BR112019013210A2

BR112019013210A2 - planta estévia não geneticamente modificada, semente, folha seca, cultura de tecido ou uma célula de planta cultivada, métodos para produzir uma planta estévia, um extrato, rebaudiosídeo c, um medicamento, um flavorizante ou um alimento ou bebida e para classificar uma planta estévia, extrato, e, medicamento, flavorizante ou alimento ou bebida.

Info

Publication number: BR112019013210A2
Application number: BR112019013210A
Authority: BR
Inventors: Ono Eiichiro; Miyagawa Katsuro; Iwaki Kazunari; Hirai Tadayoshi
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2019-12-10
Also published as: JPWO2018124142A1; EP3569707A4; US20220217933A1; CN110114459B; EP3569707B1; NZ754482A; EP4273230A3; US20200170209A1; EP3569707A1; CN110114459A; EP4273230A2; ES2959827T3; JP7128117B2; WO2018124142A1; US11284576B2; AU2017388705B2; AU2017388705A1

Abstract

é um objetivo da presente invenção prover uma planta estévia tendo um alto teor de rebaudiosídeo c. a presente invenção provê uma planta estévia não geneticamente modificada tipo alto teor de rebaudiosídeo c que tem um maior teor de rebaudiosídeo c do que variedades de estévia tipo selvagem, mais especificamente pelo menos 20% mais de teor. a presente invenção provê adicionalmente: um método para produzir uma planta estévia não geneticamente modificada tipo alto teor de rebaudiosídeo c como essa, e folhas secas obtidas de uma planta como essa.

Description

PLANTA ESTÉVIA NÃO GENETICAMENTE MODIFICADA, SEMENTE, FOLHA SECA, CULTURA DE TECIDO OU UMA CÉLULA DE PLANTA CULTIVADA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA ESTÉVIA, UM EXTRATO, REBAUDIOSÍDEO C, UM MEDICAMENTO, UM FLAVORIZANTE OU UM ALIMENTO OU BEBIDA E PARA CLASSIFICAR UMA PLANTA ESTÉVIA, EXTRATO, E, MEDICAMENTO, FLAVORIZANTE OU ALIMENTO OU BEBIDA CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção se refere a uma planta estévia com alto teor de rebaudiosídeo C.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [002] Em resposta às necessidades diversificadas dos consumidores, várias bebidas foram desenvolvidas e são comercialmente disponíveis. Sacarídeos tal como sacarose são componentes muito comumente combinados em bebidas para efeito de, por exemplo, conferir doçura. Entretanto, sua influência na saúde devido a consumo excessivo tem sido salientada. Assim, existe cada vez mais necessidade de adoçantes menos calóricos e naturalmente derivados. Por exemplo, a Literatura de Patente 1 descreve uma composição de adoçante funcional contendo uma vitamina, um adoçante de alta intensidade, e uma composição de melhoria de doçura.

[003] Rebaudiosídeo (a seguir, também referido como “Reb”) é conhecido como um componente doce contido em um extrato de estévia. O extrato de estévia é obtido por extração e purificação de folhas secas de estévia. Estévia é uma planta perene da família Compositae, com o Paraguai na América do Sul como seu lugar de origem, e seu nome científico é Stevia rebaudiana Bertoni. Estévia contém um componente tendo aproximadamente 300 ou mais vezes a doçura do açúcar e é, portanto, cultivada para uso deste componente doce extraído da mesma como um adoçante natural. A presença de vários glicosídeos tais como RebA, RebB, RebC, RebD, RebE e RebM foi

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2/31 reportada como Reb (JP 2012-504552 A). Dentre vários Rebs, por exemplo, RebA é avaliado como um adoçante de alta intensidade tendo boa qualidade de doçura e é amplamente usado. Tem sido também observado cada vez mais que outros Rebs têm sua doçura exclusiva e gosto associado.

[004] Nessas circunstâncias, uma planta estévia contendo 3 a 8% em peso de rebaudiosídeo C por folha seca é conhecida (Literatura de Patente 3). Lista de Citação

Literatura de Patente

Literatura de Patente 1: JP 2009-517043 A

Literatura de Patente 2: Relatório Descritivo Nacional do

Pedido de Patente Internacional No. 2016-515814

Literatura de Patente 3: Relatório Descritivo Internacional No.

WO 2016/090460 panfleto

Descrição da Invenção [005] Embora um componente doce nessas plantas estévia ofereça doçura razoável, o problema do mesmo é maior sabor residual de doçura comparado com sacarose. Para lidar com esse problema, os presentes inventores observaram que o grau desse sabor residual difere dependendo da composição de um extrato de estévia, e particularmente observaram que rebaudiosídeo C (a seguir, pode ser referido como “RebC”) contido no extrato de estévia melhora o sabor residual de doçura.

[006] Dessa maneira, existe uma demanda para a obtenção de uma planta estévia mais rica em rebaudiosídeo Cea provisão de uma abordagem para produzir uma planta como essa, uma folha seca obtenível de uma planta como essa, e um alimento, uma bebida, etc. contendo rebaudiosídeo C obtido desta folha seca.

[007] O presente pedido provê uma planta estévia não geneticamente modificada com alto teor de rebaudiosídeo C contendo rebaudiosídeo C a alto teor comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, um método para

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3/31 produzir a planta, e um método para classificar a planta.

[008] A presente invenção permite a obtenção de uma planta estévia mais rica em rebaudiosídeo Cea provisão de uma abordagem para produzir uma planta como essa, uma folha seca obtenível de uma planta como essa, e um alimento, uma bebida, etc. contendo rebaudiosídeo C obtido desta folha seca.

Descrição das Modalidades [009] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes. As modalidades são dadas a seguir meramente para ilustrar a presente invenção e não são destinadas a limitar a presente invenção por tais modalidades. A presente invenção pode ser realizada em vários modos sem fugir do espírito da presente invenção.

1. Planta estévia não geneticamente modificada com alto teor de rebaudiosídeo C da presente invenção [0010] A presente invenção provê uma planta estévia não geneticamente modificada com alto teor de rebaudiosídeo C compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, em que a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total é 40% ou mais (a seguir, referida como a “planta da presente invenção”).

[0011] A planta estévia da presente invenção é uma espécie derivada de uma planta estévia de espécie selvagem, mas ocorreu uma variação genética que aumenta o nível de rebaudiosídeo C. A variação genética ocorre de uma maneira não geneticamente modificada (mencionada posteriormente).

