CN115516106A - 富含甜菊醇糖苷的甜菊植物及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有以下遗传性状(1)及(2)的富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体、其制作方法、筛选方法等。(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性。(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。

Description

富含甜菊醇糖苷的甜菊植物及其筛选方法
技术领域
本发明涉及甜菊醇糖苷的含量高的甜菊植物及其筛选方法等。
背景技术
为了应对多样化的消费者需求，各种各样的饮料被开发销售。蔗糖等糖类是因提供甜味等目的而极普遍地调配至饮料中的成分，然而指出其因过度摄取而对健康造成影响，对于更低热量，且来自于天然的甜味剂的需求逐渐提高。例如专利文献1中公开有含有维生素、高甜度甜味剂及甜味改善组合物的功能性甜味剂组合物。
甜菊醇糖苷作为甜菊萃取物中所含的甜味成分被熟知。甜菊萃取物主要从甜菊的干燥叶中萃取、提纯而得。甜菊为以南美巴拉圭为原产地的菊科多年生植物，学名称作Stevia Rebaudiana Bertoni。由于甜菊含有具有砂糖的约300倍以上的甜味的成分，因此为了萃取该甜味成分作为天然甜味剂使用而被栽培。作为甜菊醇糖苷，报告有瑞鲍迪苷A(Rebaudioside A，以下有时将“瑞鲍迪苷”(Rebaudioside)简称为“Reb”)、RebB、RebC、RebD、RebE、RebM等各种各样的糖苷的存在(专利文献2)。在各种各样的甜菊醇糖苷中，例如RebA被评价为具有高甜度和优质甜味的甜味剂而被广泛使用。关于其他的甜菊醇糖苷，也不断地明确其特有的甜味及附带的味道。
在这样的情况下，已知甜味成分含量高的甜菊植物体的筛选方法(专利文献3)。
专利文献
专利文献1：国际WO2007/070224
专利文献2：国际WO2010/038911
专利文献3：国际WO2020/027155
发明内容
追求甜菊醇糖苷的含量高的甜菊植物。
本发明在一个侧面，提供以下发明。
[1]一种方法，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含从被检甜菊植物体的基因组中，检测存在及/或不存在以下遗传性状(1)和存在及/或不存在以下遗传性状(2)的工序，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
[2]根据[1]所述的方法，其特征在于，进一步包含对检测遗传性状的存在及/或不存在后的被检甜菊植物组织的甜菊醇糖苷的含量进行测定的工序。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其特征在于，富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的甜菊醇糖苷含量比通过包含检测存在及/或不存在遗传性状(2)的工序，但不包含检测存在及/或不存在遗传性状(1)的工序的筛选方法选择的甜菊植物体的甜菊醇糖苷含量高3％以上。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其特征在于，检测存在及/或不存在遗传性状的工序使用dCAPS法或TaqMan PCR法实施。
[5]一种筛选试剂盒，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的筛选试剂盒，其特征在于，包含用于检测存在及/或不存在以下遗传性状(1)的试剂，和用于检测存在及/或不存在以下遗传性状(2)的试剂，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
[6]根据[5]所述的试剂盒，其特征在于，试剂包含CAPS法、dCAPS法或TaqMan PCR法中使用的引物及/或探针。
[7]一种富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体，其特征在于，具有以下遗传性状(1)及(2)，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
[8]根据[7]所述的植物体，其特征在于，为非转基因植物体。
[9]根据[7]或[8]所述的植物体，其特征在于，包含经变异诱发处理的甜菊植物体及其后代植物体。
[10]一种种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞，其特征在于，为[7]～[9]中任一项所述的植物体的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞。
[11]根据[10]所述的组织、组织培养物或细胞，其特征在于，选自胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织。
[12]一种方法，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的制作方法，其特征在于，包含使[7]～[9]中任一项所述的甜菊植物体与第2甜菊植物体杂交的工序。
[13]根据[12]所述的方法，其特征在于，第2植物体为[7]～[9]中任一项所述的甜菊植物体。
[14]一种方法，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的制作方法，其特征在于，包含向甜菊植物体的基因组中以所述基因组具有以下遗传性状(1)及(2)的方式加入改变的工序，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
[15]根据[14]所述的方法，其特征在于，基因组的改变通过变异诱发处理来实施。
[16]一种萃取物，其为[7]～[9]中任一项所述的植物体、[10]或[11]所述的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞的萃取物，其特征在于，含有甜菊醇糖苷。
[17]一种含有甜菊醇糖苷的萃取物的制造方法，其特征在于，包含从[7]～[9]中任一项所述的植物体、[10]或[11]所述的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞中获得萃取物的工序。
[18]一种甜菊醇糖苷的制造方法，其特征在于，包含从[16]所述的萃取物中提纯甜菊醇糖苷的工序。
[19]一种饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品的制造方法，其特征在于，包含提供[7]～[9]中任一项所述的植物体的萃取物、[10]或[11]所述的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞的萃取物，或者[16]所述的萃取物的工序，及，
将所述萃取物添加至饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品的原料中的工序。
根据本发明，可获得含有更多甜菊醇糖苷的甜菊植物体，可提供制作这样的植物体的方法，从这样的植物体中获得的叶，及含有从这样的叶中获得的甜菊醇糖苷的食物或饮料等。
附图说明
图1为表示序列号1的碱基序列中的遗传性状(1)涉及的碱基的位置的图。被框围起来的碱基为遗传性状(1)涉及的碱基。
图2为表示序列号2的碱基序列中的遗传性状(2)涉及的碱基的位置的图。被框围起来的碱基为遗传性状(2)涉及的碱基。
图3为表示集团A中具有各种遗传性状的个体群的干燥叶中的TSG含量的平均值(％)的图表。“All”表示集团A的所有个体，“(2)”表示具有遗传性状(2)的个体，“(1)+(2)”表示具有本发明的遗传性状的个体，“Not(1)+(2)”表示不具有本发明的遗传性状的个体。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。以下实施方式为用于说明本发明的例示，本发明并不仅限定于这些实施方式。只要不脱离该主旨，本发明可通过各种方式来实施。
另外，本说明书中引用的所有文献及公开公报、专利公报以及其他专利文献，作为参考纳入本说明书。此外，本说明书包含2020年5月12日提出申请的作为本申请优先权主张的基础的日本专利申请(日本特愿2020-084133号)的说明书及附图中所述内容。
1.富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体
