JP7382965B2 - 高ブロウソネチン含有ステビア植物 - Google Patents
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Description
[1]
野生型よりブロウソネチン含量が高い、変異型ステビア植物体。
[2]
乾燥葉の単位質量当たり1%以上のレバウジオシドDを含むこと、及び/又は
乾燥葉の単位質量当たり0.6%超のレバウジオシドMを含むことを特徴とする、[1]に記載のステビア植物体。
[3]
ブロウソネチンが、ブロウソネチンF、ブロウソネチンH、ブロウソネチンR、ブロウソネチンT又はこれらの組合せを含む、[1]又は[2]に記載の植物体。
[4]
非遺伝子組換植物体である、[1]~[3]のいずれか一項に記載の植物体。
[5]
突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、[1]~[4]のいずれか一項に記載の植物体。
[1]~[5]のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
[7]
胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、[6]に記載の組織、組織培養物又は細胞。
[8]
[1]~[5]のいずれか一項に記載の植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型よりブロウソネチン含量が高いステビア植物体を作出する方法。
[9]
第2の植物体が[1]~[5]のいずれか一項に記載の植物体である、[7]に記載の方法。
[10]
[1]~[5]のいずれか一項に記載の植物体、[6]又は[7]に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
ステビア植物体、その種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチン含有抽出物の製造方法。
[12]
ステビア植物体が[1]~[5]のいずれか一項に記載の植物体である、[11]に記載の方法。
[13]
ブロウソネチン含有抽出物がステビオール配糖体をさらに含有する、[11]又は[12]に記載の方法。
[14]
[11]~[13]のいずれか一項に記載の方法で得たブロウソネチン含有抽出物からブロウソネチンを精製する工程を含む、ブロウソネチンの製造方法。
[15]
[11]~[13]のいずれか一項に記載の方法を用いてブロウソネチン含有抽出物を提供する工程、
任意選択で前記ブロウソネチン含有抽出物を精製してブロウソネチンを提供する工程、及び
前記抽出物又はブロウソネチンを、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、ブロウソネチンを含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
被験ステビア植物体におけるブロウソネチンの含量を決定する工程を含む、高レバウジオシドD含有ステビア植物体及び/又は高レバウジオシドM含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
[17]
ブロウソネチンの含量を決定する工程が、クロマトグラフィー又は質量分析を用いて行われる、[16]に記載の方法。
[18] 被験ステビア植物組織のレバウジオシドD及び/又はレバウジオシドMの含有量を測定する工程をさらに含む、[16]又は[17]に記載の方法。
なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2018年12月28日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2018-248697号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
一態様において、本発明は、野生型よりブロウソネチン含量が高い、変異型ステビア植物体(以下、「本発明の植物体」又は「本発明のステビア植物体」と称する場合がある)を提供する。
ブロウソネチンとしては、ブロウソネチンA、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V等が挙げられる。好ましいブロウソネチンは、ブロウソネチンF、H、R及びTである。より好ましいブロウソネチンは、ブロウソネチンF、H及びTである。
ブロウソネチンは、限定されずに、以下の手法により抽出、定量することができる(以下、「測定方法A」と称する場合がある)。まずステビア植物体の新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物を終濃度75%のメタノール中に投入する。ビーズ式ホモジナイザーでホモジナイズし、15,000rpmで10分間遠心後、上清を回収する。上清をコンディショニング済みのMonoSpin(R)C18カラム(GL Sciences)に適用し、5000gで2分間遠心後、溶出液を回収し、0.2μmフィルターでろ過したものをLC-MS分析に供する。LC-MS分析は以下の条件で行う。
ブロウソネチンの測定値として、複数回、例えば、2回、3回、4回、5回又はそれ以上の測定値の平均値を用いることが好ましい。
(a)乾燥葉の単位質量当たり1%以上、好ましくは2%以上、より好ましくは3%以上のレバウジオシド(Rebaudioside、以下「Reb」ともいう)Dを含む。
(b)乾燥葉の単位質量当たり0.6%超、好ましくは0.7%超、より好ましくは0.8%超のRebMを含む。
(1)乾燥葉の単位質量当たり3.3%以上のRebDを含む(以下、「本発明の植物体A」又は「本発明のステビア植物体A」と称する場合がある)。
(2)乾燥葉の単位質量当たり2.6%以上のRebDと0.4%以上のRebMとを含む(以下、「本発明の植物体B」又は「本発明のステビア植物体B」と称する場合がある)。
(3)乾燥葉の単位質量当たりRebDとRebMを合計で3.7%以上含む(以下、「本発明の植物体C」又は「本発明のステビア植物体C」と称する場合がある)。
(4)総ステビオール配糖体に対するRebDとRebMの質量比が合計で37.8%以上(以下、「本発明の植物体D」又は「本発明のステビア植物体D」と称する場合がある)。
ここで乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を3~4重量%にまで減らしたものをいう。