[0012] A expressão “compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem” significa que, quando a quantidade de rebaudiosídeo C contida por quantidade unitária (por exemplo, 10 mL) de um extrato líquido obtido de uma folha fresca (folha não seca) da planta estévia do tipo selvagem é usada como uma

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4/31 referência (concentração), a quantidade (concentração) de rebaudiosídeo C contida pela mesma quantidade unitária (a mesma quantidade daquela do extrato líquido obtido da folha da planta estévia do tipo selvagem) de um extrato líquido obtido de uma folha fresca (folha não seca) da planta estévia da presente invenção é maior em 20% ou mais. Neste contexto, a planta estévia da presente invenção pode compreender rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais, 22% ou mais, 24% ou mais, 26% ou mais, 28% ou mais, 30% ou mais, 32% ou mais, 34% ou mais, 36% ou mais, 38% ou mais, 40% ou mais, 42% ou mais, 44% ou mais, 46% ou mais, 48% ou mais, 50% ou mais, 52% ou mais, 54% ou mais, 56% ou mais, 58% ou mais, 60% ou mais, 62% ou mais, 64% ou mais, 66% ou mais, 68% ou mais, ou 70% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0013] A expressão “a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total é 40% ou mais” significa que rebaudiosídeo C está presente a uma razão de 40% ou mais para a quantidade de glicosídeo de esteviol total presente em um extrato líquido obtido de uma folha fresca (folha não seca) da planta estévia da presente invenção. O glicosídeo de esteviol total não inclui um glicosídeo de esteviol desconhecido nem inclui um glicosídeo de esteviol presente a um nível menor que o limite de detenção. Preferivelmente, o glicosídeo de esteviol total é qualquer combinação de dois ou mais membros selecionados do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, esteviolmonosídeo, esteviolbiosídeo e esteviosídeo. Em uma certa modalidade, o glicosídeo de esteviol total pode consistir de, por exemplo, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M e esteviol. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol total pode

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5/31 consistir de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O e esteviol.

[Formula 1]

Nome do composto

Esteviol '7. Estevioibiosideo

Estevioskko

Rebí-udicsideo A £ Rebaudiosídeo E X’

Rebaudiosídeo C

Rebaudiosídeo i)

Rebaisdiosideo E

RebaiKiíosideo F

K2

E /Xxlc AGk (2 1)

X4· 1) /MjkG-ri) #Ok{3->Íi

AGlc- j ,AGM3~>U /TGIíí-./>Gfci 2—>h .t h> ΑΧγ 2ά i } |(| Rubuscsideo

Dulcosídeo A

Rebaudio s ide o ?vi

/Mile- ô-R&m. 2 41}

^4 Rebaudiosídeo N

2—4)

Μ?!ί>(3····Ή [0014]

Embora o teor de rebaudiosídeo C na planta da presente invenção seja como mencionado anteriormente, no caso de obtenção de uma

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6/31 folha seca a partir da planta da presente invenção, rebaudiosídeo C pode estar presente em uma quantidade de 7% em peso ou mais, 8% em peso ou mais, 9% em peso ou mais, 10% em peso ou mais, 11% em peso ou mais, 12% em peso ou mais, 13% em peso ou mais, 14% em peso ou mais, 15% em peso ou mais, 16% em peso ou mais, 17% em peso ou mais, 18% em peso ou mais, 19% em peso ou mais, ou 20% em peso ou mais com relação ao peso da folha seca.

[0015] Neste contexto, a folha seca da planta da presente invenção se refere a uma folha tendo um teor de água diminuído para 10% em peso ou menos, 7% em peso ou menos, 5% em peso ou menos, 4% em peso ou menos, 3% em peso ou menos, 2% em peso ou menos, ou 1% em peso ou menos pela secagem de uma folha fresca da planta estévia da presente invenção. Preferivelmente, o teor de água da folha seca da planta da presente invenção é 3 a 4% em peso.

[0016] A planta da presente invenção pode ter pelo menos uma das propriedades seguintes além das propriedades anteriores relacionadas ao rebaudiosídeo C.

[0017] (1) O teor de rebaudiosídeo A (a quantidade de rebaudiosídeo

A produzido) é menor comparado com a espécie de estévia tipo selvagem. Mais especificamente, o teor (por exemplo, a concentração em peso em uma folha seca ou similares) de rebaudiosídeo A é menor em aproximadamente 40% ou mais, aproximadamente 50% ou mais, aproximadamente 60% ou mais, aproximadamente 70% ou mais, ou aproximadamente 80% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0018] (2) O teor de esteviosídeo (a quantidade de esteviosídeo produzida) é menor comparado com a espécie de estévia tipo selvagem. Mais especificamente, o teor (por exemplo, a concentração em peso em uma folha seca ou similares) de esteviosídeo é menor em aproximadamente 50% ou mais, aproximadamente 60% ou mais, aproximadamente 70% ou mais, ou

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7/31 aproximadamente 80% ou mais, comparado com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0019] (3) O teor de rebaudiosídeo F (a quantidade de rebaudiosídeo

F produzida) é maior comparado com a espécie de estévia tipo selvagem. Mais especificamente, o teor (por exemplo, a concentração em peso em uma folha seca ou similares) de rebaudiosídeo F é maior em aproximadamente 2 vezes ou mais, aproximadamente 3 vezes ou mais, aproximadamente 4 vezes ou mais, aproximadamente 5 vezes ou mais, ou aproximadamente 6 vezes ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0020] (4) A razão do teor de rebaudiosídeo A para o teor de glicosídeo de esteviol total é menor comparada com a espécie de estévia tipo selvagem. Mais especificamente, a razão do teor de rebaudiosídeo A para o teor de glicosídeo de esteviol total (por exemplo, em uma folha seca ou similares) é menor em aproximadamente 8% ou mais, aproximadamente 20% ou mais, aproximadamente 30% ou mais, aproximadamente 40% ou mais, aproximadamente 50% ou mais, aproximadamente 60% ou mais, ou aproximadamente 70% ou mais comparada com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0021] (5) A razão do teor de esteviosídeo para o teor de glicosídeo de esteviol total é menor comparada com a espécie de estévia tipo selvagem. Mais especificamente, a razão do teor de esteviosídeo para o teor de glicosídeo de esteviol total (por exemplo, em uma folha seca ou similares) é menor em aproximadamente 30% ou mais, aproximadamente 40% ou mais, aproximadamente 50% ou mais, aproximadamente 60% ou mais, ou aproximadamente 70% ou mais comparada com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0022] (6) A razão do teor de rebaudiosídeo F para o teor de glicosídeo de esteviol total é maior comparada com a espécie de estévia tipo selvagem. Mais especificamente, a razão do teor de rebaudiosídeo F para o

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8/31 teor de glicosídeo de esteviol total (por exemplo, em uma folha seca ou similares) é menor em aproximadamente 3 vezes ou mais, aproximadamente 4 vezes ou mais, aproximadamente 5 vezes ou mais, ou aproximadamente 6 vezes ou mais comparada com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0023] As propriedades anteriores (1) a (6) podem ser baseadas na comparação de um indivíduo específico da planta da presente invenção com um indivíduo específico da espécie de estévia tipo selvagem, ou podem ser baseadas na comparação de um valor da média aritmética de uma população que consiste de uma pluralidade de indivíduos da planta da presente invenção com um valor da média aritmética de uma população que consiste de uma pluralidade de indivíduos da espécie de estévia tipo selvagem.

[0024] Em uma modalidade, a planta da presente invenção tem menores teores de rebaudiosídeo A e esteviosídeo (menores quantidades de rebaudiosídeo A e esteviosídeo produzidos) e um maior teor de rebaudiosídeo F (uma maior quantidade de rebaudiosídeo F produzida) comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, e/ou menores razões dos teores de rebaudiosídeo A e esteviosídeo para o teor de glicosídeo de esteviol total e um maior razão do teor de rebaudiosídeo F para o teor de glicosídeo de esteviol total comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, além das propriedades anteriores relacionadas a rebaudiosídeo C.

