BR112019020304A2

BR112019020304A2 - composto, alimento ou bebida, composição edulcorante, planta, extrato da planta, método para produzir o composto, e, uso do composto

Info

Publication number: BR112019020304A2
Application number: BR112019020304A
Authority: BR
Inventors: Ono Eiichiro; Miyagawa Katsuro; Iwaki Kazunari; Fujikawa Kohki; Nagao Koji; Ochiai Misa; Urai Soichiro; Hirai Tadayoshi; Watanabe Takehiro
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2020-04-28
Also published as: WO2018181515A1; CN110621686A; NZ758479A; US11873521B2; JP6789382B2; EP3611179A4; JP2021035965A; ES2942429T3; BR112019020304B1; AU2018243332A1; EP3611179B1; SG10202111903TA; JP7225183B2; EP3611179A1; US20200224235A1; SG11201908370VA; AU2018243332B2; JPWO2018181515A1

Abstract

o objetivo da presente invenção é: determinar a estrutura de um novo glicosídeo de esteviol que é detectado a partir de espécies contendo uma grande quantidade de reb. c (também referido como dulcosídeo b), e uma quantidade traço do qual é capaz de influenciar a qualidade do sabor; e entender as características de sabor de dito glicosídeo de esteviol. a presente invenção fornece um composto representado pela fórmula (1) ou um sal do mesmo, ou um hidrato do mesmo.

Description

COMPOSTO, ALIMENTO OU BEBIDA, COMPOSIÇÃO EDULCORANTE, PLANTA, EXTRATO DA PLANTA, MÉTODO PARA PRODUZIR O COMPOSTO, E, USO DO COMPOSTO

CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção refere-se a um novo glicosídeo de esteviol, a um método para produzir o mesmo, e a uma composição edulcorante contendo o mesmo. Além disso, a presente invenção refere-se também a um alimento ou bebida, uma planta, um extrato da mesma e um agente controlador de aroma contendo o novo glicosídeo de esteviol. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [002] Folhas de Stevia rebaudiana contêm um metabólito secundário contendo esteviol que é um tipo de diterpenoides, em que glicosídeo de esteviol fornece uma doçura que é quase 300 vezes a doçura de açúcar e é, portanto, utilizado como um edulcorante sem calorias na indústria de alimentos. A demanda para edulcorantes sem calorias está crescendo dia a dia já que a obesidade se tomou um sério problema social em todo o mundo e também por uma questão de promoção da saúde e redução de despesas médicas. Atualmente, aspartame e acessulfame de potássio, que são derivados de aminoácidos sintetizados artificialmente, são utilizados como edulcorantes artificiais, mas espera-se que edulcorantes sem calorias naturais como os glicosídeos de esteviol sejam mais seguros e mais propensos a ganhar aceitação pública.

[003] Os principais glicosídeos de esteviol a partir de estévia são finalmente glicosilados em um glicosídeo chamado rebaudiosídeo A (Reb.A) que tem quatro porções de açúcar (Figura 1). Esteviosídeo, isto é, um glicosídeo de esteviol tri-glicosilado e um precursor de Reb.A, é o glicosídeo mais abundante. Estes dois glicosídeos são as substâncias principais responsáveis pela doçura da estévia. Esteviosídeo é responsável pelo maior teor nas folhas de estévia e é conhecido por fornecer a doçura que é cerca de

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250-300 vezes a doçura do açúcar. Reb.A é um glicosídeo de esteviol tetraglicosilado que tem forte doçura (350-450 vezes a do açúcar) com boa qualidade de sabor. Eles têm chamado a atenção como edulcorantes sem calorias. Além deles, a existência de glicosídeos que são considerados como sendo intermediários de reação e análogos tendo diferentes tipos de porções de açúcar são conhecidos. Por exemplo, enquanto todas dentre as quatro porções de açúcar do glicosídeo de Reb.A são glicose, rebaudiosídeo C (Reb.C) é conhecido por ter ramnose em vez de glicose fixada em C-2 de glicose em C-13, e rebaudiosídeo F (Reb.F) é conhecido por ter xilose fixada na mesma posição.

[004] Até a presente data, tentativas foram feitas para obter uma planta de estévia tendo um teor de Reb.A superior ao das plantas de estévia do tipo selvagem por reprodução ou similares já que a qualidade do sabor de Reb.A, no qual todas as quatro porções de açúcar no glicosídeo são glicose, é boa (por exemplo, Documento Patentário 1).

DOCUMENTO DA TÉCNICA ANTERIOR

Documento patentário

Documento patentário 1: Patente JP No. 3436317

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Problema a ser resolvido pela invenção [005] Entrementes, alguns dos cultivares de estévia resultantes de reprodução podem conter uma quantidade diminuta de um glicosídeo de esteviol cuja estrutura não foi ainda identificada, onde a presença de tal glicosídeo de esteviol presente em uma quantidade diminuta pode estar contribuindo potencialmente para o aroma característico do extrato de estévia. Além disso, embora pesquisas tenham sido realizadas até o momento com glicosídeos de esteviol obtidos por fixação adicional de glicose ao Reb.A e nos cultivares contendo os mesmos, nenhuma pesquisa foi feita até este momento em um cultivar contendo uma quantidade abundante de um

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3/68 glicosídeo de esteviol tendo ramnose como Reb.C e em tal glicosídeo de esteviol.

[006] Consequentemente, o objetivo da presente invenção é determinar a estrutura de um novo glicosídeo de esteviol presente em quantidade diminuta que afeta a qualidade do sabor, e identificar as características de sua qualidade de sabor. Além disso, objetivos adicionais da presente invenção são fornecer um novo glicosídeo de esteviol, um método para produzir o mesmo, e uma composição edulcorante contendo o mesmo. Meios para resolver o problema [007] Os presentes inventores realizaram uma investigação extensiva para resolver o problema descrito acima e, como um resultado, alcançaram sucesso em determinar a estrutura do novo glicosídeo de esteviol presente em uma quantidade diminuta que afeta a qualidade do sabor. A presente invenção foi obtida com base na constatação acima.

EFEITO DA INVENÇÃO [008] A presente invenção pode fornecer um novo glicosídeo de esteviol presente em uma quantidade diminuta que afeta a qualidade do sabor. Além disso, a presente invenção pode fornecer também um método para produzir o novo glicosídeo de esteviol, e uma composição edulcorante, um alimento ou bebida, uma planta, um extrato da mesma e um agente controlador de aroma contendo o novo glicosídeo de esteviol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [009] A Figura 1 ilustra um diagrama mostrando estruturas e nomes de glicosídeos de esteviol.

[0010] A Figura 2 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma iônico selecionado de amostra 1 em m/z de 1095,4.

[0011] A Figura 3 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma iônico selecionado de amostra 1 em m/z de 1257,5.

[0012] A Figura 4 ilustra um diagrama mostrando os espectros de

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4/68 massa fragmentada de MS/MS e MS³ do novo glicosídeo de esteviol 1.

[0013] A Figura 5 ilustra um diagrama mostrando os espectros de massa fragmentada de MS/MS e MS³ do novo glicosídeo de esteviol 2.

[0014] A Figura 6 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro de ^XH-RMN do composto 15 (800 MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro de ¹³C-RMN do composto 15 (200 MHz, Pyr-d5).

[0015] A Figura 7 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro de COSY ’Η-’Η do composto 15 (800 MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro de HSQC do composto 15 (800 MHz, Pyr-d5).

[0016] A Figura 8 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro de HMBC do composto 15 (800 MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro TOCSY do composto 15 (800 MHz, Pyr-d5).

[0017] A Figura 9 ilustra um diagrama mostrando um espectro de NOESY do composto 15 (800 MHz, Pyr-d5).

[0018] A Figura 10 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro de ^XH-RMN do composto 17 (800 MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro ¹³C-RMN do composto 17 (200 MHz, Pyr-d5).

[0019] A Figura 11 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro de COSY Ή-Ή do composto 17 (800 MHz, Pyr-d5); e (b) a HSQC do composto 17 (800 MHz, Pyr-d5).

[0020] A Figura 12 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro de HMBC do composto 17 (800 MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro TOCSY do composto 17 (800 MHz, Pyr-d5).

[0021] A Figura 13 ilustra um diagrama mostrando um espectro NOESY do composto 17 (800 MHz, Pyr-d5).

[0022] A Figura 14 ilustra um diagrama mostrando cromatogramas iônicos extraídos do novo glicosídeo de esteviol 1 (extrato de folha de estévia) e um produto sintetizado quimicamente (a forma β do composto 15).

[0023] A Figura 15 ilustra diagramas mostrando os espectros de

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5/68 massa fragmentada MS/MS e MS³ do novo glicosídeo de esteviol 1 (extrato de folha de estévia) e um produto sintetizado quimicamente (a forma β do composto 15).

[0024] A Figura 16 ilustra um diagrama mostrando cromatogramas iónicos extraídos do novo glicosídeo de esteviol 2 (extrato de folha de estévia) e um produto sintetizado quimicamente (a forma β do composto 17).

[0025] A Figura 17 ilustra diagramas mostrando espectros de massa fragmentada MS/MS e MS³ do novo glicosídeo de esteviol 2 (extrato de folha de estévia) e um produto sintetizado quimicamente (a forma β do composto 17).

[0026] A Figura 18 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma iônico selecionado de uma amostra obtida por biossíntese em m/z de 1095,4.

[0027] A Figura 19 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma iônico selecionado de uma amostra obtida por biossíntese em m/z de 1257,5.

[0028] A Figura 20 ilustra diagramas mostrando resultados de avaliações sensoriais para comparação do novo glicosídeo de esteviol com rebaudiosídeo A e rebaudiosídeo D.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO [0029] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em detalhes. A modalidade seguinte é dada para ilustrar a presente invenção e não com a intenção de limitar a presente invenção apenas a esta modalidade. A presente invenção pode ser realizada de vários modos sem sair escopo da mesma. Todos os documentos, publicações, publicações de patente e outros documentos patentários descritos aqui são incorporados aqui por referência.

[0030] Os termos “rebaudiosídeo” e “Reb.” como usados aqui têm o mesmo significado e ambos se referem ao “rebaudiosídeo”. Similarmente, os termos “dulcosídeo” e “dulcosídeo” como usados aqui têm o mesmo significado e ambos se referem a “dulcosídeo”.

1. Novo glicosídeo de esteviol

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6/68 [0031] Pela primeira vez, os presentes inventores identificaram a estrutura de uma quantidade diminuta de um novo glicosídeo de esteviol que afeta a qualidade do sabor. O novo glicosídeo de esteviol da presente invenção (daqui em diante, também referido como o “glicosídeo da presente invenção”) é um composto representado pela fórmula (1):

ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, em que R representa uma cadeia de açúcar de fórmula (2) ou (3);e rha(1-2)' glc(1-3)—glc-1— rha(1-2f (₃) glc representa glicose, e rha representa ramnose.

[0032] Como representado acima, o glicosídeo da presente invenção tem uma cadeia de açúcar contendo duas porções de glicose e uma porção de ramnose em C-13 de esteviol, e uma cadeia de açúcar contendo uma porção de glicose e uma porção de ramnose, ou duas porções de glicose e uma porção de ramnose em C-19.

[0033] Além disso, como representado acima, glc representa glicose e rha representa ramnose. “Glc” como usado aqui pode ser a- ou β-glicose enquanto rha pode ser a- ou β-ramnose. Altemativamente, “glc” como usado

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7/68 aqui pode ser a- e β-glicose enquanto rha pode ser a- e β-ramnose. Além de que, “glc-1-” indica que o átomo de carbono em C-1 de glicose está unido ao esteviol via uma ligação glicosídica, e “glc(l-3)-glc-l-” indica que o átomo de carbono em C-3 de glicose representado por “glc-1-” está unido a um átomo de carbono em C-1 de outra glicose via uma ligação glicosídica. Além disso, “rha(l-2)-glc-l-” indica que o átomo de carbono em C-2 de glicose representado por “glc-1-” está unido a um átomo de carbono em C-1 de ramnose via uma ligação glicosídica.

[0034] Aqui, entre os compostos representados pela fórmula (1), aqueles em que R tem uma cadeia de açúcar de fórmula (2) são ditos como “glicosídeo A” enquanto aqueles em que R tem uma cadeia de açúcar de fórmula (3) são ditos como “glicosídeo B”.

[0035] Exemplos de Glicosídeo A incluem glicosídeos tendo as estruturas representadas pelas fórmulas (ll)e(12).

[0036] No glicosídeo A representado pela fórmula (11), glicose está unida ao grupo carboxílico em C-19 do esteviol via uma ligação β-glicosídica, enquanto no Glicosídeo A representado pela fórmula (12), glicose está unida ao grupo carboxílico em C-19 do esteviol via uma ligação β-glicosídica.

[0037] Exemplos de Glicosídeo B incluem glicosídeos tendo as

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8/68 estruturas representadas pelas fórmulas (13)e(14).

