KR20190010487A

KR20190010487A - 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20190010487A
Application number: KR1020180084749A
Authority: KR
Inventors: 김선창; 라히미 샤디
Original assignee: 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단; 주식회사 아몽
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2019-01-30
Also published as: KR102096348B1; WO2019017722A3; WO2019017722A2

Abstract

본 발명은 돌외(Gynostemma pentaphyllum) 유래의 막뿌리(adventitious root)로부터 진세노사이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 돌외로부터 막뿌리를 형성시키는 단계; 및 상기 막뿌리로부터 진세노사이드를 분리하는 단계를 포함하는, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법에 관한 것으로, 지금까지 진세노사이드의 생산에 이용하지 않았던 돌외 유래의 막뿌리를 이용하여 진세노사이드를 생산함으로써, 이를 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법 {Method for producing ginsenoside from adventitious root of Gynostemma pentaphyllum}

본 발명은 돌외(Gynostemma pentaphyllum) 유래의 막뿌리(adventitious root)로부터 진세노사이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 돌외로부터 막뿌리를 형성시키는 단계; 및 상기 막뿌리로부터 진세노사이드를 분리하는 단계를 포함하는, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

돌외(Gynostemma pentaphyllum)는 칠엽담(七葉膽) 또는 덩굴차로도 불리우며, 산이나 숲속에서 자라는 박과(Cucurbitaceae)의 덩굴성 여러해살이 식물로, 가느다란 줄기는 덩굴수염으로 다른 식물이나 물체에 감아 올라가며, 3 내지 9개(주로 5 내지 7개)의 손바닥 모양의 잎을 가지고 있다(Blumert and Liu 2003). 일반적으로, 주로 약용 부분으로 지상부를 사용하여 차를 만들 수 있고, 그 외 다른 부분도 잘게 썰어 사용될 수 있다. 민간에서는 근경 또는 전초를 만성기관지염에 약용으로 사용한다. 한편, 야생에서 돌외는 성장하는데 있어서 추운 날씨에 영향을 받으며, 이는 온실에서 성공적으로 재배될 수 있지만 너무 건조하지 않고 따뜻한 온도를 필요로 한다(Razmovski-Naumovski et al., 2005).

돌외에는 약 100종의 다마렌 사포닌(dammarane saponin), 즉 지페노사이드(gypenoside) 또는 지노사포닌(gynosaponin)이 함유되어 있고, 이는 콜레스테롤 저하, 면역 강화, 항종양, 항산화, 및 항당뇨 효과 등 다양한 생물학적, 임상적 효과를 가진 활성 성분으로 알려져 있다(Yuin et al. 2004). 이러한 생물학적 효과로 인해 돌외는 인삼(Panax ginseng)을 대체/보완할 수 있는 것으로 상당한 주목을 받았다(Razmovski-Naumovski et al. 2005). 구체적으로, 지페노사이드 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XIX, XXII, XXIII, XXV, XXVIII, XXXVIII, XLIX, LV, LVIII, LXII, LXIII, LXXV, 진세노사이드 Rb1, Rb2, F2 , Rc, Rf, Rg3, 말로닐-Rb1, 말로닐-Rd가 돌외의 주성분으로 발견되었다(Kao et al. 2008; Tang and Eisenbrand 2011).

한편, 진세노사이드 생합성 경로에 대해서는 부분적으로만 알려져 있다. 상기 생합성 경로는 IPP 이성화효소(IPI), GPP 합성효소(GPS), FPP 합성효소(FPS), 스쿠알렌 합성효소(SS) 및 스쿠알렌 애폭시데이즈(SE)의 작용에 의하여 이소펜테닐2인산(isopentenyl diphosphate) 및 DMADP(dimethylallyldiphosphate)의 일련의 축합반응이 일어나 옥시도스콸렌(oxidosqualene)이 합성될 때까지는 다른 트리테르펜 경로와 함께 그 경로를 일부 공유하는 것으로 알려져 있다(Ajikumar et al.Science, 330, 70-74. 2010; Ro et al. Nature, 440, 940-943. 2006; Sun et al.BMC genomics, 11, 262, 2010).

