JPWO2019074089A1 - 高レバウジオシドm含有ステビア植物 - Google Patents
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Abstract
Description
[1−1] 葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体。
[1−2] 葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し9.5%以上のレバウジオシドDをさらに含む、[1−1]に記載の植物体。
[1−3]
以下の(1)〜(5)の少なくとも1つの遺伝的特徴を有する、[1−1]又は[1−2]に記載の植物体。
(1)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(2)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(3)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレルについてホモ接合性である。
(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
(5)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレルについてホモ接合性である。
[1−4]
P01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーについて陽性である、[1−1]〜[1−3]のいずれか一項に記載の植物体。
[1−5] [1−1]〜[1−4]のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は植物培養細胞。
[1−6] 胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスである[1−5]に記載の組織、組織培養物又は植物培養細胞。
[1−7] [1−1]〜[1−4]のいずれか一項に記載のステビア植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有ステビア植物体を作出する方法。
[1−8] 第2の植物体が[1−1]〜[1−4]のいずれか一項に記載のステビア植物体である、[1−7]に記載の方法。
[1−9] [1−1]〜[1−4]のいずれか一項に記載の植物体、[1−5]に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
[1−10] [1−9]に記載の抽出物を含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。
[1−11] [1−1]〜[1−4]のいずれか一項に記載の植物体、[1−5]に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドM含有抽出物の製造方法。
[1−12] [1−11]に記載のレバウジオシドM含有抽出物からレバウジオシドMを精製する工程を含む、レバウジオシドMの製造方法。
[1−13] [1−11]に記載の方法により得られる抽出物及び/又は[1−12]に記載の方法により得られるレバウジオシドMと他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
[1−14] 被験植物のゲノムから以下の(1)〜(5)の少なくとも1つの遺伝的特徴の存在及び/又は不在を検出する工程を含む、高レバウジオシドM含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
(1)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(2)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(3)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレルについてホモ接合性である。
(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
(5)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレルについてホモ接合性である。
[1−15] 被験植物のゲノムからP01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出する工程を含む、[1−14]に記載の方法。
[1−16] さらに、葉組織のレバウジオシドMの含有量を測定する工程を含む、[1−14]又は[1−15]に記載の方法。
[1−17]
(1)配列番号1における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号2における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(2)配列番号3における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号4における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(3)配列番号5における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号6における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(4)配列番号7における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号8における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
(5)配列番号9における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号10における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットであり、前記任意の連続する15塩基以上の配列は各プライマーの3‘末端に位置する、前記プライマーセット。
[1−18]
[1−17]に記載のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含むキットであり、
前記プライマーセットが配列番号1における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素XbaIを含み、
前記プライマーセットが配列番号3における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素KpnIを含み、
前記プライマーセットが配列番号5における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素AflIIを含み、
前記プライマーセットが配列番号9における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素PvuIを含む、
前記キット。
[1−19]
検出可能な標識と結合していてもよい、配列番号55〜64のいずれか一つに示す塩基配列を含むプローブ。
[1−20]
蛍光標識、色素又は結合部分を有する[1−19]に記載のプローブ。
[1−21] P01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出することを目的として被験植物のゲノムDNAに対し[1−17]に記載のプライマーセットを用いてPCR増幅を行う工程、及び前記多型マーカーがP01〜P03及びP05からなる群より選択される少なくとも一つである場合、前記PCR増幅により得られたPCR産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程を含む、高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法。
