JP2016515814A

JP2016515814A - 増大したレバウジオシドｄ含量を有するステビア属植物

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Publication number: JP2016515814A
Application number: JP2016502599A
Authority: JP
Inventors: ロバート・ジョシュア・ブラウワー; ティン・リウ・カールソン; ベンユアン・ダン; モイセス・デイビッド・ゴンザレス; モリー・マクドナルド・ケネディ; ネイサン・エドワード・ナットソン
Original assignee: カーギル・インコーポレイテッド
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2016-06-02
Anticipated expiration: 2034-03-18
Also published as: BR112015023476A2; WO2014146084A1; EP2966990A1; CN105050388B; PE20151544A1; US20210068360A1; HK1220080A1; CN105050388A; BR112015023476A8; JP2020156508A; JP7091021B2; EP2966990A4; US20160021918A1

Abstract

レバウジオシドＤの増大した含量および他の望ましい特徴を有する植物、およびこのような植物を産生する方法が、開示される。レバウジオシドＤ（ｒｅｂＤ）は、所望の甘味付与特性を有することが観察されており、従って、ステビア葉の総重量ベースで、若しくは他のグリコシド（例えば、ｒｅｂＡ又はステビオシド）と比較してのいずれか、又はその両方で、ｒｅｂＤの含量が増大している所定のグリコシドプロフィールを有するステビア属植物系統、品種および変種を産生するために望ましい。

Description

本出願は、２０１３年３月１５日に提出された米国仮特許出願第６１／７９２，７９６号の優先権を主張し、この出願の全体は、本明細書で参考として組み込まれる。

ステビア・レバウディアナ（Stevia Rebaudiana）（例えば、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Stevia Rebaudiana Bertoni）、本明細書で以下「ステビア」）は、１９００年代初頭に南米において発見されたと考えられている。この植物の葉は、一般に、一連のグリコシドの存在に起因して、サトウキビよりも一桁以上甘さが強いと考えられる。この植物およびそのグリコシドは、低カロリー甘味料としての使用に望ましいと考えられる。甘味付与構成要素の中でも、ステビア属植物の葉には、ステビオシド、レバウジオシドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ズルコシドＡ（ＤＡ）、ステビオールビオシド、ルブソシドなどが存在し、これらのそれぞれは、その独自の甘さおよび付随する味を有する。甘さの質は捕らえにくく、ステビア属植物における主要なグルコシドとはいえないかも知れないが、ステビオシドは、精製されたものですら、レバウジオシドＡと比較して不快な苦い後味を有すると考えられている。レバウジオシドＡ（「ｒｅｂＡ］）のように、レバウジオシド（「ｒｅｂＤ」）は所望の甘味付与品質、特性および味を有することが観察されている。

レバウジオシドＤ（ｒｅｂＤ）は、所望の甘味付与特性を有することが観察されており、従って、ステビア葉の総重量ベースで、若しくは他のグリコシド（例えば、ｒｅｂＡ又はステビオシド）と比較してのいずれか、又はその両方で、ｒｅｂＤの含量が増大している所定のグリコシドプロフィールを有するステビア属植物系統、品種および変種を産生するために望ましい。このようなステビア属植物は、より多くの具体的に望ましい甘味付与構成要素を産生する（すなわち、ステビアグルコシドプロフィールがｒｅｂＤにおいて高い）のみでなく、また、甘味付与特性の質に影響を及ぼし得るより望ましくない構成要素および所望しない構成要素を最小限にすることによって、処理を容易にする。

ステビオール、ステビオシド、ズルコシドＡ（ＤＡ）および関連のグリコシド類の構造を示す：Ｇｌｃ＝グルコース；Ｘｙｌ＝キシロース；およびＲｈａ＝ラムノース。実施例に詳細に記載される高ｒｅｂＤステビア属植物を得るための交配図を示す。ｒｅｂＤ含量百分率対葉において見出される材料の乾燥重量の百分率としての量に基づくｒｅｂＡ（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）の比のプロットを示す。高ｒｅｂＤ含量表現型を有する植物は菱形で表され、野生型ｒｅｂＤ表現型含量を有する植物は四角で表される。横座標上の８５のおける垂直の線は、高ｒｅｂＤ表現型の植物と低ｒｅｂＤ表現型の植物とを分離する。葉において見出される乾燥重量の百分率としての、ｒｅｂＥ（ＲＥ）＋ｒｅｂＮ（ＲＮ）＋ｒｅｂＭ（ＲＭ）含量対ｒｅｂＤ含量のプロットを示す。ＲＥ＋ＲＮ＋ＲＭの量は、相関係数Ｒ^２＝０．８６で、ｒｅｂＤの量と有意に相関する。高ｒｅｂＤ表現型を有する植物は、０．４％より高いＲＥ＋ＲＮ＋ＲＭ含量を有する。

１．０定義
レバウジオシドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＭおよびＮは、それぞれｒｅｂＡ、ｒｅｂＢ、ｒｅｂＣ、ｒｅｂＤ、ｒｅｂＥ（又はＲＥ）、ｒｅｂＦ、ｒｅｂＭ（又はＲＭ）およびｒｅｂＮと表記される。