[0025] Como mencionado anteriormente, a planta estévia da presente invenção é uma espécie derivada de uma planta estévia de espécie selvagem, mas ocorreu uma variação genética que aumenta o nível de rebaudiosídeo C. A variação genética ocorre em condições naturais ou por uma abordagem de modificação não genética. A variação genética é como mostrado na SEQ ID NO: 1 (a seguir, referido como o “polimorfismo genético da presente invenção”). A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 tem um polimorfismo de único nucleotídeo (SNP; a seguir, referido como o “SNP da presente invenção”) no qual o 60° nucleotídeo da sequência de nucleotídeos

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9/31 dos alelos tipo selvagem correspondentes (SEQ ID NO: 2) variou em relação ao tipo selvagem A a T.

[0026] Assim, a planta estévia da presente invenção é distinguida por ter um polimorfismo mostrado na SEQ ID NO: 1 no genoma. Foi confirmado nos Exemplos que um polimorfismo como esse tem correlação estatística com um fenótipo contendo altamente rebaudiosídeo C.

[0027] A planta estévia da presente invenção pode ter o polimorfismo genético anterior heterozigotamente ou homozigotamente. Em geral, uma planta tendo o polimorfismo genético homozigotamente tende a ter maior teor de rebaudiosídeo C comparada com uma planta tendo o polimorfismo genético heterozigotamente.

[0028] O polimorfismo genético é detectável por método de PCR, método de PCR TaqMan, método de sequenciamento, método de microarranjo, método Invader, método TILLING, etc., embora o método de detenção não seja limitado a esses. O método detalhado para detectar o polimorfismo genético será mencionado posteriormente.

[0029] Exemplos da “abordagem de modificação não genética” aqui incluem um método para induzir uma variação no gene de uma célula hospedeira (ou uma planta hospedeira) sem transfecção com um gene estranho. Exemplos de um método como esse incluem um método de permitir que um mutagênio atue em uma célula de planta. Exemplos de um mutagênio como esse incluem etil metanossulfonato (EMS) e azida de sódio. Por exemplo, o metanossulfonato de etila (EMS) pode ser usado a uma concentração tais como 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, ou 1,0% para tratar uma célula de planta. O tempo de tratamento é 1 a 48 horas, 2 a 36 horas, 3 a 30 horas, 4 a 28 horas, 5 a 26 horas, ou 6 a 24 horas. Os próprios procedimentos do tratamento são conhecidos na técnica e podem ser realizados imergindo uma semente absorvida em água obtida através de um processo de absorção de água em uma solução para tratamento

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10/31 contendo o mutagênio na concentração descrita anteriormente para o tempo de tratamento descrito anteriormente.

[0030] Um exemplo alternativo da abordagem de modificação não genética pode ser um método de irradiar uma célula de planta com radiação ou feixe de luz tais como raios-X, raios-γ, ou raio ultravioleta. Neste caso, uma célula irradiada usando uma dose apropriada (intensidade, distância, e tempo da lâmpada ultravioleta) de raio ultravioleta é cultivado em um meio seletivo ou similares, e então, uma célula, um calo, ou uma planta tendo o traço de interesse podem ser selecionados. Nesta operação, a intensidade de irradiação é 0,0 1 a 100 Gr, 0,03 a 75 Gr, 0,05 a 50 Gr, 0,07 a 25 Gr, 0,09 a 20 Gr, 0, 1 a 15 Gr, 0, 1 a 10 Gr, 0,5 a 10 Gr, ou 1 a 10 Gr. A distância de irradiação é 1 cm a 200 m, 5 cm a 100 m, 7 cm a 75 m, 9 cm a 50 m, 10 cm a 30 m, 10 cm a 20 m, ou 10 cm a 10 m. O tempo de irradiação é 1 minuto a 2 anos, 2 minutos a 1 ano, 3 minutos a 0,5 anos, 4 minutos a 1 mês, 5 minutos a 2 semanas, ou 10 minutos a 1 semana. A intensidade, distância e tempo de irradiação diferem dependendo do tipo de radiação ou do estado do objeto a ser irradiado (célula, calo, ou planta) e podem ser apropriadamente ajustados pelos versados na técnica.

[0031] Abordagens tais como fusão de célula, cultura de antera (indução haplóide), e cruzamento remoto (indução haplóide) são também conhecidas na técnica.

[0032] Em geral, células de planta podem envolver uma mutação durante a cultura. Portanto, é preferível regenerar um indivíduo de planta para manter mais estavelmente o traço.

[0033] Embora a planta da presente invenção seja uma planta estévia não geneticamente modificada, o escopo da presente invenção não exclui uma planta obtida por recombinação genética a partir do fato passado com a planta da presente invenção como um hospedeiro (por exemplo, uma planta provida adicionalmente com um outro traço por recombinação genética com a planta

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11/31 da presente invenção como um hospedeiro).

[0034] O rebaudiosídeo C pode ser extraído no estado de um extrato líquido reagindo uma folha fresca ou uma folha seca da planta da presente invenção com um solvente adequado (um solvente aquoso tal como água ou um solvente orgânico tais como um álcool, éter ou acetona). Para as condições de extração, etc., vide um método descrito em WO 2016/090460, ou um método descrito nos Exemplos mencionados posteriormente.

[0035] O rebaudiosídeo C pode ser purificado adicionalmente a partir do extrato líquido assim obtido por uso de um método conhecido na técnica tais como um gradiente de acetato de etila ou qualquer um dos outros solventes orgânicos:água, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia gasosa, espectrometria de massa por tempo de voo (TOF-MS), ou cromatografia líquida de ultra (alto) desempenho (UPLC).

[0036] O teor de rebaudiosídeo C de acordo com a presente invenção pode ser medido por um método descrito em WO 2016/090460, ou um método descrito nos Exemplos mencionados posteriormente. Especificamente, uma folha fresca pode ser amostrada da planta estévia da presente invenção, seguido por medição por LC/MS-MS.

[0037] A planta da presente invenção pode incluir não apenas toda a planta, mas um órgão da planta (por exemplo, uma folha, uma pétala, um tronco, uma raiz, e uma semente), um tecido de planta (por exemplo, epiderme, pólen, tecido macio, xilema, feixe vascular, tecido paliçado, e tecido esponjoso), várias formas de células de planta (por exemplo, células cultivadas suspensas), um protoplasto, uma seção da folha, um calo, e similares.

[0038] A planta da presente invenção pode também incluir uma cultura de tecido ou uma célula de planta cultivada. Isso é em virtude de a planta poder ser regenerada cultivando uma cultura de tecido ou uma célula de planta cultivada como essa. Exemplos da cultura de tecido ou da célula de

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12/31 planta cultivada da planta da presente invenção incluem, mas não se limitando a embriões, células de meristema, pólens, folhas, raízes, ápices de raiz, pétalas, protoplastos, seções de folha e calos.