[1−22] 前記制限酵素がXbaI、KpnI、AflII及びPvuIからなる群より選択される少なくとも一つである、[1−21]に記載の方法。
[1−23] 前記多型マーカーがP02及びP05を含む、[1−21]に記載の方法。
[1−24] 前記制限酵素がKpnI及びPvuIを含む、[1−23]に記載の方法。
[1−25] スクリーニングにより得られる植物体が葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含む、[1−21]〜[1−24]のいずれか一項に記載の方法。
本発明はまた、以下を提供する。
[2−1] 乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体。
[2−2] 乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し9.5%以上のレバウジオシドDをさらに含む、前記[2−1]に記載の植物体。
[2−3]
P01、P02、P03、P04及びP05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーについて陽性である、前記[2−1]又は[2−2]に記載の植物体。
[2−4] 前記[2−1]〜[2−3]のいずれか一つに記載の植物体の種子。
[2−5] 前記[2−1]〜[2−3]のいずれか一つに記載の植物体の乾燥葉。
[2−6] 前記[2−1]〜[2−3]のいずれか一つに記載の植物体の組織培養物又は植物培養細胞。
[2−7] 胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスである前記[2−6]に記載の組織培養物又は植物培養細胞。
[2−8] 前記[2−1]〜[2−3]のいずれか一つに記載のステビア植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有ステビア植物体を作出する方法。
[2−9] 第2の植物体が前記[2−1]〜[2−3]のいずれか一つに記載のステビア植物体である、前記[2−8]に記載の方法。
[2−10] 前記[2−1]〜[2−3]のいずれか一つに記載の植物体、前記[2−4]に記載の種子又は前記[2−5]に記載の乾燥葉の抽出物。
[2−11] 前記[2−10]に記載の抽出物を含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。
[2−12] 前記[2−1]〜[2−3]のいずれか一つに記載の植物体、前記[2−4]に記載の種子又は前記[2−5]に記載の乾燥葉から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドM含有抽出物の製造方法。
[2−13] 前記[2−12]に記載のレバウジオシドM含有抽出物からレバウジオシドMを精製する工程を含む、レバウジオシドMの製造方法。
[2−14] 前記[2−12]に記載の方法により得られる抽出物及び/又は前記[2−13]に記載の方法により得られるレバウジオシドMと他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
[2−15] 被験植物のゲノムからP01、P02、P03、P04及びP05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出する工程を含む、高レバウジオシドM含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
[2−16] さらに、葉組織のレバウジオシドMの含有量を測定する工程を含む、前記[2−15]に記載の方法。
[2−17]
(1)配列番号1における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号2における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(2)配列番号3における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号4における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(3)配列番号5における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号6における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(4)配列番号7における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号8における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
(5)配列番号9における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号10における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットであり、前記任意の連続する15塩基以上の配列は各プライマーの3‘末端に位置する、前記プライマーセット。
[2−18]
前記[2−17]に記載の(1)〜(5)より選択される少なくとも1つのプライマーセットと制限酵素を含むキットであり、
前記プライマーセットが(1)の場合は、前記制限酵素はXbaIであり、
前記プライマーセットが(2)の場合は、前記制限酵素はKpnIであり、
前記プライマーセットが(3)の場合は、前記制限酵素はAflIIであり、
前記プライマーセットが(5)の場合は、前記制限酵素はPvuIである、
前記キット。
[2−19]
検出可能な標識と結合していてもよい、配列番号1〜10のいずれか一つに示す塩基配列を含むプローブ。
[2−20]
蛍光標識、色素又は結合部分を有する前記[2−19]に記載のプローブ。
[2−21] P01、P02、P03、P04及びP05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出することを目的として被験植物のゲノムDNAに対し前記[2−17]に記載のプライマーセットを用いてPCR増幅を行う工程、及び
前記多型マーカーがP01、P02、P03及びP05からなる群より選択される少なくとも一つである場合、前記PCR増幅により得られたPCR産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程、
を含む、高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法。
[2−22] 前記制限酵素がXbaI、KpnI、AflII及びPvuIからなる群より選択される少なくとも一つである、前記[2−21]に記載の方法。
[2−23] 前記多型マーカーがP02及びP05である、前記[2−21]に記載の方法。
[2−24] 前記制限酵素がKpnI及びPvuIである、前記[2−23]に記載の方法。
[2−25] スクリーニングにより得られる植物体が乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含む、前記[2−21]〜[2−24]のいずれか一つに記載の方法。
なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2017年10月12日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2017-198515号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
本発明は、葉(例えば、乾燥葉又は新鮮葉)に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体(以下、「本発明の植物体」又は「本発明のステビア植物体」と称する場合がある)を提供する。
本発明のステビア植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であるが、レバウジオシドMが高くなるように遺伝子に変異が生じたものである。かつ当該遺伝子の変異は非遺伝子組換え的に生じるものである(後述)。