[0038] No Glicosídeo B representado pela fórmula (13), glicose está unida ao grupo carboxílico em C-19 do esteviol via uma ligação β-glicosídica, enquanto no Glicosídeo B representado pela fórmula (14), glicose está unida ao grupo carboxílico em C-19 do esteviol via uma ligação a-glicosídica.

[0039] O glicosídeo da presente invenção compreende também isômeros tais como as formas a- e β- como descritas acima. Portanto, o glicosídeo da presente invenção pode compreender apenas aqueles da forma a, apenas aqueles da forma β ou uma mistura das formas a- e β-. O glicosídeo da presente invenção tem a forma β em uma proporção de preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, e particularmente preferivelmente 99% ou mais. As formas a- e β- podem ser isoladas/purificadas por um método conhecido tal como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia líquida de ultra (alta) eficiência (UPLC), ou similares.

[0040] O glicosídeo da presente invenção pode ser não apenas o composto representado pela fórmula (1), mas também pode ser um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. O termo “derivado” como usado aqui referese a um composto resultante de uma mudança estrutural de uma porção menor do composto, por exemplo, um composto em que alguns dos grupos hidroxila

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9/68 são substituídos com outros substituintes. Portanto, derivados do composto representado pela fórmula (1) incluem compostos e que alguns grupos hidroxila contidos no composto foram substituídos com um substituinte selecionado dentre hidrogênio, um halogênio, um grupo alquila, um grupo alquenila, um grupo alquinila, um grupo arila, um grupo amino, um grupo ciano ou similares. Como usado aqui, um “sal do composto representado pela fórmula (1)” refere-se a um sal fisiologicamente aceitável, por exemplo, um sal de sódio, do composto representado pela fórmula (1). Além disso, um “hidrato do composto representado pela fórmula (1)” como usado aqui referese a um composto resultante da adição de uma molécula de água no composto representado pela fórmula (1).

[0041] Embora o glicosídeo da presente invenção não seja particularmente limitado, ele pode ser um produto derivado de planta, um produto sintetizado quimicamente ou um produto biossintético. Por exemplo, ele pode ser isolado e purificado a partir de uma planta com Reb.C abundante, ou ele pode ser obtido por síntese ou biossíntese química. Detalhes de um método para produzir um glicosídeo da presente invenção serão descritos abaixo aqui.

[0042] O glicosídeo da presente invenção é mais doce do que açúcar (sacarose), tem qualidade de sabor tal como um início antecipado da doçura e pós-sabor persistente tão bom quanto o do açúcar, e pode afetar a qualidade do sabor de alimentos/bebidas em uma pequena quantidade. Assim, o glicosídeo da presente invenção pode ser usado como um novo edulcorante.

[0043] Um glicosídeo em um aspecto preferível da presente invenção é selecionado dentre Glicosídeo A ou Glicosídeo B. Glicosídeo B é mais doce do que açúcar (sacarose), ocasiona um início antecipado da doçura e uma persistência da doçura tão bons quanto os de açúcar, sendo altamente solúvel em água. Consequentemente, ele pode ser usado de modo favorável como um edulcorante em várias aplicações, como descrito abaixo. Glicosídeo A,

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10/68 embora não seja tão doce como o Glicosídeo B, é mais doce do que açúcar (sacarose), ocasiona um início antecipado da doçura e uma persistência da doçura tão bons quanto o do açúcar. Similar ao Glicosídeo B, Glicosídeo A também pode ser usado de modo favorável como um edulcorante em várias aplicações. Já que ele tem uma solubilidade em água menor do que o Glicosídeo B, ele pode ser usado de modo particularmente favorável em uma bebida láctea fermentada, uma bebida de suco de fruta em suspensão, e uma bebida turva. Ele também pode ser usado de modo favorável para ajustar a doçura de um produto farmacêutico ou similares. Embora não desejando ser limitado por qualquer teoria, uma baixa solubilidade em água pode suprimir o amargor sentido pela língua, enquanto intensificando a sensação estimulante descendo pela garganta sendo, assim, vantajoso para intensificar o corpo da bebida.

2. Composição edulcorante contendo o novo glicosídeo de esteviol [0044] Em um aspecto da presente invenção, uma composição edulcorante contendo o composto representado pela fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo (daqui em diante, também referido como a “composição edulcorante da presente invenção”) é fornecida. A composição edulcorante da presente invenção não é particularmente limitada contanto que ela contenha o composto representado pela fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, e ela pode ser uma composição contendo um extrato contendo o composto representado pela fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.

[0045] A quantidade do glicosídeo da presente invenção contido na composição edulcorante da presente invenção não e particularmente limitada. [0046] Altemativamente, a composição edulcorante da presente invenção é preferivelmente uma composição contendo o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior do que a quantidade em uma estévia do tipo selvagem ou extrato de estévia em pelo menos 0,01%. Como

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11/68 mencionado acima, o glicosídeo da presente invenção foi detectado a primeira vez em um cultivar contendo Reb.C abundante, e ele não está contido em uma estévia do tipo selvagem ou um extrato da mesma de todo ou, caso presente, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menor.

[0047] A composição edulcorante da presente invenção pode conter adicionalmente outros glicosídeos de esteviol. Por exemplo, a composição edulcorante da presente invenção pode conter, além do glicosídeo da presente invenção, um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, dulcosídeo C, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo. Aqui, “dulcosídeo C” refere-se a um composto tendo a estrutura seguinte.

[0048] Em um caso em que outro glicosídeo de esteviol está contido, a razão da composição do glicosídeo da presente invenção e outro glicosídeo de esteviol é preferivelmente 0,01:9,99-6:4 em uma razão em massa.

[0049] A composição edulcorante da presente invenção pode conter adicionalmente um edulcorante geral. Exemplos de tal edulcorante geral

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12/68 incluem edulcorantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutoseglicose, glicose, maltose, sacarose, xarope com alto teor de frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensado (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorit), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii, e edulcorantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sucralose, neotame, aspartame e sacarina. Entre estes, edulcorantes naturais são usados preferivelmente a partir do aspecto de conferir um sabor puro, facilidade de ser consumido como uma bebida, aroma natural e sabor moderadamente rico, onde frutose, glicose, maltose, sacarose e açúcar são particularmente usados preferivelmente. Tanto um único tipo, como uma pluralidade de tipos destes ingredientes conferindo doçura, podem ser usados.

3. Alimento/bebida contendo o novo glicosídeo de este viol [0050] Em um aspecto da presente invenção, um alimento ou bebida contendo o composto representado pela fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo (daqui em diante, também referido como o “alimento ou bebida da presente invenção”) é fornecido. O alimento ou bebida da presente invenção não é particularmente limitado contanto que ele contenha o composto representado pela fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, e ele pode ser um alimento ou bebida contendo um extrato ou uma composição edulcorante contendo o composto representado pela fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. Como usado aqui, um alimento ou bebida refere-se a alimentos e bebidas. Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção fornece um novo alimento ou bebida, e um método para produzir dito alimento ou bebida.

[0051] Embora a quantidade do glicosídeo da presente invenção contido no alimento ou bebida da presente invenção seja diferente dependendo do alimento ou bebida específico, ela é preferivelmente em tomo

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13/68 de 0,0004%-0,8% e particularmente preferivelmente 0,04%-0,4%. Contanto que o teor esteja dentro desta faixa, o sabor persistente após ingestão pode ser vantajosamente suprimido.

[0052] O alimento ou bebida da presente invenção pode conter adicionalmente outros glicosídeos de esteviol. Por exemplo, a composição edulcorante da presente invenção pode conter, além do glicosídeo da presente invenção, um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, dulcosídeo C, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.

[0053] Em um caso em que glicosídeo de esteviol está contido, a razão da composição do glicosídeo da presente invenção e outro glicosídeo de esteviol é preferivelmente 0,01:9,99-6:4 em uma razão em massa.

[0054] O alimento ou bebida da presente invenção pode conter adicionalmente um edulcorante geral. Exemplos de tal edulcorante geral incluem edulcorantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutoseglicose, glicose, maltose, sacarose, xarope com alto teor de frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorit), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii, e edulcorantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sucralose, neotame, aspartame e sacarina. Entre estes, edulcorantes naturais são usados preferivelmente a partir do aspecto de conferir um sabor puro, facilidade de beber, aroma natural e sabor moderadamente rico, onde frutose, glicose, maltose, sacarose e açúcar são particularmente preferivelmente usados. Tanto

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14/68 um único tipo como uma pluralidade de tipos destes ingredientes doces podem ser usados.

[0055] Exemplos do alimento da presente invenção incluem, mas não particularmente limitados a, um confeito, um pão, farinha de cereais, macarrão, arroz, um alimento agrícola/florestal processado, um produto de pecuária processado, um produto de pesca processado, um produto de leite/laticínios, um produto de óleo e gordura/óleo e gordura processado, tempero ou outro material alimentício.

[0056] Exemplos da bebida da presente invenção incluem, mas não particularmente limitados a, uma bebida gaseificada, uma bebida não gaseificada, uma bebida alcoólica, uma bebida não alcoólica, uma bebida com sabor de cerveja tal como cerveja ou cerveja sem álcool, uma bebida de café, uma bebida de chá, uma bebida de cacau, uma bebida nutritiva e uma bebida funcional.

[0057] A bebida da presente invenção pode ser esterilizada com calor e acondicionada para ser preparada como uma bebida acondicionada. Exemplos de tal embalagem incluem, mas não particularmente limitados a, uma garrafa PET, uma lata de alumínio, uma lata de aço, uma embalagem de papel, um copo gelado, e uma garrafa. Em um caso em que esterilização com calor deve ser realizada, o tipo de esterilização com calor não é particularmente limitado. Por exemplo, esterilização por calor pode ser realizada empregando uma técnica comum tal como esterilização UHT, esterilização em retorta ou similares. Embora a temperatura durante o processo de esterilização por não seja particularmente limitada, ela é, por exemplo, 65-130°C, e preferivelmente 85-120°C, durante 10-40 minutos. A esterilização, no entanto, pode ser realizada em uma temperatura apropriada durante vários segundos, por exemplo, 5-30 segundos, sem problema contanto que o mesmo valor de esterilização como o sob as condições descritas acima possa ser obtido.

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4. Planta contendo o novo glicosídeo de esteviol e extrato da mesma [0058] Em um aspecto da presente invenção, uma planta contendo o novo glicosídeo de esteviol e um extrato da mesma são fornecidos. Além disso, em outro aspecto da presente invenção, um alimento ou bebida, preferivelmente uma bebida, contendo a planta da presente invenção ou um extrato de dita planta é fornecido. Embora a quantidade do glicosídeo da presente invenção contido na planta da presente invenção não seja particularmente limitada, ela é preferivelmente 0,001%-1,000% e mais preferivelmente 0,01%-0,80%.

[0059] Preferivelmente, a planta da presente invenção é uma planta que contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior do que uma espécie de estévia do tipo selvagem em 0,01% ou mais. Como descrito acima, o glicosídeo de esteviol da presente invenção não está contido em uma estévia do tipo selvagem de modo algum ou, caso esteja, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos.

[0060] A frase “contém glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior do que uma espécie de estévia do tipo selvagem em 0,01% ou mais” significa que, com relação a uma quantidade (concentração) do glicosídeo da presente invenção contido por quantidade unitária (por exemplo, 10 ml) de um extrato líquido de folhas frescas (folhas não secas) de uma planta de estévia do tipo selvagem, uma quantidade (concentração) do glicosídeo da presente invenção contido em uma quantidade unitária igual de um extrato líquido de folhas frescas (folhas não secas) da planta da presente invenção (a mesma quantidade que a do extrato líquido das folhas da planta de estévia do tipo selvagem) é superior em 0,01% ou mais. Aqui, a planta da presente invenção pode conter o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior do que uma espécie de estévia do tipo selvagem em 0,02% ou mais, 0,03% ou mais, 0,04% ou mais, 0,05% ou mais, 0,07% ou mais, 0,09% ou mais, 0,10% ou mais, 0,15% ou mais, 0,20% ou mais, 0,40% ou

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16/68 mais, 0,0% ou mais, 0,80% ou mais, 1,0% ou mais, 1,50% ou mais, 2,00% ou mais, 4,00% ou mais, 6,00% ou mais, 8,00% ou mais, ou 10,00% ou mais.

[0061] Além disso, a frase “a proporção do glicosídeo da presente invenção entre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais” significa que o glicosídeo da presente invenção existe em uma porcentagem de 0,01% ou mais com relação ao teor dos glicosídeos de esteviol totais existentes no extrato líquido das folhas frescas (folhas não secas) da planta de estévia da presente invenção. Aqui, os glicosídeos de esteviol totais não contêm glicosídeos de esteviol desconhecidos nem qualquer glicosídeo de esteviol existente em uma quantidade menor do que o limite de detecção. Preferivelmente, os glicosídeos de esteviol totais consistem em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, dulcosídeo C, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.