식물 조직 배양 기술은 생식질(germplasm)의 보존 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Iankova et al., 2001, Bhatia et al., 2002). 뿌리 배양은 유전적/생화학적 안정성, 빠른 성장 속도 및 원래의 식물과 비슷한 수준으로 2차 산물을 합성할 수 있는 점 등으로 인해, 식물의 2차 대사물질을 생산하는 유망한 방법으로 여겨진다(Sevo´n & Oksman-Caldentey 2002). 이와 관련하여, 돌외의 모상근(hairy root)은 아그로박테리움 리조센스(Ahgrobacterium rhizogenes)와 공동배양을 통한 리프 디스크법(leaf disc)에 의해 확립되었고(Chang et al. 2005), 줄기 증식(shoot propagation) 방법은 조직배양 방법에 의해 확립되었지만(Liu and Wu, 2000), 아직 돌외의 막뿌리 배양에 대한 보고는 없었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 진세노사이드의 생합성에 사용할 수 있는 돌외의 막뿌리 배양 방법을 개발하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 본 발명의 배양 방법에 의해 유도된 돌외의 막뿌리에서 스쿠알렌 신타아제(GpSS), 스쿠알렌 에폭시다제(GpSE) 및 프로토파낙사이다이올(protopanaxadiol, PPD)형 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올(protopanaxatriol, PPT)형 진세노사이드에 당을 전달하는 당전이 효소 GpUGT23를 포함하는 진세노사이드 관련 유전자가 발현되는 것을 확인하였고, 상기 배양 방법에 의해 유도된 돌외의 막뿌리가 진세노사이드, 구체적으로는 진세노사이드 Rd의 생산에 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

고려인삼학회지 vol 8, 2 pp. 172-177 1226-8453 KCI (1984.12.)

본 발명의 목적은 돌외(Gynostemma pentaphyllum)로부터 막뿌리(adventitious root)를 형성시키는 단계; 및 상기 막뿌리로부터 진세노사이드를 분리하는 단계를 포함하는, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 과제들을 해결하고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법은, 돌외로부터 막뿌리를 형성시키는 단계; 및 상기 막뿌리로부터 진세노사이드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 돌외로부터 막뿌리의 형성은, 돌외를 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및 상기 캘러스를 배양하여 막뿌리를 유도하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은, 돌외로부터 진세노사이드를 생산하는데에 있어서, 막뿌리를 최초로 이용하고자 한 데에 특징이 있다. 구체적으로는, 돌외로부터 캘러스를 유도하고 이로부터 막뿌리를 유도하는 과정을 거쳐 막뿌리를 배양하였으며, 이로부터 진세노사이드 Rd를 비롯한 다양한 진세노사이드를 분리하여 생산할 수 있고, 특히 돌외의 다른 부위 대비 진세노사이드 Rd를 현저히 높은 수준으로 생산할 수 있음을 확인하여, 이를 산업적으로 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 용어 "돌외(Gynostemma pentaphyllum)"는 칠엽담(七葉膽) 또는 덩굴차로도 불리우며, 산이나 숲 속에서 자라는 박과(Cucurbitaceae)의 덩굴성 여러해살이 식물을 말하나, 이에 제한되지 않으며, Gynostemma 속 식물을 모두 포함할 수 있다. 상기 돌외는 상업적으로 판매되는 것을 구입해서 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.

돌외의 줄기는 옆으로 뻗고 마디에 흰털이 있고 엉키면서 자라지만 덩굴손으로 기어올라가기도 한다. 잎은 어긋나고 3 내지 9개(주로 5 내지 7개)의 작은 잎을 가진 겹잎이며 좁은 달걀모양 타원형 또는 좁은 달걀모양이다. 끝의 작은잎은 작은 잎자루와 더불어 길이 4∼8cm, 나비 2∼3cm로서 끝이 뾰족하고 앞면 잎맥 위에 잔털이 있으며 가장자리에 톱니가 있다. 주로 약용 부분으로 지상부를 사용하여 차를 만들 수 있고, 그 외 다른 부분도 잘게 썰어 사용될 수 있으며, 소염, 해독, 거담, 지해의 효능이 있어 민간에서는 근경 또는 전초를 만성기관지염에 약용으로 사용한다. 돌외에는 약 100종의 다마렌 사포닌(dammarane saponin), 즉 지페노사이드(gypenoside) 또는 지노사포닌(gynosaponin)이 함유되어 있고, 이는 콜레스테롤 저하, 면역 강화, 항종양, 항산화, 및 항당뇨 효과 등 다양한 생물학적, 임상적 효과를 가진 활성 성분으로 알려져 있다(Yuin et al. 2004).

본 발명의 일 실시예에서는, 한국 내 다양한 지역에서 수집한 여러 Gynostemma 속 식물의 종자를 22 내지 24℃ 온도에서 16시간의 빛/8시간의 암흑 조건에서 성장시키고, 각각의 식물의 줄기 추출물을 사용하여 진세노사이드 또는 지페노사이드의 수준을 비교하였다. 상기 종자 중, 4개의 Gynostemma 속 식물(2258-1, 2258-2, 3083-1, 3083-2)을 선별하여 대사물질의 분석에 사용하였다.

본 발명에서는 돌외의 막뿌리를 배양하기 위해, 돌외를 배양하여 캘러스를 유도하고 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "캘러스(callus)"는 식물체에 상처가 났을 때 생기는 특수한 조직 또는 세포 덩어리를 말하는 것으로, 유상조직(癒傷組織), 유합조직, 칼루스라고도 하며, 적당한 조건하에서 배양하여 분열증식시킬 수 있는 무정형의 세포괴를 의미한다. 식물체의 어느 부분도 캘러스로 만드는 것이 가능하며, 분화기능이 없고 탈분화된 상태이지만 정기적으로 이식하여 배양하면 그대로 무한 증식할 수 있을 뿐 아니라, 특정 조건하에서는 배양하면 싹, 뿌리, 배 또는 완전한 식물체까지 재분화시킬 수 있다.