本発明において、高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体のうち、葉(例えば、乾燥葉又は新鮮葉)に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2〜4.6%のレバウジオシドMを含むことを特徴とするステビア植物体を高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体と称することがあり、4.7%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とするステビア植物体は超高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体と称することもある。
ここで、レバウジオシドMとDとの含量の組み合わせは特に限定されず、任意である。
好ましくは、本発明の植物体は、乾燥葉100g中に1.03g以上のレバウジオシドMと1.1g以上のレバウジオシドDを含む。
また、本発明のステビア植物体は、葉(例えば、乾燥葉又は新鮮葉)中のレバウジオシドM(RebM)及びレバウジオシドD(RebD)の含量をステビオール配糖体総量に対する比率として(RebD+RebM)/TSG%で表した場合、(RebD+RebM)/TSGの値の下限が14%以上、16%以上、18%以上、20%以上、22%以上、24%以上、26%以上、28%以上、30%以上、32%以上、34%以上、36%以上、38%以上であることを特徴とする。一方、(RebD+RebM)/TSGの値の上限は、18%以下、20%以下、22%以下、24%以下、26%以下、28%以下、30%以下、32%以下、34%以下、36%以下、38%以下、40%以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは14%以上かつ40%以下、あるいは16%以上かつ40%以下である。
(1)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(2)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(3)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレルについてホモ接合性である。
(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
(5)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレルについてホモ接合性である。
ここでは簡潔のため遺伝的特徴(1)を例に説明したが、遺伝的特徴(2)〜(5)についても同様である。
特定の態様において、「配列番号37に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号47の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号48の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたPCRにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号39に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号49の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号50の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたPCRにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号42に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号51の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号52の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたPCRにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号43に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号53の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号54の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたPCRにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレル」は、配列番号57、67又は77の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレル」は、配列番号59、69又は79の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレル」は、配列番号61、71又は81の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレル」は、配列番号63、73又は83の塩基配列を含む。
また、(1)配列番号35の44位に相当する位置におけるAからTへの変異、(2)配列番号37の40位に相当する位置におけるCからTへの変異、(3)配列番号39の41位に相当する位置におけるGからCへの変異、(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分の欠失、及び(5)配列番号43の50位に相当する位置におけるGからAへの変異からなる群から選択される変異を、「本発明の多型」又は「本発明の変異」と称することがある。
ここで多型マーカーはP01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つである。
P02について陽性とは、候補植物体のゲノムDNAに対し、配列番号3に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号4に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物(297bp長)(例えば、配列番号24又は25)に対しKpnI制限酵素処理を行っても約297bp長のバンド(例えば、配列番号24)しか得られないことを意味する。反対に、約258bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号26)を生じる場合、その候補植物体はP02陰性となる。
P03について陽性とは、候補植物体のゲノムDNAに対し、配列番号5に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号6に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物(約390bp長)(例えば、配列番号27又は28)に対しAflII制限酵素処理を行っても約390bp長のバンド(例えば、配列番号27)しか得られないことを意味する。反対に、約347bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号29)を生じる場合、その候補植物体はP03陰性となる。
P05について陽性とは、候補植物体のゲノムDNAに対し、配列番号9に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号10に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物(約288bp長)(例えば、配列番号31又は32)に対しPvuI制限酵素処理を行っても約288bp長のバンド(例えば、配列番号31)しか得られないことを意味する。反対に、約240bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号33)を生じる場合、その候補植物体はP05陰性となる。