本明細書で使用される場合、高ｒｅｂＤ植物は、乾燥したステビア属の葉におけるｒｅｂＤの重量に基づいて０．５％より多いｒｅｂＤ含量を有するものをいう。

本明細書で使用される場合、高ｒｅｂＭ植物は、乾燥したステビア属の葉におけるｒｅｂＭの重量に基づいて０．１％より多いｒｅｂＭ含量を有するものをいう。

本明細書で使用される場合、高ｒｅｂＮ植物は、乾燥したステビア属の葉におけるｒｅｂＮの重量に基づいて０．１％より多いｒｅｂＮ含量を有するものをいう。

高ｒｅｂＤ植物はまた、高ｒｅｂＭおよび／又は高ｒｅｂＮ植物でもあり得ることに留意されたい。

品種は、栽培において産生された植物又は植物分類であり、繁殖によって維持され得る望ましい特徴について選択される。特定の品種のメンバーは、必ずしも遺伝的に同一ではない。

植物変種は、最も低いランクの分類群における任意の他の品種から識別できることが明らかな、既知の最も低いランクの単一の植物分類群の範囲内の植物分類を意味する。本明細書で使用される場合、品種は、栄養増殖させた同一のクローン単利体を含む。

本明細書で使用される種子は、単数および／又は複数のステビア属植物の穀粒又は熟した胚珠をいうことが理解される。

本明細書で使用される場合、「多交雑」は、選択的植物育種において使用される３つ以上の親変種の間の交雑であり、同じ種の他の植物との交雑育種の際に、１つ以上の望ましい表現型の観点から最も生産的な植物をもたらす１つ以上の望ましい表現型を有する植物を、同定することを含む。交雑に由来する子孫は、一般に、栄養増殖させられ、その後の交雑育種によって新たな品種を開発するために使用され得る。

本開示を通して与えられるグリコシドの重量は、示された構成要素の重量百分率をいい、水分含量について修正された乾燥組織の重量の百分率である。重量は、１０５℃にて３時間にわたりサンプルを乾燥することにより水分含量について修正され（代表的には２グラム）、水分に起因する重量のいかなる損失をも勘定に入れる。乾燥組織は、代表的に、約６〜８％の水分を有する。

２．０ｒｅｂＤ含量の増大した植物の産生
高ｒｅｂＤ含量を有する植物は、ｒｅｂＤおよびｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）が図３において示されるようにプロットされた場合に、異なる集団を形成することが見出され得る。このような植物は、精製されたｒｅｂＤおよび他のレバウジオシド類を得るために望ましいだけでなく、ｒｅｂＤおよび他のグリコシド類（ｒｅｂＡ、ｒｅｂＥ、ｒｅｂＭ、およびｒｅｂＮが挙げられるがこれらに限定されない）を含む組成物を得るためにも望ましい。このような組成物は、低カロリー甘味料として、食物産業において有用である。この組成物は、有益には、ある個体に対して、ステビオシドなどの、苦い構成要素又は望ましくない味／後味を有する構成要素を、限定的な量でしか含まなくてもよい。

増大したｒｅｂＤ含量を有し且つ本明細書で記載される他の望ましい特徴を有するステビア属植物は、米国寄託当局（ＡＴＣＣ），１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０ＵＳＡに、２０１３年３月１５日に送られた種子から成長させることによって達成され得、これらとしては、以下の種子が挙げられる：ＳＣＯ４１９×ＳＣＯ４３５、寄託番号＿＿＿＿＿＿＿；およびＳＣＯ４２２×ＳＣＯ３１２、寄託番号＿＿＿＿＿＿＿。ＡＴＣＣへの種子の移送は、２０１３年３月１５日に、ＦｅｄｅｒａｌＥｘｐｒｅｓｓ輸送サービス（ＦｅｄＥｘ）（包装番号３２０５８３９／ＩＮＥＴ３３７０および追跡番号７９９２９２７５２２９１）を介して行われた。種子の一部は、ＡＴＣＣからＮＣＩＭＢ、Ｌｔｄ．、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＡＢ２１９ＹＡへと送られ、ここで、この寄託は、番号ＮＣＩＭＢ４２２２６ステビア・ラバウディアナＳＣＯ４１９×ＳＣＯ４３５Ｔｅｎｔ１、および寄託番号ＮＣＩＭＢ４２２２７ステビア・ラバウディアナＳＣＯ４２２×ＳＣＯ３１２Ｔｅｎｔ２を割り当てられた。

従来型交雑育種技術又は１つ以上の遺伝子要素（遺伝子、プロモーター、タンパク質コード配列など）を他のステビア属植物に移入するための分子的技術のいずれかによる寄託系統を用いて、ステビア属変種および系統を産生することもまた、可能である。あるいは、古典的選択および交雑育種を、これのみ、又は化学的に若しくは放射線により誘導した突然変異と組み合わせてのいずれかを通して、高ｒｅｂＤ含量を有するステビア属植物を産生することが、可能である。

約０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％、１．０％、１．０５％若しくは１．１％よりも大きいか又はこれに等しいｒｅｂＤ含量、又は約０．５％〜約１％、約１．０％〜約１．５％、又は約１．５％〜約２．０％のｒｅｂＤ含量を有する、高ｒｅｂＤステビア属植物および品種が、本明細書で記載される。このような植物および品種は、約２％、２．２５％、２．５％、２．７５％又は３％未満の最大ｒｅｂＤ含量を有し得る。