캘러스의 유도에 사용되는 것은 돌외의 전체 또는 일부분일 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 돌외의 줄기 부위로부터 캘러스를 유도할 수 있다. 캘러스를 유도하고 배양하기 위해, 이에 제한되지 않으나, 에탄올 또는 치아염소산나트륨 용액 등을 사용하여 식물의 외식편(explant)을 무균화하는 과정을 포함할 수 있고, 캘러스 유도 배지에 심는 과정 및 캘러스가 유도되고 일정 기간 후 다른 배지에 옮겨 계대배양하는 과정을 포함할 수 있다. 또한, 캘러스를 배양하는 과정에 있어서 배양온도, 빛, 가스공급, 질소원, 무기염의 조성, 한천의 농도, 식물의 생장조절물질 등의 요소가 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 있어서, 상기 캘러스는 돌외의 줄기로부터 유도된 캘러스일 수 있다.

본 발명에서 상기 캘러스를 유도하기 위한 배지는 MS(Murashige and Skoog), B5(Gamberg), N6(Gupfa and Durzan) 및 White 등과 같은 영양 기본 배지일 수 있고, 상기 배지는 에너지원, 비타민 및 식물 생장조절물질 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 바람직하게는 당류이고, 보다 바람직하게는 수크로스이며, 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 식물 생장조절물질은 IAA(Indoleacetic acid), IBA(Indolebutyric acid), NAA(Naphthalene acetic acid) 및 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 옥신류일 수 있으며, 0.01-5 ppm, 바람직하게는 0.1-5ppm의 옥신류를 처리하여 캘러스를 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 돌외의 막뿌리의 배양을 위한 상기 캘러스를 유도하기 위해, 돌외의 줄기를 외식편으로 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "외식편(explant)"은, 시험관 또는 배지 내에서 배양을 시작할 때에 사용하는 식물의 조직 또는 기관을 절제한 단편을 말하는 것으로, 주로 동물발생학 및 실험형태학 등에서는 개체의 몸의 일부를 분리하여 체외에서 배양하는 세포군, 조직편, 기관 등을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 외식편은 돌외의 줄기를 사용한 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 돌외의 줄기를 외식편(explant)으로 사용하여 줄기로부터 캘러스를 유도하였다. 구체적으로, 상기 외식편의 표면을 70% 에탄올로 1분 동안 살균하고, 이어서 1% 치아염소산나트륨으로 10분 동안 살균하였다. 그 후, 상기 외식편을 멸균 증류수에 3 내지 5회 침지시켰다. 멸균 후, 외식편을 1cm 길이로 자르고 25℃의 온도, 16시간의 빛/8시간의 암흑 조건의 반량(half strength) MS 배지(2mg/L의 α-나프탈린아세테이트산(1-NAA), 3% 수크로오스, 0.8% 한천)에서 배양하였다. 그 결과, 캘러스는 줄기의 상처 부위에서 배양 7 내지 10일 후에 유도되었으며, 배양 2주 후에는 줄기 외식편의 전체를 둘러쌌다.

따라서, 본 발명에서는 상기 돌외로부터 캘러스를 유도하는 과정에서, 상기 돌외를 7일 내지 10일 배양하여 캘러스를 유도하는 것일 수 있다.

본 발명에서는 진세노사이드를 생산하기 위해 돌외를 배양하여 유도된 캘러스로부터 유도된 막뿌리를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "막뿌리(adventitious root)"는 부정근(不定根)이라고도 하며, 식물의 뿌리 이외의 기관, 즉, 줄기나 잎 등에서 2차적으로 형성되는 뿌리를 말한다.

본 발명에서 상기 막뿌리를 유도하고 배양하기 위해, MS(Murashige and Skoog); 1/2 MS, B5(Gamberg), SH(Schenk and Hild ebrandt), LS(Linsmair-Skoog) 또는 N6(Gupfa and Durzan)배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 돌외의 줄기에서 유도된 캘러스로부터 막뿌리를 제조하였다. 구체적으로, 돌외 줄기의 상처 부위의 표면으로부터 캘러스가 나타날 때 이를 2mg/l의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)가 첨가된 MS(B5 비타민 포함)/B5 배지에 옮겨 배양하였다. 그 결과, 막뿌리는 배양 3 내지 4주 후에 캘러스로부터 유도되었으며, 유도된 막뿌리를 25℃의 온도 및 암흑 조건에서 150rpm의 오비탈 진탕기에서 2mg/l의 IBA가 첨가된 100ml의 MS(B5 비타민 포함)/B5 배지에 매 4주 마다 계대배양함으로써 보존하였다. 상기 막뿌리의 성장은 막뿌리의 상대적인 생중량(fresh weight, FW)을 측정함으로써 확인하였다. 막뿌리의 생중량 측정 결과, 액체 배양 2주 및 3주 후에 그 값이 2.5배 이상 증가했음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서는, 상기 캘러스로부터 막뿌리를 유도하는 과정에서, 상기 캘러스를 3주 내지 4주 배양하여 막뿌리를 유도하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 막뿌리를 유도한 이후에, 계대배양하여 막뿌리를 유지하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 약 4주마다 계대배양할 수 있다.