上記bp長に関し、「約」とは、±5bpを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
上記遺伝的特徴(例えば、上記多型マーカー陽性の多型)は、高レバウジオシドM含有及び/又は高レバウジオシドD含有という表現型と統計学上の相関関係を有することが実施例において確認されている。
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析(Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS)、超高性能液体クロマトグラフィー(Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC)等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドMを精製することができる。
本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、葉(例えば、乾燥葉又は新鮮葉)に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有ステビア植物体を作出する方法(以下、「本発明の作出方法」と称する場合がある)を提供する。
当該方法により作出される「葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有ステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
ここで、レバウジオシドMとDとの含量の組み合わせは特に限定されず、任意である。
好ましくは、本発明の作出方法によって得られた植物体は、乾燥葉100g中に1.03g以上のレバウジオシドMと1.1g以上のレバウジオシドDを含む。
また、本発明の作出方法によって得られた植物体は、葉(例えば、乾燥葉又は新鮮葉)中のレバウジオシドM(RebM)及びレバウジオシドD(RebD)の含量をステビオール配糖体総量に対する比率として(RebD+RebM)/TSG%で表した場合、(RebD+RebM)/TSGの値の下限が14%以上、16%以上、18%以上、20%以上、22%以上、24%以上、26%以上、28%以上、30%以上、32%以上、34%以上、36%以上、38%以上であることを特徴とする。一方、(RebD+RebM)/TSGの値の上限は、18%以下、20%以下、22%以下、24%以下、26%以下、28%以下、30%以下、32%以下、34%以下、36%以下、38%以下、40%以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは14%以上かつ40%以下、あるいは16%以上かつ40%以下である。
(1)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(2)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(3)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレルについてホモ接合性である。
(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
(5)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレルについてホモ接合性である。
かかる遺伝的特徴は、本発明者らが開発した多型マーカーを用いて「多型マーカー陽性」のものとして検出することが可能である。
ここで多型マーカーはP01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つである。
P02について陽性とは、候補植物体のゲノムDNAに対し、配列番号3に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号4に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物(297bp長)(例えば、配列番号24又は25)に対しKpnI制限酵素処理を行っても約297bp長のバンド(例えば、配列番号24)しか得られないことを意味する。反対に、約258bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号26)を生じる場合、その候補植物体はP02陰性となる。
P03について陽性とは、候補植物体のゲノムDNAに対し、配列番号5に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号6に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物(約390bp長)(例えば、配列番号27又は28)に対しAflII制限酵素処理を行っても約390bp長のバンド(例えば、配列番号27)しか得られないことを意味する。反対に、約347bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号29)を生じる場合、その候補植物体はP03陰性となる。
P05について陽性とは、候補植物体のゲノムDNAに対し、配列番号9に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号10に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてPCR増幅を行い、得られたPCR産物(約288bp長)(例えば、配列番号31又は32)に対しPvuI制限酵素処理を行っても約288bp長のバンド(例えば、配列番号31)しか得られないことを意味する。反対に、約240bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号33)を生じる場合、その候補植物体はP05陰性となる。
上記bp長に関し、「約」とは、±5bpを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
なお、本発明の植物体は非遺伝子組み換えステビア植物体であるが、本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換え(例えばゲノム編集等により)を行って得られた植物体(例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体)も、本発明の範囲から除外されるものではない。
本発明の植物体及び本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝的特徴を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
したがって、本発明は、別の実施形態として、被験植物のゲノムから以下の(1)〜(5)の少なくとも1つの遺伝的特徴の存在及び/又は不在を検出する工程を含む、高レバウジオシドM含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法(以下、「本発明のスクリーニング方法」と称する場合がある)を提供する。
(1)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(2)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(3)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレルについてホモ接合性である。
(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
(5)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレルについてホモ接合性である。
本発明のスクリーニング方法は、上記(1)〜(5)の少なくとも1つの遺伝的特徴の存在が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