１つの実施形態において、高ｒｅｂＤ含量植物は、野生型植物の交雑から選択される高ｒｅｂＤステビア属植物のＦ１、Ｆ２、Ｆ３、又はその後の子孫であり、ここで、この高ｒｅｂＤ植物は、さらに、約０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９２、０．９３、０．９４、又は０．９５よりも高いｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比を有し、このような植物はまた、約０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９２、０．９３，０．９４，又は０．９５未満のステビオシド含量を有し得る。このような植物は、約２％、２．２５％、２．５％、２．７５％又は３％未満の最大ｒｅｂＤ含量を有し得る。あるいは、この植物は、約０．５％〜約１％、約１．０％〜約１．５％、又は約１．５％〜約２．０％のｒｅｂＤ含量を有し得る。

別の実施形態において、高ｒｅｂＤ含量植物は、種子が化学的又は放射線突然変異誘発に供された高ｒｅｂＤステビア属植物の第１世代又はその後の子孫であり、ここで、この高ｒｅｂＤ植物は、さらに、約０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９２、０．９３、０．９４、又は０．９５よりも高いｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比を有し、このような植物はまた、約０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９２、０．９３、０．９４、又は０．９５未満のステビオシド含量を有し得る。このような植物はまた、約２％、２．２５％、２．５％、２．７５％又は３％未満の最大ｒｅｂＤ含量を有し得る。あるいは、この植物は、約０．５％〜約１％、約１．０％〜約１．５％、又は約１．５％〜約２．０％のｒｅｂＤ含量を有し得る。

本明細書で記載される高ｒｅｂＤステビア属植物は、乾燥植物組織の約４．０重量％、４．２重量％、４．４重量％、４．５重量％、５．０重量％、５．２５重量％、又は５．５重量％よりも大きいｒｅｂＡ含量を有し得、且つこれは、約１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％、１１．５重量％、１１重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７．５重量％、７．０重量％、６．５重量％、６．０重量％未満であり得る。ステビア属植物はまた、乾燥植物組織の約４．０重量％、４．２重量％、４．４重量％、４．５重量％、５．０重量％、５．２５重量％、又は５．５重量％よりも大きく、且つ約５．５重量％、５．２５重量％、５．０重量％、４．７５重量％又は４．６重量％未満であり得るｒｅｂＡ含量を有し得、但し、ｒｅｂＡについての上限は、ｒｅｂＡについての下限を下回らない。

ｒｅｂＤおよびｒｅｂＡ含量に加え、本明細書で記載される高ｒｅｂＤ植物は、乾燥植物組織の約０．６５重量％、０．７０重量％、０．７５重量％、０．８０重量％、０．８５重量％、０．９０重量％、０．９２重量％、０．９３重量％、０．９４重量％、０．９５重量％又は１．２９重量％未満であるステビオシド含量を有し得る。１つの実施形態において、高ｒｅｂＤ植物のステビオシド含量は、約０．３重量％、０．３５重量％又は０．４重量％よりも高いが、約０．６５重量％、０．７０重量％、０．７５重量％、０．８０重量％、０．８５重量％、０．９０重量％、０．９２重量％、０．９３重量％、０．９４重量％、０．９５重量％又は１．２９重量％未満である。

本明細書で記載される高ｒｅｂＤステビア属植物は、乾燥植物組織に対し約０．１％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％又は０．６４％よりも高いｒｅｂＭ含量を有し得る。

ｒｅｂＤおよびｒｅｂＭ含量に加え、本明細書で記載される高ｒｅｂＤ植物は、乾燥植物組織に対し約０．１％、０．１５％、０．２％、０．２７％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％又は０．４７％よりも高いｒｅｂＮ含量を有し得る。

約０．１％、０．２％、０．２５％、０．２６％、０．２７％、０．２８％、０．２９％、０．３０％、０．３１％、０．４％、０．５％、０．６％又は０．６４％よりも高いか又はこれに等しいｒｅｂＭ含量、又は約０．１％〜約１％、約０．１％〜約０．５％、又は約０．１％〜約０．７％のｒｅｂＭ含量を有する高ｒｅｂＭステビア属植物および品種が、本明細書で記載される。このような植物および品種は、約０．５％、０．７％、１％又は２％未満の最大ｒｅｂＭ含量を有し得る。

約０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．２６％、０．２７％、０．２８％、０．３０％、０．３５％、０．４％、０．４５％又は０．４７％よりも高いか又はこれに等しいｒｅｂＮ含量、又は約０．１％〜約１％又は約０．１％〜約０．５％のｒｅｂＮ含量を有する高ｒｅｂＮステビア属植物および品種が、本明細書で記載される。このような植物および品種は、約０．５％、１％又は２％未満の最大ｒｅｂＮ含量を有し得る。