本发明在1个侧面，提供一种富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体(以下，有时称作“本发明的植物体”)，其特征在于，具有以下遗传性状(1)及(2)，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
本发明的植物体为由野生种的甜菊植物体派生的种，为获得甜菊醇糖苷含量提高的上述遗传性状(1)及(2)的种(以下，有时将上述遗传性状(1)及(2)统称“本发明的遗传性状”)。
所谓“与～相当的位置”，当在基因组中存在与标准序列(例如，序列号1等)相同的序列时，指在基因组中存在的该序列中的位置(例如，290位、40位等)，当在基因组中不存在与标准序列相同的序列时，指基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置相当的位置。在基因组中是否存在与标准序列相同或与其相当的序列，例如可通过以下方法决定：通过可用PCR对标准序列进行扩增的引物对作为对象的甜菊植物的基因组DNA进行扩增，并实施扩增产物的测序，实施所得序列和标准序列的比对分析。作为与标准序列相当的序列的非限定例，例如可列举相对于标准序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列一致性的碱基序列。基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置相当的位置，可以考虑标准序列中的位置的前后的碱基序列等而决定。例如，可通过对标准序列和基因组中的与标准序列相当的序列的比对分析，决定基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置相当的位置。
例如，以本发明的遗传性状(1)的“与序列号1的290位相当的位置”为例，当甜菊植物体的基因组具有由与序列号1相同的碱基序列构成的部分时，“与序列号1的290位相当的位置”为自基因组中的由与序列号1相同的碱基序列构成的部分的5’侧开始的290位。另一方面，当甜菊植物体的基因组具有由与序列号1不同但是与其相当的碱基序列构成的部分时，由于基因组不具有由与序列号1相同的碱基序列构成的部分，因此“与序列号1的290位相当的位置”并非一定符合自与序列号1相当的部分的5’侧开始的290位，而可考虑序列号1的290位的前后的碱基序列等，来确定涉及的甜菊植物的基因组中的“与序列号1的290位相当的位置”。例如，通过甜菊植物的基因组中的与序列号1相当的部分的碱基序列和序列号1的碱基序列的比对分析，可确定甜菊植物的基因组中的“与序列号1的290位相当的位置”。
“由与序列号1相当的碱基序列构成的部分”，是指例如，由相对于序列号1的碱基序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列一致性的碱基序列构成的部分。
在一部分方式中，在“由与序列号1相当的碱基序列构成的部分”中包含可通过使用以下引物的PCR进行扩增的甜菊植物体的基因组的部分：与从序列号1的5’末端开始1～289位(即，从序列号1的5’末端至遗传性状(1)涉及的位置的290位的1碱基5’末端侧的碱基为止)的部分的互补序列杂交的正向引物(例如，具有序列号3的序列的引物)和与从序列号1的3’末端侧开始1～36位(即，从序列号1的3’末端至遗传性状(1)涉及的位置的290位的1碱基3’末端侧的碱基为止)的部分杂交的反向引物(例如，具有序列号4的序列的引物)。
在一部分方式中，在“由与序列号2相当的碱基序列构成的部分”中包含可通过使用以下引物的PCR进行扩增的甜菊植物体的基因组的部分：与从序列号2的5’末端开始1～39位(即，从序列号2的5’末端至遗传性状(2)涉及的位置的40位的1碱基5’末端侧的碱基为止)的部分的互补序列杂交的正向引物(例如，具有序列号5的序列的引物)和与从序列号2的3’末端侧开始1～105位(即，从序列号2的3’末端至遗传性状(2)涉及的位置的40位的1碱基3’末端侧的碱基为止)的部分杂交的反向引物(例如，具有序列号6的序列的引物)。
特定的方式中，“由与序列号1相当的碱基序列构成的部分”例如，包含可通过使用以下引物的PCR进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：含有序列号3的碱基序列的正向引物，与含有序列号4的碱基序列的反向引物。
特定的方式中，“由与序列号2相当的碱基序列构成的部分”例如，包含可通过使用以下引物的PCR进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：含有序列号5的碱基序列的正向引物，与含有序列号6的碱基序列的反向引物。
特定的方式中，“与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因”(以下，有时称作“遗传性状(1)涉及的等位基因”)包含序列号1、7、8或9的碱基序列。
特定的方式中，“与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因”(以下，有时称作“遗传性状(2)涉及的等位基因”)包含序列号2、10、11或12的碱基序列。
此处，有时将(1)与序列号1的290位相当的位置及(2)与序列号2的40位相当的位置，统称“本发明的多态部位”或“本发明的遗传性状涉及的部位”。
所述遗传性状可通过以下方法进行检测：PCR法、TaqMan PCR法、测序法、微阵列法、Invader法、TILLING法、RAD(random amplified polymorphic DNA)法、限制酶片段长度多态性(RFLP)法、PCR-SSCP法、AFLP(amplified fragment length polymorphism)法、SSLP(simple sequence length polymorphism)法、CAPS(cleaved amplified polymorphicsequence)法、dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequence)法、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)法、ARMS法、变性梯度凝胶电泳(DGGE)法、CCM(chemical cleavageof mismatch)法、DOL法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、锁式探针法、分子信标法、DASH(dynamicallele specific hybridization)法、UCAN法、ECA法、PINPOINT法、PROBE(primer oligobase extension)法、VSET(very short extension)法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、GOOD法、LCx法、SNaPshot法、Mass ARRAY法、Pyrosequences法、SNP-IT法、熔解曲线分析法等，但检测方法并不限定于这些。基因变异的检测方法的细节如后所述。
在特定方式中，本发明的遗传性状可通过基于以下引物集及限制酶的组合的dCAPS法来检测。
候选植物体具有遗传性状(1)时，例如，对候选植物体的基因组DNA，使用具有序列号21所示的碱基序列的正向引物及具有序列号22所示的碱基序列的反向引物进行PCR扩增，通过限制酶RsaI对所得PCR产物(约326bp长，例如，序列号30)实施处理时，获得约290bp长的条带(例如，序列号31)和约36bp长的条带(例如，序列号32)。另一方面，候选植物体不具有遗传性状(1)时，与上述同样地实施PCR扩增时，生成约326bp长的PCR产物(例如，序列号33或序列号30及33)，但即使实施限制酶处理，也仅可确认未切断的约326bp长的PCR产物(例如，序列号33)的条带。
候选植物体具有遗传性状(2)时，例如，对候选植物体的基因组DNA，使用具有序列号25所示的碱基序列的正向引物及具有序列号28所示的碱基序列的反向引物进行PCR扩增，通过限制酶RsaI对所得PCR产物(约367bp长，例如，序列号34或序列号34及35)实施处理时，获得约46bp长的条带(例如，序列号36)和约320bp长的条带(例如，序列号37)。另一方面，候选植物体不具有遗传性状(2)时，与上述同样地实施PCR扩增时，生成约367bp长的PCR产物(例如，序列号35)，但即使实施限制酶处理，也仅可确认未切断的约367bp长的PCR产物(例如，序列号35)的条带。
