant that originates in Paraguay, South America, and the scientific name is Stevia Rebaudiana Bertoni (Stevia Rebaudiana Bertoni). Since stevia contains a component having a sweetness about 300 times or more that of sugar, it is cultivated to extract the sweetening component and use it as a natural sweetener.
  • As Reb the presence of various glycosides such as RebA, RebB, RebC, RebD, RebE, and RebM has been reported (Table 2012-504552).
  • RebA for example, is evaluated as a sweetener having a high degree of sweetness and a high-quality sweetness, and is widely used. Other Rebs are also being found to have their own sweetness and associated taste.
  • Patent Document 3 a Stevia plant containing 3.28% RebD per dry leaf is known.
  • RebD is said to have a good taste among steviol glycosides, but it is not possible to obtain much from natural Stevia plants, and its availability is a problem.
  • the present invention provides a high-RebD-containing Stevia plant containing RebD in a higher content than that of a wild-type Stevia species, and a method for producing and screening the plant.
  • the invention provides: [1] A high rebaudioside D (RebD)-containing stevia plant body containing 3.3% or more of RebD per unit mass of dried leaves. [2] The plant according to [1], which is homozygous for the allele in which the base at the position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1 is A. [3] The plant according to [1] or [2], which further has at least one of the following genetic characteristics. (1) It is homozygous for the allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T. (2) Homozygosity for the allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T.
  • RebD rebaudioside D
  • [6] The plant according to any one of [1] to [5], which comprises a stevia plant and a progeny plant thereof that have been subjected to a mutagenesis treatment.
  • [7] A seed, tissue, tissue culture or cell of the plant according to any one of [1] to [6].
  • [8] The tissue, tissue culture or cell according to [7], which is selected from embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections and callus.
  • [9] Containing 3.3% or more of RebD per unit mass of dry leaf, which comprises a step of crossing the plant according to any one of [1] to [6] with a second Stevia plant A method for producing a Stevia plant having high RebD content.
  • the method according to [9], wherein the second plant is the plant according to any one of [1] to [5].
  • the method for producing a food/beverage product, a sweetening composition, a flavor or a pharmaceutical product which comprises the step of providing the extract, and the step of adding the extract to a raw material of a food/beverage product, a sweetening composition, a flavor or a pharmaceutical product. ..
  • a step of detecting the presence and/or absence of a genetic feature that is homozygous for an allele having a base A at the position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1 from the genome of a test Stevia plant Method for screening Stevia plant having high RebD content.
  • [16] The method according to [15], further comprising the step of detecting the presence and/or absence of at least one of the following genetic characteristics from the genome of the test Stevia plant.
  • (1) It is homozygous for the allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T.
  • (2) Homozygosity for the allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T.
  • the method further comprises detecting from the genome of the test Stevia plant the presence and/or absence of the genetic feature that is heterozygous for the allele whose base at position 49 corresponding to SEQ ID NO: 6 is A. [ 15] or the method described in [16]. [18] The method according to any one of [15] to [17], wherein the step of detecting the genetic characteristic is performed using the CAPS method, dCAPS method, or TaqMan PCR method. [19] The method according to any one of [15] to [18], further comprising the step of measuring the content of the sweetness component of the test stevia plant tissue.
  • a reagent for detecting the presence and/or absence of at least one of the following genetic features (1) to (4) comprising a reagent for detecting the presence and/or absence of at least one of the following genetic features (1) to (4).
  • a method for producing a high RebD-containing Stevia plant comprising a step of introducing a mutation from C to A at a position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1.
  • the method according to [24] wherein the introduction of the mutation is performed by a mutagenesis process.
  • a Stevia plant containing more RebD means for producing such a plant, leaves obtained from such a plant, foods and beverages containing RebD obtained from this leaf, etc. Can be provided.
  • High RebD-containing Stevia plant having at least one of the following features (1) to (4) (hereinafter, "plant of the present invention” or “stevia plant of the present invention”). (Sometimes collectively referred to as “body”). (1) Containing 3.3% or more of RebD per unit mass of dried leaf (hereinafter, may be referred to as “plant A of the present invention” or “stevia plant A of the present invention”). (2) Containing 2.6% or more RebD and 0.4% or more RebM per unit mass of dry leaf (hereinafter referred to as "plant B of the present invention” or “stevia plant B of the present invention”) Sometimes).
  • plant C of the present invention A total of 3.7% or more of RebD and RebM per unit mass of dried leaves (hereinafter, may be referred to as "plant C of the present invention” or “stevia plant C of the present invention”).
  • plant D of the present invention A total of 3.7% or more of RebD and RebM per unit mass of dried leaves.
  • Total steviol glycoside is a generic term for measurable steviol glycosides, and does not include unknown steviol glycosides or steviol glycosides present in amounts below the detection limit. ..
  • the total steviol glycoside is RebA, RebB, RebD, RebE, RebF, RebI, RebJ, RebK, RebM, RebN, RebO, RebQ, RebR, Zulcoside A, Rubusoside, Steviol, Steviol monoside, Steviolbio. Any combination of two or more selected from the group consisting of side and stevioside.
  • the total steviol glycoside consists of RebA, RebB, RebM, RebD, RebF, RebM and steviol
  • the total steviol glycoside is RebA, RebB, RebM, RebD, It may consist of RebF, RebM, RebN, RebO and steviol.
  • containing 3.3% or more of RebD per unit mass of dry leaf means, for example, that the ratio of 3.3% by mass or more to a predetermined amount of dry leaf (for example, 50 mg). It means that RebD (for example, 1.65 mg or more) is contained.
  • the ratio of RebD per unit mass of dried leaves in this aspect is not limited, and is, for example, 3.3% or more, 3.4% or more, 3.5% or more, 3.6% or more, 3.7%.
  • the upper limit of the ratio of RebD per unit mass of dried leaf is not particularly limited, but may be, for example, 20%, 15%, 10%.
  • the dry leaf refers to a leaf of which the water content is reduced to 3 to 4% by weight by drying the fresh leaf of the Stevia plant of the present invention.
  • containing 2.6% or more of RebD and 0.4% or more of RebM per unit mass of dry leaf means, for example, in a dry leaf of a predetermined mass (for example, 50 mg), RebD in a ratio of 2.6% by mass or more (for example, 1.3 mg or more per 50 mg of dry leaves) and 0.4% by mass or more of RebM (for example, 0.2 mg or more per 50 mg of dry leaves) are contained. means.
  • the ratio of RebD and RebM per unit mass of dried leaves in this aspect is not limited when (Ratio of RebD:Ratio of RebM) is, for example, (2.6% or more: 0.4% or more).
  • the upper limit of the ratio of RebD per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 20%, 15%, 10%, etc., and the upper limit of the ratio of RebM is not particularly limited, but is 10%, 5%. It may be 3% or the like.
  • containing 3.7% or more in total of RebD and RebM per unit mass of dry leaf means, for example, that of RebD and RebM contained in dry leaf of a predetermined mass (for example, 50 mg). It means that the total mass is 3.7% by mass or more (for example, 1.85 mg or more).
  • the total ratio of RebD and RebM per unit mass of dried leaves in this embodiment is not limited and is, for example, 3.7% or more, 3.8% or more, 3.9% or more, 4.0% or more, 4.1% or more, 4.2% or more, 4.3% or more, 4.4% or more, 4.5% or more, 4.6% or more, 4.7% or more, 4.8% or more, 4.
  • the upper limit of the total ratio of RebD and RebM per unit mass of dried leaves is not particularly limited, but may be, for example, 25%, 20%, 15%.
  • the total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 37.8% or more, for example, RebD and RebM contained in leaves (for example, dry leaves or fresh leaves).
  • the total mass of RebD+RebM/TSG% is expressed as a ratio with respect to the total mass of steviol glycosides obtained from leaves, it means that the value of RebD+RebM/TSG is 37.8% or more.
  • the value of RebD+RebM/TSG in this embodiment is not limited and is, for example, 37.8% or more, 37.9% or more, 38.0% or more, 38.1% or more, 38.2% or more, 38.3.
  • % Or more 38.4% or more, 38.5% or more, 38.6% or more, 38.7% or more, 38.8% or more, 38.9% or more, 39.0% or more, 39.2% or more. , 39.4% or more, 39.6% or more, 39.8% or more, 40.0% or more, 40.2% or more, 40.4% or more, 40.6% or more, 40.8% or more, 41 0.0% or more, 41.2% or more, 41.4% or more, 41.6% or more, 41.8% or more, 42.0% or more, 42.4% or more, 42.8% or more, 43.2.
  • the upper limit of the mass ratio of RebD+RebM to the total steviol glycoside is not particularly limited, but may be, for example, 85%, 75%, 65%, 55%.
  • the Stevia plant of the present invention has a genetic characteristic that is homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1 is A (hereinafter, referred to as “genetic characteristic A of the present invention A Sometimes referred to as ").
  • the Stevia plant of the present invention may be referred to as at least one of the following (B-1) to (B-4) genetic characteristics (hereinafter, referred to as "genetic characteristic B of the present invention”). ) Has. (B-1) It is homozygous for the allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T (hereinafter, may be referred to as "genetic feature B-1 of the present invention”).
  • (B-2) It is homozygous for the allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T (hereinafter, may be referred to as "genetic feature B-2 of the present invention”).
  • (B-3) It is homozygous for the allele in which the base at the position corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 4 is C (hereinafter sometimes referred to as “genetic feature B-3 of the present invention”).
  • (B-4) Homozygous for an allele lacking the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 (hereinafter sometimes referred to as "genetic feature B-4 of the present invention”) ..
  • the Stevia plant of the present invention has a genetic feature that is heterozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6 is A (hereinafter, referred to as “genetic feature of the present invention”). Sometimes referred to as "C").
  • the Stevia plant of the present invention has the genetic characteristic A of the present invention and the genetic characteristic B (that is, at least one of the genetic characteristics B-1 to B-4 of the present invention).
  • the Stevia plant of the present invention has the genetic characteristic A and the genetic characteristic C of the present invention.
  • the Stevia plant of the present invention has the genetic characteristic B and the genetic characteristic C of the present invention.
  • the Stevia plant of the invention has all of the genetic features AC of the invention.
  • “Position (or part) corresponding to” means a position in the sequence present in the genome when a sequence identical to the reference sequence (eg, SEQ ID NOs: 1 to 6) is present in the genome, or A portion (eg, 201st, 40th, 44th, 41st, 55th to 72nd, 49th, etc.), and if the same sequence as the reference sequence does not exist in the genome, the reference sequence in the genome It means a position or part in the corresponding sequence that corresponds to a position or part in the reference sequence.
  • a sequence identical to the reference sequence eg, SEQ ID NOs: 1 to 6
  • a portion eg, 201st, 40th, 44th, 41st, 55th to 72nd, 49th, etc.
  • Whether there is a sequence identical to or equivalent to the reference sequence in the genome is determined by, for example, amplifying the target DNA of Stevia plant with a primer capable of amplifying the reference sequence by PCR, and sequencing the amplified products. It can be determined by performing alignment analysis of the obtained sequence and the reference sequence.
  • sequences corresponding to the reference sequence include, for example, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more with respect to the reference sequence.
  • a base sequence having The position or portion corresponding to the position or portion in the reference sequence in the sequence corresponding to the reference sequence in the genome can be determined in consideration of the nucleotide sequences before and after the position or portion in the reference sequence.
  • a position or a portion corresponding to a position or a portion in the reference sequence in a sequence corresponding to the reference sequence in the genome by alignment analysis of the reference sequence and a sequence corresponding to the reference sequence in the genome. it can.
  • the genome of the Stevia plant has a portion having the same nucleotide sequence as SEQ ID NO: 1.
  • the “position corresponding to the 201st position of SEQ ID NO: 1” is the 201st position from the 5′ side of the part consisting of the same nucleotide sequence as the SEQ ID NO: 1 in the genome.
  • the genome of the Stevia plant when the genome of the Stevia plant is not the same as SEQ ID NO: 1 but has a part consisting of the corresponding nucleotide sequence, the genome does not have a part consisting of the same nucleotide sequence as SEQ ID NO: 1,
  • the "position corresponding to the 201st position of SEQ ID NO: 1" does not necessarily correspond to the 201st position from the 5'side of the portion corresponding to the SEQ ID NO: 1, but includes the nucleotide sequence before and after the 201st position of SEQ ID NO: 1 and the like. Taking this into consideration, the "position corresponding to the 201st position of SEQ ID NO: 1" in the genome of such Stevia plant can be specified.