[0062] Embora o teor do glicosídeo da presente invenção na planta da presente invenção seja como descrito acima, em um caso em que folhas secas são obtidas da planta da presente invenção, o glicosídeo da presente invenção pode existir em uma quantidade de 0,01% em peso ou mais, 0,02% em peso ou mais, 0,03% em peso ou mais, 0,04% em peso ou mais, 0,05% em peso ou mais, 0,07% mais, 0,20% mais, 0,60% mais, 2,00% em peso ou em peso ou em peso ou em peso ou mais, 0,10% mais, 0,30% mais, 0,80% mais, 4,00% em peso ou em peso ou em peso ou em peso ou mais, 0,15% mais, 0,50% mais, 1,00% mais, 6,00% em peso ou em peso ou em peso ou em peso ou mais, 8,00% em peso ou mais, ou 10,00% em peso ou mais com relação ao peso de ditas folhas secas.

[0063] Aqui, folhas secas da planta da presente invenção refere-se as obtidas pela secagem de folhas frescas da planta da presente invenção para

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17/68 reduzir seu teor de água para 10% em peso ou menos, 7% em peso ou menos, 5% em peso ou menos, 4% em peso ou menos, 3% em peso ou menos, 2% em peso ou menos, ou 1% em peso ou menos. Preferivelmente, o teor de água das folhas secas da planta da presente invenção é 3-4% em peso.

[0064] Um exemplo da planta da presente invenção inclui uma planta com Reb.C abundante. Como descrito acima, o glicosídeo de esteviol da presente invenção não está contido em uma estévia do tipo selvagem de modo algum ou, caso esteja, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos. Entretanto, os presentes inventores constataram que o glicosídeo de esteviol da presente invenção está contido em uma quantidade maior em uma planta tendo Reb.C abundante. Portanto, o novo glicosídeo de esteviol e o extrato do mesmo também compreende tal planta com Reb.C abundante e um extrato da mesma.

[0065] Um exemplo de tal planta com Reb.C abundante inclui, mas não é particularmente limitado a, uma planta de estévia não recombinante contendo alto teor de rebaudiosídeo C, que contém rebaudiosídeo C em uma quantidade maior do que uma espécie de estévia do tipo selvagem em 20% ou mais, e cuja proporção de rebaudiosídeo C entre os glicosídeos de esteviol totais é 40% ou mais (daqui em diante, também referido como uma “planta com alto teor de Reb.C”).

[0066] Um exemplo de tal planta com alto teor de Reb. C inclui uma planta de estévia não recombinante contendo alto teor de rebaudiosídeo C que contém rebaudiosídeo C em uma quantidade maior do que uma espécie de estévia do tipo selvagem em 20% ou mais, e cuja proporção de rebaudiosídeo C entre os glicosídeos de esteviol totais é 40% ou mais.

[0067] Uma planta com alto teor de Reb. C é um cultivar derivado de uma planta de uma estévia do tipo selvagem, em que mutação genética ocorreu para aumentar o rebaudiosídeo C. Exemplos de tal mutação genética incluem, mas não particularmente limitados a, mutação genética induzida sob

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18/68 condições de ocorrência natural, mutação genética induzida por uma técnica não recombinacional e mutação genética induzida por recombinação genética. [0068] A planta com alto teor de Reb. C pode ser triada, por exemplo, detectando o polimorfismo do gene no tecido da planta. Aqui, “triagem” significa identificar e selecionar uma planta com alto teor de Reb. C entre outros corpos de planta.

[0069] A planta com alto teor de Reb. C também pode ser triada de acordo com um método de triagem que inclui uma etapa de identificar um polimorfismo de A no tipo selvagem sendo alterado para T no 60° nucleotídeo da sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 11 no genoma de uma planta de teste.

[0070] A planta da presente invenção não compreende apenas toda a planta, mas também compreende órgãos da planta (por exemplo, folha, pétala, caule, raiz, semente, etc.), tecidos de planta (por exemplo, epiderme, floema, parênquima, xilema, feixes vasculares, tecido de paliçada, tecido esponjoso etc.), várias formas de células de planta (por exemplo, células cultivadas em suspensão), um protoplasto, um pedaço de folha, calo e similares.

[0071] Além disso, a planta da presente invenção pode compreender também uma cultura de tecido ou uma cultura de célula de planta. Isto é porque tal cultura de tecido ou cultura de célula de planta podem ser cultivadas para regenerar uma planta. Exemplos da cultura de tecido ou uma cultura de célula de planta da presente invenção incluem, mas não limitados a, um embrião, células meristemáticas, pólen, uma folha, uma raiz, um ápice radicular, uma pétala, um protoplasto, um pedaço de folha e calos.

[0072] Um extrato da planta da presente invenção pode ser obtido pela reação de uma folha fresca ou seca da planta da presente invenção com um solvente apropriado (um solvente aquoso tal como água ou um solvente orgânico tal como álcool, éter ou acetona). Para condições de extração, ver o método descrito em WO2016/090460 ou um método descrito no exemplo

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19/68 abaixo.

[0073] Preferivelmente, o extrato da planta da presente invenção contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior do que a estévia do tipo selvagem em 0,01% ou mais, em que a proporção do glicosídeo da presente invenção entre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais. Aqui, a frase “contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior do que a estévia do tipo selvagem em 0,01% ou mais” significa o mesmo que o descrito acima. Similarmente, a frase a “proporção do glicosídeo da presente invenção entre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais” também significa o mesmo que o descrito acima.

5. Agente de controle de aroma contendo o novo glicosídeo de esteviol [0074] Embora o novo glicosídeo de esteviol da presente invenção esteja contido em um extrato de estévia em uma quantidade diminuta, é considerado que ele tem uma influência no aroma do extrato de estévia. Embora não desejando ser limitado por qualquer teoria, a adição de uma pequena quantidade do glicosídeo de esteviol da presente invenção é presumivelmente capaz de controlar o aroma de um alimento ou bebida. Portanto, em um aspecto da presente invenção, um agente de controle de aroma contendo o composto representado pela fórmula (1) descrito acima ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo é fornecido.

[0075] Como usado aqui, um “agente de controle de aroma” refere-se a uma substância que pode ser adicionada em um alimento ou bebida para controlar o aroma do alimento ou bebida. Preferivelmente, o agente de controle de aroma da presente invenção pode ser adicionado em um alimento ou bebida a fim de controlar o aroma do próprio alimento ou bebida sem os consumidores reconhecerem o sabor do próprio agente de controle de aroma. Por exemplo, já que o glicosídeo de esteviol da presente invenção apresenta uma boa persistência da doçura em comparação com glicosídeos de esteviol convencionais, ele pode ser usado como um agente de controle de aroma para

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20/68 controlar a persistência da doçura do alimento ou bebida.

[0076] O agente controlador de aroma da presente invenção preferivelmente contém, além do composto representado pela fórmula (1) descrito acima ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, um ou mais tipos de outros edulcorantes. Exemplos de tal edulcorante incluem: um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, dulcosídeo C, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo; edulcorantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutose-glicose, glicose, maltose, sacarose, xarope com alto teor de frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorit), um extrato de Lo Han Kuo extrato, pó de alcaçuz, um extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e um extrato de semente de Thaumatococcus daniellii; e edulcorantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sucralose, neotame, aspartame e sacarina.

6. Método para produzir o novo glicosídeo de esteviol [0077] Como descrito acima, o glicosídeo de esteviol da presente invenção pode ser produzido por (A) isolamento/purificação de uma planta, (B) uma síntese química, ou (C) uma biossíntese. Nas partes abaixo, cada um deles será descrito.

(A) Isolamento/purificação da planta [0078] Já que a planta da presente invenção contém o novo glicosídeo de esteviol da presente invenção, o novo glicosídeo de esteviol pode ser isolado/purificado a partir de dita planta. Uma folha fresca ou seca da planta da presente invenção é deixada reagir com um solvente apropriado (um

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21/68 solvente aquoso tal como água ou um solvente tal como álcool, éter ou acetona) para extrair o novo glicosídeo de esteviol em um estado de extrato líquido. Para condições de extração e mais, ver o método descrito em WO2016/090460 ou o método descrito no exemplo abaixo.

[0079] Além disso, o extrato líquido resultante pode ser submetido a um método conhecido tal como um gradiente de acetato de etila ou outro solvente orgânico: água, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), ou cromatografia líquida de ultra (alta) eficiência (UPLC) para isolar/purificar o novo glicosídeo de esteviol.

[0080] O teor do novo glicosídeo de esteviol na planta pode ser determinado elo método descrito em WO2016/090460 ou o método descrito no exemplo abaixo. Especificamente, o teor pode ser medido por amostragem de folhas frescas da planta da presente invenção e subtendo as folhas a LCMS/MS.

(B) Síntese química [0081] Um método para produzir o glicosídeo de esteviol da presente invenção através de síntese química será descrito em detalhes abaixo.

[0082] Glicosídeos de esteviol têm estruturas em que diferentes porções de açúcar (glicose, ramnose, xilose, etc.) estão fixadas à aglicona, isto é, esteviol, através de várias formas de ligação (posições e conformações de ligação). Portanto, um glicosídeo de esteviol de interesse pode ser obtido através de várias vias sintéticas dependendo do material de partida selecionado. Os versados na técnica à qual a presente invenção pertence, no entanto, entenderão que o tempo e o rendimento para obter o composto de interesse variam muito dependendo das vias sintéticas.

[0083] Desta vez, os presentes inventores constataram um novo método para produzir um glicosídeo de esteviol da presente invenção com seletividade maior e rendimento maior através de uma via sintética específica. De acordo com o método para produzir o glicosídeo de esteviol da presente

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22/68 invenção, uma síntese química do glicosídeo de este viol prossegue pela separação do glicosídeo de esteviol em um “glicosídeo de esteviol” e um “hemiacetal de açúcar “ como mostrado no Esquema 1.

Esquema 1: Novo método para sintetizar glicosídeo de esteviol gSsp ♦·«·<) 'O em

[0084] O glicosídeo de esteviol pode ser preparado por derivação de uma substância natural existente (rebaudiosídeo, dulcosídeo, esteviosídeo, biosídeo de esteviol, rubusosídeo, etc.). Entretanto, o hemiacetal de açúcar pode ser preparado ou a partir de uma substância natural existente ou por uma síntese química. Os presentes inventores constataram que o glicosídeo de esteviol de interesse pode ser obtido com bom rendimento e seletividade β extremamente alta por condensação do glicosídeo de esteviol e do hemiacetal de açúcar através de uma reação de Mitsunobu.

[0085] Em um aspecto da presente invenção, um método para produzir o composto representado pela fórmula (1) é fornecido, em que o método compreende as etapas de:

(A) preparar o intermediário 1 representado pela fórmula (5):

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em que p-glc representa glicose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, e p-rha representa ramnose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, a partir do rebaudiosídeo C representado pela fórmula (4):

em que glc representa glicose e rha representa ramnose;

(B) preparar o intermediário 2 representado pela fórmula (6) ou intermediário 3 representado pela fórmula (7) de um derivado de glicopiranosídeo:

p-gíc-1p-rha(1-2) (₆) p-glc(1-3)—p-glc-1p-rha(1-2) ( ₇ ) em que p-glc representa glicose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, e p-rha representa ramnose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor; e (C) permitir que o intermediário 1 reaja com o intermediário 2 ou 3 na presença de um reagente de fosfina e um composto azo para obter o intermediário 4 representado pela fórmula (8):

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em que, Ri representa uma cadeia de açúcar de fórmula (9) ou (10); e p-g!ç-1p~rha(1-2) (₉) p-glc( 1 -3)—p-glc-1p-rhafl^)^ (10) p-glc representa glicose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, e p-rha representa ramnose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor.

[0086] Aqui, exemplos do grupo protetor incluem um grupo protetor acila, um grupo silila trissubstituído, um grupo protetor acetal e um grupo protetor éter. Exemplos preferíveis incluem um grupo silila trissubstituído (um grupo trimetilsilila, um grupo trietilsilila, um grupo t-butildimetilsilila, etc.) e um grupo protetor acila (um grupo acetila, um grupo benzoíla, etc.).

[0087] Nas partes abaixo, um aspecto específico do método para produzir o glicosídeo de esteviol da presente invenção será descrito, mas o método para produzir o glicosídeo da presente invenção não deve ser limitado por este aspecto.

(A) Primeira etapa (síntese de glicosídeo de esteviol) [0088] Um glicosídeo de esteviol pode ser obtido, por exemplo, pelo Esquema 2 seguinte abaixo rebaudiosídeo C de ocorrência natural (dulcosídeo B) como um material de partida.

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Esquema 2: Síntese de glicosídeo de esteviol

Rebaudiosideo C

Glicosídeo de esteviol 3 [0089]

Primeiro, rebaudiosídeo C é dissolvido em um solvente tal como metanol e água, adicionado com uma base forte tal como hidróxido de sódio, e refluxado a 60°C-120°C durante 2 horas ou mais de modo que a molécula de glicose é removida de C-19 de rebaudiosídeo C para dar o composto 2 acima. Ao fazer isso, o solvente pode ser evaporado após neutralização da solução de reação com uma resina de troca iônica ou similares.