本发明的甜菊植物体为由野生种的甜菊植物体派生的种，获得了甜菊醇糖苷含量提高的上述遗传性状。该遗传性状可由转基因的方法产生，也可由非转基因的方法产生。从而，本发明的植物体可为通过转基因的方法而得的植物体或其后代(以下，有时称作“转基因植物体”)，也可为通过非转基因的方法而得的植物体或其后代(以下，有时称作“非转基因植物体”)。
本说明书中，作为“非转基因的方法”的示例，可列举不导入外来基因而诱导宿主细胞(或宿主植物体)的基因变异的方法。作为那样的方法可列举使植物细胞的诱变剂产生作用的方法。作为那样的诱变剂，可列举甲磺酸乙酯(EMS)及叠氮化钠等。例如，EMS可以0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等浓度对植物细胞进行处理。处理时间为约1～约48小时、约2～约36小时、约3～约30小时、约4～约28小时、约5～约26小时、约6～约24小时。处理流程自身为公知的，可通过使经过吸水过程的吸水种子在以上述浓度含有诱变剂的处理液中浸渍上述处理时间来实施。
作为非转基因的方法的其他示例，可列举使X射线、γ射线、紫外线等放射线或光线照射植物细胞的方法。照射紫外线时，将用适当的紫外线的照射量(紫外线灯强度、距离、时间)进行照射后的细胞以选择培养基等培养后，可选择具有目标性状的细胞、愈伤组织、植物体。此时的照射强度为0.01～100Gr、0.03～75Gr、0.05～50Gr、0.07～25Gr、0.09～20Gr、0.1～15Gr、0.1～10Gr、0.5～10Gr、1～10Gr，照射距离为1cm～200m、5cm～100m、7cm～75m、9cm～50m、10cm～30m、10cm～20m、10cm～10m，照射时间为1分钟～2年、2分钟～1年、3分钟～0.5年、4分钟～1个月、5分钟～2周、10分钟～1周。照射的强度、距离及时间根据放射线或光线的种类或作为照射对象的状态(细胞、愈伤组织、植物体)而不同，只要为本领域技术人员则可进行适当调整。
此外，细胞融合、花药培养(单倍体培养)、远系杂交(单倍体培养)等方法也是公知的。
一般而言，植物细胞由于有时在培养期间伴随变异，因此为了维持更稳定的性状优选恢复为植物个体。
以非转基因甜菊植物体为宿主，事后进行转基因(例如通过基因组编辑等)而得的植物体(例如，以本发明的植物体为宿主实施转基因，进一步附加了其他性状的植物体)也不从本发明的范围中排除。
本发明的植物体为富含甜菊醇糖苷型。所谓富含甜菊醇糖苷的甜菊植物是指，与不具有本发明的遗传性状的甜菊植物相比，甜菊醇糖苷的含量高。所谓甜菊醇糖苷的含量高，是指例如，本发明的甜菊植物体的集团中的甜菊醇糖苷含量的平均值或中央值，与不具有本发明的遗传性状的甜菊植物体的集团中的甜菊醇糖苷的含量的平均值或中央值相比较高，及/或与具有遗传性状(2)的甜菊植物体的集团中的甜菊醇糖苷含量的平均值或中央值相比较高。
在一部分方式中，本发明的植物体的集团中的甜菊醇糖苷的含量的平均值，比不具有本发明的遗传性状的甜菊植物体的集团中的甜菊醇糖苷的含量的平均值高约10％以上、约11％以上、约12％以上、约13％以上、约14％以上、约15％以上、约16％以上、约17％以上、约18％以上、约19％以上、约20％以上、约21％以上、约22％以上、约23％以上、约24％以上、约25％以上、约26％以上、约27％以上、约28％以上、约29％以上、约30％以上、约31％以上、约32％以上、约33％以上、约34％以上、约35％以上、约36％以上、约37％以上、约38％以上、约39％以上、约40％以上、约41％以上、约42％以上、约43％以上、约43.5％以上、约44％以上、约45％以上、约46％以上、约47％以上、约48％以上、约49％以上或约50％以上。
此外，在一部分方式中，本发明的植物体的集团中的甜菊醇糖苷的含量的平均值，比具有遗传性状(2)的甜菊植物体的集团中的甜菊醇糖苷的含量的平均值高约1.0％以上、约1.3％以上、约1.5％以上、约1.8％以上、约2.0％以上、约2.3％以上、约2.5％以上、约2.8％以上、约3.0％以上、约3.3％以上、约3.5％以上、约3.8％以上、约4.0％以上、约4.3％以上、约4.5％以上、约4.8％以上、约5.0％以上、约5.3％以上、约5.5％以上、约5.8％以上、约6.0％以上、约6.3％以上、约6.5％以上、约6.8％以上、约7.0％以上、约7.2％以上、约7.5％以上、约7.8％以上、约8.0％以上、约8.3％以上、约8.5％以上、约8.8％以上、约9.0％以上、约9.3％以上、约9.5％以上、约9.8％以上或约10.0％以上。
甜菊醇糖苷为甜菊醇骨架上结合有葡萄糖、鼠李糖、木糖等糖的化合物的总称，例如，包含RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebG、RebI、RebJ、RebK、RebN、RebM、RebO、RebQ、RebR、杜克苷A、甜叶悬钩子苷、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷等。在一部分方式中，甜菊醇糖苷包含选自RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebI、RebJ、RebK、RebN、RebM、RebO、RebQ、RebR、杜克苷A、甜叶悬钩子苷、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的1种以上的糖苷。在特定的方式中，甜菊醇糖苷包含RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebG、RebM、RebN及甜菊苷，或选自这些甜菊醇糖苷。
总甜菊醇糖苷(Total Steviol Glycoside：TSG)，为可测定的甜菊醇糖苷的总称，不包含未知的甜菊醇糖苷或以低于检测极限的量存在的甜菊醇糖苷。TSG优选为选自RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebG、RebI、RebJ、RebK、RebM、RebN、RebO、RebQ、RebR、杜克苷A、甜叶悬钩子苷、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的2种以上的任意组合。在特定的方式中，TSG由RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebG、RebM、RebN及甜菊苷的组合构成。
甜菊醇糖苷可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应，以萃取液的状态进行萃取。萃取条件等可参考Ohtaet al.,J.Appl.Glycosci.,Vol.57,No.3,199-209(2010)或WO2010/038911中所述的方法、后述实施例中所述的方法。所谓干燥叶，是指通过使新鲜叶干燥而将含水量降低至10重量％以下、7重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下、2重量％以下、1重量％以下的叶。本发明的植物体的干燥叶的含水量优选为3～4重量％。
进一步，相对于如此而得的萃取液，可通过使用乙酸乙酯以及其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、气相色谱法、飞行时间型质量分析(Time-of-Flight Mass spectrometry:TOF-MS)、超高效液相色谱法(Ultra(High)Performance Liquid chromatography:UPLC)等公知的方法来提纯甜菊醇糖苷。
本发明涉及的甜菊醇糖苷含量可通过上述Ohta et al.或WO2010/038911中所述的方法、后述的实施例中所述的方法来测定。具体而言，例如，可从本发明的甜菊植物体中采集新鲜叶作为样本，并通过实施LC/MS-MS等来测定。
本发明的植物体不仅包含植物体整体，还可包含植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵状组织等)或各种形态的植物细胞(例如，悬浊培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。此外，叶可为干燥叶。
此外，本发明的植物体还可包含组织培养物或植物培养细胞。这是因为通过培养这样的组织培养物或植物培养细胞，可再生植物体。作为本发明的植物体的可再生的方式的示例，可列举胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织等，但并不限定于此。
2.本发明的植物体的制作方法