  • the “position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1” in the genome of Stevia plant is identified by alignment analysis of the base sequence of the part corresponding to SEQ ID NO: 1 in the genome of Stevia plant and the base sequence of SEQ ID NO: 1. can do.
  • a portion consisting of a base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 means, for example, 60% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 1. 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% Or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 98.1% or more, 98.4% or more, 98.7% or more, 99% or more, 99.2% or more, 99.5% or more or 99. It means a portion consisting of a nucleotide sequence having a sequence identity of 8% or more.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1" includes a forward primer that hybridizes to a complementary sequence of a portion 15 to 25 bases in length from the 5'end of SEQ ID NO: 1, and a SEQ ID NO: A portion of the genome of Stevia plant that can be amplified by PCR using a reverse primer that hybridizes to a portion having a length of 15 to 25 bases from the 3'end side of 1 is included.
  • the genetic feature A of the present invention has been described as an example for simplification, but the same applies to the genetic features B (including genetic features B-1 to B-4) and C of the present invention.
  • the “portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 1” is, for example, a PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the part of the genome of the Stevia plant that can be amplified by the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 2" is, for example, a PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 9 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the “portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 3” is, for example, a PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 11 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the part of the genome of the Stevia plant that can be amplified by In a specific embodiment, the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 4" is, for example, a PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 13 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 5" is, for example, a PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 15 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the part of the genome of the Stevia plant that can be amplified by the "portion consisting of the base sequence corresponding to SEQ ID NO: 6" is, for example, a PCR using a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 17 and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the “allele in which the base at the position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1 is A” includes the base sequence of SEQ ID NO: 19, 20 or 21.
  • the “allele in which the base at the position corresponding to the 40th position of SEQ ID NO: 2 is T” includes the base sequence of SEQ ID NO: 22, 23, or 24.
  • the “allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T” includes the base sequence of SEQ ID NO: 25, 26 or 27.
  • the “allele in which the base at the position corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 4 is C” includes the base sequence of SEQ ID NO: 28, 29 or 30.
  • the “allele lacking the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5” comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, 32 or 33.
  • the “allele in which the base at the position corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6 is A” includes the base sequence of SEQ ID NO: 34, 35 or 36.
  • (A) a position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1, (B-1) a position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2, (B-2) a position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3, B-3) A group consisting of a position corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 4, a part corresponding to positions 55 to 72 of (B-4) SEQ ID NO: 5, and a position corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6.
  • the positions selected from may be collectively referred to as the “polymorphic site of the present invention” or the “mutation site of the present invention”.
  • the above-mentioned genetic characteristics are PCR method, TaqMan PCR method, sequencing method, microarray method, invader method, TILLING method, RAD (random amplified polymorphic DNA) method, restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) method, PCR-SSCP method.
  • AFLP amplified fragment length polymorphism
  • SSLP simple sequence length polymorphism
  • CAPS cleaved amplified polymorphic sequence
  • dCAPS derived cleaved amplified polymorphic sequence
  • ASO allele-specific oligonucleotide
  • ARMS Denaturant gradient gel electrophoresis
  • CCM chemical cleavage of mismatch
  • DOL DOL
  • MALDI-TOF/MS MALDI-TOF/MS method
  • TDI method padlock probe method
  • molecular beacon method DASH (dynamic allele specific hybridization) Method
  • UCAN method ECA method
  • PINPOINT method PROBE (primeroligo base extension) method
  • VSET very short extension
  • Survivorassay Sniper assay
  • Luminex assay GOOD method
  • LCx method LCx method
  • SNaPshot method MassARRAY method It can be detected by the pyrosequencing method
  • the genetic features of the invention can be detected with the following primer set and restriction enzyme combinations.
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 38.
  • the resulting PCR product (about 196 bp long) (for example, SEQ ID NO: 39 or 40) was treated with the restriction enzyme Hpy188I, a band of about 96 bp long (for example, SEQ ID NO: 41) and about 100 bp long were obtained.
  • Band for example, SEQ ID NO: 42
  • a restriction enzyme-treated product of about 43 bp eg, SEQ ID NO:43
  • 57 bp eg, SEQ ID NO:44
  • a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 are used for the genomic DNA of the candidate plant.
  • PCR amplification of the obtained PCR product (about 297 bp long, for example, SEQ ID NO:47 or 48) gives only a band of about 297 bp long (for example, SEQ ID NO:47) even if KpnI restriction enzyme treatment is performed. ..
  • a restriction enzyme digestion product of about 258 bp eg, SEQ ID NO:49
  • a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 50 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 51 are used for the genomic DNA of the candidate plant.
  • PCR is carried out, and the obtained PCR product (about 383 bp long, for example, SEQ ID NO: 52 or 53) is treated with XbaI restriction enzyme to obtain only a band about 383 bp long (for example, SEQ ID NO: 52).
  • the candidate plant does not have the genetic characteristic B-2.
  • a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 are used for the genomic DNA of the candidate plant.
  • PCR amplification of the obtained PCR product (about 390 bp long, for example, SEQ ID NO: 57 or 58) gives a band of about 390 bp long (for example, SEQ ID NO: 57) even if AflII restriction enzyme treatment is performed. ..
  • a restriction enzyme digestion product of about 347 bp eg, SEQ ID NO:59
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 60 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 61. Amplification yields only a PCR product of approximately 140 bp (eg SEQ ID NO:62). On the other hand, if a 140 bp (eg, SEQ ID NO:62) and 158 bp (eg, SEQ ID NO:63) PCR product is produced, then the candidate plant does not have the genetic feature B-4.
  • a 140 bp eg, SEQ ID NO:62
  • 158 bp eg, SEQ ID NO:63
  • PCR is performed on the genomic DNA of the candidate plant using a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 64 and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 65.
  • amplification is performed and the obtained PCR product (about 367 bp length, for example, SEQ ID NO: 66 or 67) is treated with a restriction enzyme SpeI, about 367 bp length (for example, SEQ ID NO: 66) and about 321 bp length (for example, sequence No. 68) is obtained.
  • a restriction enzyme treatment product of about 367 bp for example, SEQ ID NO: 67
  • “about” means ⁇ 5 bp.
  • the restriction enzyme treatment can be performed according to the conditions recommended by the vendor of each restriction enzyme used.
  • Steviol glycosides such as RebD and M are extracted by reacting fresh or dried leaves of the plant of the present invention with a suitable solvent (aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone). Can be extracted in the state of.
  • a suitable solvent aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • a gradient of ethyl acetate or other organic solvent water, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass spectrometry (Time- Purification of individual steviol glycosides such as RebD and M by using known methods such as of-Flight mass spectrometry (TOF-MS) and Ultra (High) Performance Liquid chromatography (UPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • gas chromatography gas chromatography
  • time-of-flight mass spectrometry Time- Purification of individual steviol glycosides such as RebD and M by using known methods such as of-Flight mass spectrometry (TOF-MS) and Ultra (High) Performance Liquid chromatography (UPLC).
  • the content of steviol glycosides such as RebD and M can be determined according to the method described in Ohta, et al., J.Appl. Glycosci., Vol.57, No.3 (2010) or WO2010/038911, and the examples described later. It can be measured by the described method. Specifically, it can be measured by sampling fresh leaves from the Stevia plant of the present invention and performing LC/MS-MS.
  • the plant of the present invention includes not only the whole plant but also plant organs (eg, leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg, epidermis, phloem, parenchyma, xylem, vascular bundles, fences). Tissue, spongy tissue, etc.) or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • the leaves may also be the dry leaves mentioned above.
  • the plant of the present invention may also include tissue culture or plant culture cells. This is because the plant body can be regenerated by culturing such a tissue culture or plant culture cell.
  • tissue culture or plant culture cells of the plant of the present invention include embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections and callus, and the like. It is not limited.
  • the present invention comprises the following characteristics (1) to (4), which comprises a step of crossing the Stevia plant of the present invention with a second Stevia plant.
  • the present invention provides a method for producing a Stevia plant having a high RebD content, which comprises at least one of the following (hereinafter sometimes referred to as "the production method of the present invention”). (1) It contains 3.3% or more of RebD per unit mass of dried leaf. (2) It contains 2.6% or more of RebD and 0.4% or more of RebM per unit mass of dry leaf. (3) The total amount of RebD and RebM is 3.7% or more per unit mass of dried leaves. (4) The total mass ratio of RebD and RebM to the total steviol glycoside is 37.8% or more.
  • the high RebD-containing Stevia plant produced by the method has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention.
  • RebD, RebM the range of the total amount of RebD and RebM, the range of the ratio of the total amount of RebD, RebD and RebM to the total steviol glycoside amount in the plant obtained by the production method of the present invention,
  • the plant body is as described above.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic characteristic A of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic characteristic B of the present invention (that is, at least one of the genetic characteristics B-1 to B-4 of the present invention).
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic characteristic C of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention comprises the genetic feature A of the present invention and the genetic feature B (that is, at least one of the genetic features B-1 to B-4 of the present invention).
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic characteristic A and the genetic characteristic C of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has the genetic characteristic B and the genetic characteristic C of the present invention.
  • the plant obtained by the production method of the present invention has all of the genetic characteristics A to C of the present invention.
  • crossing means crossing the plant body of the present invention (first generation (S1)) with the second plant body (S1) to obtain its offspring (the present invention). Means to obtain a plant body (second generation (S2)) produced by the production method of 1.
  • the backcross is preferable as the crossing method.
  • the "backcross” means the plant of the present invention and the second The progeny of the present invention (S2) is further crossed with the plant of the present invention (that is, a plant having the genetic characteristics of the present invention) (S1) to give the genetic characteristics of the present invention.
  • the second plant (S1) used in the production method of the present invention has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention, it is substantially effective.
  • the gene polymorphism of the present invention is inherited according to Mendelian's law, and a phenotype correlated with the gene polymorphism, that is, a phenotype of high RebD content is also inherited according to Mendelian's law.
  • the plant of the present invention can be produced by selfing. Self-pollination can be performed by allowing the pistil of the plant of the present invention to self-pollinate the pollen of the stamen of the plant of the present invention.
  • the plant produced by the producing method of the present invention has the same phenotype and genetic characteristics as the plant of the present invention. Therefore, the plant produced by the producing method of the present invention is further a third Stevia plant. It is also possible to produce a Stevia plant having a phenotype equivalent to that of the plant of the present invention by crossing with.
  • the plant of the present invention can be produced by regenerating the plant by culturing the above-described tissue culture or plant culture cells.
  • the culture conditions are the same as the conditions for culturing tissue cultures or plant culture cells of wild-type Stevia plants, and are known (Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicalinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123).