[0090] O composto 2 é dissolvido adicionalmente em um solvente tal como piridina, e adicionado com anidrido acético ou similares para proteger os grupos hidroxila contidos no Composto 2, obtendo assim o Composto 3 (Intermediário 1).

(B) Segunda etapa (síntese de hemiacetal de dissacarídeo ou trissacarídeo) [0091] Um hemiacetal de dissacarídeo ou um hemiacetal de trissacarídeo pode ser obtido, por exemplo, usando um derivado de glicopiranosídeo comercialmente disponível como um material de partida. Sínteses de um hemiacetal de dissacarídeo (Etapa 2a) e de um hemiacetal de trissacarídeo (Etapa 2b) são mostradas nos Esquemas 3 e 4, respectivamente. Esquema 3 mostrando a síntese de um hemiacetal de dissacarídeo (Etapa 2a) é como a seguir.

Esquema 3: Síntese de hemiacetal de dissacarídeo

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h₂

Pd(OH)₂ 'jB·

EtOH/THF

RT

Í1) Ac₂O Pyr. RT (2) CAN

MeCN/H₂O =2/1

RT

Hemiacetal de dissacarideo [0092] Primeiro, 4-metoxifenil 3-O-benzil-4,6-O-benzilidina-3-Dglicopiranosídeo (Composto 4), Composto 5 e peneiras moleculares (MS) são dissolvidos em um solvente tal como diclorometano, adicionado com ácido trifluorometanossulfônico (catalisador ácido), e agitados a 25°C-80°C durante 2 horas ou mais para dar o composto 6.

[0093] Subsequentemente, o composto 6 é dissolvido em um solvente tal como etanol ou THF, adicionado com um catalisador tal como hidróxido de paládio em temperatura ambiente, e agitado em uma atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 2 horas ou mais para terminar a reação. Então, o catalisador é removido por filtração para dar o composto 7. O composto 7 é dissolvido em um solvente tal como piridina, adicionado com anidrido acético em temperatura ambiente, e agitado em temperatura ambiente durante 12-36 horas. Depois disso, a solução é concentrada sob uma pressão reduzida, adicionada com acetonitrila e água, adicionada com um oxidante tal como nitrato de cério e amônio, e agitada durante 5 minutos a 2 horas para dar o composto 8 (Intermediário 2).

[0094] Esquema 4 mostrando a síntese de um hemiacetal trissacarídeo (Etapa 2b) é como a seguir.

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Esquema 4: Síntese de hemiacetal de trissacarídeo

AcQ. _ _AcX I NPh ^ACV OAg

1.1 eq.

Ph—VO'

O— BnOO ^-ÜMP OH

TfOH

ΡίιΎΟΛ „

BnÕJÍM-OMP

O

AcO-íZy*2/ ^Ac0 OAc

MeCN

RT

CH₂CI₂

MS

RT

EtOH/THF

RT

PhCH(OMe)₂CSA

(1) H_?.

Pd(OH)₂EtOH/THF

RT (2) Ag₂O Pvr.

RT

CAN ——-—-—>

MeCN/HjO =2/1

RT

Hemiacetal cie trissacarídeo ^3 [0095] Primeiro, 4-metoxifenil 3-O-benzil-4,6-O-benzilidina-3-Dglicopiranosídeo (Composto 4), composto 5 e peneiras moleculares (MS) são dissolvidos em um solvente tal como diclorometano, adicionado com ácido trifluorometanossulfônico (catalisador ácido), e agitados a 25°C-80°C durante 2 horas ou mais para dar o composto 6.

[0096] Subsequentemente, o composto 6 é dissolvido em um solvente como etanol ou THF, adicionado com um catalisador tal como hidróxido de paládio em temperatura ambiente, e agitado em atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 2 horas ou mais para terminar a reação. Então, o catalisador é removido por filtração para dar o composto 7. O composto 7 é dissolvido em acetonitrila, adicionado com benzaldeído dimetil acetal em temperatura ambiente, e agitado por 2 horas ou mais para dar o composto 9.

[0097] Compostos 9 e 10 e peneiras moleculares (MS) são dissolvidos em um solvente tal como diclorometano, adicionado com ácido

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28/68 trifluorometanossulfônico em temperatura ambiente, e agitados a 0°C durante 3-9 horas para dar o composto 11. O composto 11 resultante é dissolvido em um solvente tal como etanol ou THF, adicionado com um catalisador tal como hidróxido de paládio em temperatura ambiente, e agitado em uma atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 2 horas ou mais para terminar a reação. Então, o resultante é dissolvido em um solvente tal como piridina, adicionado com anidrido acético em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 12-36 horas para dar o composto 12. Depois disso, a solução é concentrada sob uma pressão reduzida, adicionada com acetonitrila e água, adicionada com um oxidante tal como nitrato de cério e amônio, e agitada durante 5 minutos a 2 horas, obtendo assim o composto 13 (Intermediário 3).

(C) Terceira etapa (Síntese de composto de fórmula (1)) [0098] O composto representado pela fórmula (1) pode ser sintetizado, por exemplo, pelo esquema 5 ou 6 seguinte abaixo usando o composto 3 (Intermediário 1) e composto 8 ou 13 (Intermediário 2 ou 3) obtidos nas etapas 1 e 2 (2a ou 2b) acima.

Esquema 5: Síntese de composto representado pela fórmula (1) (Glicosídeo A)

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1,5 eq.

Hemiacetal de dissacarideo g

Glicosídeo de esteviol 3

PBu₃

TMAD --------->· .4-dioxano °C

NaOMe ----------*

MeOH/THF RT

Glicosídeo A 15

Esquema 6: Síntese de composto representado pela fórmula (1) (Glicosídeo

B)

1,5 eq.

Hemiacetal de dissacarideo 13

Glicosídeo de esteviol 3

NáOMe

MeOH/THF RT

Glicosídeo B 17

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30/68 [0099] Primeiro, o hemiacetal de dissacarídeo ou trissacarídeo e o glicosídeo de esteviol obtidos nas etapas 1 e 2 (2a ou 2b) são deixados passar por uma reação de Mitsunobu a fim de obter um glicosídeo no qual o hemiacetal de dissacarídeo ou trissacarídeo é fixado seletivamente ao grupo carboxílico em C-19 do esteviol. Especificamente, estes compostos são dissolvidos em 1,4-dioxano, adicionado com um reagente de fosfina tal como tributilfosfina ou trifenilfosfina e um composto azo tal como l,l’-azobis (Ν,Ν’-dimetilformamida) (TMAD) em temperatura ambiente, e agitados a 50°C-80°C durante 2 horas ou mais para dar o composto 14 ou 16. Finalmente, os grupos protetores do composto 14 ou 16 são desprotegidos para dar o composto representado pela fórmula (1) (Glicosídeo A ou B).

(C) Biossíntese [00100] O glicosídeo de esteviol da presente invenção também pode ser gerado pela transferência de um polinucleotídeo codificante uma proteína predeterminada em uma célula hospedeira derivada de uma bactéria, uma planta, um inseto, um mamífero não humano ou similares, e usando esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose e/ou UDP-ramnose como um substrato. Esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose ou UDP-ramnose como um substrato podem ser ou fornecidos ou biossintetizados na célula. Embora exemplos da proteína determinada incluam UGT85C2 derivado de estévia (cuja sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO:2), UGT74G1 (cuja sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO:4), UGT91D2 (cuja sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO:6), UGT76G1 (cuja sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO:8) e UDP-ramnose sintase AtRHM2 derivada de Arabidopsis thaliana (cuja sequência de aminoácidos é representada pela SEQ ID NO: 10), não está limitada a isso contanto que ela tenha uma atividade equivalente.

[00101] A proteína descrita acima é uma enzima derivada de Arabidopsis thaliana ou estévia, que se espera que seja altamente ativa em um

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31/68 ambiente fora das células de planta tal como Arabidopsis thaliana e estévia (por exemplo, em um ambiente extracelular, ou dentro de uma célula hospedeira diferente de estévia). Neste caso, o polinucleotídeo codificando para a proteína descrita acima (por exemplo, gene UGT85C2 é representado pela SEQ ID NO:1, gene UGT74G1 é representado pela SEQ ID NO:3, gene UGT91D2 é representado pela SEQ ID NO:5, gene UGT76G1 é representado pela SEQ ID NO:7 e gene AtRHM2 é representado pela SEQ ID NO:9) é transferido para uma célula hospedeira derivada de uma bactéria, um fungo, uma planta, um inseto ou um mamífero não humano a fim de permitir a expressão da proteína da presente invenção, para a qual esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose ou UDP-ramnose como substrato é fornecido para gerar o composto da presente invenção. Altemativamente, dependendo do hospedeiro, a proteína descrita acima é expressada na célula hospedeira, para a qual um substrato é fornecido para gerar o composto da presente invenção.

[00102] Em um aspecto da presente invenção, um método para produzir o novo glicosídeo de esteviol da presente invenção é fornecido, em que o método é distinguido pelo uso de um transformante não humano que foi introduzido com pelo menos um de polinucleotídeos (a) a (g).

[00103] (a) Um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e que tem uma atividade de adição de glicose ao grupo hidroxila em C-13 do glicosídeo de esteviol.

[00104] (b) Um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 e que tem uma atividade de adição de glicose ao ácido carboxílico em C-19 do glicosídeo de esteviol.

[00105] (c) Um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6

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32/68 e que tem uma atividade de adição de ramnose à glicose fixada em C-13 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>2.

[00106] (d) Um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adição de glicose a C-3 de glicose em C-13 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>3.

[00107] (e) Um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adição de glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>2.

[00108] (f) Um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adição de glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>3.

[00109] (g) Um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e que tem uma atividade de gerar UDP-ramnose a partir de UDPglicose.

[00110] Em um aspecto preferível da presente invenção, polinucleotídeos tendo independentemente 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais, 99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais, ou 99,9% ou mais de identidade de sequência com as sequências de nucleotídeo dos números de sequência mencionados em (a) a (g) acima podem ser usados.

[00111] Em outro aspecto preferível da presente invenção, proteínas que têm independentemente uma sequência de aminoácidos tendo 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais,

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99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais, ou 99,9% ou mais de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos do número de sequência mencionado em (a) a (g) acima e que têm uma atividade predeterminada escrita em (a) a (g) acima podem ser usadas.

[00112] Preferivelmente, um polinucleotídeo codificando a proteína descrita acima é introduzido em um hospedeiro enquanto sendo inserido em um vetor de expressão apropriado. Os polinucleotídeos podem ser inseridos individualmente em vetores separados.

[00113] Um vetor de expressão apropriado é geralmente produzido para conter:

(i) um promotor que permita transcrição na célula hospedeira;

(ii) um polinucleotídeo da presente invenção ligado a dito promotor; e (iii) um cassete de expressão que está envolvido na terminação da transcrição e poliadenilação de moléculas de RNA e que contém, como um componente do mesmo, um sinal que funciona na célula hospedeira.

[00114] Exemplos do método para preparar um vetor de expressão incluem, mas não particularmente limitado a, um método que usa um plasmídeo, um fago, um cosmídeo ou similares, e moléculas de DNA tendo os componentes necessários.

[00115] O tipo específico do vetor não é particularmente limitado, e qualquer vetor que permita a expressão na célula hospedeira pode ser apropriadamente selecionado. Especificamente, uma sequência promotora é apropriadamente selecionada de acordo com o tipo da célula hospedeira para assegurar a expressão do polinucleotídeo da presente invenção, e um vetor obtido pela integração desta sequência promotora e o polinucleotídeo da presente invenção em um plasmídeo ou similares é usado como um vetor de expressão.

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34/68 [00116] O vetor de expressão da presente invenção inclui regiões de controle de expressão (por exemplo, um promotor, um terminador e/ou uma origem de replicação e similares) dependendo do tipo do hospedeiro no qual ele é introduzido. Um promotor usado em um vetor de expressão de bacteriano pode ser um promotor comum (por exemplo, um promotor trc, um promotor tac, um promotor lac, etc.), um promotor usado para um levedura pode ser, por exemplo, um promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um promotor PH05, um promotor GAL1/10 ou similares, e um promotor para fungos filamentosos pode ser, por exemplo, amilase, trpC ou similares. Além de que, exemplos de um promotor para expressar o gene de interesse em uma célula de planta incluem um promotor de RNA 35S do vírus do mosaico da couve-flor, um promotor do gene rd29A, um promotor rbcS, e um promotor mac-1 no qual o intensificador de sequência promotor do RNA 35S do vírus do mosaico da couve-flor é fornecido na 5' extremidade de uma sequência promotora de manopina sintase derivada de Agrobactéria. Um promotor para um hospedeiro de célula animal pode ser um promotor viral (por exemplo, um promotor inicial de SV40, um promotor final de SV40, etc.). Exemplos de um promotor que é ativado induzivelmente em resposta a estímulos externos incluem um promotor do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), um promotor responsivo à tetraciclina, um promotor de metalotioneína e um promotor de proteína de choque térmico.