2. Método para produzir planta da presente invenção [0039] Em um aspecto alternativo, a presente invenção provê um método para produzir uma planta estévia com alto teor de rebaudiosídeo C compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, o método compreendendo uma etapa de cruzar a planta estévia da presente invenção com uma segunda planta estévia (a seguir, referida como o “método de produção da presente invenção”).

[0040] A “planta estévia com alto teor de rebaudiosídeo C compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem” produzido por o método tem o mesmo fenótipo e propriedades genéticas daquelas da planta da presente invenção.

[0041] Especificamente, o fenótipo da planta produzido pelo método de produção da presente invenção é que a planta compreende rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, e a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total é 40% ou mais. Neste contexto, a expressão “compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem” é como mencionado anteriormente. A expressão “a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total é 40% ou mais” é também como mencionado anteriormente.

[0042] Quando uma folha seca é obtida da planta produzida pelo método de produção da presente invenção, rebaudiosídeo C pode estar presente em uma quantidade de 7% em peso ou mais, 8% em peso ou mais, 9% em peso ou mais, 10% em peso ou mais, 11% em peso ou mais, 12% em

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13/31 peso ou mais, 13% em peso ou mais, 14% em peso ou mais, 15% em peso ou mais, 16% em peso ou mais, 17% em peso ou mais, 18% em peso ou mais, 19% em peso ou mais, ou 20% em peso ou mais com relação ao peso da folha seca. A definição da folha seca é como mencionado anteriormente.

[0043] As propriedades genéticas da planta produzida pelo método de produção da presente invenção devem ter um polimorfismo genético mostrado na SEQ ID NO: 1. A planta produzida pelo método de produção da presente invenção pode ter o polimorfismo genético heterozigotamente ou homozigotamente. O método para detectar um polimorfismo como esse é como mencionado anteriormente e como mencionado posteriormente.

[0044] No método de produção da presente invenção, “hibridização” significa que a planta da presente invenção é cruzada com uma segunda planta para obter uma planta progênie da mesma (planta produzida pelo método de produção da presente invenção). O método de hibridização é preferivelmente retrocruzamento. O “retrocruzamento” é uma abordagem de cruzar adicionalmente uma planta progênie gerada entre a planta da presente invenção e a segunda planta, com a planta da presente invenção (isto é, uma planta tendo o polimorfismo genético da presente invenção) para produzir uma planta homozigota tendo o polimorfismo genético da presente invenção. Quando a segunda planta para uso no método de produção da presente invenção tem o mesmo fenótipo e propriedades genéticas daquelas da planta da presente invenção, o cruzamento é substancialmente retrocruzamento. O polimorfismo genético da presente invenção é hereditário de acordo com a lei de Mendel. Em associação com isso, o fenótipo que correlaciona com o polimorfismo genético, isto é, o fenótipo de alto teor de rebaudiosídeo C, é também hereditário de acordo com a lei de Mendel.

[0045] Altemativamente, a planta da presente invenção pode também ser produzida por autofecundação. A autofecundação pode ser realizada pela autopolinização do pólen de estame da planta da presente invenção com o

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14/31 pistilo da planta da presente invenção.

[0046] Uma vez que a planta produzida pelo método de produção da presente invenção tem o mesmo fenótipo e propriedades genéticas daquelas da planta da presente invenção, a planta produzida pelo método de produção da presente invenção pode ser cruzada adicionalmente com uma terceira planta estévia para produzir uma planta estévia com alto teor de rebaudiosídeo C compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem.

[0047] Em uma modalidade alternativa, a planta da presente invenção pode ser produzida regenerando uma planta pela cultura da cultura de tecido ou da célula de planta cultivada mencionada anteriormente. As condições de cultura são as mesmas daquelas para cultivar uma cultura de tecido ou uma célula de planta cultivada da planta estévia do tipo selvagem e são conhecidas na técnica (Protocolos para culturas in vitro e análise de metabólito secundário de plantas aromáticas e medicinal, Method in molecular biology, vo. 1391, pp. 113-123).

3. Método para classificação de planta de presente invenção [0048] A planta da presente invenção ou a planta tendo o mesmo fenótipo e propriedades genéticas daquelas da planta da presente invenção pode ser classificada detectando o polimorfismo genético da presente invenção de um tecido desta planta. Neste contexto, “classificação” significa que a planta da presente invenção é discriminada das outras plantas para selecionar a planta da presente invenção.

[0049] Assim, em um aspecto alternativo, a presente invenção provê um método para classificar uma planta estévia com alto teor de rebaudiosídeo C, compreendendo uma etapa de identificar um polimorfismo mostrado na SEQ ID NO: 1 no genoma de uma planta de teste (a seguir, pode ser referido como o “método de classificação da presente invenção”).

Exemplos do método de classificação da presente invenção incluem um

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15/31 método compreendendo:

(a) uma etapa de submeter uma biblioteca genômica ou cDNA de uma planta de estévia teste a tratamento de amplificação e/ou tratamento de hibridização usando um oligonucleotídeo sonda compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo o polimorfismo genético da presente invenção, e/ou um oligonucleotídeo iniciador preparado de maneira tal que, quando pelo menos uma da sequência de nucleotídeos do gene e uma sequência complementar da mesma é amplificada, o fragmento de amplificação compreende o sítio de variação, e (b) uma etapa de detectar o sítio de variação analisando o produto tratado.

[0050] Tais exemplos específicos de métodos para detectar os recursos genéticos da presente invenção incluem, mas não se limitando a método de PCR, método de PCR TaqMan, método de sequenciamento, método de microarranjo, método Invader, e método TILLING.

[0051] No caso do método de PCR, é preferível gerar um oligonucleotídeo iniciador de maneira tal que a porção da extremidade 3’ tenha uma sequência complementar ao SNP da presente invenção. Usando um oligonucleotídeo iniciador projetado dessa maneira, a reação de extensão da polimerase se dá em virtude de o oligonucleotídeo iniciador hibridizar completamente no molde, se a amostra do molde tiver a variação, ao passo que, se o molde não tiver o SNP da presente invenção, a reação de extensão não ocorre em virtude de o nucleotídeo na extremidade 3 ’ do oligonucleotídeo iniciador tiver pareamento incorreto com o molde. Portanto, amplificação por PCR é realizada usando um oligonucleotídeo iniciador como esse, e o produto da amplificação é analisado por eletroforese de gel de agarose ou similares, e se um produto da amplificação de um tamanho predeterminado puder ser confirmado, o molde como a amostra tem uma variação, e, se o produto da amplificação não estiver presente, pode-se julgar que o molde não tem uma

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16/31 variação.

[0052] Altemativamente, o polimorfismo genético da presente invenção pode ser detectado projetando a sequência de oligonucleotídeo iniciador de maneira tal que o SNP da presente invenção e a sequência de oligonucleotídeo iniciador não se sobreponham e o polimorfismo genético da presente invenção possa ser amplificado por PCR, e por sequenciamento da sequência de base do fragmento de nucleotídeo amplificado.