本開示の別の局面は、本明細書で記載される１以上の高ｒｅｂＤステビア属植物又はステビア属品種由来の組織および種子を指向する。より具体的には、本開示の１つの実施形態は、高ｒｅｂＤステビア属植物又はステビア属品種の種子を含む。別の実施形態において、本開示は、葉、幹、根、苗条又は細胞が挙げられるがこれらに限定されない、高ｒｅｂＤステビア属植物又はステビア属品種の組織を指向する。このような組織は任意の形態であってもよく、単離形態、収穫形態、乾燥形態、粉末形態、凍結乾燥形態、化学的破砕形態、機械的破砕形態、又は物理的破砕形態を含む。

本明細書で記載されるステビア属植物は、食物産業において種々の用途を有するので、本開示は、高ｒｅｂＤ植物由来の任意の形態の組織を含む甘味付与食物又は飲料のための組成物を含むことが、理解される。１つの実施形態において、この組成物は、本明細書で記載される高ｒｅｂＤ植物の、単離、収穫、乾燥、粉末化、凍結乾燥、化学的破砕、機械的破砕、又は物理的破砕された組織を含む。このような実施形態の１つにおいて、この組成物は、１．５％、１％、０．９％０．８％、０．７％、０．６％又は０．５％未満のステビオシドを含み、且つ必要に応じて、０．８０、０．８５、０．８７又は０．９０よりも高いｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比を有する、高ｒｅｂＤ植物由来の組織を含む。

本開示の別の局面は、本明細書で記載される高ｒｅｂＤ植物の抽出物を指向する。このような抽出物は、この抽出物が高ｒｅｂＤ植物から調製されたことを同定するために充分なＤＮＡおよび／又はＲＮＡを含む。ｒｅｂＤ並びにＤＮＡおよび／又はＲＮＡがこの抽出物を同定するために充分であることに加え、この抽出物はまた、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＢ、ｒｅｂＣ、ｒｅｂＥ、ｒｅｂＦ、ｒｅｂＭおよび／又はｒｅｂＮの任意の１つ以上をも含み得る。抽出物が本明細書で記載される高ｒｅｂＤ植物から調製されたことを同定するために充分なＤＮＡおよび／若しくはＲＮＡは、高ｒｅｂＤ植物から生じたＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は抽出物中に存在する高ｒｅｂＤ植物ＤＮＡおよび／若しくはＲＮＡから生じた増幅核酸を意味すると理解される。サンプル中に存在する核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む当該分野で公知の任意の技術によって達成され得る。配列決定、ＲＦＬＰマッピングなどを含むがこれらに限定されない分子技術による分析が、ＤＮＡおよび／又はＲＮＡが高ｒｅｂＤ植物から生じたことを示す場合、ＤＮＡおよび／又はＲＮＡは、この抽出物の供給源が高ｒｅｂＤ植物であることを同定すると理解される。１つの実施形態において、試験は、抽出物が高ｒｅｂＤステビア属植物に由来することを、９５％、９７％、９８％又は９９％より高い信頼限界をもって確立する。

３．０特定の実施形態
１．１種以上のステビア属植物又はステビア属品種であって、上記１種以上の植物又は上記品種の葉（例えば、発芽３〜４か月後に収穫された葉）が、乾燥したステビア属の葉の約０．５重量％より多いｒｅｂＤを含む、上記１種以上のステビア属植物又はステビア属品種。

２．上記１種以上の植物又は上記品種は、乾燥重量の約０．５重量％、０．５５重量％、０．６重量％、０．６５重量％、０．７重量％、０．７５重量％、０．８重量％、０．８５重量％、０．９重量％、０．９５重量％、１．０重量％、１．０５重量％若しくは１．１重量％よりも大きいか又はこれに等しいｒｅｂＤ含量、又は約０．５重量％〜約１重量％、約１．０重量％〜約１．５重量％、又は約１．５重量％〜約２．０重量％のｒｅｂＤ含量を有する実施形態１に記載の１種以上のステビア属植物又はステビア属品種。

３．上記１種以上の植物は、乾燥重量の１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％、１１．５重量％、１１重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６．５重量％、６重量％、５．５重量％、５．２５重量％、５重量％、４．７５重量％又は４．６重量％未満であるｒｅｂＡ含量を有する、実施形態１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。

４．ｒｅｂＡ含量が、乾燥重量の約４重量％、４．２重量％、４．４重量％、４．５重量％、５重量％、５．２５重量％又は５．５重量％よりも多い、実施形態１〜３のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物。

５．ステビオシド含量が、乾燥重量の約０．６５重量％、０．７０重量％、０．７５重量％、０．８０重量％、０．８５重量％、０．９０重量％、０．９２重量％、０．９３重量％、０．９４重量％又は１．２９重量％未満である、実施形態１〜４のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物。

６．ステビオシド含量が、乾燥重量の約０．３重量％、０．３５重量％又は０．４重量％より多い、実施形態１〜５のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物。

７．ｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比が、約０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９２、０．９３、０．９４又は０．９５より高く、且つ上記比は１未満である、実施形態１〜６のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物。

８．ｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比が、約０．８５、０．９０、０．９２、０．９３、０．９４又は０．９５より高く、且つ上記比は１未満である、実施形態１〜７のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物。