本发明在其他实施方式中，提供一种富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的制作方法(以下，称作“本发明的制作方法”)，其特征在于，包含使本发明的甜菊植物体与第2甜菊植物体杂交的工序。
通过该方法制作的“富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体”，可具有与本发明的植物体相同的表现型和遗传性状。
具体而言，根据本发明的制作方法制作的植物体的表现型，为本发明的植物体的项目中记载的富含甜菊醇糖苷型的表现型。根据本发明的制作方法制作的植物体的遗传性状，具有本发明的遗传性状。关于这些遗传性状的检测方法，如前述及后述所示。
在本发明的制作方法中，所谓“使其杂交”是指通过使本发明的植物体和第2植物体交配获得其子植物体(根据本发明的制作方法制作的植物体)。作为杂交方法，优选回交。所谓“回交”是使在本发明的植物体和第2植物体之间诞生的子植物体进一步与本发明的植物体(即，具有本发明的遗传性状的植物体)杂交，制作具有本发明的遗传性状的植物体的方法。本发明的制作方法中使用的第2植物体与本发明的植物体具有相同的表现型和遗传性状时实质上为回交。杂交优选持续实施二代以上，遗传性状为异型接合性等时，有时通过一代也可获得具有期望的遗传性状的组合的植物体。
或者，本发明的植物体也可通过自体受精进行制作。自体受精可通过使本发明的植物体的雄蕊的花粉向本发明的植物体的雌蕊自花传粉来实施。
根据本发明的制作方法制作的植物体的表现型及遗传性状与本发明的植物体相同，因此通过使根据本发明的制作方法制作的植物体进一步与第3甜菊植物体杂交，也可制作富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体。
作为其他方式，本发明的植物体也可通过对上述组织培养物或植物培养细胞进行培养而再生植物体的方式制作。关于培养条件，与野生型甜菊植物的组织培养物或植物培养细胞的培养条件相同，是公知的(Protocols for In Vitro cultures and secondarymetabolite analysis of aromatic and medicinal plants,Method in molecularbiology,vol.1391,pp113-123)。
进一步作为其他方式，本发明的植物体可通过改变甜菊植物体的基因组，获得本发明的遗传性状来制作。本发明的遗传性状的获得，可通过转基因的方法来实施，也可通过上述非转基因的方法来实施。非转基因的方法，如本发明的植物体的项目中所述，包含基于诱变剂的处理、基于放射线或光线的照射的处理等的变异诱发处理。具体而言，例如，对于具有与序列号1的290位相当的位置的碱基并非T的等位基因(例如，所述位置的碱基为C的等位基因)的个体，通过所述位置上的碱基向T的取代，对于具有与序列号2的40位相当的位置的碱基并非A的等位基因(例如，所述位置的碱基为C的等位基因)的个体，通过所述位置上的碱基向A的取代，获得本发明的遗传性状。
3.本发明的植物体的筛选方法
本发明的植物体及与本发明的植物体具有相同表现型及/或遗传性状的植物体，可通过从该植物体的组织中检测本发明的遗传性状来筛选。此处，所谓“筛选”是指，对本发明的植物体和其以外的植物体进行识别，并选择本发明的植物体。
从而，本发明在其他侧面，提供一种富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的筛选方法(以下，有时称“本发明的筛选方法”)，其特征在于，包含从被检甜菊植物体的基因组中检测存在及/或不存在本发明的遗传性状(1)和存在及/或不存在本发明的遗传性状(2)的工序。
本发明的筛选方法也可进一步包含将检测出存在上述的至少1个的遗传性状的植物体从被检植物中选出的工序。
本发明的遗传性状的存在，例如，可通过检测出以下结果来确定：
·仅存在与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因(例如，包含序列号1、7、8或9的碱基序列的等位基因)，
·存在与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因(例如，包含序列号2、10、11或12的碱基序列的等位基因)，及/或，
·不存在与序列号1的290位相当的位置的碱基为C的等位基因(例如，包含序列号13、14、15或16的碱基序列的等位基因)。
本发明的遗传性状的不存在，例如，可通过检测出以下结果来确定：
检测出不存在选自以下的等位基因，
·与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因(例如，包含序列号1、7、8或9的碱基序列的等位基因)、及，
·与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因(例如，包含序列号2、10、11或12的碱基序列的等位基因)、及/或，
·检测出存在与序列号1的290位相当的位置的碱基为C的等位基因(例如，包含序列号13、14、15或16的碱基序列的等位基因)。
作为本发明的变异的检测方法的具体例，可列举PCR法、TaqMan PCR法、测序法、微阵列法、Invader法、TILLING法、RAD法、RFLP法、PCR-SSCP法、AFLP法、SSLP法、CAPS法、dCAPS法、ASO法、ARMS法、DGGE法、CCM法、DOL法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、锁式探针法、分子信标法、DASH法、UCAN法、ECA法、PINPOINT法、PROBE法、VSET法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、GOOD法、LCx法、SNaPshot法、Mass ARRAY法、Pyrosequences法、SNP-IT法、熔解曲线分析法等，但并不限定于这些。
在PCR法的情况下，优选制作3’末端部分具有与本发明的遗传性状涉及的部位互补的序列的引物。若使用这样设计的引物，当作为模板的样本具有本发明的遗传性状涉及的等位基因时，由于引物完全与模板杂交，发生聚合酶延伸反应，模板不具有本发明的遗传性状涉及的等位基因时，由于引物的3’末端的核苷酸与模板产生不匹配，不发生延伸反应。从而，使用这样的引物实施PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳等对扩增产物进行分析，若能确认一定大小的扩增产物，则作为样本的模板具有本发明的遗传性状涉及的等位基因，扩增产物不存在时，可判断模板不具有本发明的遗传性状涉及的等位基因。
或者，使本发明的遗传性状涉及的部位不和引物序列重复，且设计可使包含本发明的遗传性状涉及的等位基因的核苷酸片段PCR扩增的引物序列，通过对扩增的核苷酸片段的碱基序列测序，可检测本发明的遗传性状。
关于PCR及琼脂糖凝胶电泳，参考以下：Sambrook,Fritsch and Maniatis,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring HarborLaboratory Press。
所谓TaqMan PCR法是利用基于经荧光标记的等位基因特异性寡核苷酸和Taq DNA聚合酶的PCR反应的方法(Livak,K.J.Genet.Anal.14,143(1999)；Morris T.et al.,J.Clin.Microbiol.34,2933(1996))。
所谓测序法是通过PCR使包含遗传性状涉及的部位的区域扩增，使用DyeTerminator等对DNA序列进行测序，分析遗传性状的有无的方法(Sambrook,Fritsch andManiatis,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold SpringHarbor Laboratory Press)。
DNA微阵列为核苷酸探针的一端在支持体上固定为阵列状的物质，包含DNA芯片、基因芯片、微芯片、珠阵列等。通过使用包含与包含本发明的遗传性状的序列互补的序列的探针可详尽地检测本发明的遗传性状的有无。作为DNA芯片等DNA微阵列测定可列举基因芯片测定(Affymetrix公司；参考美国专利第6,045,996号，同第5,925,525号及同第5,858,659号)。基因芯片技术为利用贴附于芯片上的寡核苷酸探针的小型化高密度微阵列的技术。