  • the plant of the present invention can be created by introducing the mutation of the present invention into the genome of Stevia plant.
  • the mutation may be introduced by a gene recombination technique or a non-gene recombination technique.
  • Examples of the “non-genetically recombinant method” include a method of inducing a mutation in a gene of a host cell (or a host plant) without introducing a foreign gene. Examples of such a method include a method of acting a mutagen of a plant cell. Examples of such a mutagen include ethyl methane sulfonic acid (EMS) and sodium azide.
  • EMS ethyl methane sulfonic acid
  • ethyl methane sulfonic acid is 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8% , 0.9%, 1.0%, etc. can be used to treat plant cells.
  • the treatment time is 1 to 48 hours, 2 to 36 hours, 3 to 30 hours, 4 to 28 hours, 5 to 26 hours, and 6 to 24 hours.
  • the treatment procedure itself is known, it can be carried out by immersing the water-absorbed seeds that have undergone the water absorption process in the treatment liquid containing the mutagen at the above concentration for the above treatment time.
  • a method of irradiating a plant cell with radiation such as X-rays, ⁇ -rays, and ultraviolet rays can be used.
  • cells irradiated with an appropriate amount of ultraviolet irradiation are cultured in a selective medium or the like, and then cells, callus, or plants having the desired trait can be selected. ..
  • the irradiation intensity at that time is 0.01 to 100 Gr, 0.03 to 75 Gr, 0.05 to 50 Gr, 0.07 to 25 Gr, 0.09 to 20 Gr, 0.1 to 15 Gr, 0.1 to 10 Gr, 0.
  • 5 to 10 Gr, 1 to 10 Gr, irradiation distance is 1 cm to 200 m, 5 cm to 100 m, 7 cm to 75 m, 9 cm to 50 m, 10 cm to 30 m, 10 cm to 20 m, 10 cm to 10 m, irradiation time is 1 minute to 2 The period is 2 minutes to 1 year, 3 minutes to 0.5 year, 4 minutes to 1 month, 5 minutes to 2 weeks, 10 minutes to 1 week.
  • the irradiation intensity, distance, and time vary depending on the type of radiation and the state (cell, callus, plant) to be irradiated, but can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • plant cells may undergo mutation during culturing, and therefore it is preferable to return them to individual plants for more stable trait maintenance.
  • the plant of the present invention is used as a host for subsequent gene recombination (for example, by genome editing) to obtain a plant (for example, the plant of the present invention is used as a host for gene recombination, and another trait is obtained).
  • the added plants are not excluded from the scope of the present invention.
  • a plant having the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention and the plant of the present invention is obtained by detecting the genetic characteristic of the present invention from the tissue of the plant. Can be screened.
  • “screening” means identifying the plant of the present invention from other plants and selecting the plant of the present invention.
  • the present invention in another aspect, screens a high RebD-containing Stevia plant comprising detecting the presence and/or absence of at least one of the genetic features AC of the present invention from the genome of a test plant.
  • a method hereinafter sometimes referred to as “screening method of the present invention”.
  • the genetic feature to be detected is the genetic feature A of the present invention.
  • the genetic feature to be detected is genetic feature B of the present invention (that is, at least one of genetic features B-1 to B-4 of the present invention).
  • the genetic feature to be detected is genetic feature C of the present invention.
  • the genetic features to be detected are the genetic feature A and the genetic feature B of the present invention (that is, at least one of the genetic features B-1 to B-4 of the present invention).
  • the genetic features to be detected are genetic feature A and genetic feature C of the present invention.
  • the genetic features to be detected are genetic feature B and genetic feature C of the present invention.
  • the genetic features to be detected are all of the genetic features A to C of the present invention.
  • the screening method of the present invention may further include a step of selecting, from test plants, a plant in which the presence of at least one of the above genetic characteristics is detected.
  • the presence of the genetic features of the invention is (A) an allele in which the base at the position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1 is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 69), (B-1) an allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 70), (B-2) an allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 71), (B-3) an allele in which the base at the position corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 4 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 72), (B-4) an allele lacking a portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 (for example, an allele containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73),
  • the absence of the genetic features of the present invention is (A) an allele in which the base at the position corresponding to position 201 of SEQ ID NO: 1 is A (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 69), (B-1) an allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 70), (B-2) an allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 71), (B-3) an allele in which the base at the position corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 4 is C (for example, an allele containing the base sequence of SEQ ID NO: 72), (B-4) an allele lacking a portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO: 5 (for example, an allele containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73
  • Specific examples of the method for detecting genetic characteristics of the present invention include PCR method, TaqMan PCR method, sequencing method, microarray method, invader method, TILLING method, RAD method, RFLP method, PCR-SSCP method, AFLP method, SSLP method.
  • CAPS method CAPS method, dCAPS method, ASO method, ARMS method, DGGE method, CCM method, DOL method, MALDI-TOF/MS method, TDI method, padlock probe method, molecular beacon method, DASH method, UCAN method, ECA method, PINPOINT Method, PROBE method, VSET method, Survivor assay, Sniper assay, Luminex assay, GOOD method, LCx method, SNaPshot method, Mass ARRAY method, pyrosequencing method, SNP-IT method, melting curve analysis method, etc. It is not limited to.
  • a primer having a 3'terminal portion having a sequence complementary to the polymorphic site of the present invention it is preferable to prepare a primer having a 3'terminal portion having a sequence complementary to the polymorphic site of the present invention.
  • the primer designed in this way when the sample serving as a template has a polymorphism, the primer completely hybridizes to the template, and thus the polymerase extension reaction proceeds, but the template has the mutation of the present invention. Otherwise, the nucleotides at the 3'end of the primer will mismatch the template and the extension reaction will not occur.
  • the primer sequence is designed so that the polymorphism of the present invention and the primer sequence do not overlap, and the gene mutation of the present invention can be PCR-amplified, and the base sequence of the amplified nucleotide fragment is sequenced.
  • the genetic characteristic of the present invention can be detected.
  • the TaqMan PCR method is a method utilizing a fluorescently labeled allele-specific oligo and a PCR reaction with Taq DNA polymerase (Livak, KJ Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)).
  • the sequence method is a method of analyzing the presence or absence of a mutation by amplifying a region containing the mutation by PCR and sequencing the DNA sequence using a Dye Terminator or the like (Sambrook, Fritsch and Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the DNA microarray is one in which one end of a nucleotide probe is fixed in an array on a support, and includes a DNA chip, a Gene chip, a microchip, a bead array and the like.
  • the presence or absence of the polymorphism of the present invention can be comprehensively detected by using a probe containing a sequence complementary to the polymorphism of the present invention.
  • GeneChip assay is mentioned as a DNA microarray assay such as a DNA chip (see Affymetrix; US Pat. Nos. 6,045,996, 5,925,525, and 5,858,659).
  • GeneChip technology utilizes miniaturized, high-density microarrays of oligonucleotide probes attached to the chip.
  • the invader method is a special method in which two types of reporter probes and one type of invader probe specific to each allele of polymorphism such as SNP are hybridized with template DNA and the DNA structure is recognized and cleaved.
  • This is a method that combines the cleavage of DNA with a Cleavase enzyme having endonuclease activity (Livak, KJ Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933. (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)).
  • the TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) method is a method for screening a mutation mismatch in the genome of a mutant population having a mutation introduced therein by PCR amplification and CEL I nuclease treatment.
  • the genetic feature A of the present invention includes, without limitation, a primer set capable of amplifying a region containing a sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 19-21 and a polyset of SEQ ID NOs: 19-21.
  • a restriction enzyme that cleaves nucleotides but does not cleave the polynucleotides of SEQ ID NOs: 75-77 or a polynucleotide of SEQ ID NOs: 19-21 but does cleave a polynucleotide of SEQ ID NOs: 75-77 (eg, Hpy188I ) And can be detected by the CAPS method.
  • Non-limiting examples of primer sets include the following. Forward primer: ATGGTTTGGGAATAGCTCTGTTGTT (SEQ ID NO: 37)
  • Reverse primer AGAACTTTGTTCTTGAACCTCTTG (SEQ ID NO: 38)
  • the genetic feature B of the present invention can be detected by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme without limitation.
  • B-1 A primer set containing a forward primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 and a reverse primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 46
  • B-2 a primer set containing a forward primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 50 and a reverse primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 51
  • B-3 A primer set containing a forward primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 55 and a reverse primer containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 56, or
  • B-4) a forward containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 60.
  • a primer set comprising a primer and a reverse primer containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 61.
  • the primer set is not limited to those having the sequences of SEQ ID NOs: 45, 46, 50, 51, 55, 56, 60 or 61.
  • Any reverse primer may be used as long as it has a sequence from the 3'end to 15 bases upstream (see the table below) at the 3'end, and as a reverse primer, from the 3'end of SEQ ID NO: 46, 51, 56 or 61 to 15 bases upstream. As long as it has the sequence (see the table below) at the 3'end.
  • Such primers may be 15 to 50 bases long, 20 to 45 bases long.
  • the primer set is not limited to those having the sequences of SEQ ID NOs: 45, 46, 50, 51, 55, 56, 60 or 61.
  • any of SEQ ID NOS: 45, 50, 55 or 60 may be used.
  • the reverse primer may have or include a sequence of 15 or more consecutive bases in SEQ ID NO: 46, 51, 56 or 61. ..
  • a primer comprising a forward primer having or including a sequence of 15 consecutive bases or more in SEQ ID NO: 45 and a reverse primer having a sequence of 15 consecutive bases or more in SEQ ID NO: 46 set
  • B-2′′ a primer including a forward primer having or including a sequence of 15 consecutive or more bases in SEQ ID NO: 50 and a reverse primer having a sequence of 15 consecutive or more bases in SEQ ID NO: 51 set
  • B-3′′ A primer comprising a forward primer having or including a sequence of 15 consecutive or more bases in SEQ ID NO: 55 and a reverse primer having a sequence of 15 consecutive or more bases in SEQ ID NO: 56 Set
  • B-4′′ a forward primer having or including a sequence of 15 or more consecutive bases in SEQ ID NO: 60 and a reverse primer having or including a sequence of 15 or more consecutive bases in SEQ ID NO: 61 Including, primer set.
  • Such a primer may have a length of 15 to 50 bases, 20 to 45 bases, or 30 to 65 bases as
  • restriction enzymes to be combined with the above-mentioned primers include the following.
  • the genetic feature C of the present invention can be detected by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • Primer set A sequence selected from SEQ ID NOs: 86-109 located at the 3'end, and optionally a contiguous sequence continuing from position 28 to 5'of SEQ ID NO: 6 added to the 5'end of said sequence (eg, , A contiguous sequence of any length) and a sequence complementary to any contiguous sequence of 20 bases or more located on the 3'side of position 50 of SEQ ID NO: 6 (for example, SEQ ID NO: 65). , 110) and a reverse primer.
  • the primer sequence can be optimized within the range satisfying the above conditions.
  • each of the above primers may have a length of 15 to 50 bases, a length of 18 to 48 bases, a length of 20 to 45 bases, a length of 30 to 65 bases, and the like.
  • ⁇ Restriction enzyme The restriction enzymes corresponding to each of SEQ ID NOs: 86 to 109 are shown below. In the following sequences, “R” represents A or G and “Y” represents C or T.
  • the genetic feature C of the present invention can be detected by the dCAPS method using the following primer set and restriction enzyme.
  • the screening method of the present invention may further include the step of measuring the RebD content of the tissue (eg, leaf) of the test Stevia plant in which the genetic characteristic of the present invention has been detected.
  • the measurement of the RebD content is as described in the section of the plant of the present invention.
  • an individual having a high RebD content is selected, and this is crossed with another stevia plant to obtain the offspring.
  • the screening method of the present invention may be applied to plants. Therefore, the screening method of the present invention may include one or more of the following steps.