９．（ＲｅｂＥ＋ＲｅｂＭ＋ＲｅｂＮ）の合計が、乾燥重量の約０．４重量％、０．５重量％又は０．６重量％より多い、実施形態７又は８に記載の１種以上のステビア属植物。

１０．実施形態１〜９のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物由来の種子。

１１．実施形態１〜１０の植物由来の組織。

１２．実施形態１〜９の植物の葉、幹、苗条又は細胞。

１３．実施形態１〜９のいずれかに記載の植物の種子、組織、葉、幹又は細胞を含む組成物であって、上記種子、組織、葉、幹又は細胞は、収穫、乾燥、粉末化、凍結乾燥、化学的破砕、機械的破砕、又は物理的破砕されている、上記組成物。

１４．実施形態１３に記載の組成物を含む、食物又は飲料に甘味付与するための組成物。

１５．上記組成物は、１．５％未満のステビオシドを含む、実施形態１３又は実施形態１４に記載の組成物。

１６．実施形態１３に記載の組成物を調製することを含む、ｒｅｂＤを含み且つ必要に応じてｒｅｂＡを含む組成物を調製するプロセス。

１７．ｒｅｂＤ、および実施形態１〜９のいずれかに記載の植物から調製されたことを同定するために充分な遺伝物質を含む抽出物であって、上記抽出物は、必要に応じて、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＣ、ｒｅｂＦの任意の１以上を含む、上記抽出物。

１８．実施形態１７に記載の抽出物を含む、甘味料組成物。

１９．実施形態１〜９に記載の１種以上の高ｒｅｂＤ植物を含む品種。

２０．ＲｅｂＭの含量が、乾燥重量の約０．１重量％、０．２重量％又は０．３重量％より多い、実施形態１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。

２１．ＲｅｂＮの含量が、乾燥重量の約０．１重量％、０．２重量％又は０．３重量％より多い、実施形態１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。

２２．ｒｅｂＤ、および実施形態１〜９のいずれかに記載の植物から調製されたことを同定するために充分な遺伝物質を含む抽出物であって、上記抽出物は、必要に応じて、ｒｅｂＥ、ｒｅｂＭ、ｒｅｂＮの任意の１以上を含む、上記抽出物。

２３．実施形態２２に記載の抽出物を含む、甘味料組成物。

２４．ステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は上記品種の葉は、乾燥ステビア組織（例えば、葉）の約０．１重量％、０．１５重量％、０．２重量％、０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％、０．２８重量％、０．２９重量％、０．３０重量％又は０．３１重量％よりも多いｒｅｂＭを含む、上記植物又は上記品種。

２５．ステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は上記品種の葉は、乾燥ステビア組織（例えば、葉）の約０．１重量％、０．２重量％、０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％、０．２８重量％、０．２９重量％、０．３０重量％、０．３１重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％又は０．６４重量％よりも多いｒｅｂＭを含む、上記植物又は上記品種。

２６．ステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は上記品種の葉は、乾燥ステビア組織（例えば、葉）の約０．１重量％、０．１５重量％、０．２重量％又は０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％又は０．２８重量％よりも多いｒｅｂＮを含む、上記植物又は上記品種。

２７．ステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は上記品種の葉は、乾燥ステビア組織（例えば、葉）の約０．１重量％、０．１５重量％、０．２重量％、０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％、０．２８重量％、０．３重量％、０．３５重量％、０．４重量％、０．４５重量％又は０．４７重量％よりも多いｒｅｂＮを含む、上記植物又は上記品種。

２８．ステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は上記品種の葉は、乾燥ステビア組織（例えば、葉）の約０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％、０．２８重量％、０．２９重量％、０．３０重量％、０．３１重量％よりも多いｒｅｂＭを含み、且つ／又は約０．２２重量％、０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％、０．２８重量％よりも多いｒｅｂＮを含む、上記植物又は上記品種。

２９．ステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は上記品種の葉は、乾燥ステビア組織（例えば、葉）の約０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％、０．２８重量％、０．２９重量％、０．３０重量％、０．３１重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％若しくは０．６４重量％よりも多いｒｅｂＭを含み、且つ／又は約０．２５重量％、０．２６重量％、０．２７重量％、０．２８重量％、０．３重量％、０．３５重量％、０．４重量％、０．４５重量％又は０．４７重量％よりも多いｒｅｂＮを含む、上記植物又は上記品種。

３０．ステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は上記品種の葉は、乾燥ステビア組織（例えば、葉）の約０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％若しくは０．６４重量％よりも多いｒｅｂＭを含み、且つ／又は約０．３５重量％、０．４重量％、０．４５重量％又は０．４７重量％よりも多いｒｅｂＮを含む、上記植物又は上記品種。

３１．実施形態２４〜３０のいずれかに記載のステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は品種が、乾燥ステビア属組織の約０．８７重量％よりも多いｒｅｂＤ又は約０．９重量％よりも多いｒｅｂＤを含む、上記植物又は上記品種。

３２．実施形態３１に記載のステビア属植物又はステビア属品種であって、上記植物又は品種が、乾燥ステビア属組織の約１．０重量％、１．１重量％、１．２重量％１．３重量％、１．４重量％、１．５重量％又は１．６重量％よりも多いｒｅｂＤを含む、上記植物又は上記品種。