所谓Invader法为组合：对于SNP等具有或不具有遗传性状的等位基因分别呈特异性的2种Reporter探针及1种Invader探针向模板DNA的杂交，和基于具有识别DNA的结构并切断的特殊的核酸内切酶活性的Cleavase酶的DNA的切断的方法(Livak,K.J.Biomol.Eng.14,143-149(1999)；Morris T.et al.,J.Clin.Microbiol.34,2933(1996)；Lyamichev,V.et al.,Science,260,778-783(1993)等)。
所谓TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)法为通过PCR扩增和CELI核酸酶处理对导入变异的变异体集团的基因组中的变异不匹配进行筛选的方法。
在一种方式中，本发明的遗传性状(1)例如，可通过使用以下引物集与限制酶的dCAPS法进行检测。
·引物集：
一种引物集，其含有：包含从序列号1的289位起，位于5’侧的任意的连续15个碱基以上的序列(例如，序列号21)的正向引物，和包含从选自序列号22～24的序列的3’末端起连续15～36个碱基长的序列的反向引物。
·限制酶：
与基于序列号22的引物集对应的限制酶包含RsaI，与基于序列号23的引物集对应的限制酶包含SnaI，与基于序列号24的引物集对应的限制酶包含AluI。
在一种方式中，本发明的遗传性状(2)例如，可通过使用以下引物集与限制酶的dCAPS法进行检测。
·引物集：
一种引物集，其含有：包含从选自序列号25～27的序列的3’末端起连续15～48个碱基长的序列的正向引物，和包含从序列号29的49位起，位于3’侧的任意的连续15个碱基以上的序列(例如，序列号28)的反向引物。
·限制酶：
与基于序列号25的引物集对应的限制酶包含SpeI或MaeI，与基于序列号26的引物集对应的限制酶包含AflII/MseI，与基于序列号27的引物集对应的限制酶包含BspHI。
引物的序列可在满足上述条件的范围内进行最优化。关于引物设计的最优化，参考例如Sambrook and Russell,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”3rd Edition(2001),Cold Spring Harbor Laboratory Press等。上述各引物可为15～50个碱基长、18～48个碱基长、20～45个碱基长、30～40个碱基长等。与各引物集对应的限制酶，也包含与上述酶识别相同序列，在相同位置切断的其他酶，或上述酶的同裂限制酶。此外，也可基于本发明的遗传性状，设计上述以外的引物集，并选择与其对应的限制酶。
在特定的方式中，本发明的遗传性状例如，可通过使用具有以下序列的引物集与限制酶的dCAPS法进行检测。
[表1]
表1用于检测遗传性状(1)的引物集和限制酶的组合的示例
正向引物 反向引物 限制酶
序列号21 序列号22 RsaI
序列号21 序列号23 SnaI
序列号21 序列号24 AluI
[表2]
表2用于检测遗传性状(2)的引物集和限制酶的组合的示例
正向引物 反向引物 限制酶
序列号25 序列号28 SpeI/MaeI
序列号26 序列号28 AflII/MseI
序列号27 序列号28 BspHI
另外，上述引物集与限制酶的组合仅为一个示例，只要为本领域技术人员，可寻找可检测本发明的遗传性状的其他引物集与限制酶的组合。
本发明的筛选方法也可进一步包含测定检测出本发明的遗传性状的被检甜菊植物的组织(例如叶)的甜菊醇糖苷的含量(例如，TSG的含量)的工序。甜菊醇糖苷含量的测定，如本发明的植物体的项目所述。此外，在该方式中，从检测出本发明的遗传性状的被检甜菊植物体中，选择甜菊醇糖苷的含量高的个体，使其与其他甜菊植物体交配，对于所得子植物体，也可适用本发明的筛选方法。从而，本发明的筛选方法可包含以下1个以上的工序。
(i)从被检甜菊植物的基因组中，检测本发明的遗传性状的工序，
(ii)测定检测出本发明的遗传性状的被检甜菊植物组织的甜菊醇糖苷的含量的工序，
(iii)在检测出本发明的遗传性状的被检甜菊植物体中，选择甜菊醇糖苷的含量高的个体的工序，
(iv)使所选甜菊醇糖苷的含量高的个体与其他甜菊植物体交配的工序，
(v)从通过交配而得的子植物体的基因组中，检测本发明的遗传性状的工序，
(vi)测定检测出本发明的遗传性状的子植物组织的甜菊醇糖苷的含量的工序，
(vii)在检测出本发明的遗传性状的子植物体中，选择甜菊醇糖苷的含量高的个体的工序。
所选择的甜菊醇糖苷的含量高的个体，例如，可为检测出本发明的遗传性状的被检甜菊植物体中，甜菊醇糖苷的含量高达排名前50％为止、排名前40％为止、排名前30％为止、排名前20％为止、排名前10％为止、排名前5％为止、排名前4％为止、排名前3％为止、排名前2％为止或排名前1％为止的个体等。此外，进行交配的其他甜菊植物体，可含也可不含本发明的遗传性状。上述方式中，工序(iv)～(vii)可重复数次。如此，可筛选甜菊醇糖苷的含量更高的甜菊植物体。
在本发明的筛选方法中，被检甜菊植物体可为天然植物体，也可为非转基因植物体。关于非转基因植物体，如本发明的植物体的项目中所述。
在本发明的筛选方法中，被检甜菊植物体也可包含经变异诱发处理的甜菊植物及其后代植物。关于变异诱发处理，如本发明的植物体的项目中所述，包含基于诱变剂的处理、基于放射线或光线的照射的处理等。
此外，本发明提供上述所述的引物集及其组合，例如，上述表1～2所述的引物集及检测上述表1所述的遗传性状(1)的引物集和检测上述表2所述的遗传性状(2)的引物集的组合。本发明进一步提供，可通过PCR对具有选自序列号1、2、13及17中的碱基序列的区域进行扩增的引物集，例如，包含序列号3的碱基序列的正向引物与包含序列号4的碱基序列的反向引物的引物集、包含序列号5的碱基序列的正向引物与包含序列号6的碱基序列的反向引物的引物集。此外，本发明进一步提供，可通过PCR对具有序列号1或13的碱基序列的区域进行扩增的引物集，与可通过PCR对具有序列号2或17的碱基序列的区域进行扩增的引物集的组合，例如，包含序列号3的碱基序列的正向引物及包含序列号4的碱基序列的反向引物的引物集，与包含序列号5的碱基序列的正向引物及包含序列号6的碱基序列的反向引物的引物集的组合。
进一步，本发明提供可检测存在及/或不存在本发明的遗传性状的探针(以下，有时称“本发明的探针”)。本发明的探针可具有适合各种检测存在及/或不存在本发明的遗传性状的方法(例如，TaqMan PCR法等Realtime PCR法)的结构。例如，本发明的探针可包含与包含本发明的遗传性状涉及的部位的基因组的部分具有互补性的碱基序列。作为所述探针的非限定例，可列举包含与选自序列号7～12、14～16、18～20中的碱基序列互补的序列的探针。这些序列中，序列号7～12对于本发明的遗传性状涉及的等位基因呈特异性，序列号14～16、18～20对于并非本发明的遗传性状涉及的等位基因的等位基因呈特异性。此外，序列号7～9对于本发明的遗传性状(1)涉及的等位基因呈特异性，序列号10～12对于本发明的遗传性状(2)涉及的等位基因呈特异性。进一步，序列号14～16对于并非本发明的遗传性状(1)涉及的等位基因的等位基因呈特异性，序列号18～20对于并非本发明的遗传性状(2)涉及的等位基因的等位基因呈特异性。本发明的遗传性状的存在可通过检测出本发明的遗传性状涉及的等位基因及/或未检出并非本发明的遗传性状涉及的等位基因的等位基因来检测，本发明的遗传性状的不存在可通过未检出本发明的遗传性状涉及的等位基因及/或检测出并非本发明的遗传性状涉及的等位基因的等位基因来检测。本发明的探针优选具有标记。作为涉及的标记的非限定例，可列举荧光标记、发光标记、放射性标记、色素、酶、淬灭剂(Quencher)、与可以检测的标记结合的部分等。在特定方式中，本发明的探针具有包含与选自序列号7～12、14～16、18～20中的序列互补的碱基序列的多核苷酸和标记。
本发明还提供包含上述的引物集及与其对应的限制酶的试剂盒。在特定的方式中，本发明的试剂盒包含：包含上述表1～2所述正向引物和反向引物的组合的引物集及与其对应的限制酶。
此外，本发明的试剂盒包含可通过PCR对具有选自序列号1、2、13及17中的碱基序列的区域进行扩增的引物集及与其对应的上述的本发明的探针。
这些引物集、探针及试剂盒可用于检测本发明的遗传性状，用于本发明的筛选方法等。此外，在这些引物集及试剂盒中也可包含：包含与本发明的遗传性状的检测或本发明的筛选方法相关的说明的指示，例如，使用说明书或包含与使用方法相关的信息的网站信息(例如，URL、二维码)，记录有与使用方法相关的信息的媒体，例如软盘、CD、DVD、蓝光光盘、存储卡、USB存储器等。