(A)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレル、
(B)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレル、
(C)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレル、
(D)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレル、及び
(E)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレル
からなる群から選択されるアレルの存在の検出、及び/又は、
(a)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がAであるアレル、
(b)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がCであるアレル、
(c)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がGであるアレル、
(d)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失していないアレル、及び
(e)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がGであるアレル
からなる群から選択されるアレルの不在の検出
により決定することができる。
(A)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレル、
(B)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレル、
(C)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレル、
(D)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレル、及び
(E)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレル
からなる群から選択されるアレルの不在の検出、及び/又は、
(a)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がAであるアレル、
(b)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がCであるアレル、
(c)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がGであるアレル、
(d)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失していないアレル、及び
(e)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がGであるアレル
からなる群から選択されるアレルの存在の検出
により決定することができる。
あるいは、本発明の多型とプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子変異をPCR増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝的特徴を検出することができる。
PCR及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照:Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてDNA配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である(Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
DNAマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の多型と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の多型の有無を検出することができる。DNAチップなどのDNAマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる(Affymetrix社;米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照)。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをPCR増幅とCEL Iヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
P01〜P05の陽性の検出方法については既に述べた通りである。
この態様において、本発明のスクリーニング方法は、本発明の多型マーカー陽性が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
前記PCR増幅により得られたPCR産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程、
を含む、高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法が提供される。
(1)配列番号1に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号2に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(2)配列番号3に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号4に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(3)配列番号5に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号6に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(4)配列番号7に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号8に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、又は
(5)配列番号9に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号10に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。 PCR増幅の条件についてはすでに述べたとおりである。
(1’’)配列番号1における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号2における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(2’’)配列番号3における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号4における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(3’’)配列番号5における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号6における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(4’’)配列番号7における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号8における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