[0053] Para PCR e eletroforese de gel de agarose, vide Sambrook, Fritsch and Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[0054] Método de PCR TaqMan usa oligos e DNA Taq polimerases específicos de alelo fluorescentemente marcado (Livak, K. J. Genet). Anal. 14, 143 (1999); Morris T. etal., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)).

[0055] O método de sequenciamento é um método para analisar a presença ou ausência de uma variação amplificando uma região contendo a variação por PCR e sequenciando a sequência de DNA usando um Dye Terminator ou similares (Sambrook, Fritsch and Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[0056] Um microarranjo de DNA é um no qual uma extremidade de uma sonda de nucleotídeo é imobilizada em um arranjo em um suporte, e inclui um chip de DNA, um chip de Gene, um microchip, um arranjo de glóbulo, e similares. Usando uma sonda contendo uma sequência complementar ao polimorfismo genético da presente invenção, a presença ou ausência do polimorfismo genético da presente invenção pode ser compreensivelmente detectada. Ensaios de microarranjo de DNA tais como chips de DNA incluem ensaios GeneChip (vide Affymetrix; Patentes Nos. U.S. 6.045.996; 5.925.525; e 5.858.659). A técnica GeneChip utiliza um microarranjo miniaturizado, de alta densidade de sonda de oligonucleotídeos

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17/31 fixado a um chip.

[0057] O método invader combina a hibridização de duas sondas repórteres específicas para cada alelo de um polimorfismo genético tais como SNPs e uma sonda invader no DNA do molde e a clivagem de DNA por enzima Cleavase com um atividade endonuclease especial que cliva um DNA reconhecendo sua estrutura (Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993), e similares).

[0058] Método TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) é um método no qual pareamentos incorretos mutacionais nos genomas de uma população mutante mutagenizada são classificados por amplificação por PCR e tratamento com CEL I nuclease.

4. Extrato derivado da planta da presente invenção e produto compreendendo o extrato [0059] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para produzir um extrato contendo rebaudiosídeo C, compreendendo uma etapa de obter um extrato da planta da presente invenção, ou uma semente ou uma folha seca de planta (a seguir, referido como o “método de produção de extrato da presente invenção”). A presente invenção provê adicionalmente um método para produzir rebaudiosídeo C, compreendendo uma etapa de purificar rebaudiosídeo C de um extrato obtido pelo método de produção de extrato da presente invenção (a seguir, referido como o “método de produção de rebaudiosídeo C da presente invenção”).

[0060] O extrato contendo rebaudiosídeo C pode ser obtido reagindo uma folha fresca ou uma folha seca da planta da presente invenção com um solvente adequado (o solvente aquoso tal como água ou um solvente orgânico tais como um álcool, éter ou acetona). Para as condições de extração, etc., vide um método descrito em WO 2016/090460, ou um método descrito em Exemplos mencionados posteriormente.

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18/31 [0061] O rebaudiosídeo C pode ser purificado a partir do extrato contendo rebaudiosídeo C por uso de um método conhecido na técnica tais como um gradiente de acetato de etila ou qualquer de outros solventes orgânicos: água, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia gasosa, espectrometria de massa por tempo de voo (TOF-MS), ou cromatografia líquida de ultra (alto) desempenho (UPLC).

[0062] O extrato obtido pelo método de produção de extrato da presente invenção (a seguir referido como o “extrato da presente invenção”) é distinguido em que o extrato compreende rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, e a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total é 40% ou mais. Neste contexto, a expressão “compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem” é como mencionado anteriormente. A expressão “a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total é 40% ou mais” é também como mencionado anteriormente. O extrato da presente invenção difere pelo menos na razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total de um extrato similarmente obtido por extração da espécie de estévia tipo selvagem e é, portanto, considerado diferir nas propriedades tais como propriedades gustativas do extrato similarmente obtido por extração da espécie de estévia tipo selvagem.

[0063] O extrato da presente invenção assim obtido e/ou rebaudiosídeo C obtido pelo método para produção de rebaudiosídeo C de acordo com a presente invenção pode ser misturado com outro(s) componente(s) para produzir um medicamento inovador, flavorizante ou alimento ou bebida com teor aumentado de rebaudiosídeo C. Dessa maneira, em um aspecto alternativo, a presente invenção provê um método para produzir um medicamento, um flavorizante ou um alimento ou bebida, compreendendo uma etapa de misturar o extrato da presente invenção e/ou

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19/31 rebaudiosídeo C obtido pelo método para produzir rebaudiosídeo C de acordo com a presente invenção com outro(s) componente(s). A presente invenção provê adicionalmente um medicamento, flavorizante ou alimento ou bebida inovadores com teor de rebaudiosídeo C aumentado, obtido pelo método de produção. Neste contexto, o alimento ou bebida significa uma bebida e um alimento. Assim, em uma certa modalidade, a presente invenção provê um medicamento, flavorizante, bebida ou alimento inovadores e também provê um método para produzir o medicamento, o flavorizante, o bebida ou o alimento.

[0064] Outro(s) componente(s) não é/são particularmente limitado(s), desde que o(s) componente(s) possa(am) ser usado(s) em um medicamento, um flavorizante ou um alimento ou bebida. Um componente natural e um componente não natural podem ser usados. Exemplos do componente não natural incluem compostos de ocorrência não natural, por exemplo, aditivos sintéticos tais como agentes flavorizantes sintéticos e conservantes sintéticos, e produtos de fermentação.

[0065] A forma de dosagem do medicamento (composição farmacêutica) não é particularmente limitada, e qualquer forma de dosagem tais como uma solução, uma pasta, um gel, um sólido, ou um pó podes ser adotados. O medicamento (composição farmacêutica) da presente invenção pode ser usado em preparações externas para pele tais como óleos, loções, cremes, emulsões, géis, xampus, enxagues capilares, condicionador capilar, esmaltes, bases, batons, pós faciais, máscaras faciais, unguentos, pós, pastas dentais, aerossóis, e espumas de limpeza bem como agentes de banho, estimulantes de crescimento capilar, soros de pele, agentes proteção solar, e similares. O medicamento (composição farmacêutica) da presente invenção pode opcionalmente compreender adicionalmente outros ingredientes farmaceuticamente ativos (por exemplo, um ingrediente anti-inflamatório) ou ingredientes auxiliares (por exemplo, um ingrediente lubrificante e um

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20/31 ingrediente carreador). O ingrediente farmaceuticamente ativo ou o ingrediente auxiliar pode ser um componente natural ou um componente não natural.

[0066] Exemplos da bebida incluem, mas não se limitando a bebidas de suco de fruta, refrigerantes, bebidas isotônicas, bebidas de chá (por exemplo, chá não fermentado tal como chá verde, chá semi fermentado tal como chá azul, chá totalmente fermentado tal como chá preto, e chá fermentado após aquecimento tal como chá vermelho), bebidas fermentadas (por exemplo, bebidas lácteas e bebidas alcoólicas tais como saquê refinado, vinho, cerveja, e licores medicinais), vitaminas, e leites batidos.