[00117] Preferivelmente, o vetor de expressão contém pelo menos um marcador selecionável. Como tal marcador, um marcador auxotrófico (LEU2, URA3, HIS3, TRP1, ura5, niaD), um marcador resistente a fármaco (higromicina, zeocina), um gene de resistência a geneticina (G418r), um gene de resistência a cobre (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 81, p. 337, 1984), um gene de resistência à cerulenina (fas2m, PDR4) (Junji Inokoshi et al., Journal of Japanese Biochemical Society, vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991, respectivamente) ou

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35/68 similares podem ser usados.

[00118] Como um método para transformar uma célula hospedeira, um método conhecido geralmente empregado pode ser empregado. Por exemplo, um método de eletroporação (Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000), um método de distribuição de partícula (Publicação de Pedido de Patente Não Examinado JP No. 2005287403), um método de esferoplastos (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), um método de acetato de lítio (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983), um método descrito em Methods in yeast genetics, 2000 Edição: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, ou similares podem ser realizados embora a presente invenção não seja limitada aos mesmo.

[00119] Além disso, como para processos gerais de biologia molecular, ver “Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”, “Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)” e similares.

[00120] Um transformante não humano obtido como descrito acima pode ser cultivado a fim de permitir que o transformante não humano produza um glicosídeo de este viol. Tal transformante não humano é preferivelmente uma levedura. Além de que, o transformante não humano é cultivado preferivelmente em um meio contendo esteviol. O glicosídeo de esteviol acumulado pode ser extraído/purificado para obter o glicosídeo de esteviol da presente invenção.

EXEMPLOS [Isolamento do novo glicosídeo de esteviol] [00121] Extratos obtidos a partir de folhas de quatro linhagens de novos corpos de planta de estévia (Amostra 1 (EM3-4), Amostra 2 (EM2-278), Amostra 3 (EM2-27-15) e Amostra 4 (EM2-11)) desenvolvidos em Suntory Global Innovation Center (SIC) foram submetidos a cromatografia

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36/68 líquida de alta eficiência (HPLC) - espectrometria de separação-massa (MS) para a análise de triagem do glicosídeos de esteviol contido nos corpos da planta de estévia com base nos pesos moleculares de glicosídeos de esteviol que tinham uma cadeia de açúcar formada de D-glucopiranosil (Glc), Lrhamnopiranosil (Rha) e xilopiranosil (Xyl). Aqui, Amostra 1 é uma planta com alto teor de Reb. C tendo um polimorfismo do genoma de A no tipo selvagem sendo alterado para T no 60° nucleotídeo da sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 11 no genoma. Uma análise estatística da correlação entre o fenótipo tendo uma alta concentração de Reb.C e o polimorfismo de SEQ ID NO: 11 revelou que dito polimorfismo tinha uma correlação estatística com o fenótipo tendo uma alta concentração de Reb.C.

[00122] Um processo para preparar um líquido de teste foi como a seguir: 10,0 mg de cada de folhas de estévia secas liofilizadas foram pesados em um frasco de vidro, ao qual 1,0 mL de água/metanol (1/1 volume/volume) foram adicionados como um solvente de extração, e então o resultante foi submetido a irradiação ultrassônica em um limpador ultrassônico (AS ONE, AS52GTU) a uma temperatura estabelecida de 25°C durante 20 minutos, obtendo assim um extrato líquido de um glicosídeo de esteviol das folhas de folhas de estévia. O resultante foi diluído adicionalmente 10 vezes com água/metanol e filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 pm (Nacalai tesque, filtro Cosmonice S (solvente)) antes de ser submetido a HPLC-MS.

[00123] Para a parte HPLC de HPLC-MS, Nexera LC-30AD (Shimadzu Corporation) foi usado como uma bomba LC de unidade de entrega de líquido, e SM-C18 (4,6 x 250 mm) (de Imtakt) como uma coluna de separação. Distribuição de líquido da fase móvel LC foi realizada usando 0,2% água Milli-Q água contendo ácido acético como fase móvel A e metanol como fase móvel B onde o gradiente binário foi tal que a concentração da fase

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37/68 móvel B foi mantida constantemente a 10% durante 0-5 minutos, trocada para 10% a 70% os 15 minutos seguintes, e então trocada para 70% a 100% nos 5 minutos seguintes, e o gradiente foi finalmente terminado mantendo a concentração da fase móvel B a 100% durante 5 minutos. A taxa de fluxo da fase móvel foi 0,4 mL/min, e o extrato líquido de folha de estévia que tinha sido diluído e filtrado com um filtro foi injetado para 5 pL.

[00124] Para a parte MS, espectrômetro de massa triplo quadrupolo LCMS-8030 (Shimadzu Corporation) equipado com uma fonte de íons para ionização por eletropulverização (ESI) foi usado. A medição de espectrometria de massa foi realizada no modo de monitoramento de íon selecionado (SIM) selecionando o modo de medição de íons negativos e os valores m/z. os valores m/z foram selecionados pelo cálculo com base nos pesos moleculares do glicosídeos de esteviol que tinha cadeias de açúcar formadas de D-glucopiranosil (Glc), L-rhamnopiranosil (Rha) e xilopiranosil (Xyl). Consequentemente, m/z = 641,2 (Glc (2)), 773,2 (Glc (2), Xyl (1)), 787,2 (Glc (2), Rha (1)), 803,2 (Glc (3)), 935,3 (Glc (3), Xyl (1)), 949,3 (Glc (3), Rha (1)), 965,3 (Glc (4)), 1095,4 (Glc (3), Rha (2)), 1097,4 (Glc (4), Xyl (1)), 1111,4 (Glc (4), Rha (1)), 1127,4 (Glc (5)), 1257,5 (Glc (4), Rha (2)),

1259,5 (Glc (5), Xyl (1)), 1273,5 (Glc (5), Rha (1)), 1289,5 (Glc (6)), 1435,6 (Glc (6), Rha (1)) foram selecionados. Além disso, um reagente de elevada pureza, rebaudiosídeos A, B, D, F, M, N e O, esteviosídeo, e dulcosídeos A e B disponíveis também foram medidos sob as mesmas condições a fim de confirmar os valores negativos de íon m/z e o tempo de retenção em HPLC. As áreas de pico (unidade arbitrária) dos glicosídeos de esteviol detectados principalmente são mostradas na tabela 1.

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STM em HPLC-MS

Tabela 1: Áreas de pico (unidade arbitrária) observadas

Nome do composto	Rebaudiosídeo A	Rebaudiosíde oC	Rebaudiosídeo D	Rebaudiosídeo M	Dulcosídeo C	Novo glicosídeo de esteviol 1 m/z 1095,4	Novo glicosídeo de esteviol 2 m/z 1257,5	Rebaudiosíde oN
Tempo de retenção (min)	29,60	29,96	28,00	28,66	27,70	28,73	28,50	28,18
Área de pico (Amostra 1)	29.669.582	30.122.062	1.428.384	1.030.603	140.947	76.369	242.070	772.570
46,92%	47,63%	2,26%	1,63%	0,22%	0,12%	0,38%	1,22%
Área de pico (Amostra 2)	23.762.676	24.201.473	2.253.735	1.029.837	97.388	94.330	292.157	1.211.504
45,13%	45,97%	4,28%	1,96%	0,18%	0,18%	0,55%	2,30%
Área de pico (Amostra 3)	15.386.726	5.872.656	3.585.775	3.296.579	89.988	0	86,845	896,549
52,82%	20,16%	12,31%	11,32%	0,31%	0,00%	0,30%	3,08%
Área de pico (Amostra 4)	16.070.017	10.339.094	1.404.429	74.413	0	17.634	0	308.709
56,96%	36,64%	4,98%	0,26%	0,00%	0,06%	0,00%	1,09%

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39/68 [00125] A Figura 2 mostra um cromatograma iônico selecionado da amostra 1 (EM3-4) em m/z de 1095,4. Um pico de um peso molecular que nunca tinha sido relatado foi observado no cromatograma iônico selecionado do glicosídeo de esteviol (m/z 1095,4) no qual a cadeia de açúcar modificada continha três porções de glicose (Glc) e duas porções de ramnose (Rha). Especificamente, o pico a Rt 28,73 minutos mostrado na Figura 2 era uma substância desconhecida. Para a Amostra 3 cujo teor de rebaudiosídeo C era inferior ao teor de rebaudiosídeo A e cujo alongamento de cadeia de açúcar era mais curto do que o de outras amostras, o valor de pico a Rt 28,73 minutos era inferior ao do limite de detecção.

[00126] A Figura 3 mostra um cromatograma iônico selecionado da amostra 1 (EM3-4) em m/z de 1257,5. Um pico de um peso molecular que nunca tinha sido relatado foi observado no cromatograma iônico selecionado do glicosídeo de esteviol (m/z 1257,5) no qual a cadeia de açúcar modificado continha quatro porções de glicose (Glc) e duas porções de ramnose (Rha). Especificamente, o pico a Rt 28,50 minutos mostrado na Figura 3 era uma substância desconhecida. Para a Amostra 4 cujo teor de rebaudiosídeo C era inferior ao do teor de rebaudiosídeo A e cujo alongamento de cadeia de açúcar era mais curto do que o de outras amostras, o valor do pico a Rt 28,50 minutos era inferior ao do limite de detecção.

[Análise estrutural de novo glicosídeo de esteviol] [00127] De acordo com a presente invenção, a análise estrutural dos novos glicosídeos de esteviol 1 e 2 detectados em um cultivar com alto teor de rebaudiosídeo C foi realizada de acordo com o seguinte procedimento.

(i) Dedução estrutural por uma análise de fragmentação através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)-espectrometria de massa de alta resolução (MS), MS/MS, e fragmentação de íons em três estágios (fragmentação MS³).

(ii) Síntese química dos produtos padrão de glicosídeo de

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40/68 esteviol deduzidos através de reação química.

(iii) Confirmação estrutural por combinação com os produtos padrão sintetizados quimicamente com relação ao tempo de retenção e o padrão fragmentado de fragmentação MS e MS³ por HPLC de alta resolução [00128] Nas partes abaixo, cada de Etapas (i)-(iii) acima serão descritas em detalhes.

(i) Dedução estrutural por uma análise de fragmentação através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)-espectrometria de massa de alta resolução (MS), MS/MS, fragmentação de íons em três estágios (fragmentação MS³) [00129] Um processo para preparar líquidos de teste foi como a seguir: 10,0 mg cada de folhas de estévia secas liofilizadas foram pesados em um frasco de vidro, ao qual 1,0 mL de água/metanol (1/1 volume/volume) foram adicionados como um solvente de extração, e então o resultante foi submetido à irradiação ultrassônica em um limpador ultrassônico (AS ONE, AS52GTU) a uma temperatura definida de 25°C durante 20 minutos, obtendo assim um extrato líquido e um glicosídeo de esteviol das folhas de estévia. O resultante foi adicionalmente diluído 10 vezes com água/metanol e filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 pm (Nacalai tesque, filtro Cosmonice S (solvente)) antes de ser submetido a HPLC-MS.

[00130] Em uma configuração de equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência-ionização por pulverização-espectrometria de massa de alta resolução (HPLC-ESI-HRMS), equipamento de HPLC foi configurado usando Prominence LC-20AD (Shimadzu Corporation) como uma bomba K/c de unidade de entrega de líquidos e SM-C18 (4,6 x 250 mm) (de Imtakt) como uma coluna de separação. A fase móvel LC foi distribuída usando água Milli-Q contendo 0,2% de ácido acético como fase móvel A e metanol como fase móvel B, onde o gradiente binário era de modo que a concentração da fase móvel B foi mantida constantemente a 10% durante 0-5 minutos, trocada

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41/68 de 10% para 70% nos próximos 15 minutos, e trocada adicionalmente de 70% para 100% nos 5 minutos seguintes. Finalmente, a concentração da fase móvel B foi mantida a 100% durante 5 minutos até o final. A taxa de fluxo da fase móvel era 0,4 mL/min, e o extrato líquido de folha de estévia que tinha sido diluído e subsequentemente filtrado com um filtro foi injetado para 20 pL. para a parte de espectrometria de massa, Orbitrap Elite MS (de Thermo Fisher Scientific) equipado com uma fonte de ion ESI foi usado. A medição de espectrometria de massa foi realizada em um modo de medição de íons negativos em m/z em uma faixa de 150-2000 com resolução definida para 60.000. A medição MS/MS foi realizada selecionando o m/z alvo de 1095,4 ou 1257,5 e em um modo CID onde fragmentação foi induzida por colisão com um gás inerte. O ion com a intensidade mais alta no espectro MS/MS foi marcado para MS³. Irradiação de energia exigida para fragmentação foi realizada na energia de colisão padrão única para o aparelho, isto é, 35.

[00131] A fim de estudar o padrão fragmentado dos novos glicosídeos de esteviol 1 e 2, amostras padrão de rebaudiosídeos A, D e M com estruturas conhecidas foram submetidos à análise de padrão de fragmentação MS/MS e MS³. Como um resultado, MS/MS do novo glicosídeo de esteviol deram dados mostrando que a intensidade mais alta de íons apareceu no pico onde todas as cadeias de açúcar fixadas em C-19 via uma ligação éster foram liberadas. Este resultado representa o peso molecular total as cadeias de açúcar fixadas no carbono em C-19 via uma ligação éster.