在一种方式中，本发明提供一种富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的筛选试剂盒，其特征在于，包含用于检测存在及/或不存在遗传性状(1)的试剂，和用于检测存在及/或不存在遗传性状(2)的试剂。试剂可包含CAPS法、dCAPS法或TaqMan PCR法中使用的引物及/或探针。在特定方式中，用于检测存在及/或不存在遗传性状(1)的试剂包含：用于通过dCAPS法检测上述的遗传性状(1)的引物集和限制酶的组合，例如，表1所述的引物集和限制酶的组合，或可在TaqMan PCR法等中使用的对遗传性状(1)涉及的部位(例如，包含选自序列号7～9中的序列的部位)进行扩增的引物集，及与遗传性状(1)涉及的部位互补的探针的组合。在特定方式中，用于检测存在及/或不存在遗传性状(2)的试剂包含：用于通过dCAPS法检测上述的遗传性状(2)的引物集和限制酶的组合，例如表2所述的引物集和限制酶的组合，或可在TaqMan PCR法等中使用的对遗传性状(2)涉及的部位(例如，包含选自序列号10～12中的序列的部位)进行扩增的引物集，及与遗传性状(2)涉及的部位互补的探针的组合。
4.来自植物体的萃取物的制造方法及使用该萃取物的制品
在本发明的进一步的方式中，提供一种含有甜菊醇糖苷(例如，RebD及/或RebM)的萃取物的制造方法(以下，有时称“本发明的萃取物的制造方法”)，其特征在于，包含从本发明的植物体、根据本发明的筛选方法选择的甜菊植物体或根据本发明的制作方法制造的甜菊植物体或该植物体的种子、叶(例如，干燥叶或新鲜叶)、组织、组织培养物或细胞中获得萃取物的工序。
进一步，提供一种含有从本发明的植物体、根据本发明的筛选方法选择的甜菊植物体或根据本发明的制作方法制造的甜菊植物体或该植物体的种子、叶(例如，干燥叶或新鲜叶)、组织、组织培养物或细胞中获得的甜菊醇糖苷(例如，RebD及/或RebM)的萃取物(以下，有时称作“本发明的萃取物”)。本发明的萃取物优选为根据本发明的萃取物的制造方法制造的萃取物。此外，进一步提供一种甜菊醇糖苷的制造方法(以下，有时称作“本发明的甜菊醇糖苷的制造方法”)，其特征在于，包含从本发明的萃取物中提纯甜菊醇糖苷(例如，RebD及/或RebM)的工序。本发明的甜菊醇糖苷的制造方法也可进一步包含从本发明的甜菊植物体、根据本发明的筛选方法选择的甜菊植物体或根据本发明的制作方法制造的甜菊植物体中获得含有甜菊醇糖苷的萃取物的工序。
含有甜菊醇糖苷的萃取物可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应来获得。萃取条件等可参考上述Ohtaet al.或WO2010/038911中所述的方法或后述的实施例中所述的方法。
此外，可通过用乙酸乙酯及其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography:HPLC)、气相色谱法、飞行时间型质量分析(Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS)、超高效液相色谱法(Ultra(High)PerformanceLiquid chromatography:UPLC)等公知的方法对含有甜菊醇糖苷的萃取物进行各甜菊醇糖苷的提纯。甜菊醇糖苷的例子如本发明的植物体的项目中所述。
根据本发明的萃取物的制造方法获得的萃取物(以下，称“本发明的萃取物”)的一种方式，与不具有本发明的遗传性状的甜菊植物体的萃取物相比，以更高含量含有甜菊醇糖苷。
本发明的萃取物与从不具有本发明的遗传性状的甜菊植物体中获得的萃取物相比，也可以5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、15％以上、16％以上、17％以上、18％以上、19％以上、20％以上、21％以上、22％以上、23％以上、24％以上、25％以上、26％以上、27％以上、28％以上、29％以上、30％以上、31％以上、32％以上、33％以上、34％以上、35％以上的高含量含有甜菊醇糖苷。此处，本发明的萃取物与从不具有本发明的遗传性状的甜菊植物体中获得的萃取物可以相同方法获得。
通过将如此获得的本发明的萃取物及/或根据本发明的甜菊醇糖苷精制品的制造方法获得的甜菊醇糖苷精制品(例如，RebD及/或RebM)与其他成分混合，可制造含有甜菊醇糖苷的饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品。于是，本发明，作为其他实施方式，提供一种饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品的制造方法，其特征在于，包含将本发明的萃取物及/或根据本发明的甜菊醇糖苷精制品的制造方法获得的甜菊醇糖苷精制品与其他成分混合的工序。进一步，本发明提供一种饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品，其特征在于，含有根据所述制造方法而得的甜菊醇糖苷。此处，饮食品包含饮料及食品。从而，在某种实施方式中，本发明提供一种饮料、食品、甜味剂组合物、香料或医药品，还提供一种该饮料、食品、甜味剂组合物、香料或医药品的制造方法。
5.本发明的植物体涉及的碱基序列
本发明在其他方式中，提供本发明的甜菊植物体涉及的碱基序列。
具有遗传性状(1)的甜菊植物体涉及的碱基序列包含选自序列号1、7、8及9的碱基序列或由其构成。具有遗传性状(2)的甜菊植物体涉及的碱基序列包含选自序列号2、10、11及12的碱基序列或由其构成。具有本发明的遗传性状的甜菊植物体涉及的碱基序列包含选自序列号1、7、8及9的碱基序列和选自序列号2、10、11及12的碱基序列的组合或由其构成。
实施例
以下对本发明涉及的实验例、实施例等进行记载，但本发明并不限定于这些具体的方式。
(1)富含甜菊醇糖苷的集团的创造
对野生型甜菊种子(市售品种)实施甲磺酸乙酯(EMS)处理，将其播种至三得利国际研究中心内的温室中，并栽培。从长成的各个体中采集适量的新鲜叶作为样本，通过LC-MS/MS(岛津LCMS8050)对甜菊醇糖苷的浓度进行定量。具体而言，通过冷冻干燥对0.25g的新鲜叶进行干燥，将干燥粉碎物0.05g投入100倍量(5mL)的纯水中。通过20分钟超声波处理进行萃取，离心分离并过滤后，将用32％乙腈进行60倍稀释后的液体作为样本液。通过LCMS8050的MRM模式对该样本液1mL实施LC-MS/MS分析，对RebA、RebB、RebC、RebD、RebF、RebM、RebN、RebO及甜菊苷的浓度进行定量，选择其合计浓度约5～20％的个体进行交配，获得种子。这样的选拔重复4代，获得集团A。
(2)富含甜菊醇糖苷的个体的基因分析
从集团A的各个体中采集适量新鲜叶作为样本，与上述(1)同样通过LC-MS/MS(岛津LCMS8050)，对RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebG、RebM、RebN及甜菊苷(TSG)的浓度进行定量。此外，从一部分的个体的新鲜叶中提取基因组DNA，通过测序仪(HiSeq 2500，Illumina)实施基因分析。结果，确认具有本发明的遗传性状的个体群的TSG含量的平均值，比不具有本发明的遗传性状的个体、集团A的所有个体，以及具有遗传性状(2)的个体的TSG含量的平均值高的倾向。于是，为了提高遗传性状的检测效率，制作用于检测遗传性状(1)及(2)的dCAPS引物，通过dCAPS法对剩余个体是否具有这些遗传性状进行评价。
dCAPS引物及限制酶使用以下引物及限制酶。
[表3]
表3 dCAPS引物的序列及限制酶
Figure BDA0003935919990000221
基于dCAPS法的各遗传性状的检测如以下方式实施。首先，从各个体的新鲜叶中提取基因组DNA，使用与各遗传性状对应的上述dCAPS引物实施PCR，向PCR产物中添加与各遗传性状对应的上述限制酶，于37℃下进行酶促反应。通过微芯片型电泳装置LabChip GXTouch HT(PerkinElmer)实施限制酶处理物的电泳，根据所得条带的带型判定有无遗传性状。具体而言，关于呈同型接合性的遗传性状(1)，将仅可确认分解产物的条带的个体判定为具有遗传性状，关于呈同型或异型接合性的遗传性状(2)，将确认非分解物的条带的个体判定为具有遗传性状。
如表4及图3所示结果，确认在测序中确认的倾向。即，具有本发明的遗传性状的个体群的TSG含量的平均值，相对于不具有本发明的遗传性状的个体、集团A的所有个体，以及具有遗传性状(2)的个体的TSG含量的平均值，分别高43.5％、27.4％及7.2％。此外，遗传性状(2)作为富含甜味成分型的甜菊植物体的选拔用标记被熟知(专利文献3)，可知通过与本发明的遗传性状(1)组合，可选拔TSG含量更高的个体。
[表4]
表4 TSG含量与遗传性状的关系
Figure BDA0003935919990000222
工业实用性