상기와 같이 돌외로부터 캘러스를 유도하고 이로부터 막뿌리를 유도하게 되면, 최종적으로 돌외 유래의 막뿌리가 형성되게 되며, 본 발명의 목적상 상기 막뿌리를 추출하여 그로부터 진세노사이드, 즉 사포닌을 분리할 수 있다.

본 발명에서 용어 "사포닌(Saponin)"은, 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 본 발명에서 용어 사포닌은 진세노사이드 및 지페노사이드를 모두 포함하는 용어로 사용될 수 있다.

특히, 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜 사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견된 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 "진세노사이드(Ginsenoside)"라고 부른다. 상기 진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(Oleanolicacid-type) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(아글리콘)(sugar moieties(aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 현재, 40 여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Ra, Rh2, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 화합물 O(Compound O), 화합물 Mc1(Compound Mc1), F2, 화합물 Y(Compound Y), 화합물 Mc(Compound Mc), Rg3, 화합물 K(Coumpound K)가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1, F1 등이 포함된다. 본 발명의 진세노사이드 생산방법에 의해 생산되는 진세노사이드의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 진세노사이드 Ro, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2일 수 있고, 보다 바람직하게는 진세노사이드 Rd일 수 있으며, 본 발명에서 용어 진세노사이드는 지페노사이드와 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "지페노사이드"는 트리테르펜 사포닌 계열 화합물로, 돌외에서 분리되는 지페노사이드는 약 100여종에 이르며, 방향성분인 필로두신(phyllodulcin)과 플라보노이드, 카르틴 등을 함유하고 있다. 주요 생리활성으로는 항산화 작용 및 혈관내피세포 보호 작용, 심혈관 기능 개선 작용등이 있으며, 최근의 연구에 따르면, 지페노사이드는 T-세포를 활성화시키고, 신경보호작용(neuroprotective)을 하는 등 면역 조절과 항산화 작용을 하는 것으로 알려졌다. 특히, 지페노사이드는 그 동안 인삼에만 함유된 것으로 알려진 진세노사이드와 구조와 생리활성 작용이 거의 유사하며, 그 함량 또한 인삼보다 2-3배 많은 것으로 알려졌다.

본 발명에서는, 돌외 유래의 막뿌리를 추출하여 그 추출물로부터 진세노사이드를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "추출물"이란, 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 수득한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명에서 사포닌 성분의 추출은 돌외 유래의 막뿌리를 동결시키는 단계; 상기 동결된 막뿌리를 갈고 추출 용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 추출물을 농축시키는 단계 등을 포함할 수 있다. 상기 사포닌 성분의 추출에 있어서, 돌외는 상업적으로 판매되는 것을 구입해서 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것 등 제한없이 사용할 수 있다.

상기 추출 용매로 추출하여 추출물을 수득하는 단계는 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 추출용매를 돌외 유래의 막뿌리 분량에 1배 내지 10배 첨가하여 추출할 수 있으며, 구체적으로 2배 내지 3배 첨가하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 일 수 있으며, 구체적으로 60℃ 내지 80℃일 수 있으며, 더 구체적으로 65℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추출시간은 10분 내지 1시간일 수 있으며, 구체적으로 20분 내지 40분일 수 있고, 더 구체적으로 25분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추출회수는 1회 내지 5회일 수 있으며, 구체적으로 3회 내지 4회 반복 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 추출물을 수득하는 단계는 수지 흡착법에 의한 사포닌 성분의 분리를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 추출물을 농축시키는 단계는 추출물을 감압 농축하는 과정이 추가로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 회전식 증발기를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 돌외의 막뿌리 샘플을 액체 질소로 동결시키고, 막자사발과 막자로 갈아 65℃의 항온수조에서 70% 에탄올로 25분간 추출한 후, 초음파 수조(ultrasonic bath)에서 5분간 초음파 처리하였다. 상기 처리된 에탄올 추출물을 7배 희석하고 Diaion® HP-20 컬럼을 수행하여 사포닌을 추출하였다. Diaion® HP-20 컬럼에 흡착된 사포닌(진세노사이드 및 지페노사이드)을 100% 에탄올로 용출시키고, 회전식 증발기로 건조, 농축시켜 농축된 화합물을 수득하였다.