[00132] Os espectros de massa fragmentada MS/MS e MS³ do novo glicosídeo de esteviol 1 (correspondendo em m/z 1095,4, Rt:28,73) são mostrados na Figura 4. No espectro MS/MS do novo glicosídeo de esteviol, o pico principal foi detectado em m/z de 787,38 correspondendo a liberação de uma porção Glc e uma porção Rha. A partir destes resultados, o número de cadeias de açúcar fixadas ao carbono de C-19 via uma ligação éster foi verificado como sendo uma porção Glc e uma porção Rha. A fim de adquirir

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42/68 informação estrutural adicional, um espectro MS³ foi adquirido fragmentando o pico principal em m/z de 787,4 obtido por MS/MS. Como um resultado, um espectro tendo o mesmo padrão de pico que o espectro MS³ de rebaudiosídeo C (949,4^787,4^) foi adquirido. Consequentemente, as cadeias de açúcar fixadas em C-13 foram presumidas como sendo a mesma que a do rebaudiosídeo C. A estrutura deduzida é mostrada na Figura 4.

[00133] Os espectros de massa fragmentada MS/MS e MS³ do novo glicosídeo de esteviol 2 (correspondendo em m/z 1257,5, Rt:28,50) são mostrados na Figura 5. No espectro MS/MS do novo glicosídeo de esteviol, o pico principal foi detectado em m/z de 787,38 correspondendo a liberação de duas porções Glc e uma porção Rha. A partir destes resultados, o número de cadeias de açúcar fixadas ao carbono de C-19 via uma ligação éster foi verificado como sendo duas porções Glc e uma porção Rha. A fim de adquirir informação estrutural adicional, um espectro MS³ foi adquirido fragmentando o pico principal em m/z de 787,4 obtido por MS/MS. Como um resultado, um espectro tendo o mesmo padrão de pico que o do espectro MS³ de rebaudiosídeo C (949,4^787,4^) foi adquirido. Consequentemente, as cadeias de açúcar fixadas em C-13 foram presumidas coo sendo as mesmas que a do rebaudiosídeo C. A estrutura deduzida é mostrada na Figura 5.

(ii) Síntese química de produto padrão de glicosídeo de esteviol deduzido por reação química [Síntese do novo glicosídeo de esteviol 1] (1) Esboço de vias sintéticas

Esquema 7: Estratégia para sintetizar o novo glicosídeo de esteviol 1

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Bemisceial de disssearideo (8)

doador de ramnC'Se <5 (3) *OH

Receptor de glicose

[00134] Como pode ser notado a partir do Esquema 7, para a síntese do novo glicosídeo de esteviol 1 (Composto 15), o glicosideo de esteviol (Composto 3) e o hemiacetal de dissacarídeo (Composto 8) foram condensados através de reação de Mitsunobu para obter a estrutura dorsal do novo glicosideo de esteviol 1 (Composto 15). Para síntese do glicosideo de esteviol, uma substância natural conhecida, rebaudiosídeo C (Composto 1), foi comprada de Ark Pharm, a ligação éster em C-19 de esteviol foi submetida à hidrólise alcalina e então os grupos hidroxila da cadeia de açúcar foram protegidos com grupos acetila (Ac) para obter o glicosídeo de esteviol. Para síntese do hemiacetal de dissacarídeo, uma estrutura dorsal de dissacarídeo foi produzida por reação de condensação entre um receptor de glicose apropriadamente protegido (Composto 4) e um doador de ramnose (Composto 5), e o grupo protetor no carbono anomérico da extremidade redutora foi

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44/68 desprotegido para dar o hemiacetal de dissacarídeo. O glicosídeo de esteviol e hemiacetal de dissacarídeo resultantes foram submetidos à condensação através de reação de Mitsunobu, onde a reação prossegui com bom rendimento e alta seletividade β de 75% (α/β= 1/20). Os grupos protetores do composto resultante foram desprotegidos, obtendo assim o novo glicosídeo de esteviol 1 (15).

[00135] Em seguida, cada uma das etapas de síntese será descrita.

(2) Síntese de glicosídeo de esteviol

Esquema 8: Síntese de glicosídeo de esteviol

[00136] Como pode ser notado a partir do Esquema 8, para síntese do glicosídeo de esteviol (Composto 3), rebaudiosídeo C (Composto 1) (1,0 g, 1,05 mmol) comprado de Ark Pharm foi dissolvido em metanol (10 mL) e água (10 mL), adicionado com 4 mol/L de hidróxido de sódio (2,6 mL, 10,4 mmol) em temperatura ambiente, e refluxado a 100°C durante 20 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (clorofórmio/metanol/água = 5/4/0,1, valor Rf = 0,9), a solução de reação foi neutralizada com resina de troca catiônica Dowex MAC-3 na forma de hidrogênio (SIGMA-ALDRICH) (pH 7). Após a resina ser removida por filtração, o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi seco durante 18 horas usando uma bomba de vácuo para dar o composto 2 (828 mg, quant.).

[00137] Composto 2 (828 mg, 1,05 mmol) foi dissolvido em piridina (20 mL), adicionado com anidrido acético (5 mL) em temperatura ambiente e agitado em temperatura ambiente durante 48 horas. Após confirmação do

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45/68 término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor Rf = 0,5), uma solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio (5 mL) foi adicionada, e a solução de reação foi concentrada sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido à cromatografia em coluna de silica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 2/1) foi usado para dar o composto 3 (1,1 g, 92%).

[Composto 3]

Ή-RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 0,81 (m, 2H), 0,83-1,45 (complexo, 19H), 1,39-1,91 (complexo, 24H), 1,91-2,35 (s, 30H), 3,58 (m, 1H), 3,71-3,81 (complexo, 4H), 3,95-4,12 (complexo, 7H), 4,34-4,46 (complexo, 3H), 4,56-4,66 (complexo, 4H), 4,69-4,92 (complexo, 7H), 5,055,14 (complexo, 5H), 5,23-5,38 (complexo, 6H), 5,45 (s, 1H); ¹³C-RMN (CDCI3, 100 MHz) δ 15,9, 17,3, 19,1, 20,5, 20,7, 20,8, 20,9, 21,1, 21,5, 21,7,

29,1, 37,8, 38,0, 39,5, 40,7, 41,4, 42,2, 43,8, 48,4, 53,8, 56,8, 61,6, 63,0, 65,5,

66,8, 68,0, 68,6, 69,3, 69,6, 69,8, 70,5, 70,9, 71,6, 71,9, 72,4, 72,8, 73,9, 74,9,

81,3, 87,3, 96,6, 96,8, 99,2, 99,4, 125,4, 128,3, 129,1, 137,9, 151,9, 168,9,

169,2, 169,5, 169,6, 169,8, 170,1, 170,2, 170,3, 170,6, 170,9, 176,8, 183,4.

(3) Síntese de hemiacetal de dissacarídeo

Esquema 9: Síntese de hemiacetal de dissacarídeo

Aco-^rüz π AcO^Z ' NPh ^ACU OAc

S 1.1 eq.

TfOH

OH ch₂çi₂

MS4A

RT

81% _A.

O

AeoZZZ^^{2 3}'

AcO

GAc

H₂

Pd(OH)₂

EtOH/THF

RT <^OH

O

AcO-ZZ^S/ ^AcO OAc (Í) Ac₂o

Pyr. RT (2) CAN

MeCN/H₂O =2/1

RT

66% (3 etapas)

-OAc

AcO-A-O AcG->«^*V^oh0 AcO-ZZpSj^ ^AcO OAc

Hemiacetal de dissacarídeo

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46/68 [00138] Como pode ser notado a partir do Esquema 9, para síntese do hemiacetal de dissacarídeo (Composto 8), 4-metoxifenil 3-O-benzil-4,6-Obenzilidina-P-D-glicopiranosídeo (Composto 4) (3,0 g, 6,46 mmol) comprado de Tokyo Chemical Industry, Composto 5 (3,3 g, 7,10 mmol) e peneiras o

moleculares 4A (6,0 g) foram dissolvidos em diclorometano (136 mL), adicionado com ácido trifluorometanossulfônico (114 pL, 1,29 mmol) em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 18 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 1/2, valor Rf = 0,5), o resultante foi neutralizado com trietilamina (100 pL) o

(pH 8), peneiras moleculares 4A foram removidas por filtração, e o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido à cromatografia em coluna de silica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 1/1,5) foi usado para dar o composto 6 (3,9 g, 81%).

[Composto 6]

Ή-RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 1,18 (d, J = 6,4 Hz, 3H, H-6 de Rha), 1,96 (s, 3H, OAc), 1,98 (s, 3H, OAc), 2,07 (s, 3H, OAc), 3,51 (m, 1H, H-5), 3,73-3,81 (complexo, 5H, H-4, H-6, OMe), 3,83-3,96 (complexo, 2H, H-2, H-3), 4,28 (m, 1H, H-5 de Rha), 4,36 (m, 1H, H-6’), 4,70 (d, 1H, CH₂Ph), 4,95 (d, 1H, CH₂Ph), 4,99 (d, J = 7,2 Hz, 1H, H-l), 5,03 (t, 1H, H-4 de Rha), 5,20 (dd, 1H, H-3 de Rha), 5,32 (s, 1H, H-l de Rha), 5,34 (m, 1H, H-2 de Rha), 5,57 (s, 1H, CHPh), 6,90 (dd, 4H, OMePh), 7,21-7,49 (complexo, 10H, Ph); ¹³C-RMN (CDC1₃, 100 MHz) δ 14,2, 17,4, 20,8, 20,9, 21,0, 22,8, 31,7, 55,8, 66,2, 66,7, 68,8, 69,4, 69,5, 71,0, 75,2, 76,7, 77,5, 81,7,

81,8, 98,4, 100,8, 101,4, 114,8, 118,3, 126,1, 127,9, 128,4, 128,5x2, 129,2,

137,2, 137,9, 150,8, 155,7, 169,9, 170,1, 170,2.

[00139] Composto 6 (3,9 g, 5,29 mmol) foi dissolvido em etanol (27 mL) e THF (27 mL), adicionado com hidróxido de paládio (2,0 g) em temperatura ambiente, e agitado em uma atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 18 horas. Após confirmação do término da

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47/68 reação por TLC (clorofórmio/metanol = 10/1, valor Rf = 0,2), hidróxido de paládio foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado sob uma pressão reduzida para dar o composto 7 (quantidade 2,9 g).

[00140] Composto 7 (1,1 g, 1,97 mmol) foi dissolvido em piridina (20 mL), adicionado com anidrido acético (740 pL, 7,88 mmol) em temperatura ambiente, e agitado em temperatura ambiente durante 24 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 1/1, valor Rf = 0,6), destilação azeotrópica com tolueno (30 mL) foi repetida três vezes. Subsequentemente, o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida e o xarope resultante foi dissolvido em acetonitrila (14 mL) e água (7,0 mL), adicionado com nitrato de cério e amônio (3,2 g, 5,91 mmol) em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 30 minutos. Após confirmação do término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 1,5/1, valor Rf = 0,5), o resultante foi diluído com acetato de etila, a camada orgânica foi lavada com água e uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio, e seca com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração e o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido à cromatografia em coluna de silica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 1/1) e (tolueno/acetato de etila = 3/1) foram usados para dar o composto 8 (721 mg, 66%, 3 etapas).

[Composto 8]

Ή-RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 1,16-1,19 (complexo, 4,5H, H6a de Rha, Η-6β de Rha), 1,97-2,34 (complexo, 27 H, OAc), 3,58 (t, 0,5H, H2β), 3,72-3,75 (complexo, 1,5H, Η-2α, Η-5β), 4,00 (m, 1H, H-4a de Rha), 4,05-4,16 (complexo, 1,5H), 4,21-4,27 (complexo, 3H), 4,76 (d, J = 7,6 Hz, 0,5H, Η-1β), 4,86 (s, 1H, H-Ία de Rha), 4,91 (s, 0,5H, H-Ιβ de Rha), 4,985,08 (complexo, 4,6H), 5,23-5,26 (complexo, 2H), 5,34 (d, J = 3,2 Hz, 1H, Hla), 5,48 (t, 1H, H-3a); ¹³C-RMN (CDC1₃, 100 MHz) δ 17,2, 17,5, 20,7x2,

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48/68

20,8x3, 20,9x2, 21,0, 21,6, 62,1, 62,2, 67,2, 67,3, 67,5, 68,5, 68,6, 68,7, 70,0,

70,4, 71,0, 74,2, 77,4, 77,9, 79,3, 92,0, 75,7, 98,4, 99,2, 125,4, 128,3, 129,1, 137,9, 169,8, 169,9x2, 170,0, 170,1x2, 170,2, 170,4, 170,9x2.