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析(Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS)、超高性能液体クロマトグラフィー(Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC)等の公知の方法を用いることによりRebD及びRebMを精製することができる。
本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第2のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型よりブロウソネチン含量が高い、高ブロウソネチン含有ステビア植物体を作出する方法(以下、「本発明の作出方法」と称する場合がある)を提供する。
当該方法により作出される植物体は、本発明の植物体と同じ表現型を有する。
一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換え(例えばゲノム編集等により)を行って得られた植物体(例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体)も、本発明の範囲から除外されるものではない。
ステビア植物体のブロウソネチン含量はRebD及びRebM含量と相関性を有することから、高ブロウソネチン含有ステビア植物体を、RebD又はRebM含量に基づいてスクリーニングすることや、高RebD含有及び/又は高RebM含有ステビア植物体を、ブロウソネチン含量に基づいてスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
したがって、本発明の別の側面は、
(A)被験ステビア植物体におけるブロウソネチンの含量を決定する工程を含む、高RebD含有ステビア植物体及び/又は高RebM含有ステビア植物体をスクリーニングする方法(以下、本発明のスクリーニング方法Aと称する場合がある)、及び
(B)被験ステビア植物体におけるRebD及び/又はRebMの含量を決定する工程を含む、高ブロウソネチン含有ステビア植物体をスクリーニングする方法(以下、本発明のスクリーニング方法Bと称する場合がある)
に関する。
基準値は、高RebD含有型及び/又は高RebM含有型ステビア植物体と、低RebD含有型及び/又は低RebM含有型ステビア植物体を識別できるものであれば特に限定されないが、例えば、上記測定方法Aで測定した場合のピーク強度として、ブロウソネチンFについては500000、700000、1000000、1500000など、ブロウソネチンHについては90000、120000、130000、400000など、ブロウソネチンTについては400000、500000、1000000、1500000などであってよい。
ブロウソネチンの測定値として、複数回、例えば、2回、3回、4回、5回又はそれ以上の測定値の平均値を用いることが好ましい。
基準値は、高ブロウソネチン含有型ステビア植物体と、低ブロウソネチン含有型ステビア植物体を識別できるものであれば特に限定されないが、例えば、乾燥葉中の含量として、RebDについては1質量%、2質量%、3質量%、3.3質量%、3.6質量%など、RebMについては0.4質量%、0.6質量%、0.7質量%、0.8質量%などであってよい。
(i)被験ステビア植物におけるブロウソネチン含量を測定する工程、
(ii)基準値以上のブロウソネチンが検出された被験ステビア植物組織のRebD及び/又はRebMの含有量を測定する工程、
(iii)基準値以上のブロウソネチンが検出された被験ステビア植物体のうち、RebD及び/又はRebMの含有量が高い個体を選択する工程、
(iv)選択したRebD及び/又はRebMの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
(v)交配により得られた子植物体におけるブロウソネチン含量を測定する工程、
(vi)基準値以上のブロウソネチンが検出された子植物組織のRebD及び/又はRebMの含有量を測定する工程、
(vii)基準値以上のブロウソネチンが検出された子植物体のうち、RebD及び/又はRebMの含有量が高い個体を選択する工程。
(i)被験ステビア植物におけるRebD及び/又はRebM含量を測定する工程、
(ii)基準値以上のRebD及び/又はRebMが検出された被験ステビア植物組織のブロウソネチンの含有量を測定する工程、
(iii)基準値以上のRebD及び/又はRebMが検出された被験ステビア植物体のうち、ブロウソネチンの含有量が高い個体を選択する工程、
(iv)選択したブロウソネチンの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
(v)交配により得られた子植物体におけるRebD及び/又はRebM含量を測定する工程、
(vi)基準値以上のRebD及び/又はRebMが検出された子植物組織のブロウソネチンの含有量を測定する工程、
(vii)基準値以上のRebD及び/又はRebMが検出された子植物体のうち、ブロウソネチンの含有量が高い個体を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは葉(例えば、乾燥葉又は新鮮葉)から抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチン含有抽出物の製造方法(以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある)が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からブロウソネチンを精製する工程を含む、ブロウソネチンの製造方法(以下、「本発明のブロウソネチンの製造方法」と称する場合がある)が提供される。
具体的には、本発明の高ブロウソネチン含有型ステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別された高ブロウソネチン含有型ステビア植物体又は本発明の方法により製造された高ブロウソネチン含有型ステビア植物体からブロウソネチンを含む抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチンの製造方法が提供される。