따라서, 본 발명에서는, 상기 돌외 유래의 막뿌리 추출물로부터 진세노사이드를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드는 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 진세노사이드 Ro, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2일 수 있고, 보다 바람직하게는 진세노사이드 Rd일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 사포닌 성분에 대해 전개 용매으로 CHCl₃: CH₃OH : H₂O (65:35:10, v/v/v, 저상)를 사용하여 실리카겔 60 플레이트로 얇은 막 크로마토그래피(TLC) 분석을 수행하였다. 그 결과, 여러 Gynostemma 속 종자에서 선별된 4개의 종자(2258-1, 2258-2, 3083-1, 3083-2)에서 진세노사이드 F1, Rg1 및 Re가 생산되는 것을 확인하였고, 2258-1 또는 2258-2와 비교하여 3083-1 및 3083-2 종자가 진세노사이드 F1, Rg1 및 Re를 보다 더 많이 생산하는 것을 확인하였다(도 4).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 사포닌 성분의 정량적 분석을 통해 돌외의 막뿌리로부터 진세노사이드의 생산 여부를 확인하기 위해, 진세노사이드 Rd 표준물질, 막뿌리 추출물 및 진세노사이드 Rd가 첨가된 막뿌리 추출물에 대해 물과 아세토니트릴을 이동상으로 사용하여 C18 컬럼(5㎛, 4.6×250mm)상에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행하였고, 각 진세노사이드를 기준 진세노사이드 샘플과 비교하였다. 그 결과, 돌외의 막뿌리 추출물의 크로마토그램에서 진세노사이드 Rd에 해당하는 피크가 검출되었음을 확인하였고(도 5의 B), 이로부터 돌외의 막뿌리 추출물은 진세노사이드 Rd를 비롯한 진세노사이드의 생산에 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 돌외의 잎, 줄기와 돌외의 막뿌리로부터 생산되는 진세노사이드 Rd의 양을 정량적으로 비교·분석한 결과, 돌외의 막뿌리 추출물을 사용한 경우, 돌외의 잎이나 줄기 추출물을 사용한 경우 대비 생산된 진세노사이드 Rd의 함량이 현저히 높음을 확인하였다(도 7의 C).

한편, 본 발명에서, 상기 돌외 유래 막뿌리의 배양물은 진세노사이드 생합성 유전자를 발현하는 것일 수 있다. 상기 진세노사이드 생합성 유전자는, 이에 제한되지는 않으나, 스쿠알렌 신타아제(GpSS), 스쿠알렌 에폭시다제(GpSE) 및 글리코실트랜스퍼라제(GpUGT23)를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "GpSS(Gynostemma pentaphyllum squalene synthase)"는 스쿠알렌 합성효소, "GpSE(Gynostemma pentaphyllum squalene epoxidase)"는 스쿠알렌 에폭시다제, "GpUGT23"은 UDP(Uridine diphosphate)-당전이효소(UGT, UDP-glycosyltransferase)를 의미하며, 이들 효소는 진세노사이드의 생합성 경로에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, Spectrum Plant Total RNA Kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여 돌외의 막뿌리에서 총 RNA를 추출하였다. 1000ng의 총 RNA를 주형으로, 0.1mM 올리고(dT)₂₀ 프라이머 및 5U/㎕ M-MLV 역전사 효소(Promega)를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 합성하였다.

정량적 실시간 PCR은 Topreal™ qPCR 2X PreMIX(높은 ROX를 갖는 SYX Green)(Enzynomics)를 사용하여, 100ng의 cDNA를 사용하여 수행하였다. 이때 프라이머는 하기 표 1에 나타낸, 각 유전자(GpSS, GpSE 및 GpUGT23)에 특이적인 프라이머를 사용하였으며, 온도 및 시간 조건은 95℃에서 15분 후, 95℃에서 20초, 53℃에서 20초, 72℃에서 20초 동안 54 사이클을 수행하였다. 정량적 분석을 위한 형광 물질의 검출은 각 사이클의 마지막 단계에서 수행하였으며, Bio-Rad CFX connect Real-Time PCR Detection System을 사용하여 유전자 전사 수준의 상대적인 양을 측정하고, 측정된 데이터를 정규화하기 위해 comparative cycle threshold (CT) 방법을 사용하여 계산하였다. 유전자의 상대적인 발현 정도를 평가하기 위해, 액틴 유전자의 발현 정도를 내부 참조로 사용하였다.