  • the individuals having a high RebD content are, for example, among the test Stevia plants in which the genetic characteristics of the present invention have been detected, the highest RebD content is in the top 50%, the top 40%, and the top 30. %, top 20%, top 10%, top 5%, top 4%, top 3%, top 2% or top 1%, and the like. Further, other Stevia plants to be crossed may or may not include the genetic characteristic of the present invention. In the above aspect, steps (iv) to (vii) can be repeated multiple times. In this way, Stevia plants with a higher RebD content can be screened.
  • the test stevia plant may be a natural plant or a non-genetically recombinant plant.
  • the non-transgenic plant is as described in the section of the plant of the present invention.
  • the test stevia plant may include a mutagenized stevia plant and its progeny plant.
  • the mutagenesis treatment is as described in the section of the plant body of the present invention, and includes treatment with a mutagen, irradiation with radiation or light, and the like.
  • the present invention also provides a primer set described above, for example, a primer set containing the forward primer of SEQ ID NO: 37 and the reverse primer of SEQ ID NO: 38, (B-1) to (B-4), B-1′) to (B-4′) and (B-1′′) to (B-4′′), and one or more primer sets selected from the group and/or the above table.
  • the primer set described in 2 to 3 is provided.
  • the present invention further comprises a primer set capable of amplifying a region having a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 69 to 74 by PCR, for example, a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 7, A primer set with a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO:8, a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO:9, and a primer set with a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO:10, containing the base sequence of SEQ ID NO:11 A primer set of a forward primer and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 12, a primer set of a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 13, and a reverse primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 14, A primer set consisting of a forward primer containing a base sequence and a reverse primer containing a base sequence of SEQ ID NO:16, a forward primer containing a base sequence of SEQ ID NO:17
  • the present invention provides a probe capable of detecting the presence and/or absence of the genetic characteristic of the present invention (hereinafter, may be referred to as “probe of the present invention”).
  • the probe of the present invention may have a structure suitable for various detection methods for the presence and/or absence of the genetic feature of the present invention.
  • the probe of the present invention may contain a nucleotide sequence having complementarity to the part of the genome containing the mutation site of the present invention.
  • Non-limiting examples of such probes include those containing a nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 19 to 36, 75 to 77, 135 to 149.
  • SEQ ID NOs: 19-36 are specific for alleles containing the mutation of the invention
  • SEQ ID NOs: 75-77, 135-149 are specific for alleles not containing the mutation of the invention.
  • the presence of the genetic feature of the present invention can be detected by detection of the allele containing the mutation of the present invention and/or non-detection of the allele not containing the mutation of the present invention, and the absence of the genetic feature of the present invention is It can be detected by non-detection of the allele containing the mutation of the present invention and/or detection of the allele not containing the mutation of the present invention.
  • the probe of the present invention preferably has a label.
  • Non-limiting examples of such labels include fluorescent labels, luminescent labels, radioactive labels, dyes, enzymes, quenchers, binding moieties to detectable labels and the like.
  • the probe of the present invention has a base sequence selected from SEQ ID NOs: 19 to 36, 75 to 77, 135 to 149, and a label.
  • the present invention further includes a primer set capable of amplifying a region containing the sequence of any of SEQ ID NOs: 19 to 21, for example, a forward primer containing the base sequence of SEQ ID NO: 7 and a base sequence of SEQ ID NO: 8.
  • a kit including a restriction enzyme eg, Hpy188I
  • a screening kit is provided.
  • the present invention further includes the group consisting of (B-1) to (B-4), (B-1') to (B-4') and (B-1'') to (B-4'').
  • a kit for example, a screening kit, containing any one or more primer sets selected from the above and optionally a restriction enzyme is provided. If any one or more primer sets selected from the group consisting of (B-1), (B-1′) and (B-1′′) is used in the kit, it is included in the kit.
  • the restriction enzyme used is KpnI. In the kit, when any one or more primer sets selected from the group consisting of (B-2), (B-2′) and (B-2′′) is used, it is included in the kit.
  • the restriction enzyme used is XbaI. If any one or more primer sets selected from the group consisting of (B-3), (B-3′) and (B-3′′) is used in the kit, it is included in the kit.
  • the restriction enzyme used is AflII.
  • the present invention further provides a kit including, for example, a screening kit containing a primer set containing the combination of the forward primer and the reverse primer shown in Tables 2 to 3 and a restriction enzyme corresponding thereto.
  • the restriction enzyme includes KpnI
  • the restriction enzyme contains XbaI
  • the restriction enzyme includes AflII
  • the present invention also provides a screening kit comprising a primer set capable of amplifying a region having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 69 to 74 by PCR, and the probe of the present invention. ..
  • primer sets, probes, and kits can be used for detecting the genetic characteristics of the present invention, used in the screening method of the present invention, and the like.
  • instructions including detection of the genetic characteristics of the present invention and a description of the screening method of the present invention, for example, instructions for use, a medium recording information on the method of use, for example, A flexible disk, CD, DVD, Blu-ray disk, memory card, USB memory, etc. may be included.
  • an extract is obtained from the plant of the present invention or seeds or leaves (for example, dried leaves or fresh leaves) of the plant.
  • a method for producing a RebD-containing extract (hereinafter sometimes referred to as “the method for producing an extract of the present invention”) including the step of obtaining.
  • a method for producing RebD (hereinafter, also referred to as “method for producing RebD of the present invention”), which comprises a step of purifying RebD from the extract obtained by the method for producing an extract of the present invention.
  • the high RebD-containing stevia plant selected by the screening method of the present invention, or the high RebD-containing stevia plant produced by the method of the present invention RebD, RebM or
  • a method for producing RebD, RebM, or both which comprises the step of obtaining an extract containing both.
  • An extract containing RebD, RebM or both is obtained by reacting a fresh leaf or a dry leaf of the plant of the present invention with a suitable solvent (an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone). be able to.
  • a suitable solvent an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • an extract containing RebD, RebM, or both of them is extracted with ethyl acetate or another organic solvent:water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass spectrometry (Time-of-flight).
  • RebD, RebM, or both can be purified by using a known method such as -Flight mass spectrometry (TOF-MS) or Ultra (High) Performance Liquid chromatography (UPLC).
  • the extract obtained by the method for producing an extract of the present invention contains RebD, RebM or both in a higher content than the wild-type Stevia species.
  • the extract of the present invention has RebD, RebM or both of which are 300% or more, 400% or more, 500% or more, 600% or more, 700% or more, 800% or more, as compared with an extract obtained from a wild-type Stevia species.
  • the content may be 4800% or higher, 4900% or higher, and 5000% or higher.
  • the extract of the present invention and the extract obtained from the wild-type Stevia species may be obtained by the
  • the RebD, RebM or both obtained by the method for producing the extract and/or the RebD or RebM of the present invention thus obtained are mixed with other components to give RebD, RebM.
  • it is possible to produce a novel drug, a fragrance, or a food or drink with an increased content of both of them. Therefore, the present invention as another embodiment, a step of mixing the extract of the present invention and/or RebD, RebM or both of them obtained by the method for producing RebD, RebM of the present invention, and other components A method for producing a drug, a fragrance, or a food or drink is provided.
  • the present invention provides a novel drug, fragrance or food or drink, which is obtained by the above-mentioned production method and has an increased content of RebD, RebM or both.
  • the food and drink means beverages and foods. Therefore, in one embodiment, the present invention provides a novel drug, flavor, beverage or food, and a method for producing the drug, flavor, beverage or food.
  • nucleotide sequence of plant of the present invention provides a nucleotide sequence of Stevia plant of the present invention.
  • a specific embodiment of the nucleotide sequence of the Stevia plant having the genetic feature A of the present invention includes or consists of the nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 19 to 21 and 69.
  • a specific embodiment of the nucleotide sequence of the Stevia plant having the genetic characteristic B of the present invention is SEQ ID NOs: 22 to 33 and 70. Contains or consists of a nucleotide sequence selected from ⁇ 73.
  • a specific embodiment of the base sequence of the Stevia plant having the genetic feature C of the present invention includes or consists of the base sequence selected from SEQ ID NOs: 34 to 36 and 74.
  • Specific embodiments of the base sequence of the Stevia plant having the genetic characteristic A and the genetic characteristic B of the present invention include the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 19 to 21 and 69, and SEQ ID NOs: 22 to 33 and 70.
  • Specific embodiments of the base sequence of the Stevia plant having the genetic characteristic A and the genetic characteristic C of the present invention include the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 19 to 21 and 69, and SEQ ID NOs: 34 to 36 and 74. And a base sequence selected from.
  • a specific embodiment of the nucleotide sequence of the Stevia plant having the genetic characteristic B and the genetic characteristic C of the present invention is the nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs:22 to 33 and 70 to 73, and SEQ ID NOs:34 to 36. And a nucleotide sequence selected from 74.
  • a specific embodiment of the nucleotide sequence of the Stevia plant having all of the genetic features A to C of the present invention is that the nucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 19 to 21 and 69 and SEQ ID NOs: 22 to 33 and 70 to 73 It includes the base sequence selected and the base sequences selected from SEQ ID NOs: 34 to 36 and 74.
  • Example 1 Production of high RebD stevia plants 1. Preparation of Test Lines A male strain (P1) having a high TSG-containing genetic characteristic and a female strain (P2) having a high RebM-containing genetic characteristic were crossed to obtain a hybrid first generation (S1 generation) seed. Were sown and sown in a greenhouse in the Suntory Research Center to obtain S1 generation seedlings.
  • a high RebM-containing genetic trait has at least one of the following traits: B-1: Homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 40 of SEQ ID NO: 2 is T. B-2: Homozygous for an allele in which the base at the position corresponding to position 44 of SEQ ID NO: 3 is T.
  • B-3 Homozygous for the allele in which the base at the position corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 4 is C.
  • B-4 Homozygous for the allele lacking the portion corresponding to positions 55 to 72 of SEQ ID NO:5.
  • the fact that these genetic characteristics are related to the high RebM content characteristic is shown in an unpublished prior application by the present applicant (PCT/JP2018/038064 filed on October 12, 2018).
  • the genetic characteristics of the high TSG content type have the following characteristics.
  • C Heterozygosity for the allele in which the base at the position corresponding to position 49 of SEQ ID NO: 6 is A.
  • Genomic DNA was extracted from the fresh leaves of each individual tested in Example 1, and the possession status of genetic characteristics B-1 and C was investigated. ..
  • PCR was carried out using the following primers, a restriction enzyme (KpnI) was added to the PCR product, an enzyme reaction was carried out at 37° C., and treatment with a restriction enzyme was carried out. After the restriction enzyme treatment, electrophoresis was performed using a microchip type electrophoresis apparatus LabChip GX Touch HT, and markers were identified by the band pattern after the electrophoresis.
  • the primer sequences are as follows.
  • Fw primer 5'-TAATCATCCAAACCCTAATCTCGCCAAACAACCGGGGTAC-3' (SEQ ID NO: 45)
  • Rv primer 5'-GAGGAAGACATTGGGCAACTC-3' (SEQ ID NO: 46)
  • SEQ ID NO: 49 a product which did not generate a restriction enzyme-treated product (for example, SEQ ID NO: 49) of about 260 bp was defined as genetic feature B-1 positive.
  • PCR was performed using the following primers, a restriction enzyme (SpeI) was added to the PCR product, and the enzyme reaction was performed at 37°C. After treatment with a restriction enzyme, electrophoresis was performed using a microchip type electrophoresis apparatus LabChip GX Touch HT (PerkinElmer), and markers were identified by a band pattern after electrophoresis.
  • SpeI restriction enzyme
  • LabChip GX Touch HT PerkinElmer
  • the present invention makes it possible to provide RebD more efficiently, by containing a sufficient amount of RebD, it is possible to provide pharmaceuticals, flavors, foods and drinks, etc. with high-quality taste.