３３．実施形態２４〜３２のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物であって、上記１種以上のステビア属植物は、ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿＿＿＿；ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿＿＿＿；ＮＣＩＭＢ寄託番号ＮＣＩＭＢ４２２２６ステビア・レバウディアナＳＣＯ４１９×ＳＣＯ４３５Ｔｅｎｔ１；又はＮＣＩＭＢ寄託番号ＮＣＩＭＢ４２２２７ステビア・レバウディアナＳＣＯ４２２×ＳＣＯ３１２Ｔｅｎｔ２から選択される１種以上の種子寄託物から育ったステビア属植物の子孫である、１種以上のステビア属植物。

３４．実施形態２４〜３２のいずれかに記載の１種以上のステビア属植物であって、上記１種以上のステビア属植物は、ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿＿＿＿；ＡＴＣＣ寄託番号＿＿＿＿＿＿；ＮＣＩＭＢ寄託番号ＮＣＩＭＢ４２２２６ステビア・レバウディアナＳＣＯ４１９×ＳＣＯ４３５Ｔｅｎｔ１；又はＮＣＩＭＢ寄託番号ＮＣＩＭＢ４２２２７ステビア・レバウディアナＳＣＯ４２２×ＳＣＯ３１２Ｔｅｎｔ２から選択される１種以上のステビア属種子寄託物から育った、１種以上のステビア属植物。

３５．実施形態２４〜３４のいずれかに記載のステビア属植物の一部（例えば、葉、幹、根、子葉、種子又は細胞）。

３６．実施形態２４〜３５のいずれかに記載のステビア属植物又はその一部から産生された組成物であって、上記組成物は、上記ステビア属植物又はその一部から調製されていることを同定するために充分な遺伝物質を含み、上記組成物（例えば、化学的又は物理的抽出物）は、必要に応じて、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＢ、ｒｅｂＣ、ｒｅｂＤ、ｒｅｂＥ、ｒｅｂＦ、ズルコシドＡ（ＤＡ）、ステビオシド又はルブソシドの任意の１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上を含む、上記組成物。

３７．実施形態２４〜３５のいずれかに記載の植物又はその一部から、１種以上のグリコシド（例えば、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＢ、ｒｅｂＣ、ｒｅｂＤ、ｒｅｂＥ、ｒｅｂＦ）を抽出することによって、甘味料を調製する方法。

（実施例１）
中国およびアルゼンチン（ＡＲ）から回収されたステビア属生殖細胞質を、高、中程度および低ｒｅｂＡおよびｒｅｂＤ含量に基づいて、３つの遺伝子群に分類した。各群から４つの系統を選択し、別個のテントに保存した（テント１：高ｒｅｂＡおよびｒｅｂＤ植物、テント２：中程度ｒｅｂＡおよびｒｅｂＤ植物、およびテント３：低ｒｅｂＡおよびｒｅｂＤ植物；表１を参照されたい）。種子は、温室内に入れた各テントにおいて、一般のイエバエ（ムスカ・ドメスティカ（Musca domestica））を花粉媒介者として用いて産生した。

^＊グリコシドプロフィール重量百分率（％）は、水分含量について修正した組織重量の％として与えられる。実施例２におけるステビア属植物の葉を乾燥させるためのプロトコールを参照されたい。

種子を、各テントから収穫した。回収した種子の一部を、コバルト６０（^６０Ｃｏ）線源（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄＲａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｏｌｏｒａｄｏＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を用いて１００、２５０又は５００グレイ（１０、２５又は５０キロラド）にてガンマ線照射に供した。表２は、各テントから収穫した種子の量、各照射処理に供した種子の一部、および照射しない対照種子として保持した量をまとめる。

^＊温室条件下で１０００の種子が産生され、約０．４グラムの平均重量を有する。

照射された（突然変異誘発された）種子および対照種子を、土壌内で芽吹かせ、約２４℃にて２４時間の照明を用いて、成長チャンバ内で発芽させた。種子は、約３〜４日以内に発芽を開始し、その後、種蒔きの約１週間後に、成長のために温室内へ移した。照射した種子から成長した植物を、Ｍ_０世代植物と命名した。表３は、異なる放射線量に供した、各テント種子から産生した植物の数。

表３に挙げられた植物が、３〜４月齢である場合、葉組織（７５％が上部三分の一由来、２５％が中間部三分の一由来）をテント１の対照および照射突然変異植物の各個々の植物から収集した。葉を、脱水機内で２０〜２４時間にわたって６８℃で乾燥させた。乾燥した葉サンプルを、高圧薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）および／又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、時に高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれる）により、グリコシドプロフィールについて分析した。

テント１由来の高ｒｅｂＤ植物を、ＨＰＬＣによって分析した。表４に示す非照射対照、１００Ｇｙ（グレイ）、２５０Ｇｙおよび５００Ｇｙ（１０ｋｒａｄ（キロラド）、２ｋｒａｄおよび５０ｋｒａｄ）における平均グリコシド組成は、平均で、２５０Ｇｙ（２５ｋｒａｄ）が、より高いｒｅｂＤ含量およびより高いｒｅｂＡ（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比を有する植物を産生したことを示唆した。表４を参照されたい。