그 결과, 진세노사이드 생합성과 관련된, 스쿠알렌 신타아제(GpSS), 스쿠알렌 에폭시다제(GpSE), PPD 및 PPT-형 진세노사이드 모두에 글루코오스를 전달하는 활성을 갖는 GpUGT23 유전자가 돌외의 막뿌리 배양물에서 발현되는 것을 확인하였다(도 5의 A). 이로부터 돌외의 막뿌리 추출물은 진세노사이드 Rd를 비롯한 진세노사이드의 생산에 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 지금까지 진세노사이드의 생산에 이용하지 않았던 돌외 유래의 막뿌리를 이용하여 진세노사이드를 생산함으로써, 이를 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 돌외로부터 막뿌리를 배양하는 과정을 나타낸 도면이다.
구체적으로, 도 1의 A는 돌외 유래의 막뿌리를 배양하는 전반적인 과정을 나타낸 것이고, 도 1의 B는 돌외 줄기의 측면에서 유도된 캘러스를 나타낸 것이며, 도 1의 C는 유도된 캘러스로부터 형성된 막뿌리를 나타낸 것이고, 도 1의 D는 배지에서의 막뿌리의 성장을 나타낸 것이며, 도 1의 E는 막뿌리의 액체배양(liquid culture)을 나타낸 것이다.
도 2는, 캘러스 유도 배지에서, 2주 배양 후 줄기의 주변 전체에서 형성된 캘러스를 나타낸 것으로, 흰색 막대는 1cm 길이에 해당한다.
도 3은, 2mg/l의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)가 첨가된 보존배지에서 4주 배양 후 돌외 유래의 막뿌리의 성장을 나타낸 것이다.
도 4는, 서로 다른 네 개의 Gynostemma 속 식물의 줄기 추출물을 사용하여 TLC(thin layer chormatography)를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A는, 돌외 유래의 막뿌리 배양 시스템에서 액틴에 대해 스쿠알렌 신타아제(GpSS), 스쿠알렌 에폭시다제(GpSE) 및 글리코실트랜스퍼라제(GpUGT23) 유전자의 상대적인 발현 수준을 나타낸다.
도 5의 B는, 진세노사이드 Rd 표준물질, 돌외 유래의 막뿌리 추출물 및 Rd가 첨가된 돌외 유래의 막뿌리 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 진세노사이드 Rd 표준물질과 돌외의 잎 추출물, 줄기 추출물 및 막뿌리 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것으로, 도 6의 A는 잎 추출물, 도 6의 B는 줄기 추출물, 도 6의 C는 막뿌리 추출물의 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸다.
도 7의 A 및 B는 진세노사이드 Rd 표준물질과 돌외의 잎 추출물, 줄기 추출물 및 막뿌리 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타내며, 도 7의 C는 돌외의 잎, 줄기 및 막뿌리 추출물로부터 생산된 진세노사이드 Rd의 양(mg/gFW)을 정량적으로 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 야생 Gynostemma 속 식물의 선별

각 Gynostemma 속 식물마다 성분이 현저히 다른 것으로 보고되어 있는바(Takemoto et al. 1983), 한국 내 다양한 지역에서 수집한 여러 Gynostemma 속 식물의 종자를 22 내지 24℃ 온도에서 16시간의 빛/8시간의 암흑 조건에서 성장시키고, 그 줄기의 추출물을 사용하여 진세노사이드 및 지페노사이드의 수준을 비교하였다. 상기 종자 중, 4개의 Gynostemma 속 라인(2258-1, 2258-2, 3083-1, 3083-2)을 선별하여 대사물질의 분석에 사용하였다.

실시예 2: 캘러스의 유도

막뿌리 배양을 위한 캘러스를 유도하기 위해, 돌외(Gynostemma pentaphyllum Makino) 줄기를 외식편(explant)으로 사용하였다. 상기 외식편의 표면을 70% 에탄올로 1분 동안 살균하고, 이어서 1% 치아염소산나트륨으로 10분 동안 살균하였다. 그 후, 상기 외식편을 멸균 증류수에 3 내지 5회 침지시켰다. 멸균 후, 외식편을 1cm 길이로 자르고 25℃의 온도, 16시간의 빛/8시간의 암흑 조건의 반량(half strength) MS 배지(2mg/L의 α-나프탈린아세테이트산(1-NAA), 3% 수크로오스, 0.8% 한천)에서 배양하였다.

그 결과, 캘러스는 상처 부위에서 배양 7 내지 10일 후에 유도되었으며(도 1의 B), 배양 2주 후에는 줄기 외식편의 전체를 둘러쌌다(도 2).

실시예 3: 막뿌리의 유도 및 성장 측정

상기 실시예 2의 캘러스로부터 막뿌리를 유도하기 위해, 캘러스가 줄기 표면에 나타날 때 이를 2mg/l의 IBA(Indole-3-Butyric Acid)가 첨가된 MS(B5 비타민 포함)/B5 배지에 옮겨 배양하였다.

그 결과, 막뿌리는 배양 3 내지 4주 후에 캘러스로부터 유도되었으며(도 3), 유도된 막뿌리를 25℃의 온도 및 암흑 조건에서 150rpm의 오비탈 진탕기에서 2mg/l의 IBA가 첨가된 100ml의 MS(B5 비타민 포함)/B5 배지에 매 4주 마다 계대배양함으로써 보존하였다.