根据本发明可更有效地提供甜菊醇糖苷，从而通过含有充分量的甜菊醇糖苷可提供上乘味道的饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品等。
序列表
<110> 三得利控股株式会社
<120> 富含甜菊醇糖苷的甜菊植物及其筛选方法
<130> G2603
<150> JP 2020-084133
<151> 2020-05-12
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 326
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 1
ggcagccatt gatgatgttg ttgaatgtga ttaatttgaa tgttataaag aatttggaaa 60
agaaaaagga ggggacaaag ttgatgaaat taggggagtt atgattatga tggccatggt 120
gattgtgatg agtggcacta tgtaatctaa tatttgaaga tatgagacca cttgaccatg 180
ttataatctt atacaaaata attaatccct cacggtaatt tttttctaat ccttaaactg 240
aaatttgaaa gtaatttgag atagtgtttc ccctaattta tgcttttagt atgcatttat 300
tctatcatat tttctatgag aattgg 326
<210> 2
<211> 145
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 2
gatccaatgg agggggtgat tcaggtaata aaaggcatta gtatggaata taccaaaaca 60
ttgcgattcg ttattagcat ggatctttca agtaataaac ttatcggaga aataccagtt 120
gagttaactg cccttcatgc cttgg 145
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ggcagccatt gatgatgttg ttgaa 25
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g 61
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<213> 甜菊
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gagggggtga ttcaggtaat aaaaggcatt agtatggaat ataccaaaac attgcgattc 60
g 61
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<212> DNA
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ggcagccatt gatgatgttg ttgaatgtga ttaatttgaa tgttataaag aatttggaaa 60
agaaaaagga ggggacaaag ttgatgaaat taggggagtt atgattatga tggccatggt 120
gattgtgatg agtggcacta tgtaatctaa tatttgaaga tatgagacca cttgaccatg 180
ttataatctt atacaaaata attaatccct cacggtaatt tttttctaat ccttaaactg 240
aaatttgaaa gtaatttgag atagtgtttc ccctaattta tgcttttagc atgcatttat 300
tctatcatat tttctatgag aattgg 326
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atgcttttag catgcattta t 21
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ttgcgattcg ttattagcat ggatctttca agtaataaac ttatcggaga aataccagtt 120
gagttaactg cccttcatgc cttgg 145
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ttcaggtaat aaaaggcatt cgtatggaat ataccaaaac a 41
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<212> DNA
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g 61
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ggcagccatt gatgatgttg ttgaa 25
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ccaattctca tagaaaatat gatagaataa atgcaa 36
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ttatttaatg atccaatgga gggggtgatt caggtaataa aaggcattag tatggaatat 60
accaaaacat tgcgattcgt tattagcatg gatctttcaa gtaataaact tatcggagaa 120
ataccagttg agttaactgc ccttcatgcc ttggtgagtc tcaatttgtc taataatcat 180
cttattggac acattccgaa tagcattgga aacatgaaag ctttaaattc tctagatttc 240
tcgagaaacg agttaaatgg gttgatccct ccaagcattg gagctttgaa ttttttgagt 300
catttaaatt tgtcaaacaa caacttatca ggaccaattc caatcggaaa tcaattgaga 360
accctca 367
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gattgtgatg agtggcacta tgtaatctaa tatttgaaga tatgagacca cttgaccatg 180
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acgcatttat tctatcatat tttctatgag aattgg 36
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<211> 326
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<220>
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<400> 33
ggcagccatt gatgatgttg ttgaatgtga ttaatttgaa tgttataaag aatttggaaa 60
agaaaaagga ggggacaaag ttgatgaaat taggggagtt atgattatga tggccatggt 120
gattgtgatg agtggcacta tgtaatctaa tatttgaaga tatgagacca cttgaccatg 180
ttataatctt atacaaaata attaatccct cacggtaatt tttttctaat ccttaaactg 240
aaatttgaaa gtaatttgag atagtgtttc ccctaattta tgcttttagc acgcatttat 300
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accaaaacat tgcgattcgt tattagcatg gatctttcaa gtaataaact tatcggagaa 120