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Abstract

本発明は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＤをより高い含量で含む高レバウジオシドＤ含有ステビア植物体を提供する。本発明はまた、そのような高レバウジオシドＤ含有ステビア植物体を作出する方法、そのような植物体から得られる乾燥葉や抽出物も提供する。

Description

高レバウジオシドＤ含有ステビア植物
　本発明は、レバウジオシドＤの含有量が高いステビア植物に関する。
　多様化する消費者ニーズに対応すべく、様々な飲料が開発され、市販されている。ショ糖等の糖類は、甘味を与える等の目的で飲料にごく普通に配合される成分であるが、過剰摂取による健康への影響が指摘されてきており、より低カロリーであり、かつ天然由来の甘味料に対するニーズが高まりつつある。例えば特許文献１は、ビタミン、高甘味度甘味料、及び甘味改善組成物を含有する機能性甘味料組成物を開示している。
　レバウジオシド（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ、以下「Ｒｅｂ」ともいう）は、ステビア抽出物に含まれる甘味成分として知られている。ステビア抽出物は、ステビアの葉から抽出、精製されたものである。ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ　Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔｏｎｉ）という。ステビアは砂糖の約３００倍以上の甘味を持つ成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。Ｒｅｂとしては、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ等、様々な配糖体の存在が報告されている（特表２０１２－５０４５５２）。様々なＲｅｂの中で、例えばＲｅｂＡは、高甘味度と良質甘味を有する甘味料として評価されており、広く用いられている。その他のＲｅｂについても、その独自の甘さ及び付随する味を有することが判明しつつある。
　そのような状況において、ＲｅｂＤを乾燥葉あたり３．２８％含むステビア植物体が知られている（特許文献３）。
特表２００９－５１７０４３号明細書 特表２０１６－５１５８１４号明細書 ＵＳ２０１６／００５７９５５Ａ１
　ＲｅｂＤはステビオール配糖体の中では味質が良いとされているが、天然のステビア植物体からは多くを得ることができず、その入手が問題とされている。
　本発明は、野生型ステビア種と比べて高含有量でＲｅｂＤを含む高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体並びに当該植物体の作出方法及びスクリーニング方法を提供する。
　一態様において、本発明は以下を提供する。

［１］　乾燥葉の単位質量当たり３．３％以上のＲｅｂＤを含む、高レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）含有ステビア植物体。
［２］
　配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である、［１］に記載の植物体。
［３］
　以下の遺伝的特徴の少なくとも１つをさらに有する、［１］又は［２］に記載の植物体。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
（４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
［４］
　配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の植物体。

［５］
　非遺伝子組換植物体である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の植物体。
［６］
　突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載の植物体。

［７］　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。

［８］　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［７］に記載の組織、組織培養物又は細胞。

［９］　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、乾燥葉の単位質量当たり３．３　％以上のＲｅｂＤを含む高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体を作出する方法。

［１０］　第２の植物体が［１］～［５］のいずれか一項に記載の植物体である、［９］に記載の方法。

［１１］　ＲｅｂＤを含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体、［７］又は［８］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。

［１２］　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体、［７］又は［８］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ含有抽出物の製造方法。

［１３］　［１１］に記載の抽出物からＲｅｂＤを精製する工程を含む、ＲｅｂＤの製造方法。

［１４］　［１］～［６］のいずれか一項に記載の植物体の抽出物、［７］又は［８］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物、あるいは、［１１］に記載の抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。

［１５］　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
［１６］
　被験ステビア植物体のゲノムから以下の遺伝的特徴の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、［１５］に記載の方法。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
（４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
［１７］
　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、［１５］又は［１６］に記載の方法。

［１８］
　遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、［１５］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］　被験ステビア植物組織の甘味成分の含有量を測定する工程をさらに含む、［１５］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。

［２０］
　配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体のスクリーニングキット。
［２１］
　以下の（１）～（４）の遺伝的特徴の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、［２０］に記載のキット。（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
（４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。