한편, 막뿌리의 성장은 막뿌리의 상대적인 생중량(fresh weight, FW)을 측정함으로써 확인하였다. 막뿌리의 생중량의 측정 결과, 액체 배양 2주 및 3주 후에 그 값이 2.5배 이상 증가했음을 확인하였다.

실시예 4: 사포닌 성분의 추출

상기 실시예 3의 유도된 막뿌리로부터 사포닌을 추출하기 위해, 신선한 Gynostemma 뿌리 샘플을 액체 질소로 동결시키고, 막자사발과 막자로 갈아 65℃의 항온수조에서 70% 에탄올로 25분간 추출한 후, 초음파 수조(ultrasonic bath)에서 5분간 초음파 처리하였다. 상기 처리된 에탄올 추출물을 7배 희석하고 Diaion® HP-20 컬럼을 수행하여 사포닌을 추출하였다. Diaion® HP-20 컬럼에 흡착된 사포닌(진세노사이드 및 지페노사이드)을 100% 에탄올로 용리시키고, 회전식 증발기로 건조농축시켜 농축된 화합물을 수득하였다. 상기 화합물을 메탄올에 용해시켜 성분 분석에 사용하였다.

실시예 5: 추출된 사포닌의 TLC 분석

상기 실시예 4에서 추출된 사포닌 성분을 전개·분리하기 위해, 전개 용매으로 CHCl₃: CH₃OH : H₂O (65:35:10, v/v/v, 저상)를 사용하여 실리카겔 60 플레이트로 얇은 막 크로마토그래피(TLC) 분석을 수행하였다. TLC 플레이트 상에 나타난 스팟은 10%(v/v) H₂SO₄를 분무하고 110℃에서 10분 동안 가열함으로써 검출하였다.

TLC 플레이트 상의 스팟을 분석한 결과, 선별된 4개의 Gynostemma 속 종자(2258-1, 2258-2, 3083-1, 3083-2)에서 진세노사이드 F1, Rg1 및 Re가 생산되는 것을 확인하였고, 2258-1 또는 2258-2와 비교하여 3083-1 및 3083-2 라인이 진세노사이드 F1, Rg1 및 Re를 보다 더 많이 생산하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

실시예 6: 추출된 사포닌의 HPLC 분석

상기 실시예 4에서 추출된 사포닌 성분의 정량적 분석을 통해 돌외의 막뿌리로부터 진세노사이드의 생산 여부를 확인하기 위해, 진세노사이드 Rd 표준물질, 막뿌리 추출물 및 진세노사이드 Rd가 첨가된 막뿌리 추출물에 대해 물과 아세토니트릴을 이동상으로 사용하여 C18 컬럼(5㎛, 4.6×250mm)상에서 HPLC 분리를 수행하였다. 물(A)과 아세토니트릴(B)의 시간 및 비율은 8분 동안 B 65%, 12분 동안 B 90%, 50분 동안 B 100%, 5분 동안 B 32%이었다. 이때 이동상의 유속은 1.0ml/분이고, 진세노사이드는 파장 203nm에서 관찰되었다. 각 진세노사이드를 기준 진세노사이드 샘플(진세노사이드 Rd)과 비교하였다.

HPLC을 수행하여 얻은 크로마토그램을 분석한 결과, 돌외의 막뿌리 추출물의 크로마토그램에서 진세노사이드 Rd에 해당하는 피크가 검출되었음을 확인하였다(도 5의 B). 이로부터 돌외의 막뿌리 추출물은 진세노사이드 Rd를 비롯한 진세노사이드의 생산에 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 7: 돌외 막뿌리로부터 추출된 RNA의 RT-PCR 및 실시간 정량적 실시간 PCR 분석을 통한 진세노사이드 및 지페노사이드 관련 유전자의 발현 여부 분석

돌외 막뿌리의 배양물이 스쿠알렌 신타아제(GpSS), 스쿠알렌 에폭시다제(GpSE) 및 글리코실트랜스퍼라제(GpUGT23)와 같은 진세노사이드 및 지페노사이드 관련 유전자를 발현하는지 여부를 확인하기 위해, 돌외의 막뿌리로부터 총 RNA를 추출하여 RNA의 RT-PCR 및 실시간 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하였다.

구체적으로, Spectrum Plant Total RNA Kit(Sigma-Aldrich)를 사용하여 돌외의 막뿌리에서 총 RNA를 추출하였다. 1000ng의 총 RNA를 주형으로, 0.1mM 올리고(dT)₂₀ 프라이머 및 5U/㎕ M-MLV 역전사 효소(Promega)를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 합성하였다.