クロマトグラフィーは、照射群から生じたテント１からの幾つかの植物が、対照植物およびその親よりも高いレベルでｒｅｂＤを産生したことを示した。突然変異体ＳＣＯ３１２は、約８月齢であった開花初期において、１．１１％のｒｅｂＤを有した。表６を参照されたい。テント２および３からの全部で１５３５の植物のうち３５０を超える植物を、分析した；しかし、対照および／又は親植物と比較して、特にｒｅｂＤ含量において、有意な変化を有するグリコシドプロフィールを有するものは見出されなかった。実施例３を参照されたい。

葉組織収集物および分析を、対照および照射種子から生じた植物が開花を開始するまで、続く数か月間連続的に実施した。対照および高ｒｅｂＤ、ｒｅｂＡおよびｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ＳＴＶ）植物を選択した。Ｍ０集団における高ｒｅｂＤ親との２つの二親性交雑（ＳＣＯ４２２×ＳＣＯ３１２およびＳＣＯ４３５×ＳＣＯ４１９）およびＦ１集団から選択された高ｒｅｂＤ親との１つの二親性交雑（ＳＣＯ２７３×ＳＣＯ２６０）を作った（図２）。交雑ＳＣＯ４２２×ＳＣＯ３１２およびＳＣＯ４３５×ＳＣＯ４１９由来の種子を、２つのプールに分け、二分の一に、２００Ｇｙ（２０ｋ−ラド）の線量のガンマ線照射を、上述のように与えた。「Ｍ１」と名付けた２回のガンマ線照射を受けた種子、および非照射の「Ｍ１」および「Ｆ１」植物を、上述のように植え、選択のために、植物の次世代を産生した。

結果は、突然変異誘発および具体的にはガンマ線照射誘発した突然変異誘発は、従来の交配技術よりも、より高いｒｅｂＤ含量およびより高いｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比を有する植物を産生し得ることを示す。

実施例２ＨＰＬＣ分析によるステビア属植物におけるグリコシドの分析
実施例２（Ａ部）葉抽出
ステビア属植物から収穫した葉を、約６８℃にて２４時間にわたって乾燥させ、分析するまでインタクトなまま保存する。葉を挽き、乾燥葉粉末にする。１０ｍｌの水を、蓋をした１５ｍＬのチューブ内の０．１ｇの葉粉末を加える。混合して葉粉末を濡らした後、サンプルを、５０℃の湯浴に１時間置き、１５分毎に混合する。サンプルを、０．４５ μｍナイロンフィルターを通して濾過し、液体クロマトグラフィー容器内に入れる。

実施例２（Ｂ部）グリコシドサンプルのクロマトグラフィー
上の２Ａからの濾過サンプルを、ＵＶ−可視光検出器（Ｗａｔｅｒｓ２４８７二重波長又は均等物）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ２６９５又は均等物）に加熱しながら入れた。分析のために、ＨＰＬＣに、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍＣ１８カラム（ＣａｐｃｅｌｌｐａｋＭＧＩＩ、ＳｈｉｓｅｉｄｏＣｏ．Ｌｔｄ．又は均等物）およびガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｃ１８４×２．０ｍｍ、Ｐ／ＮＡＪ０−４２８６インサート又は均等物を備えたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＫＪ０−４２８２）を供給した。サンプルを水中で調製し、以下の表において示される勾配溶出方法によって分析した。

溶媒Ａ：０．０１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ２．６；溶媒Ｂ：アセトニトリル流速：１ｍｌ／分：カラム温度５５℃。

グリコシドの検出を、２１０ｎｍにて行う。データ収集および取扱いソフトウェア（例えば、Ｅｍｐｏｗｅｒ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｃｏｒｐ．又は均等物）を使用し、キャリブレーションのために既知のグリコシドの標準を用いてサンプルのグリコシド含量を決定する。

植物組織中のグリコシドの量を決定するために、抽出において使用する葉又は他の組織の重量を、１０５℃にて３時間にわたり重量を測定した葉粉末のサンプルを乾燥させ、水分に帰する重量損失を決定することにより、水分含量について修正する。

実施例３従来の交配およびガンマ線突然変異誘発に由来する、ステビア属植物のグリコシド分析
親植物のグリコシド含量（各親単離物を異なる２回で評価した表５を参照されたい）および実施例１における交配スキームによって開発された選択された子孫を、実施例２に概説した方法を用いてＨＰＬＣによって分析する。水分について修正した乾燥葉のグリコシドの重量に基づき０．５％より高いｒｅｂＤを含む植物を、高ｒｅｂＤ植物であるとみなす。高ｒｅｂＤ植物のサブセットは、０．５％を超えるｒｅｂＤを含み、０．８（又は８０％の百分率として表す）を超えるｒｅｂＡ（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比を有する。高ｒｅｂＤに加え、以下で記載する植物は、高レベルのより高級なグリコシド、例えばｒｅｂＮを含み得る。このような植物は、０．５％より多くのｒｅｂＤ、並びに合わせて０．４％のｒｅｂＥ＋ｒｅｂＮ＋ｒｅｂＭ、並びにより高い全グルコシド含量を含む。