［２２］
　配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、［２０］又は［２１］に記載のキット。
［２３］
　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、［２０］～［２２］のいずれか一項に記載のキット。［２４］
　配列番号１の２０１位に相当する位置にＣからＡへの変異を導入する工程を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体を作出する方法。
［２５］
　変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、［２４］に記載の方法。
　本発明によって、ＲｅｂＤをより多く含むステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる葉、この葉より得られたＲｅｂＤを含む食物や飲料などの提供が可能になる。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１８年１２月２８日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１８－２４８６５６号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
１．高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体
　本発明は、以下の（１）～（４）の特徴の少なくとも１つを有する高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体（以下、「本発明の植物体」又は「本発明のステビア植物体」と総称する場合がある）を提供する。
（１）乾燥葉の単位質量当たり３．３％以上のＲｅｂＤを含む（以下、「本発明の植物体Ａ」又は「本発明のステビア植物体Ａ」と称する場合がある）。
（２）乾燥葉の単位質量当たり２．６％以上のＲｅｂＤと０．４％以上のＲｅｂＭとを含む（以下、「本発明の植物体Ｂ」又は「本発明のステビア植物体Ｂ」と称する場合がある）。
（３）乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＤとＲｅｂＭを合計で３．７％以上含む（以下、「本発明の植物体Ｃ」又は「本発明のステビア植物体Ｃ」と称する場合がある）。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの質量比が合計で３７．８％以上（以下、「本発明の植物体Ｄ」又は「本発明のステビア植物体Ｄ」と称する場合がある）。
　総ステビオール配糖体（Ｔｏｔａｌ　Ｓｔｅｖｉｏｌ　Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ：ＴＳＧ）とは、測定可能なステビオール配糖体の総称であり、未知のステビオール配糖体や、検出限界未満の量で存在するステビオール配糖体を含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群より選択される２つ以上の任意の組み合わせである。例えば、ある実施形態では、総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ及びステビオールからなり、別の実施形態では総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ及びステビオールからなるものであってもよい。
　本発明の植物体Ａにおいて、乾燥葉の単位質量当たり３．３％以上のＲｅｂＤを含むとは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、３．３質量％以上の割合のＲｅｂＤ（例えば、１．６５ｍｇ以上）が含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合は、限定されずに、例えば、３．３％以上、３．４％以上、３．５％以上、３．６％以上、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上等であってよく、３．６％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％などであってよい。
　ここで乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を３～４重量％にまで減らしたものをいう。
　本発明の植物体Ｂにおいて、乾燥葉の単位質量当たり２．６％以上のＲｅｂＤと０．４％以上のＲｅｂＭとを含むとは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、２．６質量％以上の割合のＲｅｂＤ（例えば、乾燥葉５０ｍｇ当たり１．３ｍｇ以上）と、０．４質量％以上のＲｅｂＭ（例えば、乾燥葉５０ｍｇ当たり０．２ｍｇ以上）とが含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭの割合は、（ＲｅｂＤの割合：ＲｅｂＭの割合）とした場合、限定されずに、例えば、（２．６％以上：０．４％以上）、（２．８％以上：０．４％以上）、（３％以上：０．４％以上）、（３．２％以上：０．４％以上）、（３．４％以上：０．４％以上）、（３．６％以上：０．４％以上）、（３．８％以上：０．４％以上）、（４％以上：０．４％以上）、（４．２％以上：０．４％以上）、（４．４％以上：０．４％以上）、（４．６％以上：０．４％以上）、（４．８％以上：０．４％以上）、（５％以上：０．４％以上）、（２．６％以上：０．５％以上）、（２．８％以上：０．５％以上）、（３％以上：０．５％以上）、（３．２％以上：０．５％以上）、（３．４％以上：０．５％以上）、（３．６％以上：０．５％以上）、（３．８％以上：０．５％以上）、（４％以上：０．５％以上）、（４．２％以上：０．５％以上）、（４．４％以上：０．５％以上）、（４．６％以上：０．５％以上）、（４．８％以上：０．５％以上）、（５％以上：０．５％以上）、（２．６％以上：０．６％以上）、（２．８％以上：０．６％以上）、（３％以上：０．６％以上）、（３．２％以上：０．６％以上）、（３．４％以上：０．６％以上）、（３．６％以上：０．６％以上）、（３．８％以上：０．６％以上）、（４％以上：０．６％以上）、（４．２％以上：０．６％以上）、（４．４％以上：０．６％以上）、（４．６％以上：０．６％以上）、（４．８％以上：０．６％以上）、（５％以上：０．６％以上）、（２．６％以上：０．７％以上）、（２．８％以上：０．７％以上）、（３％以上：０．７％以上）、（３．２％以上：０．７％以上）、（３．４％以上：０．７％以上）、（３．６％以上：０．７％以上）、（３．８％以上：０．７％以上）、（４％以上：０．７％以上）、（４．２％以上：０．７％以上）、（４．４％以上：０．７％以上）、（４．６％以上：０．７％以上）、（４．８％以上：０．７％以上）、（５％以上：０．７％以上）、（２．６％以上：０．８％以上）、（２．８％以上：０．８％以上）、（３％以上：０．８％以上）、（３．２％以上：０．８％以上）、（３．４％以上：０．８％以上）、（３．６％以上：０．８％以上）、（３．８％以上：０．８％以上）、（４％以上：０．８％以上）、（４．２％以上：０．８％以上）、（４．４％以上：０．８％以上）、（４．６％以上：０．８％以上）、（４．８％以上：０．８％以上）、（５％以上：０．８％以上）等であってよく、（３．６％以上：０．４％以上）が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％等であってよく、ＲｅｂＭの割合の上限も特に限定されないが、１０％、５％、３％等であってよい。
　本発明の植物体Ｃにおいて、乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＤとＲｅｂＭを合計で３．７％以上含むとは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計質量が、３．７質量％以上（例えば、１．８５ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の割合は、限定されずに、例えば、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上、６．１％以上、６．２％以上、６．３％以上、６．４％以上、６．５％以上、６．６％以上、６．７％以上、６．８％以上、６．９％以上、７．０％以上等であってよく、４．９％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計の割合の上限は特に限定されないが、例えば、２５％、２０％、１５％などであってよい。
　本発明の植物体Ｄにおいて、総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの質量比が合計で３７．８％以上であるとは、例えば葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計質量を、葉から得られたステビオール配糖体の総質量に対する比率としてＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧ％で表した場合、ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値が３７．８％以上であることを意味する。この態様におけるＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値は、限定されずに、例えば、３７．８％以上、３７．９％以上、３８．０％以上、３８．１％以上、３８．２％以上、３８．３％以上、３８．４％以上、３８．５％以上、３８．６％以上、３８．７％以上、３８．８％以上、３８．９％以上、３９．０％以上、３９．２％以上、３９．４％以上、３９．６％以上、３９．８％以上、４０．０％以上、４０．２％以上、４０．４％以上、４０．６％以上、４０．８％以上、４１．０％以上、４１．２％以上、４１．４％以上、４１．６％以上、４１．８％以上、４２．０％以上、４２．４％以上、４２．８％以上、４３．２％以上、４３．６％以上、４４．０％以上、４４．４％以上、４４．８％以上、４５．２％以上、４５．６％以上、４６．０％以上等であってよく、３８．１％以上が好ましい。総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭの質量比の上限は特に限定されないが、例えば、８５％、７５％、６５％、５５％などであってよい。
　一態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ａ」と称する場合がある）を有する。
　別の態様において、本発明のステビア植物体は、以下の（Ｂ－１）～（Ｂ－４）の少なくとも１つの遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ」と称する場合がある）を有する。
（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－１」と称する場合がある）。
（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－２」と称する場合がある）。
（Ｂ－３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－３」と称する場合がある）。
（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ－４」と称する場合がある）。
　別の態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｃ」と称する場合がある）を有する。
　好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４の少なくとも１つ）とを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃとを有する。より好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａ～Ｃをすべて有する。
　「～に相当する位置（又は部分）」とは、ゲノム中に基準配列（例えば、配列番号１～６など）と同一の配列が存在する場合は、ゲノム中に存在するその配列中の位置又は部分（例えば、２０１位、４０位、４４位、４１位、５５～７２位、４９位など）を意味し、ゲノム中に基準配列と同一の配列が存在しない場合は、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を意味する。ゲノム中に基準配列と同一又はそれに相当する配列が存在するかどうかは、例えば、基準配列をＰＣＲで増幅し得るプライマーで、対象となるステビア植物のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物のシーケンシングを行い、得られた配列と基準配列とのアラインメント解析を行うことで決定することができる。基準配列に相当する配列の非限定例としては、例えば、基準配列に対し６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分は、基準配列中の位置又は部分の前後の塩基配列等を考慮して決定することができる。例えば、基準配列とゲノム中の基準配列に相当する配列とのアライメント解析により、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を決定することができる。
　例えば、本発明の遺伝的特徴Ａの「配列番号１の２０１位に相当する位置」を例にとると、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有している場合、「配列番号１の２０１位に相当する位置」はゲノム中の配列番号１と同一の塩基配列からなる部分の５’側から２０１位である。一方、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一ではないがこれに相当する塩基配列からなる部分を有している場合、ゲノムは配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、「配列番号１の２０１位に相当する位置」は、必ずしも配列番号１に相当する部分の５’側から２０１位に該当するわけではないが、配列番号１の２０１位の前後の塩基配列等を考慮し、かかるステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２０１位に相当する位置」を特定することができる。例えば、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１に相当する部分の塩基配列と、配列番号１の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２０１位に相当する位置」を特定することができる。
　「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」は、例えば、配列番号１の塩基配列に対し、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる部分を意味する。
　一部の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、配列番号１の５’末端から１５～２５塩基長の部分の相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマーと、配列番号１の３’末端側から１５～２５塩基長の部分にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。
　ここでは簡潔のため本発明の遺伝的特徴Ａを例に説明したが、本発明の遺伝的特徴Ｂ（遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４を含む）及びＣについても同様である。
　特定の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号２に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号３に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号４に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号５に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１６の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号６に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１８の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
　特定の態様において、「配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」は、配列番号１９、２０又は２１の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２２、２３又は２４の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２５、２６又は２７の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号２８、２９又は３０の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレル」は、配列番号３１、３２又は３３の塩基配列を含む。
　特定の態様において、「配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」は、配列番号３４、３５又は３６の塩基配列を含む。
　ここで、（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置、（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置、（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置、（Ｂ－３）配列番号４の４１位に相当する位置、（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分、及び（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置からなる群から選択される位置を、「本発明の多型部位」又は「本発明の変異部位」と総称することがある。
　また、（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置におけるＣからＡへの変異、（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置におけるＡからＴへの変異、（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置におけるＣからＴへの変異、（Ｂ－３）配列番号４の４１位に相当する位置におけるＧからＣへの変異、（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分の欠失、及び（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置におけるＣからＡへの変異からなる群から選択される変異を、「本発明の多型」又は「本発明の変異」と総称することがある。
　上記の遺伝的特徴は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴は、以下のプライマーセット及び制限酵素の組合せで検出することが可能である。