(5’’)配列番号9における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号10における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。 このようなプライマーは、前記任意の連続する15塩基以上の配列が3‘側末端に存在すれば、15〜50塩基長、20〜45塩基長、30〜65塩基長の長さにあってもよい。
(i)被験ステビア植物のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
(ii)本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物組織のRebMの含有量を測定する工程、
(iii)本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、RebMの含有量が高い個体を選択する工程、
(iv)選択したRebMの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
(v)交配により得られた子植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
(vi)本発明の遺伝的特徴が検出された子植物組織のRebMの含有量を測定する工程、
(vii)本発明の遺伝的特徴が検出された子植物体のうち、RebMの含有量が高い個体を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
当該キットにおいて、(1)、(1’)及び(1’’)からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はXbaIである。
当該キットにおいて、(2)、(2’)及び(2’’)からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はKpnIである。
当該キットにおいて、(3)、(3’)及び(3’’)からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はAflIIである。
当該キットにおいて、(5)、(5’)及び(5’’)からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はPvuIである。
前記プライマーセットが配列番号1における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はXbaIを含み、
前記プライマーセットが配列番号3における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はKpnIを含み、
前記プライマーセットが配列番号5における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はAflIIを含み、
前記プライマーセットが配列番号9における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はPvuIを含む。
本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは葉(例えば、乾燥葉又は新鮮葉)から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドM含有抽出物の製造方法(以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある)が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からレバウジオシドMを精製する工程を含む、レバウジオシドMの製造方法(以下、「本発明のレバウジオシドMの製造方法」と称する場合がある)が提供される。
具体的には、本発明の高レバウジオシドM含有型ステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別された高レバウジオシドM含有型ステビア植物体又は本発明の方法により製造された高レバウジオシドM含有型ステビア植物体からレバウジオシドM、レバウジオシドD又はその両方を含む抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドM、レバウジオシドD又はその両方の製造方法が提供される。
レバウジオシドM、レバウジオシドD又はその両方を含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒(水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒)を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はOhta et al.、J. Appl. Glycosci.、 Vol. 57、 No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
また、レバウジオシドM、レバウジオシドD又はその両方を含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析(Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS)、超高性能液体クロマトグラフィー(Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC)等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドM、レバウジオシドD又はその両方を精製することができる。
本発明の抽出物は、野生型ステビア種から得られた抽出物と比べレバウジオシドM、レバウジオシドD又はその両方を300%以上、400%以上、500%以上、600%以上、700%以上、800%以上、900%以上、1100%以上、1200%以上、1300%以上、1400%以上、1500%以上、1600%以上、1700%以上、1800%以上、1900%以上、2000%以上、2100%以上、2200%以上、2300%以上、2400%以上、2500%以上、2600%以上、2700%以上、2800%以上、2900%以上、3000%以上、3100%以上、3200%以上、3300%以上、3400%以上、3500%以上、3600%以上、3700%以上、3800%以上、3900%以上、4000%以上、4100%以上、4200%以上、4300%以上、4400%以上、4500%以上、4600%以上、4700%以上、4800%以上、4900%以上、5000%以上高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、野生型ステビア種から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
1.育種素材の導入及び初期選抜
2014年8月に市販ステビア種子を播種、育苗し、同年10月〜2015年3月までの間に約3、000個体について生育状況及び葉形態によって選抜を行った。2015年4月に得られた115個体についてLC−MS/MSを用いた定量分析により各ステビオール配糖体の含有量及び含有率を測定し、RebD及びRebMの含有率が高い3個体(2成分合計でTSGに占める割合が20%以上の個体)を選抜した。同時に、総ステビオール配糖体(TSG)含量によっても選抜も実施し、TSG収率(単位リーフ乾物重より得られる測定可能なステビオール配糖体の総量)が20%以上の14個体を得た。
上記で得られた115個体より、生育状況が良い高RebA型の5個体を選抜し、2015年1月より個体間もしくは個体内で人工授粉を行い、同年3月に集団採種を実施して自殖第一代(S1種子)を得た。さらに、これらS1種子を播種・育苗し、105個体のS1個体群を得た。2015年6月、これらのS1個体群を個体別に育成し、個体内での人工授粉により自殖第二代(S2種子)を得た。得られたS2種子は得られたS1個体ごとに系統として区別し105系統のS2個体群を得た。その後、得られたS2個体の生育状況を確認し、生育良好な個体について各個体の葉を4枚サンプリングし、LC−MS/MSを用いてステビオール配糖体量の定量分析を行った。得られた分析結果より、RebD含量、RebM含量及びTSG量を算出し、葉100g当たりのRebD含量+RebM含量の合算値が2g(=2%)を超える個体を優良個体として選抜した。