(4) Síntese de Composto 15

Esquema 10: Síntese do novo glicosídeo de esteviol 1 (Composto alvo 15)

PBu₃TMAD

Ld-cikjxaiKJ °C 75% (α/β=1/20)

Glicosídeo de esteviol 3

1,5 eq.

Hemiacetal de dissacarídeo S

-OH

Composto alvo 15 [00141] Como pode ser notado a partir do Esquema 10, para síntese de Composto 15, Composto 8 (291 mg, 0,503 mmol) e Composto 3 (391 mg, 0,335 mmol) foram dissolvidos em 1,4-dioxano (17 mL), adicionados com tributilfosfina (252 pL, 1,01 mmol) e l,l’-azobis (N,N’-dimetilformamida) (TMAD) (173 mg, 1,01 mmol) em temperatura ambiente, e agitados a 60°C durante 6 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (tolueno/acetato de etila = 1/1, valor Rf = 0,4), o resultante foi diluído com acetato de etila, a camada orgânica foi lavada com água, uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução salina saturada, e seca com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração, e o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi

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49/68 submetido à cromatografia em coluna de silica gel e um eluato (tolueno/acetato de etila = 1,5/1) foi usado para dar o composto 14 (435 mg, 75%, α/β= 1/20).

[Composto 14]

Ή-RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 0,50-1,18 (complexo, 7H), 1,15 (d, 3H, H-6 de Rham), 1,24 (s, 3H), 1,40-2,32 (complexo, 70H), 3,60 (m, 1H), 3,73 (m, 2H), 3,82-4,28 (complexo, 10H), 4,40-4,48 (complexo, 2H), 4,63 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,72 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,75-4,88 (complexo, 3H), 4,98 (s, 1H), 5,01-5,18 (complexo, 8H), 5,24-5,31 (complexo, 4H), 5,32 (s, 1H), 5,71 (d, J = 7,6 Hz, 1H, Η-1β), 6,31 (d, J = 3,0 Hz, 0,05H, H-Ια); ¹³C-RMN (CDCh, 100 MHz) δ 16,6, 17,4, 17,6, 20,5, 20,7x2, 20,8x3, 20,9x3, 21,6, 29,0, 39,5, 42,5, 44,1, 53,8, 57,9, 61,7, 66,6, 67,4, 68,0, 68,3, 68,5, 68,7, 69,7,

69,8, 70,8, 71,1, 71,4, 71,9x2, 72,4, 72,9, 74,2, 75,1, 86,6, 92,2, 96,4, 96,9,

97,7, 99,3, 125,4, 128,3, 129,1, 152,9, 169,0, 169,5, 169,8x2, 169,9, 170,0,

170,1, 170,2x2, 170,3, 170,5, 170,6, 170,9x2, 174,6.

[00142] Composto 14 (435 mg, 0,252 mmol) foi dissolvido em metanol (2,0 mL) e THF (2,0 mL), adicionado com metóxido de sódio (0,5M em MeOH) (0,5 mL, 0,252 mmol) em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 18 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (clorofórmio/metanol/água = 5/4/1, valor Rf = 0,4), o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido à coluna de filtração em gel (GE Healthcare, Sephadex LH-20, etanol) para dar o composto 15 (220 mg, 80%, α/β= 1/20). Subsequentemente, a forma β de Composto 15 foi isolada por HPLC preparativa (coluna Cl8 YMC HPLC, 20 mM solução aquosa de acetato de amônio/90% acetonitrila/10% água = 70/30-10/90, 45 minutos), e submetida à liofilização. Os dados da análise estrutural de Composto 15 pelo método de ressonância magnética nuclear (RMN) são mostrados nas Figuras 6-9.

[Composto 15 (a forma β)]

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50/68

Ή-RMN (piridina-d5, 800 MHz) δ 0,68 (m, 1H), 0,86 (m, 1H), 0,98 (m, 1H), 1,11-1,15 (complexo, 4H), 1,24 (m, 2H), 1,39 (m, 2H), 1,49 (s, 3H), 1,62 (m, 3H), 1,71 (d, 3H), 1,75 (d, 3H), 1,88 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 2,00 (m, 2H), 2,11 (m, 2H), 2,19 (m, 2H), 2,46 (m, 1H), 2,66 (m, 1H), 3,62 (m, 1H), 3,91 (m, 1H), 3,97-4,10 (complexo, 5H), 4,17-4,42 (complexo, 11H), 4,49 (m, 1H), 4,51-4,59 (complexo, 3H), 4,73 (m, 1H), 4,82 (m, 1H), 4,87 (m, 1H), 4,98 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,08 (s, 1H), 5,10 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 5,66 (s, 1H), 6,26 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,41 (s, 1H), 6,47 (s, 1H); ¹³C-RMN (piridina-d5, 200 MHz) δ 17,1, 19,2x2, 20,1, 20,9, 22,3, 29,6, 37,9, 38,2,

39,9, 40,9, 41,9, 42,8, 43,7, 44,5, 48,4, 54,1, 58,3, 62,3, 62,4, 62,5, 69,8x2,

70,2, 71,2, 71,6, 72,4, 72,5, 72,6, 74,0, 74,1, 75,2, 76,4, 76,8, 77,4, 78,5, 78,8, 79,0, 79,5, 86,9, 89,8, 94,0, 98,4, 101,8, 101,9, 104,4, 105,3, 154,5, 176,2.

[a]_D = -46,3° (c 0,05, MeOH)

MALDI-TOF-MS m/z encontrado [M + Na]⁺ 1119,5, C50H80O26 calculado para [M + Na]⁺ 1119,5.

[Síntese do novo glicosídeo de esteviol 2] (1) Esboço de vias sintéticas

Esquema 11: Estratégia para sintetizar novo glicosídeo de esteviol 2

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51/68

Hemiacetal de trissacarídeo 13

Doadoi de glicose 1Q Receptor de dissacarideo

(rebaudiosídeo Cl)

Doador de íbüiííosê 5 bSoX^Í^omp OH

Receptor de glicose 4 [00143] Como pode ser notado a partir do Esquema 11, para a síntese do novo glicosídeo de esteviol 2 (Composto 17), o glicosídeo de esteviol (Composto 3) e o hemiacetal trissacarídeo (Composto 13) foram condensados através de reação de Mitsunobu para obter a estrutura dorsal do novo glicosídeo de esteviol 2. Para síntese do glicosídeo de esteviol, uma substância natural conhecida, rebaudiosídeo C (Composto 1), foi comprada de Ark Pharm, a ligação éster em C-19 de esteviol foi submetida a hidrólise alcalina e então os grupos hidroxila da cadeia de açúcar foram protegidos com grupos acetila (Ac) para obter o glicosídeo de esteviol. Para síntese do hemiacetal trissacarídeo, um receptor de dissacarideo (Composto 9) foi

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52/68 sintetizado por reação de condensação entre um receptor de glicose apropriadamente protegido (Composto 4) e um doador de ramnose (Composto 5), que foi submetido a reação de condensação com um doador de glicose (Composto 10) para dar a estrutura dorsal de trissacarídeo. O grupo protetor no carbono anomérico da extremidade redutora do trissacarídeo resultante foi desprotegido para dar o hemiacetal trissacarídeo. O glicosídeo de esteviol e o hemiacetal trissacarídeo foram submetidos a condensação através de reação de Mitsunobu, onde a reação prosseguiu com bom rendimento e alta seletividade β de 44% (α/β= 1/10). Os grupos protetores do composto resultante foram desprotegidos, obtendo assim o novo glicosídeo de esteviol

2.

[00144] A seguir, cada uma das etapas de síntese será descrita.

(2) Síntese de glicosídeo de esteviol [00145] Glicosídeo de esteviol foi sintetizado do mesmo modo que na “Síntese do novo glicosídeo de esteviol 1”.

(3) Síntese de hemiacetal de trissacarídeo

Esquema 12: Síntese de hemiacetal de trissacarídeo

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53/68

AoO^g/^V^³ ^l_Ae

1.1 eq.

Ph-^O^

BnCi*>

.O

OH

TfOH o—' 8nO”

O _Afc^OMP

AcO-ji^ ^AcO ÓAc

MeCN

RT ch₂ci₂

MS4A

RT

81%

EtOH/THF

RT

PhCH(OMe)₂

CSA

(2) Ac.;>0 Pyr. RT (1) H₂

Pd(OH)₂

EtOH/THF

RT

----—---**

22% (3 etapas)

CAN

MeCN/HoO =2/1

RT

84% □ etapas)

hemiacetal de trissacarideo [00146] Como pode ser notado a partir do Esquema 12, Compostos 6 e 7 foram obtidos do mesmo modo que na “Síntese do novo glicosídeo de esteviol 1”.

[00147] Composto 7 (1,7 g, 3,04 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (30 mL), adicionado com benzaldeído dimetil acetal (681 pL, 4,57 mmol) em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 2 horas. O término da reação foi confirmado por TLC (acetato de etila/hexano = 1/1, valor Rf = 0,7). O resultante foi neutralizado com trietilamina (2 mL) (pH 8), e então concentrado sob uma pressão reduzida para dar o composto 9 (2,0 g).

[00148] O Composto 9 (2,0 g, 3,04 mmol), o Composto 10 (1,6 g, 3.34 o

mmol) e peneiras moleculares 4A (4,0 g) foram dissolvidos em diclorometano (64 mL), adicionados com ácido trifluorometanosulfônico (114 pL, 1,29 mmol) em temperatura ambiente, e agitados a 0°C durante 6 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 1/1,

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54/68 valor Rf = 0,4), θ resultante foi neutralizado com trietilamina (100 pL) (pH o

8), peneiras moleculares 4A foram removidas por filtração, e o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido a cromatografia em coluna de silica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 1/2) foi usado para dar o composto 11 (650 mg, 22%, 3 etapas).

[Composto 11]

Ή-RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 1,16 (d, J = 6,0 Hz, 1H, H-6 de Rha), 1,94-2,19 (complexo, 21H, OAc), 3,43-3,52 (complexo, 2H), 3,62-3,81 (complexo, 5H, OMe), 3,96-4,04 (complexo, 2H), 4,07-4,18 (complexo, 3H), 4,28-4,35 (complexo, 2H), 4,86 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-l), 4,94-4,98 (complexo, 2H, H-l), 5,01-5,11 (complexo, 2H), 5,16-5,21 (complexo, 2H), 5,28 (s, 2H, H-l de Rha), 5,52 (s, 1H, PhCH), 6,90 (dd, 4H, PhOMe), 7,317,49 (complexo, 5H, Ph); ¹³C-RMN (CDC1₃, 100 MHz) δ 14,3, 17,3, 20,4,

20.7, 20,9x3, 21,0, 21,1, 55,8, 60,5, 62,0, 66,3, 66,9, 68,3, 68,7, 69,3, 69,4,

70.7, 71,6, 71,9, 72,9, 78,9, 81,0, 97,7, 99,3, 100,7, 101,6, 114,8, 118,4,

126,2, 128,4, 129,4, 137,1, 150,7, 155,8, 169,4, 169,5, 170,0, 170,2, 170,4,

170,5, 170,8, 171,2.

[00149] Composto 11 (627 mg, 0,642 mmol) foi dissolvido em etanol (3 mL) e THF (3 mL), adicionado com hidróxido de paládio (1,0 g) em temperatura ambiente, e agitado em uma atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante duas horas. Após confirmação do término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor Rf = 0,2), hidróxido de paládio foi removido por filtração, e o filtrado foi concentrado sob uma pressão reduzida. Subsequentemente, o resultante foi dissolvido em piridina (6,4 mL), adicionado com anidrido acético (182 pL, 1,93 mmol) em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 18 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor Rf = 0,7), destilação azeotrópica com tolueno (20 mL) foi repetida três vezes. Subsequentemente, o resultante foi concentrado sob uma pressão

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55/68 reduzida. O xarope resultante foi dissolvido em acetonitrila (4 mL) e água (2 mL), adicionado com nitrato de cério e amônio (1,0 g, 1,87 mmol) em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 30 minutos. Após confirmação do término da reação por TLC (tolueno/acetato de etila = 1/1, valor Rf = 0,3), o resultante foi diluído com acetato de etila, a camada orgânica foi lavada com água e uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio, e seca com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração, e o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido à cromatografia em coluna de silica gel e um eluato (tolueno/acetato de etila = 1/1) foi usado para dar o composto 13 (468 mg, 84%, 3 etapas).