ＳＧは、ｒｅｂＤ、ｒｅｂＡ、ステビオシド（ＳＴＶ）、ｒｅｂＦ、ｒｅｂＣ、ズルコシドＡ（ＤＡ）、ルブソシドおよびｒｅｂＢの合計である。

従来の交配から生じた子孫（ＳＣＯ２６０−３００）およびガンマ線照射誘発された突然変異交配に由来する子孫（ＳＣＯ３１２−５１２）の両方を含む本研究からの高ｒｅｂＤ植物は、高ｒｅｂＡ比（ｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド））およびｒｅｂＥ、ｒｅｂＭおよびｒｅｂＮの高い含量をも示す。表６を参照されたい。

図３および図４におけるグラフは、高ｒｅｂＤ子孫の低ｒｅｂＤ親植物からのはっきりとした分離、並びに植物におけるｒｅｂＤ含量対植物におけるｒｅｂＥ＋ｒｅｂＭ＋ｒｅｂＮ含量の間の相関を示す。

実施例４その後のガンマ線突然変異誘発に由来するさらなるステビア属植物のグリコシド分析
実施例１からのガンマ線突然変異誘発によって産生された幾つかのステビア属植物を、多交雑して、種子を産生した。多交雑した植物からの種子を、実施例１に記載したものと同じ方法を用いて第２のガンマ線誘発突然変異誘発に供し、次いで、発芽させて植物を産生した。第２突然変異誘発に供した選択植物からの葉を、実施例２および３に記載したように乾燥させて分析した。葉のグリコシド含量を、表７に挙げる。

表７に示されるように、高いｒｅｂＤ、ｒｅｂＭおよび／又はｒｅｂＮ含量を有する植物は、第２回のガンマ線突然変異誘発に供した種子から産生した植物の中に見出される。

Claims

１種以上のステビア属植物又はステビア属品種であって、前記１種以上の植物又は前記品種の葉が、乾燥したステビア属の葉の約０．５重量％より多いｒｅｂＤを含む、前記１種以上のステビア属植物又はステビア属品種。
前記１種以上の植物又は前記品種の葉は、乾燥重量の約０．５重量％、０．５５重量％、０．６重量％、０．６５重量％、０．７重量％、０．７５重量％、０．８重量％、０．８５重量％、０．９重量％、０．９５重量％、１重量％、１．０５重量％若しくは１．１重量％よりも大きいか又はこれに等しいｒｅｂＤ含量、又は約０．５重量％〜約１重量％、約１．０重量％〜約１．５重量％、又は約１．５重量％〜約２．０重量％のｒｅｂＤ含量を有する請求項１に記載の１種以上のステビア属植物又はステビア属品種。
前記１種以上の植物は、乾燥重量の１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％、１１．５重量％、１１重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６．５重量％、６重量％、５．５重量％、５．２５重量％、５重量％、４．７５重量％又は４．６重量％未満であるｒｅｂＡ含量を有する、請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。
ｒｅｂＡ含量が、乾燥重量の約４重量％、４．２重量％、４．４重量％、４．５重量％、５重量％、５．２５重量％又は５．５重量％よりも多い、請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。
ステビオシド含量が、乾燥重量の約０．６５重量％、０．７０重量％、０．７５重量％、０．８０重量％、０．８５重量％、０．９０重量％、０．９２重量％、０．９３重量％、０．９４重量％又は１．２９重量％未満である、請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。
ステビオシド含量が、乾燥重量の約０．３重量％、０．３５重量％又は０．４重量％より多い、請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。
ｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比が、約０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９２、０．９３、０．９４又は０．９５より高く、且つ前記比は１未満である、請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。
ｒｅｂＡ／（ｒｅｂＡ＋ステビオシド）比が、約０．８５、０．９０、０．９２、０．９３、０．９４又は０．９５より高く、且つ前記比は１未満である、請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。
（ＲｅｂＥ＋ＲｅｂＭ＋ＲｅｂＮ）の合計が、乾燥重量の約０．４重量％、０．５重量％又は０．６重量％より多い、請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物。
請求項１又は２に記載の１種以上のステビア属植物由来の種子。
請求項１又は２に記載の植物由来の組織。
請求項１又は２に記載の植物の葉、幹、苗条又は細胞。
請求項１又は２に記載の植物の種子、組織、葉、幹又は細胞を含む組成物であって、前記種子、組織、葉、幹又は細胞は、収穫、乾燥、粉末化、凍結乾燥、化学的破砕、機械的破砕、又は物理的破砕されている、組成物。
請求項１３に記載の組成物を含む、食物又は飲料に甘味付与するための組成物。
前記組成物は、１．５％未満のステビオシドを含む、請求項１３に記載の組成物。
請求項１３に記載の組成物を調製することを含む、ｒｅｂＤを含み且つ必要に応じてｒｅｂＡを含む組成物を調製するプロセス。
ｒｅｂＤ、および請求項１又は２に記載の植物から調製されたことを同定するために充分な遺伝物質を含む抽出物であって、前記抽出物は、必要に応じて、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＣ、ｒｅｂＦの任意の１以上を含む、前記抽出物。
請求項１７に記載の抽出物を含む、甘味料組成物。
請求項１又は２に記載の１種以上の高ｒｅｂＤ植物を含む品種。