成分分析によって選抜した高RebDかつ高RebM植物体(3個体)、及び高TSG植物体(6個体)を育種母本として合計53組合せの交雑試験に供した。上記選抜個体は2015年4月に挿し木によって栄養繁殖を行い同年6月に苗を確立し、同年11月までの間に養生してそれぞれ複数株の親株を確立した。2016年1月より人工交配を開始し、各組合せ1、000粒程度の雑種種子(F1種子)を得たのち、同年3月より得られたF1種子の播種・育苗を行った。その後、得られたF1個体の生育状況を確認し、生育良好な個体について各個体の葉を4枚サンプリングし、LC−MS/MSを用いてステビオール配糖体量の定量分析を行った。得られた分析結果より、RebD含量、RebM含量及びTSG量を算出し、RebD含量+RebM含量の合算値が2g/100g(=2%)を超える個体を優良個体として選抜した。
初期選抜で得られた10個体を用いて遺伝マーカーの作製を行った。2015年6月、RebD+RebM含量率の合算値に基づいて高(29.16%以上)・低(6.06%以下)の2グループに分類し、二次代謝物の生合成経路を活性化することで知られているWRKYコード領域及びWD40コード領域において各グループに共通する多型探索を実施、特定の一塩基多型(SNP)を取得した。得られたSNPに基づいてプライマー設計と制限酵素の選択を行い、特定のSNPの識別を可能とする多型マーカー(1)〜(5)を確立した。
マーカーP01の検出には以下のプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物に制限酵素(XbaI)を添加し、37℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HTにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Fwプライマー:5’−AAGGTTCTTTATTTTTAAACTTATGTTAATTTATTGTATCTAG−3’(配列番号1)
Rvプライマー:5’−CCTTATGTACACATGCTACAC−3’(配列番号2)
得られたPCR産物(約383bp長)に対しXbaI制限酵素処理を行い、約344bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号23)を生じなかったものをP01陽性とした。
マーカーP02の検出には以下のプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物に制限酵素(KpnI)を添加し、37℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HTにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Fwプライマー:5’−TAATCATCCAAACCCTAATCTCGCCAAACAACCGGGTAC−3’(配列番号3)
Rvプライマー:5’−GAGGAAGACATTGGCAACTC−3’(配列番号4)
得られたPCR産物(約297bp長)に対しKpnI制限酵素処理を行い、約260bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号26)を生じなかったものをP02陽性とした。
マーカーP03の検出には以下のプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物に制限酵素(AflII)を添加し、37℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HTにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Fwプライマー:5’−CGATGGTTTTTGCTACATGAAAACCCTAGAAGACGAAACCCGCTTAA−3’(配列番号5)
Rvプライマー:5’−ACCAGCAATAATCCTTGAATTAG−3’(配列番号6)
得られたPCR産物(約390bp長)に対しAflII制限酵素処理を行い、約347bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号29)を生じなかったものをP03陽性とした。
マーカーP04の検出には以下のプライマーを用いてPCRを行った。PCR産物をマイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HTで電気泳動させ、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Fwプライマー:5’−CGCAAACACGTATACTAATC−3’(配列番号7)
Rvプライマー:5’−TTTAGCATGGTATGTACAAC−3’(配列番号8)
約140bpのPCR産物のみ(例えば、配列番号30)を生じたものをP04陽性とした。
マーカーP05の検出には以下のプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物に制限酵素(PvuI)を添加し、37℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置LabChip GX Touch HTにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Fwプライマー:5’−ATACAAAAACACAACCCATATGGTCAAATCAACCCATTCATGAGCGATC−3’(配列番号9)
Rvプライマー:5’−CCCTTGTAAATCCCATATGTAG−3’(配列番号10)
得られたPCR産物(約288bp長)に対しPvuI制限酵素処理を行い、約240bpの制限酵素処理産物(例えば、配列番号33)を生じなかったものをP05陽性とした。
上記で確立した多型マーカーと第I個体群を用いて、マーカーの検証実験を実施した。第I個体群192個体の成分分析を行い、RebM含量値に基づいて、上位8個体(0.35%以上)・下位8個体(0.12%以下)を選抜し、上記のとおりマーカー検定を行った。その結果、RebM含量が高い上位8個体のみが目的の多型を陽性に持つ個体として選抜された(図1)。
第II個体群についても同様に検証実験を行った。第II個体群137個体の成分分析を行い、RebM含量値に基づいて、上位8個体(0.24%以上)・下位8個体(0.01%以下)を選抜し、マーカー検定を行った。その結果、RebM含量が高い上位8個体のみが目的の多型を持つ個体として選抜された(図2)。図1及び2では高RebM表現型を有する個体にのみ目的サイズのバンドが生じていることが分かる。
遺伝マーカーの検証時に用いた2つの分離集団、第I及び第II個体群について、さらなる検証のために個体数を増加して実験を行った。上記の個体数を含めてそれぞれ、62個体、109個体を用いた。RebM含量に基づいて0.2%以上、0.1%以上〜0.2%未満、0%以上〜0.1%未満の3群に分割し、マーカー検定を行った結果、0.2%以上群が本マーカーにより優先的に検出される結果となり、陽性個体の出現頻度が群間で統計的に有意に異なることが証明された(カイ二乗検定による適合度検定、帰無仮説はマーカー検定結果と表現型が紐づかず頻度分布が均等であると仮定。検定結果は下表を参照)。
上記で得られた遺伝マーカーを用いて高RebM植物体の選抜を行ったところ、検証用集団以外の分離集団においても下表のとおりRebM比率が2%以上の個体を選抜することができ、実用的な選抜マーカーになり得ることを確認した。高RebM植物体の選抜結果を以下の表に示す。表中の「○」はマーカー検定結果が陽性であることを表す。
Claims (25)
- 葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体。
- 葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し9.5%以上のレバウジオシドDをさらに含む、請求項1に記載の植物体。
- 以下の(1)〜(5)の少なくとも1つの遺伝的特徴を有する、請求項1又は2に記載の植物体。