　候補植物体が遺伝的特徴Ａを有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号３７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号３８に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約１９６ｂｐ長）（例えば、配列番号３９又は４０）に対し制限酵素Ｈｐｙ１８８Ｉによる処理を行うと、約９６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４１）と約１００ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４２）が生じる。一方、約４３ｂｐ（例えば、配列番号４３）及び約５７ｂｐ（例えば、配列番号４４）の制限酵素処理産物を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ａを有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－１を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号４５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長、例えば、配列番号４７又は４８）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行っても約２９７ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４７）しか得られない。一方、約２５８ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４９）を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－１を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－２を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長、例えば、配列番号５２又は５３）にＸｂａＩ制限酵素処理を行っても約３８３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５２）しか得られない。一方、上記ＰＣＲ産物に対しＸｂａＩ制限酵素処理を行った場合に約３４４ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号５４）を生じた場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－２を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－３を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長、例えば、配列番号５７又は５８）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行っても約３９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５７）しか得られない。一方、約３４７ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号５９）を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－３を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｂ－４を有する場合、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うと約１４０ｂｐのＰＣＲ産物（例えば、配列番号６２）のみを生じる。一方、１４０ｂｐ（例えば、配列番号６２）及び１５８ｂｐ（例えば、配列番号６３）のＰＣＲ産物を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ－４を有しない。
　候補植物体が遺伝的特徴Ｃを有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６４に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６５に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３６７ｂｐ長、例えば、配列番号６６又は６７）に対し制限酵素ＳｐｅＩで処理を行うと約３６７ｂｐ長（例えば、配列番号６６）及び約３２１ｂｐ長（例えば、配列番号６８）のバンドが得られる。一方、約３６７ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号６７）のみを生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｃを有しない。
　上記ｂｐ長に関し、「約」とは、±５ｂｐを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
　ＲｅｂＤ及びＭ等のステビオール配糖体は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はOhta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることにより個々のステビオール配糖体、例えばＲｅｂＤ及びＭを精製することができる。
　ＲｅｂＤ及びＭ等のステビオール配糖体の含量は、Ohta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳを行うことにより測定することができる。
　本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。また、葉は先に述べた乾燥葉であってもよい。
　また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
２．本発明の植物体の作出方法
　本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、以下の（１）～（４）の特徴の少なくとも１つを有する高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」と称する場合がある）を提供する。
（１）乾燥葉の単位質量当たり３．３％以上のＲｅｂＤを含む。
（２）乾燥葉の単位質量当たり２．６％以上のＲｅｂＤと０．４％以上のＲｅｂＭとを含む。
（３）乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＤとＲｅｂＭを合計で３．７％以上含む。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの質量比が合計で３７．８％以上。
　当該方法により作出される高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
　本発明の作出方法によって得られる植物体におけるＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計量の範囲、総ステビオール配糖体量に対するＲｅｂＤ、ＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計量の比率の範囲は、本発明の植物体について上記したとおりである。
　一態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａを有する。別の態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４の少なくとも１つ）を有する。別の態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｃを有する。好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４の少なくとも１つ）とを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃとを有する。より好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａ～Ｃをすべて有する。
　本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体（第一代（Ｓ１））と、第２の植物体（Ｓ１）とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体（第二代（Ｓ２））を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体（Ｓ２）を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝的特徴を有する植物体）（Ｓ１）と交雑させて、本発明の遺伝子的特徴を有する植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体（Ｓ１）が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。本発明の遺伝子多型はメンデルの法則に従って遺伝し、これに伴って当該遺伝子多型と相関する表現型、つまり高ＲｅｂＤ含有という表現型も、メンデルの法則に従って遺伝する。
　あるいは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
　本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的性質が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体とを交雑させることにより、本発明の植物体と同等の表現型を有するステビア植物体を作出することも可能である。
　別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123）。
　さらに別の態様として、本発明の植物体は、ステビア植物体のゲノムに、本発明の変異を導入することで作出することも可能である。変異の導入は、遺伝子組換え的手法により行っても、非遺伝子組換え的手法により行ってもよい。「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１～４８時間、２～３６時間、３～３０時間、４～２８時間、５～２６時間、６～２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
　あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１～１００Ｇｒ、０．０３～７５Ｇｒ、０．０５～５０Ｇｒ、０．０７～２５Ｇｒ、０．０９～２０Ｇｒ、０．１～１５Ｇｒ、０．１～１０Ｇｒ、０．５～１０Ｇｒ、１～１０Ｇｒであり、照射距離は１ｃｍ～２００ｍ、５ｃｍ～１００ｍ、７ｃｍ～７５ｍ、９ｃｍ～５０ｍ、１０ｃｍ～３０ｍ、１０ｃｍ～２０ｍ、１０ｃｍ～１０ｍであり、照射時間は１分～２年、２分～１年、３分～０．５年、４分～１か月、５分～２週間、１０分～１週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
　また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）などの手法も公知である。
　一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
　本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換え（例えばゲノム編集等により）を行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
３．本発明の植物体のスクリーニング方法
　本発明の植物体及び本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝的特徴を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
　したがって、本発明は、別の側面において、被験植物のゲノムから本発明の遺伝的特徴Ａ～Ｃの少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称する場合がある）を提供する。
　一態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ａである。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４の少なくとも１つ）である。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｃである。好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４の少なくとも１つ）である。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃである。より好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ａ～Ｃのすべてである。
　本発明のスクリーニング方法は、上記の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
　本発明の遺伝的特徴の存在は、
（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号６９の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７０の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７１の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号７２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレル（例えば、配列番号７３の塩基配列を含むアレル）、及び
（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号７４の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの存在の検出、及び／又は、
（ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－１）配列番号２の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－２）配列番号３の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＧであるアレル（例えば、配列番号４の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失していないアレル（例えば、配列番号５の塩基配列を含むアレル）、及び
（ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号６の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの不在の検出
により決定することができる。
　本発明の遺伝的特徴の不在は、
（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号６９の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７０の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７１の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号７２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレル（例えば、配列番号７３の塩基配列を含むアレル）、及び
（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号７４の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの不在の検出、及び／又は、
（ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－１）配列番号２の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－２）配列番号３の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＧであるアレル（例えば、配列番号４の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ－４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失していないアレル（例えば、配列番号５の塩基配列を含むアレル）、及び
（ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号６の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの存在の検出
により決定することができる。
　本発明の遺伝的特徴の検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、ＡＳＯ法、ＡＲＭＳ法、ＤＧＧＥ法、ＣＣＭ法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ法、ＶＳＥＴ法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ－ＩＴ法、融解曲線分析法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が本発明の多型部位に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが多型を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明の変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
　あるいは、本発明の多型とプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子変異をＰＣＲ増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝的特徴を検出することができる。
　ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
　TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
　シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてＤＮＡ配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
　ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の多型と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の多型の有無を検出することができる。ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
　インベーダー法とは、ＳＮＰ等の多型のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
　TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ　Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ａは、限定されずに、配列番号１９～２１のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセットと、配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素又は配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）とを用いたＣＡＰＳ法により検出することができる。プライマーセットの非限定例としては、以下のものが挙げられる。
フォワードプライマー：ＡＴＧＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴ（配列番号３７）
リバースプライマー：ＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＧ（配列番号３８）
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｂは、限定されずに、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法等により検出することができる。