[0067] O produto alimentício inclui qualquer produto alimentício processado. Exemplos do produto alimentício processado incluem, mas não se limitando a pão, macarrão, pasta, arroz, artigos de confeitaria (torta, sorvete, sacolé, rosquinha, biscoito assado, bala, bala dura, sorvetes, chicletes, bala confeitada, pastilhas, petisco, bolacha de arroz, casquinha de sorvete, e artigos de confeitaria japonesa tais como bolinho de arroz japonês e pão cozido), tofu (coalho de soja) e seus produtos processados, produtos alimentícios agrícolas tais como frutas em conserva, produtos alimentícios fermentado tais como saquê de culinária, licores medicinais, vinho de arroz mirin (saquê adocicado de cozinha), vinagre, molho de soja, miso (pasta de feijão), shiokara (vísceras de peixe salgado), vinagre Vermont, chalotas de picles em vinagre açucarado, gengibre doce em conserva em salmoura, raízes de lotus conservadas em vinagre, e picles japoneses, produtos alimentícios de animais de fazenda tais como iogurte, presunto, bacon, e linguiça, produtos de frutos do mar tais como kamaboko (peixe picado e defumado), ageten (torta de peixe frita por imersão), hanpen (torta de peixe fofa), e shimesaba (filé de cavala avinagrado), sopa, sopa grossa, geléia, tsukudani (frutos do mar fervidos em molho de soja), temperos, men-tsuyu (tempero a base de molho de soja líquido para macarrão), molho para tempurá, molho para kabayaki eel, molho

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21/31 para macarrão frio, molho para carne assada grelhada, molhos, pasta de dentes, satsuma-age (torta de peixe frito), dashi-maki (omelete enrolado), molho para macarrão de frigideira, produtos de geleia de peixe, algas marinhas condimentadas, tenkasu (pedaços crocantes de tempura), e furikake (tempero de arroz). Em uma modalidade, o produto alimentício processado pode ser produzido de uma substância natural como uma matéria prima, mas difere em suas propriedades (por exemplo, propriedades físicas tais como elasticidade, viscosidade, e dureza, e propriedades sensoriais tais como gosto, cheiro, e textura) da substância natural. Em uma outra modalidade, o produto alimentício processado compreende um componente não natural.

Exemplos [0068] A seguir, a presente invenção será descrita com referência aos Exemplos Experimentais, Exemplos, etc. Entretanto, a presente invenção não está limitada por essas modalidades específicas.

(1) Isolamento de linhagem com alto teor de RebC (geração MO) [0069] Aproximadamente 2.000 (baseado no peso) de sementes de estévia tipo selvagem (cultivar comercial da Tailândia; introduzidos em agosto de 2014) foram divididos em 3 grupos, cada um dos quais foi geneticamente modificado por tratamento com 0,1%, 0,2% ou 0,3% de metanossulfonato de etileno (EMS).

[0070] As sementes assim tratadas com EMS e sementes não tratadas foram semeadas em uma estufa para plantas no centro de pesquisa Suntory para obter geração de mudas tratadas com EMS (geração M0) e mudas não tratadas. Não foi observada nenhuma diferença na taxa de germinação dentre as concentrações de tratamento.

[0071] Uma quantidade apropriada de folhas frescas foi amostrada a partir da geração de indivíduos tratados com EMS (geração M0) e não tratados, e a concentração de cada glicosídeo de esteviol foi quantificada por LC/MS-MS (Shimadzu LCMS8050). Especificamente, 0,25 g de folhas

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22/31 frescas foi seca por liofilização, e 0,05 g de substância seca homogeneizada do mesmo foi adicionado em água pura. Extração por tratamento ultrassônico por 20 minutos, e centrifugação e filtração foram realizadas para obter 0,33 mL de um extrato líquido. Em decorrência de análise desse extrato líquido por LC/MS-MS em um modo de ion LCMS8050 (Shimadzu LCMS8050), resultados da análise dados a seguir foram obtidos. Os resultados da análise são mostrados nas tabelas a seguir (Tabelas 1-1 e 1-2). Nas tabelas, o número seguinte à EM representa uma concentração do tratamento (isto é, EM1 = tratamento 0,1%).

[0072] Em decorrência da classificação de cada planta, uma pluralidade de linhagens contendo RebC (linhagens com alto teor de RebC) foram obtidas nas quais a concentração de rebaudiosídeo C (RebC) em uma folha seca foi 5,68 a 9,96% em peso, e a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total foi 40% ou mais. A quantidade de RebA produzida foi diminuída em comum nessas linhagens com alto teor de RebC (“STV” nas tabelas representa esteviosídeo).

[Concentração em peso em folha seca] [Tabela 1-1] o Linhagem com alto teor de RebC

	Concentração em folha seca (%)
No. de linhagem	RebA	RebC	Esteviosídeo	RebF	Total
EM2-14	2,69	7,83	2,11	1.32	13,99
EM2-11	2,06	5,68	1,70	1,00	10,47
EM2-16	4,98	8,66	2,10	1,57	17,35
EM2-4	9,29	9,96	1,73	1,81	22,95

o Linhagem não tratada

	Concentração em folha seca (%)
No. de linhagem	RebA	RebC	Esteviosídeo	Reb F	Total
EMO-12	10,37	1,17	8,29	0,38	20,4
EMO-2	13,79	1,26	5,07	0,38	20,78
EM0-3	8,39	1,08	9,01	0,28	19,0

[Razão para teor de glicosídeo de esteviol total] [Tabela 1-2]

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23/31 o Linhagem com alto teor de RebC

	Razão para quantidade de glicosídeo de esteviol total (%)
No. de linhagem	RebA	RebC	Esteviosídeo	RebF
EM2-14	19,2	56,0	15,1	9,47
EM2-11	19,7	54,3	16,2	9,55
EM2-16	28,7	49,9	12,1	9,06
EM3-4	40,5	43,4	7,5	7,90

o Linhagem não tratada

	Razão para quantidade de glicosídeo de esteviol total (%)
No. de linhagem	RebA	RebC	Esteviosídeo	RebF
EMO-12	51,0	5,75	40,7	1,9
EMO-2	66,39	6,05	24,38	1,85
EM0-3	44,3	5,68	47,5	1.5

(2) Isolamento de indivíduo de linhagem com alto teor de RebC (geração Ml) [0073] As primeiras sementes de geração tratadas (geração Ml) foram produzidas pela autofecundação de todos os indivíduos da geração MO. Um total de 115 populações foi preparado a partir dos 3 tipos indivíduos de geração tratada com EMS.

[0074] As sementes da geração Ml foram semeadas em uma estufa para plantas no centro de pesquisa Suntory para obter mudas da geração ML Uma quantidade apropriada de folhas frescas foi amostrada a partir dos indivíduos da geração Ml, e a concentração de cada glicosídeo de esteviol foi quantificada por LC/MS-MS (Shimadzu LCMS8050).

[0075] Especificamente, 0,25 g de folhas frescas foi seca por liofilização, e 0,05 g de substância seca homogeneizada das mesmas foi adicionado em água pura. Extração por tratamento ultrassônico por 20 minutos, e centrifugação e filtração foram realizadas para obter 0,33 mL de um extrato líquido. Em decorrência de análise desse extrato líquido por LC/MS-MS em um modo de ion LCMS8050 (Shimadzu LCMS8050), resultados da análise dados a seguir foram obtidos (Tabelas 2-1 e 2-2).