ブロウソネチンを含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒(水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒)を反応させることにより得ることができる。抽出条件等は非特許文献1~3に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
また、ブロウソネチンを含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析(Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS)、超高性能液体クロマトグラフィー(Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC)等の公知の方法を用いることによりブロウソネチンを精製することができる。
本発明の抽出物は、野生型ステビア種から得られた抽出物と比べブロウソネチンを150%以上、200%以上、300%以上、400%以上、500%以上、600%以上、700%以上、800%以上、900%以上、1100%以上、1200%以上、1300%以上、1400%以上、1500%以上、1600%以上、1700%以上、1800%以上、1900%以上、2000%以上、2100%以上、2200%以上、2300%以上、2400%以上、2500%以上、2600%以上、2700%以上、2800%以上、2900%以上、3000%以上、3100%以上、3200%以上、3300%以上、3400%以上、3500%以上、3600%以上、3700%以上、3800%以上、3900%以上、4000%以上、4100%以上、4200%以上、4300%以上、4400%以上、4500%以上、4600%以上、4700%以上、4800%以上、4900%以上、5000%以上高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、野生型ステビア種から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
種々の系統のステビア植物体の乾燥葉に含まれるブロウソネチン含量を測定した。具体的には、各個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、0.25gの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物0.05gを終濃度75%のメタノール中に投入した。ビーズ式ホモジナイザーでホモジナイズし、15,000rpmで10分間遠心後、上清を回収した。上清をコンディショニング済みのMonoSpin(R)C18カラム(GL Sciences)に適用し、5000gで2分間遠心後、溶出液を回収し、0.2μmフィルターでろ過した。これをLC-MS分析用試料とした。LC-MS分析には、Ultimate 3000 RSLC(Thermo Fisher Scientific)を接続したQ Exactive(Thermo Fisher Scientific)を用いた。分析条件及び分析結果を以下に示す。なお、分析結果は、5回の反復実験で得たマスクロマトグラムにおけるピーク強度の平均値及び総ピーク強度に対する各ブロウソネチンのピーク強度比(%)を示す。また、使用したステビア植物体は、いずれもエチルメタンスルホン酸(EMS)での変異誘発処理により遺伝子が改変された個体の子孫である。
実施例1と同じ個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、0.25gの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物0.05gを純水中に投入した。超音波処理20分にて抽出し、遠心・濾過した後に0.33mLの抽出液を得た。この抽出液をLCMS-8050(島津)にてLC/MS/MS分析を行い、RebA、RebB、RebC、RebD、RebF、RebM、RebN及びRebOの濃度を定量し、その合計を総ステビオール配糖体(TSG)濃度とした。結果を下表に示す。なお、各数値は乾燥葉中の質量%又はTSGに対する比率(%)を示す。
実施例1~2で得られた結果を基に、ブロウソネチン含量とステビオール配糖体含量との間に相関性があるか検討した。各ブロウソネチンの含量と、各ステビオール配糖体又はTSGの含量との間の相関係数を下表に示す。
Claims (8)
- ステビア植物体、その種子、組織、組織培養物又は細胞からブロウソネチン含有抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチン含有抽出物の製造方法。
- ブロウソネチン含有抽出物がステビオール配糖体をさらに含有する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の方法で得たブロウソネチン含有抽出物からブロウソネチンを精製する工程を含む、ブロウソネチンの製造方法。
- 請求項1又は2に記載の方法を用いてブロウソネチン含有抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、ブロウソネチンを含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。 - 請求項3に記載の方法を用いてブロウソネチンを提供する工程、及び
前記ブロウソネチンを、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、ブロウソネチンを含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。 - 被験ステビア植物体におけるブロウソネチンの含量を決定する工程を含む、ブロウソネチン含量に基づいて高レバウジオシドD含有ステビア植物体及び/又は高レバウジオシドM含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
- ブロウソネチンの含量を決定する工程が、クロマトグラフィー又は質量分析を用いて行われる、請求項6に記載の方法。
- 被験ステビア植物組織のレバウジオシドD及び/又はレバウジオシドMの含有量を測定する工程をさらに含む、請求項6又は7に記載の方法。
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