(1)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(2)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(3)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレルについてホモ接合性である。
(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
(5)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレルについてホモ接合性である。 - P01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーについて陽性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の植物体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は植物培養細胞。
- 胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスである請求項5記載の組織、組織培養物又は植物培養細胞。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のステビア植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含むことを特徴とする高レバウジオシドM含有ステビア植物体を作出する方法。
- 第2の植物体が請求項1〜4のいずれか一項に記載のステビア植物体である、請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の植物体、請求項5に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
- 請求項9に記載の抽出物を含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の植物体、請求項5に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドM含有抽出物の製造方法。
- 請求項11に記載のレバウジオシドM含有抽出物からレバウジオシドMを精製する工程を含む、レバウジオシドMの製造方法。
- 請求項11に記載の方法により得られる抽出物及び/又は請求項12に記載の方法により得られるレバウジオシドMと他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
- 被験植物のゲノムから以下の(1)〜(5)の少なくとも1つの遺伝的特徴の存在及び/又は不在を検出する工程を含む、高レバウジオシドM含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
(1)配列番号35の44位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(2)配列番号37の40位に相当する位置の塩基がTであるアレルについてホモ接合性である。
(3)配列番号39の41位に相当する位置の塩基がCであるアレルについてホモ接合性である。
(4)配列番号42の55〜72位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
(5)配列番号43の50位に相当する位置の塩基がAであるアレルについてホモ接合性である。
- 被験植物のゲノムからP01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出する工程を含む、請求項14に記載の方法。
- さらに、葉組織のレバウジオシドMの含有量を測定する工程を含む、請求項14又は15に記載の方法。
- (1)配列番号1における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号2における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(2)配列番号3における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号4における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(3)配列番号5における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号6における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
(4)配列番号7における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号8における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
(5)配列番号9における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号10における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットであり、前記任意の連続する15塩基以上の配列は各プライマーの3‘末端に位置する、前記プライマーセット。 - 請求項17に記載のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含むキットであり、
前記プライマーセットが配列番号1における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素XbaIを含み、
前記プライマーセットが配列番号3における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素KpnIを含み、
前記プライマーセットが配列番号5における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素AflIIを含み、
前記プライマーセットが配列番号9における任意の連続する15塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素PvuIを含む、
前記キット。 - 検出可能な標識と結合していてもよい、配列番号55〜64のいずれか一つに示す塩基配列を含むプローブ。
- 蛍光標識、色素又は結合部分を有する請求項19に記載のプローブ。
- P01〜P05からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出することを目的として被験植物のゲノムDNAに対し請求項17に記載のプライマーセットを用いてPCR増幅を行う工程、及び前記多型マーカーがP01〜P03及びP05からなる群より選択される少なくとも一つである場合、前記PCR増幅により得られたPCR産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程を含む、高レバウジオシドM含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法。
- 前記制限酵素がXbaI、KpnI、AflII及びPvuIからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項21に記載の方法。
- 前記多型マーカーがP02及びP05を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記制限酵素がKpnI及びPvuIを含む、請求項23に記載の方法。
- スクリーニングにより得られる植物体が葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し2%以上のレバウジオシドMを含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
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