[0076] Nas tabelas, o número em seguida à EM representa uma concentração do tratamento (isto é, EM1 = tratamento 0,1%).

[0077] Uma pluralidade de indivíduos com alto teor de RebC foi selecionada com base nos resultados da análise.

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24/31

Linhagem com alto teor de RebC [Concentração em peso em folha seca] [Tabela 2-1]

Concentração em folha seca (%)

^: No. de linhagem	RebA	RebG	STV <4:: x*‘ ^:	RebF	Total TSG
ΈΜ3-45-1	0,75	14.40	0X0	3.25	18.62
	Í33	132	0.71	03?	324
XM2-15-33	0.27	124	0.46	0.22	2.19
XM2 Ί5 55	0.68	191	0.51	0.35	3 45
	0.37 ;	1.13	>31	0.24	2.04
ÍEM2-Í5-35	.........aã 1	.....,.JÍ3	0.31	0.16	1.68
ΈΜ3-16-24	2.11	6.26	2..31.	106	1175
	õiõ	166	0.51	0.34	; 3.il.
ΪΜ2Η5-6	ί.7Ή	.............JJl...	0.59	0.36	3.61
ΈΜ2- 15-37	......... 0.34J	[........o	0.60	0.26	L..^
X.M2H5-61	0.Ã2	1.28	0.48	0 30	2.48
&2-Í1-87	Õ.51	2.65	iji	0,45	503
ΈΜ2-15-7	>56	132	0.41	0.27	256
ÍEM2-11-14	0.87	3 64	2.44	0.66	7 62
	2.55	6 62	3.70	105	13.95
ÍEM2-14-T8	1.77'	5 56	3.66	0.88	1178,
	2.84	6 9?	4.23	L2I	' 15,27
ÍEM2-U-48	oi	14.75	1042	2.15	.:.......i.ii
	5.95 ^:	863	3X9	196	19.90
ΈΜ2-3-1	7.28	8.84	3.30	184	2135
DM2-19-12	9.51	13.87	8.37	2.71	MSÉ
EM2HO-2	06	5.43	. 2Í2	12?	' 14.90

[Razão para teor de glicosídeo de esteviol total] [Tabela 2-2]

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Razão para teor de TSG (%)

1 No. de [ linhagem LT
ÍEM3“451	í 4.00 1
ÍSmí-47	1 H126 I
ÍM;MS~33	1 12.501
1EM2H5-55	19.58 1
02-15-46	13.07 I
02 15-35	B 17.12 1
03-16-24	17.94 1
:EM2-15-41	19.40 \|
02-15-0	II 20.57 1
EM2-Í5-37	Ϊ Í3.ÍIJ
Iemhmi	M j-6.35 \|

1-87

ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΛΧ^ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧΧ'ΛΧΧΧΧΧΧΧΧ'ί

RebG

STV

RebF

Total

...../1.09 [jol

I 2053

46

10.19

100.00 ιοο,αο 10Ü.00

J5

JS âl lí

J1

Í3

14.82

14.95

18.14

I 19.67

I; 1648 I 16.19 IjIÍb.

iolí lüí 11 32.05

26.50

30.26

7.55

7.43 Ül

6.63

9.87

10.05

1Ϊ 62

.....9,73

9.01

10.79

10.04 wX

7.86

Wffi

10000

100.00 iõo.oó ΐόό.00

100.00 ϊοο'Βο' iõSo

100.00

100.00 100.00

1¾¾

W0.0Q ioç®, wSjo ιοαοο

Linhagem com baixo teor de RebC ou com concentração de RebC normal [Concentração em peso em folha seca] [Tabela 3-1]

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	Concentração em folha seca (%)
No. de linhagem	RebA	RebC		FtebF	Total 1ΙΜ/Γ-·
	000	0 30 i to 14	0 80	Oil 15.14
.ΕΜ2-0-92	000	000 i 463	000	83
EM2-4-4	000	800 i 15.91	000	15 92
EM2-4-Í?	002	3.00	17,48	0,00	17 50
EM2-4-48	002	000	1547	000	1549
EM2-8-93	0.00	0.00	4.58	0.08	467
.KL.L....	.ML	ML.			3QL
	ò.QÍ.	ML	1W(L	0.00	1LLL
.....	..........lm..	0.13	4.43	...........0.04	...............6 34
		8,08	1-25	0.02	............lâL
EM2-H--7	080	0.39	to.2i	084	till 13.47
	...........SX...	0.43	.........nos.	...........m.	....... MIL
IEML3-5	1-6L	JM	1.6?	0.05	«L
tete-to	3,08	020	1,00	0 06	587
MX3-53.,	L1L	0.11	040	005	3 13.
EM2Í4-7 ..	2. to	012	868	005	3,38
EM2- 14.-43 EM 1-23 50 BMM.to.?		307	0,18	083	..........LP.L	4 63
	...........L-L..,	086	045	0.83	1.65
	.LM...	.......o,w	.........0.44	_______OLL,	ML
.EMi-23-38 EM 1-23-15		224..	0,14	.Q1L,	___________L05.	..................3LL.
	..........3.07	o. to	..........0T2	ow	4.56
EM?--1-15 EMi-23-31		...........nt	...........0.23.	............L.M.	0.18	..............L3?..._;
	............LL	QM	...........0.81	...........OLL.	.............3LL
EM1 -23-50	1.87	0.14	1.04	0,06	2 58
EM2- 32 -5	1,61	0.Í3	2. to	0.07	551
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27/31 [Razão para teor de glicosídeo de esteviol] [Tabela 3-2]

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28/31 (3) Isolamento de indivíduo de linhagem com alto teor de RebC (geração M2) [0078] Concentrações de RebO e RebN foram quantificadas adicionalmente com relação às linhagens com alto teor de RebC. As condições de quantificação foram as mesmas das anteriores. Uma vez que RebC, RebO, e RebN intramolecularmente têm um resíduo de ramnose em comum, hipotetizou-se que as mesmas enzima envolvidas em transglicosilação influenciaria suas razões de teor. O teste foi realizado sob o conceito de que essa hipótese pode ser suportada quando as respectivas concentrações de componentes são em uma relação proporcional.