ataccagttg agttaactgc ccttcatgcc ttggtgagtc tcaatttgtc taataatcat 180
cttattggac acattccgaa tagcattgga aacatgaaag ctttaaattc tctagatttc 240
tcgagaaacg agttaaatgg gttgatccct ccaagcattg gagctttgaa ttttttgagt 300
catttaaatt tgtcaaacaa caacttatca ggaccaattc caatcggaaa tcaattgaga 360
accctca 367
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<211> 367
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<213> 人工序列
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ttatttaatg atccaatgga gggggtgatt caggtaataa aaggcactcg tatggaatat 60
accaaaacat tgcgattcgt tattagcatg gatctttcaa gtaataaact tatcggagaa 120
ataccagttg agttaactgc ccttcatgcc ttggtgagtc tcaatttgtc taataatcat 180
cttattggac acattccgaa tagcattgga aacatgaaag ctttaaattc tctagatttc 240
tcgagaaacg agttaaatgg gttgatccct ccaagcattg gagctttgaa ttttttgagt 300
catttaaatt tgtcaaacaa caacttatca ggaccaattc caatcggaaa tcaattgaga 360
accctca 367
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<213> 人工序列
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<400> 36
ttatttaatg atccaatgga gggggtgatt caggtaataa aaggca 46
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<211> 320
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<213> 人工序列
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ctagtatgga atataccaaa acattgcgat tcgttattag catggatctt tcaagtaata 60
aacttatcgg agaaatacca gttgagttaa ctgcccttca tgccttggtg agtctcaatt 120
tgtctaataa tcatcttatt ggacacattc cgaatagcat tggaaacatg aaagctttaa 180
attctctaga tttctcgaga aacgagttaa atgggttgat ccctccaagc attggagctt 240
tgaatttttt gagtcattta aatttgtcaa acaacaactt atcaggacca attccaatcg 300
gaaatcaatt gagaaccctc 320

Claims (19)

1.一种方法，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含从被检甜菊植物体的基因组中，检测存在及/或不存在以下遗传性状(1)和存在及/或不存在以下遗传性状(2)的工序，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含对检测遗传性状的存在及/或不存在后的被检甜菊植物组织的甜菊醇糖苷的含量进行测定的工序。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的甜菊醇糖苷含量比通过包含检测存在及/或不存在遗传性状(2)的工序，但不包含检测存在及/或不存在遗传性状(1)的工序的筛选方法选择的甜菊植物体的甜菊醇糖苷含量高3％以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，检测存在及/或不存在遗传性状的工序使用dCAPS法或TaqMan PCR法实施。
5.一种筛选试剂盒，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的筛选试剂盒，其特征在于，包含用于检测存在及/或不存在以下遗传性状(1)的试剂，和用于检测存在及/或不存在以下遗传性状(2)的试剂，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂包含CAPS法、dCAPS法或TaqMan PCR法中使用的引物及/或探针。
7.一种富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体，其特征在于，具有以下遗传性状(1)及(2)，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
8.根据权利要求7所述的植物体，其特征在于，为非转基因植物体。
9.根据权利要求7或8所述的植物体，其特征在于，包含经变异诱发处理的甜菊植物体及其后代植物体。
10.一种种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞，其特征在于，为权利要求7～9中任一项所述的植物体的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞。
11.根据权利要求10所述的组织、组织培养物或细胞，其特征在于，选自胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织。
12.一种方法，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的制作方法，其特征在于，包含使权利要求7～9中任一项所述的甜菊植物体与第2甜菊植物体杂交的工序。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，第2植物体为权利要求7～9中任一项所述的甜菊植物体。
14.一种方法，其为富含甜菊醇糖苷的甜菊植物体的制作方法，其特征在于，包含向甜菊植物体的基因组中以所述基因组具有以下遗传性状(1)及(2)的方式加入改变的工序，
(1)对于与序列号1的290位相当的位置的碱基为T的等位基因呈同型接合性；
(2)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为A的等位基因呈同型接合性或异型接合性。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，基因组的改变通过变异诱发处理来实施。
16.一种萃取物，其为权利要求7～9中任一项所述的植物体、权利要求10或11所述的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞的萃取物，其特征在于，含有甜菊醇糖苷。
17.一种含有甜菊醇糖苷的萃取物的制造方法，其特征在于，包含从权利要求7～9中任一项所述的植物体、权利要求10或11所述的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞中获得萃取物的工序。
18.一种甜菊醇糖苷的制造方法，其特征在于，包含从权利要求16所述的萃取物中提纯甜菊醇糖苷的工序。
19.一种饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品的制造方法，其特征在于，包含提供权利要求7～9中任一项所述的植物体的萃取物、权利要求10或11所述的种子、组织、干燥叶、组织培养物或细胞的萃取物，或者权利要求16所述的萃取物的工序，及，
将所述萃取物添加至饮食品、甜味剂组合物、香料或医药品的原料中的工序。
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