정량적 실시간 PCR은 Topreal™ qPCR 2X PreMIX(높은 ROX를 갖는 SYX Green)(Enzynomics)를 사용하여, 20㎕ 반응 부피에서 100ng의 cDNA를 사용하여 수행하였다. 이때 프라이머는 하기 표 1에 나타낸, 각 유전자(GpSS, GpSE 및 GpUGT23)에 특이적인 프라이머를 사용하였으며, 온도 및 시간 조건은 95℃에서 15분 후, 95℃에서 20초, 53℃에서 20초, 72℃에서 20초 동안 54 사이클을 수행하였다. 정량적 분석을 위한 형광 물질의 검출은 각 사이클의 마지막 단계에서 수행하였으며, Bio-Rad CFX connect Real-Time PCR Detection System을 사용하여 유전자 전사 수준의 상대적인 양을 측정하고, 측정된 데이터를 정규화하기 위해 comparative cycle threshold (CT) 방법을 사용하여 계산하였다. 유전자의 상대적인 발현 정도를 평가하기 위해, 액틴 유전자의 발현 정도를 내부 참조로 사용하였다.

[표 1]

그 결과, 진세노사이드 생합성과 관련된, 스쿠알렌 신타아제(GpSS), 스쿠알렌 에폭시다제(GpSE), PPD 및 PPT-형 진세노사이드 모두에 글루코오스를 전달하는 활성을 갖는 GpUGT23 유전자가 돌외의 막뿌리 배양물에서 발현되는 것을 확인하였다. 구체적으로, 내부 참조로 사용된 액틴 유전자와 비교하여 GpSS는 약 0.65, GpSE는 약 0.25, GpUGT23은 약 0.53 정도의 상대적인 발현 수준을 나타내었다(도 5의 A).

이로부터, 돌외의 막뿌리 배양물에서 진세노사이드 생합성 유전자가 유의한 수준으로 발현되고, 이에 돌외의 막뿌리가 진세노사이드의 생산에 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 8: 돌외의 잎, 줄기 또는 막뿌리 추출물의 HPLC 및 생산된 진세노사이드 Rd의 정량적 비교·분석

돌외의 잎, 줄기 등 다른 부위와 돌외의 막뿌리로부터 생산되는 진세노사이드 Rd의 양을 정량적으로 비교·분석하기 위해, 진세노사이드 Rd 표준물질, 돌외의 잎, 줄기, 막뿌리 추출물 및 진세노사이드 Rd가 첨가된 돌외의 잎, 줄기, 막뿌리 추출물에 대해 실시예 4의 방법과 동일한 방법으로 HPLC를 수행하고, 그 결과 얻은 크로마토그램을 분석하였다.

그 결과, 돌외의 막뿌리 추출물은 잎이나 줄기 추출물 대비 생산된 진세노사이드 Rd의 함량이 현저히 높음을 확인하였다(도 6). 또한, 생산된 진세노사이드 Rd 함량의 정량적 분석 결과, 막뿌리 추출물의 경우 약 0.09mg/gFW의 진세노사이드 Rd 생산이 가능한 반면, 줄기 추출물의 경우 그 절반인 약 0.04mg/gFW의 생산이 가능하고, 잎 추출물의 경우 진세노사이드 Rd가 거의 생산되지 않음을 확인하였다(도 7의 C).

즉, 이는 돌외의 다른 부위 대비 돌외 유래의 막뿌리를 이용한 본 발명의 방법이 특히 진세노사이드 Rd를 현저히 높은 수준으로 생산하는데 유용하게 활용될 수 있음을 나타내는 결과이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

돌외(Gynostemma pentaphyllum)로부터 막뿌리(adventitious root)를 형성시키는 단계; 및
상기 막뿌리로부터 진세노사이드를 분리하는 단계를 포함하는, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 돌외로부터 막뿌리의 형성은,
돌외를 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및
상기 캘러스를 배양하여 막뿌리를 유도하는 단계를 포함하는 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 배양을 위한 돌외는 돌외 조직 또는 기관을 절제하여 제조한 돌외 외식편(explant)인 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 돌외는 돌외의 줄기 부위인 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 돌외를 7일 내지 10일 배양하여 캘러스를 유도하는 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 캘러스를 3주 내지 4주 배양하여 막뿌리를 유도하는 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 막뿌리를 유도한 이후에, 계대배양하여 막뿌리를 유지하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 진세노사이드는 진세노사이드 Ro, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rg2, Rg3, Rh1, Rh2로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 진세노사이드는 진세노사이드 Rd인 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 진세노사이드는 막뿌리를 추출하여 그로부터 분리하는 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 돌외 유래의 막뿌리의 배양물은 진세노사이드 생합성 유전자를 발현하는 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 진세노사이드 생합성 유전자는, 스쿠알렌 신타아제(GpSS), 스쿠알렌 에폭시다제(GpSE) 및 글리코실트랜스퍼라제(GpUGT23)인 것인, 돌외 유래의 막뿌리로부터 진세노사이드를 생산하는 방법.