[Concentração em peso em folha seca] [Tabela 4-1]

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29/31 [Tabela 4-2]

(4) Polimorfismo genético de planta com alto teor de RebC (5) Detenção de polimorfismo genético exclusivo para planta com alto teor de RebC [0079] DNA genômico foi extraído de uma folha de estévia desejado para ser examinada com relação à presença ou ausência do polimorfismo genético da presente invenção. PCR foi realizada com o DNA genômico extraído como um molde. A solução da reação PCR foi preparada usando Blend Taq (Toyobo Co., Ltd.) de acordo com a instrução de Blend Taq. A amplificação por PCR de um fragmento de DNA foi realizada usando 5’TGGTCACCCTCTAATCATGCTACCG-3’ (SEQ ID NO: 3) como um oligonucleotídeo iniciador Fw e 5’TTAACTCTCATGATCGATGGCAACCGCACGCGCATTCTTTTCCAAC3’ (SEQ ID NO: 4) como um oligonucleotídeo iniciador Rv. As condições de PCR envolveram 35 repetições de reação de 3 etapas de 95°C por 2 minutos, 55°C por 30 segundos, e 72°C por 30 segundos. O fragmento de DNA amplificado por PCR foi clivado com uma enzima de restrição (Spel; Toyobo Co., Ltd.). Uma solução da reação enzimática contendo 12 μΕ da solução da

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30/31 reação após a PCR, 2 μΕ de tampão Η, 1 μΕ de Spel, e 5 μΕ de água pura foi preparada. A solução da reação enzimática foi deixada descansar a 37°C por 16 horas para realizar reação enzimática. A solução da reação enzimática digerida com a enzima de restrição foi aplicada a LabChip GX Touch HT (PerkinElmer Inc.). Uma quantidade traços da solução da reação enzimática foi submetida a eletroforese em DNA 5k/RNA CZE LabChip, e o teor de DNA na fase móvel foi detectado por URV. Um padrão pseudo eletroforético foi preparado para detectar marcadores.

[0080] Em decorrência da detenção descrita anteriormente, uma banda superior à do tipo selvagem foi detectada usando fragmento #8 (1412, A > T) em indivíduos com concentração de RebC muito alta (EM3-45-1, EM3-16-24, EM2-14-11, EM2-14-18, e EM2-14-30). Por outro lado, uma banda do mesmo tamanho ou um tamanho comparável àquela do tipo selvagem foi detectada homozigotamente ou heterozigotamente em indivíduos com o mesmo nível de concentração de RebC ou um pouco maior (EM2-14, EM2-11, EM2-16, EM2-14-38, EM3-19-16, EM2-14-27, EM2-2-7, EM2-32-6, EMI-11, EM2-4-4, e EM2-4-13) comparado com o tipo selvagem. [0081] O polinucleotídeo de cada banda foi analisado quanto a sua sequência de nucleotídeos. A sequência de nucleotídeos (heterozigotos) da banda para EM3-16-24, EM2-14-11, EM2-14-18, e EM2-14-30 é mostrada na SEQ ID NO: 5. A sequência de nucleotídeos (homozigotos) da banda para EM-3-45-1 é mostrada na SEQ ID NO: 6. A sequência de nucleotídeos da banda para EM2-14-38, EMI-11, e EM2-2-4 é mostrada na SEQ ID NO: 7 (homozigotos).

Todos os estoques tendo um fenótipo de alto teor de RebC tiveram a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 em comum. Esta sequência teve um polimorfismo no qual a 60° base contada a partir da extremidade 5’ da sequência tipo selvagem correspondente (SEQ ID NO: 2) variou de A T. Em decorrência de analisar estatisticamente adicionalmente a correlação do

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31/31 fenótipo de alta concentração de RebC com o polimorfismo da SEQ ID NO: 1, observou-se que esse polimorfismo tem correlação estatística com o fenótipo de alta concentração de RebC. Especificamente, pode-se prever que uma razão de segregação em progênie de uma linhagem com alto teor de RebC (heterozigoto A/T) x uma linhagem com baixo teor de RebC (homozigoto selvagem A/A) é alto teor de RebCbaixo teor de RebC = 1:1 com base na hipótese nula. Os valores de observação de fenótipo de RebC de 22 indivíduos de progênie obtidos pelo cruzamento teste foram alto teor:baixo teor = 7:15. Portanto, o valor esperado foi alto teor:baixo teor = 11:11. Em decorrência de conduzir boa qualidade de teste de ajuste nos resultados da análise de segregação, χ2 foi 2,91, e a região de rejeição a df = 1 e oc = 0,05 foi 3,84. Portanto, não houve nenhuma diferença estatisticamente significante entre o valor de observação (razão de segregação real) e o valor esperado, demonstrando que ambos foram ajustados.

[0082] Especificamente, em decorrência do cruzamento de teste, os resultados de teste de marcador e do fenótipo estão em uma relação constante em virtude da razão de segregação 1:1 de alto teor de RebCbaixo teor de RebC, revelando que um genótipo de RebC pode ser definido por esse SNP. [0083] Esses resultados revelaram que um indivíduo com alta concentração de RebC é detectável no nível do genoma por uso desse procedimento na presença ou ausência do polimorfismo genético da presente invenção.

Aplicabilidade Industrial [0084] A presente invenção permite a provisão mais eficiente de rebaudiosídeo C e pode, portanto, prover um medicamento, um flavorizante ou um alimento ou bebida, etc. compreendendo uma quantidade suficiente de rebaudiosídeo C e por meio disso oferecendo sabor residual de melhor doçura atribuída a estévia.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Planta estévia não geneticamente modificada com alto teor de rebaudiosídeo C, caracterizada pelo fato de que compreende rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, em que a razão do teor de rebaudiosídeo C para o teor de glicosídeo de esteviol total é 40% ou mais.
2. Planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem um teor de rebaudiosídeo C de 7% em peso ou mais em uma folha seca.
3. Planta de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que um polimorfismo mostrado na SEQ ID NO: 1 no genoma.
4. Semente, caracterizado pelo fato de que é da planta como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Folha seca, caracterizada pelo fato de que é da planta como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
6. Cultura de tecido ou célula de planta cultivada, caracterizada pelo fato de que é da planta como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
7. Cultura de tecido ou da célula de planta cultivada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é um embrião, uma célula de meristema, um pólen, uma folha, uma raiz, um ápice de raiz, uma pétala, um protoplasto, uma seção da folha e um calo.
8. Método para produzir uma planta estévia com alto teor de rebaudiosídeo C compreendendo rebaudiosídeo C a um teor maior em 20% ou mais comparado com a espécie de estévia tipo selvagem, o método caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de cruzar uma planta estévia como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 com uma segunda planta estévia.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo

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2/2 fato de que a segunda planta é a planta estévia como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
10. Extrato, caracterizado pelo fato de que é da planta como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, da semente como definido na reivindicação 4 ou da folha seca como definido na reivindicação 5.
11. Medicamento, flavorizante ou alimento ou bebida, caracterizados pelo fato de que compreendem o extrato como definido na reivindicação 10.
12. Método para produzir um extrato contendo rebaudiosídeo C, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de obter um extrato de planta como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, a semente de como definido na reivindicação 4 ou a folha seca como definido na reivindicação 5.
13. Método para produzir rebaudiosídeo C, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de purificar rebaudiosídeo C do extrato contendo rebaudiosídeo C como definido na reivindicação 12.
14. Método para produzir um medicamento, um flavorizante ou um alimento ou bebida, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de misturar um extrato obtido pelo método como definido na reivindicação 12 e/ou rebaudiosídeo C obtido pelo método como definido na reivindicação 13 com outro(s) componente(s).
15. Método para classificar uma planta estévia com alto teor de rebaudiosídeo C, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de identificar um polimorfismo mostrado na SEQ ID NO: 1 no genoma de uma planta de teste.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de medir um teor de rebaudiosídeo C em um tecido de folha.