（Ｂ－１）配列番号４５に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号４６に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－２）配列番号５０に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号５１に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－３）配列番号５５に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号５６に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、又は
（Ｂ－４）配列番号６０に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号６１に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。
　但し、プライマーセットは配列番号４５、４６、５０、５１、５５、５６、６０又は６１の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号４５、５０、５５又は６０の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよくリバースプライマーとしては配列番号４６、５１、５６又は６１の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよい。このようなプライマーは、１５～５０塩基長、２０～４５塩基長の長さにあってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　プライマーセットは配列番号４５、４６、５０、５１、５５、５６、６０又は６１の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号４５、５０、５５、又は６０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよく、リバースプライマーとしては配列番号４６、５１、５６又は６１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよい。

（Ｂ－１’’）配列番号４５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号４６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－２’’）配列番号５０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号５１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ－３’’）配列番号５５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号５６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは（Ｂ－４’’）配列番号６０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号６１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。
　このようなプライマーは、前記任意の連続する１５塩基以上の配列が３‘側末端に存在すれば、１５～５０塩基長、２０～４５塩基長、３０～６５塩基長の長さにあってもよい。
　上記プライマーと組み合わせる制限酵素としては、以下のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｃは、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
　３’末端に位置する配列番号８６～１０９から選択される配列と、任意選択で前記配列の５’末端に付加される配列番号６の２８位から５’側に続く任意の連続する配列（例えば、任意の長さの連続する配列）とを含むフォワードプライマーと、配列番号６の５０位より３’側に位置する任意の連続する２０塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号６５、１１０）を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。プライマーの配列は、上記の条件を満たす範囲で最適化することができる。プライマー設計の最適化については、例えば、Sambrook and Russell, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press等を参照のこと。また、上記各プライマーは、１５～５０塩基長、１８～４８塩基長、２０～４５塩基長、３０～６５塩基長等であってよい。
・制限酵素：
　配列番号８６～１０９の各々に対応する制限酵素を以下に示す。なお、下記配列において、「Ｒ」はＡ又はＧを、「Ｙ」はＣ又はＴを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　特定の態様において、本発明の遺伝的特徴Ｃは、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物の組織（例えば葉）のＲｅｂＤの含有量を測定する工程をさらに含んでもよい。ＲｅｂＤ含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤの含有量が高い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物組織のＲｅｂＤの含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤの含有量が高い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択したＲｅｂＤの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｖｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物組織のＲｅｂＤの含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物体のうち、ＲｅｂＤの含有量が高い個体を選択する工程。
　選択するＲｅｂＤの含有量が高い個体は、例えば、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤの含有量の高さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体などであってよい。また、交配する他のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴を含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）～（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、ＲｅｂＤの含有量がより高いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
　本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
　本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
　また、本発明は、上記に記載されたプライマーセット、例えば、上記配列番号３７のフォワードプライマーと配列番号３８のリバースプライマーとを含むプライマーセット、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－４）、（Ｂ－１’）～（Ｂ－４’）及び（Ｂ－１’’）～（Ｂ－４’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセット、及び／又は、上記表２～３に記載のプライマーセットを提供する。本発明は、さらに、配列番号１～６、６９～７４からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセット、例えば、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１６の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１８の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセットを提供する。
　さらに、本発明は、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブは、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在の各種検出方法に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブは、本発明の変異部位を含むゲノムの部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号１９～３６、７５～７７、１３５～１４９から選択される塩基配列を含むものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号１９～３６は本発明の変異を含むアレルに特異的であり、配列番号７５～７７、１３５～１４９は、本発明の変異を含まないアレルに特異的である。本発明の遺伝的特徴の存在は、本発明の変異を含むアレルの検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの非検出により検出することができ、本発明の遺伝的特徴の不在は、本発明の変異を含むアレルの非検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの検出により検出することができる。本発明のプローブは、好ましくは標識を有する。かかる標識の非限定例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、色素、酵素、クエンチャー、検出可能な標識との結合部分等が挙げられる。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号１９～３６、７５～７７、１３５～１４９から選択される塩基配列と、標識とを有する。
　本発明はさらに、配列番号１９～２１のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセット、例えば、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素又は配列番号１９～２１のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号７５～７７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　本発明はさらに、上記（Ｂ－１）～（Ｂ－４）、（Ｂ－１’）～（Ｂ－４’）及び（Ｂ－１’’）～（Ｂ－４’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　当該キットにおいて、（Ｂ－１）、（Ｂ－１’）及び（Ｂ－１’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＫｐｎＩである。
　当該キットにおいて、（Ｂ－２）、（Ｂ－２’）及び（Ｂ－２’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＸｂａＩである。
　当該キットにおいて、（Ｂ－３）、（Ｂ－３’）及び（Ｂ－３’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＡｆｌＩＩである。
　本発明はさらに、前記表２～３に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、これに対応する制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
　当該キットの別の態様において、
　前記プライマーセットが配列番号４５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＫｐｎＩを含み、
　前記プライマーセットが配列番号５０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＸｂａＩを含み、
　前記プライマーセットが配列番号５５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＡｆｌＩＩを含む
　本発明はまた、配列番号１～６、６９～７４からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、本発明のプローブとを含む、スクリーニング用キットを提供する。
　これらのプライマーセット、プローブ及びキットは、本発明の遺伝的特徴を検出するために用いること、本発明のスクリーニング方法に用いることなどが可能である。また、これらのプライマーセット及びキットには、本発明の遺伝的特徴の検出や、本発明のスクリーニング方法に関する説明を含む指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが含まれていてもよい。
４．植物体由来抽出物の製造方法及び当該抽出物を用いた製品
　本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ含有抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある）が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からＲｅｂＤを精製する工程を含む、ＲｅｂＤの製造方法（以下、「本発明のＲｅｂＤの製造方法」と称する場合がある）が提供される。
　具体的には、本発明の高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別された高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体又は本発明の方法により製造された高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体からＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方を含む抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方の製造方法が提供される。
　ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方を含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はOhta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　また、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方を含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方を精製することができる。
　本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）は、野生型ステビア種と比べＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方をより高い含量で含む。
　本発明の抽出物は、野生型ステビア種から得られた抽出物と比べＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方を３００％以上、４００％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１１００％以上、１２００％以上、１３００％以上、１４００％以上、１５００％以上、１６００％以上、１７００％以上、１８００％以上、１９００％以上、２０００％以上、２１００％以上、２２００％以上、２３００％以上、２４００％以上、２５００％以上、２６００％以上、２７００％以上、２８００％以上、２９００％以上、３０００％以上、３１００％以上、３２００％以上、３３００％以上、３４００％以上、３５００％以上、３６００％以上、３７００％以上、３８００％以上、３９００％以上、４０００％以上、４１００％以上、４２００％以上、４３００％以上、４４００％以上、４５００％以上、４６００％以上、４７００％以上、４８００％以上、４９００％以上、５０００％以上高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、野生型ステビア種から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
　このようにして得られた本発明の抽出物及び／又は本発明のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方の製造方法により得られるＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方と他の成分とを混合することにより、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方の含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物及び／又は本発明のＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方の製造方法により得られるＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方と他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ又はその両方の含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な医薬品、香料、飲料又は食品を提供し、また、当該医薬品、香料、飲料又は食品の製造方法を提供する。
５．本発明の植物体に係る塩基配列
　本発明は、別の側面において、本発明のステビア植物体に係る塩基配列を提供する。本発明の遺伝的特徴Ａを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１９～２１及び６９から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。本発明の遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ－１～Ｂ－４の少なくとも１つ）を有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号２２～３３及び７０～７３から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。本発明の遺伝的特徴Ｃを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号３４～３６及び７４から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１９～２１及び６９から選択される塩基配列と、配列番号２２～３３及び７０～７３から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１９～２１及び６９から選択される塩基配列と、配列番号３４～３６及び７４から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号２２～３３及び７０～７３から選択される塩基配列と、配列番号３４～３６及び７４から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴Ａ～Ｃをすべて有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１９～２１及び６９から選択される塩基配列と、配列番号２２～３３及び７０～７３から選択される塩基配列と、配列番号３４～３６及び７４から選択される塩基配列とを含む。
　以下に本発明に関する実験例、実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。
［実施例１］高ＲｅｂＤステビア植物の作製
１．試験系統の作製
　高ＴＳＧ含有型の遺伝的特徴を有する雄株（Ｐ１）と、高ＲｅｂＭ含有型の遺伝的特徴を有する雌株（Ｐ２）とを交配させ、雑種第１代（Ｓ１世代）種子を採種し、サントリー研究センター内の温室内で播種し、Ｓ１世代苗を得た。
　高ＲｅｂＭ含有型の遺伝的特徴は、以下の少なくとも１つの特徴を有する。
　Ｂ－１：配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
　Ｂ－２：配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
　Ｂ－３：配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
　Ｂ－４：配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
　これらの遺伝的特徴が高ＲｅｂＭ含有特性に係ることは、本出願人による未公開の先願（２０１８年１０月１２日に出願したＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０３８０６４）に示されている。
　高ＴＳＧ含有型の遺伝的特徴は、以下の特徴を有する。
　Ｃ：配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性。
　上記の遺伝的特徴が高ＴＳＧ含有特性に係ることは、本出願人による未公開の先願（２０１８年７月３１日に出願した特願２０１８－１４４５１２）に示されている。
　また、Ｐ１及びＰ２は、いずれもエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理により遺伝子が改変された個体の子孫である。
２．各個体に含まれるステビオール配糖体の測定
　Ｐ１、Ｐ２及びＳ１世代個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物０．０５ｇを純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に０．３３ｍＬの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びＲｅｂＯの濃度（乾燥葉に対する質量％）を定量し、その合計を総ステビオール配糖体（ＴＳＧ）濃度とした。結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　上記結果が示すとおり、Ｐ１とＰ２との交配により、ＲｅｂＤ含量が乾燥葉ベースで３．３質量％を超える高ＲｅｂＤ含有個体が得られた（Ｓ１－１～Ｓ１－３）。
［実施例２］高ＲｅｂＤステビア植物体に特有の遺伝的特徴の検出
　実施例１で試験した各個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝的特徴Ｂ－１及びＣの保有状況を調査した。
　遺伝的特徴Ｂ－１の検出には、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＫｐｎＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
　プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’－ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣ－３’（配列番号４５）
Ｒｖプライマー：５’－ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＣ－３’（配列番号４６）
　得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行い、約２６０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４９）を生じなかったものを遺伝的特徴Ｂ－１陽性とした。
　遺伝的特徴Ｃの検出には、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＳｐｅＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　Ｔｏｕｃｈ　ＨＴ（PerkinElmer）により電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
フォワードプライマー：５’－ＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴ－３’（配列番号６４）
リバースプライマー：５’－ＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧ－３’（配列番号６５）
　得られた約３６７ｂｐＰＣＲ産物（例えば、配列番号６６又は６７）に対しＳｐｅＩ制限酵素処理を行い、約３２１ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号６８）を生じたものを遺伝的特徴Ｃ陽性とした。
　結果を下表５に示す。表中、「〇」は、対応する変異が検出されたことを示し、「×」は検出されなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　上記結果が示すとおり、遺伝的特徴Ｂ－１を保有する個体は、そうでない個体に比べＲｅｂＭ含量が高い傾向が、遺伝的特徴Ｃを保有する個体は、そうでない個体に比べＴＳＧ含量が高い傾向が、それぞれみられた。これは、本出願人による上記先願で示された結果を確認するものである。
　高ＲｅｂＤ含有個体を識別するためのマーカーを見出すため、各個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ（HiSeq 2500、Illumina）によるシーケンシングを行った。その結果、以下の遺伝的特徴が高ＲｅｂＤ含有個体のみに見出された。
　Ａ：配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性。
　上記結果が示すとおり、高ＲｅｂＤ含有個体（Ｓ１－１～Ｓ１－３）はいずれも遺伝的特徴Ａ、Ｂ－１及びＣを保有しており、遺伝的特徴Ａを保有しない個体に比べ、ＲｅｂＤ含量が高い傾向がみられた。
　本発明によってＲｅｂＤがより効率的に提供可能になるので、ＲｅｂＤを十分な量含むことによって上質な味質の医薬品、香料又は飲食品などを提供することができる。

Claims (25)

  1. 　乾燥葉の単位質量当たり３．３％以上のＲｅｂＤを含む、高レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）含有ステビア植物体。
  2. 　配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である、請求項１に記載の植物体。
  3. 　以下の遺伝的特徴の少なくとも１つをさらに有する、請求項1又は２に記載の植物体。
    （１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
    （３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
    （４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
  4. 　配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である、請求項1～３のいずれか一項に記載の植物体。
  5. 　非遺伝子組換植物体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の植物体。
  6. 　突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の植物体。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
  8. 　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、請求項７に記載の組織、組織培養物又は細胞。
  9. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、乾燥葉の単位質量当たり３．３ ％以上のＲｅｂＤを含む高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体を作出する方法。
  10. 　第２の植物体が請求項１～５のいずれか一項に記載の植物体である、請求項９に記載の方法。
  11. 　ＲｅｂＤを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体、請求項７又は８に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
  12. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体、請求項７又は８に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ＲｅｂＤ含有抽出物の製造方法。
  13. 　請求項１１に記載の抽出物からＲｅｂＤを精製する工程を含む、ＲｅｂＤの製造方法。
  14. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の植物体の抽出物、請求項７又は８に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物、あるいは、請求項１１に記載の抽出物を提供する工程、及び
    前記抽出物を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
    を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
  15. 　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
  16. 　被験ステビア植物体のゲノムから以下の遺伝的特徴の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
    （１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
    （３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
    （４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
  17. 　被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いて行われる、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　被験ステビア植物組織の甘味成分の含有量を測定する工程をさらに含む、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体のスクリーニングキット。
  21. 　以下の（１）～（４）の遺伝的特徴の少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、請求項２０に記載のキット。（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
    （２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
    （３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
    （４）配列番号５の５５～７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
  22. 　配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、請求項２０又は２１に記載のキット。
  23. 　試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のキット。
  24. 　配列番号１の２０１位に相当する位置にＣからＡへの変異を導入する工程を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体を作出する方法。
  25. 　変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、請求項２４に記載の方法。
     
     
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