[Composto 13]

Ή-RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 1,18 (d, J = 6,4 Hz, 1H, H-6 de Rha), 1,93-2,19 (complexo, 27H, OAc), 3,60 (t, 1,6H, Η-2β), 3,68 (m, 1,2H, Η-5β), 3,78 (m, 1,4H, Η-5’β), 3,97 (t, 1H, Η-3β), 4,03 (dd, 1H, Η-6’β), 4,15 (m, 2,3H, Η-6β, Η-6β), 4,22 (m, 1,2H, Η-5β de Rha), 4,43 (dd, 1,2H, Η-6’β), 4,67 (d, J = 7,6 Hz, 1H, Η-1β), 4,77 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Η-Γβ), 4,82-4,91 (complexo, 2,4H, Η-4β, Η-2’β), 5,06-5,14 (complexo, 2,3H, Η-4’β, Η-4β de Rha), 5,16 (s, 1H, H-l de Rha), 5,26-5,33 (complexo, 2,4H, Η-3’β, Η-3β de Rha), 5,39 (m, Ι,ΙΗ, Η-2β de Rha); ¹³C-RMN (CDC1₃, 100 MHz) δ 17,3,

17.5, 20,6, 20,7x2, 20,8x3, 20,9x2, 21,6, 29,8, 31,1, 61,7, 61,8, 62,4, 67,4,

67.6, 67,9, 68,0, 68,1x2, 68,3, 68,8x2, 69,5, 69,9, 70,6x2, 71,5, 71,8, 71,9,

72,1, 72,3, 72,8, 73,0, 75,5, 79,9, 80,1, 80,5, 91,9, 95,8, 98,1, 98,9, 99,6, 99,8,

125,4, 128,4, 129,2, 169,1, 169,4, 169,5, 169,6, 169,7, 170,0x3, 170,1, 170,4, 170,5x2, 170,7.

(4) Síntese de Composto 17

Esquema 13: Síntese do novo glicosídeo de esteviol 2 (Composto 17)

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Glicosidec de esrevi;·! 3

PBu.j

TMAD

1,4- dioxetso °C

44% (α/'β^/ΙΌ)

1.5 eq.

Hemiacetal de ffissacaiideo 13

Composto alvo 17 [00150] Como pode ser notado a partir do Esquema 13, para síntese de Composto 17, Composto 13 (468 mg, 0,540 mmol) e Composto 3 (420 mg, 0,360 mmol) foram dissolvidos em 1,4-dioxano (18 mL), adicionados com tributilfosfina (270 μΕ, 1,08 mmol) e l,l’-azobis (N,N’-dimetilformamida) (TMAD) (186 mg, 1,08 mmol) em temperatura ambiente, e agitados a 60°C durante 6 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (tolueno/acetato de etila = 1/1, valor Rf = 0,4), o resultante foi diluído com acetato de etila, a camada orgânica foi lavada com água, uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução salina saturada, e seca com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração, e o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido a cromatografia em coluna de silica gel, e um eluato (tolueno/acetato de etila = 1,5/1) e (tolueno/acetona = 3/1) foram usados para dar o composto 16 (320 mg, 44%, α/β= 1/10).

[Composto 16]

Ή-RMN (CDC1₃, 400 MHz) δ 0,45-1,18 (complexo, 8H), 1,28

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57/68 (d, 3H, H-6 de Rham), 1,40-1,81 (complexo, 20H), 1,81-2,35 (complexo, 54H, OAc), 3,60 (m, 1,2H), 3,71-3,78 (complexo, 3H), 3,81-3,91 (complexo, 2,4H), 3,98-4,20 (complexo, 10H), 4,40-4,50 (complexo, 3,4H), 4,62 (d, J = 8,0 Hz, 1,1H, H-l), 4,73 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-l), 4,75-4,91 (complexo, 7H), 4,96-5,12 (complexo, 7H), 5,17 (s, 1H, H-l de Rha), 5,21-5,31 (complexo, 6H), 5,32 (s, 1H, H-l de Rha), 5,38 (t, 1,1H), 5,60 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Η-1β), 6,22 (d, J = 3,0 Hz, 0,lH, H-Ια); ¹³C-RMN (CDC1₃, 100 MHz) δ 16,7, 17,5,

20,5, 20,7x2, 20,8x2, 20,9x2, 21,0, 21,6, 29,0, 39,6, 42,5, 44,0, 53,9, 58,1,

61,7, 66,7, 67,6, 68,0, 68,1, 68,3, 68,5, 69,8, 70,2, 70,7, 71,2, 71,4, 71,8, 71,9,

72,2, 72,4, 72,8, 72,9, 75,2, 80,3, 81,4, 86,6, 92,2, 96,4, 96,9, 99,3, 99,8,

125,4, 128,4, 129,2, 138,0, 152,9, 169,0, 169,3, 169,5x2, 169,6x2, 169,8, 170,1x3, 170,2, 170,5, 170,6, 170,9x2, 174,7.

[00151] Composto 16 (300 mg, 0,149 mmol) foi dissolvido em metanol (2,0 mL) e THF (2,0 mL), adicionado com metóxido de sódio (0,5 M in MeOH) (0,3 mL, 0,149 mmol) em temperatura ambiente, e agitados em temperatura ambiente durante 3 horas. Após confirmação do término da reação por TLC (clorofórmio/metanol/água = 5/4/1, valor Rf = 0,5), o resultante foi concentrado sob uma pressão reduzida. O xarope resultante foi submetido a coluna de filtração em gel (GE Healthcare, Sephadex LH-20, etanol) para dar o composto 17 (188 mg, 96%, α/β= 1/10). Subsequentemente, a forma β de Composto 17 foi isolada por HPLC preparativa (coluna Cl8 YMC HPLC, 20 mM solução aquosa de acetato de amônio/90% acetonitrila/10% água = 70/30-10/90, 45 minutos), e submetida a liofilização. Os dados da análise estrutural de Composto 17 por método de ressonância magnética nuclear (RMN) são mostrados nas Figuras 10-13.

[Composto 17 (a forma β]

Ή-RMN (piridina-d5, 800 MHz) δ 0,67 (m, 1H), 0,86 (m, 1H), 0,96 (m, 1H), 1,07 (m, 1H), 1,14 (s, 3H), 1,26 (m, 1H), 1,36 (m, 1H), 1,41 (m, 1H), 1,48 (s, 3H), 1,61 (m, 3H), 1,70 (m, 6H), 1,87-2,21 (complexo,

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11H), 2,46 (m, 1H), 2,57 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,95-4,09 (complexo, 8H), 4,14-4,31 (complexo, 14H), 4,33 (m, 1H), 4,45 (m, 2H), 4,55 (m, 3H), 4,78 (m, 1H), 4,82 (m, 1H), 4,86 (m, 1H), 4,98 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,05-5,11 (complexo, 3H), 5,66 (s, 1H), 6,17 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,24 (s, 1H), 6,46 (s, 1H); ¹³C-RMN (piridina-d5, 200 MHz) δ 17,0, 19,2, 20,1, 20,9, 22,3,

29,6, 37,8, 38,3, 39,9, 40,8, 41,9, 42,7, 43,7, 44,5, 48,4, 54,2, 58,4, 61,9, 62,4,

62.5, 69,1, 69,8x2, 70,5, 71,6, 71,7, 72,3, 72,4, 72,5x2, 73,9, 74,1, 75,2, 76,4,

76.5, 77,5, 78,3, 78,4, 78,5, 78,8x2, 86,9, 88,8, 89,8, 93,8, 98,4, 101,8, 101,9,

104,4, 104,5, 105,3, 154,4, 176,0.

[a]_D = -44,5° (c 0,l,MeOH)

MALDI-TOF-MS m/z encontrado [M + Na]⁺ 1281,4, C56H90O31 calculado para [M + Na]⁺ 1281,5.

(iii) Determinação estrutural por combinação com produto padrão quimicamente sintetizado com relação ao tempo de retenção e padrão fragmentado de fragmentação MS/MS e MS por HPLC de alta resolução. [00152] O produto quimicamente sintetizado do novo glicosídeo de esteviol 1 (a forma β de Composto 15) e extrato líquido de folhas de estévia foram comparados por fragmentação MS/MS e MS por HPLC de alta resolução HPLC sob as mesmas condições que em (i). Como um resultado, os picos do produto sintetizado quimicamente e o extrato líquido de folha de estévia foram detectados no pico no tempos e retenção de 29,1 minutos (Figura 14). Além de que, eles também se igualaram nos respectivos espectros de massa fragmentada MS/MS e MS³ (Figura 15). A partir deste resultado, o novo glicosídeo de esteviol 1 obtido a partir do extrato líquido da planta foi confirmado como tendo a mesma estrutura que a forma β de Composto 15. [00153] Além disso, o produto sintetizado quimicamente do novo glicosídeo de esteviol 2 (a forma β de Composto 17) e o extrato líquido de folha de estévia foram comparados por fragmentação MS/MS e MS³ por HPLC de alta resolução sob as mesmas condições como em (i). Como um

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59/68 resultado, os picos do produto sintetizado quimicamente e o extrato líquido de folha de estévia foram detectados no pico no tempo de retenção de 28,9 minutos (Figura 16). Além de que, eles também se igualaram nos respectivos espectros de massa fragmentada MS/MS e MS³ (Figura 17). A partir deste resultado, o novo glicosídeo de esteviol 2 obtido a partir do extrato líquido da planta foi confirmado como tendo a mesma estrutura que a forma β de Composto 17.

[Biossíntese de novo glicosídeo de esteviol] [00154] Um novo glicosídeo de esteviol foi gerado a partir de esteviol em levedura. Primeiro, uma levedura que podería co-expressar quatro tipos de genes de enzima glicosilada derivada de estévia UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 e UGT76G1 e gene de UDP-ramnose sintase AtRHM2 derivada de Arabidopsis thcdiana foi reproduzido.

[00155] Salvo especificado em contrário, os processos biológicos moleculares empregados neste exemplo seguiram os métodos descritos em Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001).

[00156] A fim de clonar os quatro genes de enzima glicosilada derivada de estévia, os seguintes conjuntos de iniciadores foram sintetizados para realizar PCR usando cDNA preparado a partir de folhas de estévia como um gabarito.

Conjunto de iniciadores para amplificação de gene UGT85C2 CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw (sítio de reconhecimento de Ndel sublinhado): 5 ’ -CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3 ’ (SEQ ID NO: 12)

BglII-SrUGT85C2-Rv (sítio de reconhecimento de BglII sublinhado):

5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’ (SEQ ID NO: 13) Conjunto de iniciadores para amplificação de gene UGT91D2

SrUGT91 D2-pET 15b-FW

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60/68 ’ -TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3 ’ (SEQ ID NO:35)

SrUGT91 D2-pET 15b-RV ’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3 ’ (SEQ ID NO:36)

Conjunto de iniciadores para amplificação de gene UGT74G1 CACC-NdeI-SrUGT74Gl-Fw (sítio de reconhecimento de Ndel sublinhado):

’ -CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3 ’ (SEQ ID NO: 14)

BamHI-SrUGT74Gl-Rv (sítio de reconhecimento de BamHI sublinhado):

’ -GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTC ACTTAC AAATT-3 ’ (SEQ ID NO: 15)

Conjunto de iniciadores para amplificação de geneUGT76Gl CACC-NdeI-SrUGT76Gl-Fw (sítio de reconhecimento de Ndel sublinhado): 5’-C ACCC ATATGGAAAATA AAACGGAGACC A-3’ (SEQ ID NO: 16) BamHI-SrUGT76Gl-Rv (sítio de reconhecimento de BamHI sublinhado):

’ -GGATCCTTAC A ACGATGA AATGTAAGAAACTA-3 ’ (SEQ ID

NO: 17) [00157] cDNA de folha de estévia foi obtido extraindo o RNA total de folhas de estévia usando o kit RNeasy Plant Mini (QIAGEN), e submetendo 0,5 do mesmo a reação de transcrição reversa (RT) usando o iniciador Random Oligo-dT.

[00158] A solução de reação do PCR (50 μΐ) tinha a seguinte composição: 1 μΐ de cDNA derivado de folha de estévia, 1 x KOD mais tampão (TOYOBO), 0,2 mM dNTPs, 0,4 pmol/μΐ de cada iniciador, 1 mM MgSCU e 1U KOD resistente ao calor mais polimerase. Reação PCR consistiu em reação a 95°C durante 5 minutos, seguido por amplificação por um total de 30 ciclos de reação a 94°C durante 0,5 minutos, 50°C durante 0,5 minutos e 68°C durante 2 minutos. Cada produto PCR foi submetido a eletroforese com

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0,8% de gel de agarose e coloração de brometo de etídeo, pelo que uma banda de amplificação de quase 1,4 kb de tamanho foi obtida como presumido a partir de cada DNA gabarito.

[00159] Este produto de PCR foi subclonado em vetor direcional pENTR-TOPO (Invitrogen) de acordo com um método recomendado pelo fabricante. O sequenciador de DNA modelo 3100 (Applied Biosystems) foi usado para sequenciamento por um processo de caminhada de iniciador (primer walking) com um iniciador de oligonucleotídeo sintetizado, confirmando assim que todos dos genes UGT de interesse, isto é, UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 e UGT76G1, foram clonados.

Construção de vetor de expressão de levedura [00160] O seguinte conjunto de iniciadores foi projetado para integrar estes genes UGT e gene de UDP-ramnose sintase AtRHM2 derivado de Arabidopsis thaliana (J Biol Chem 2007, Oka et. al) em um vetor de expressão de levedura.

Conjunto SrUGT85C2

Bgl2-UGT85C2-F (sítio de reconhecimento de BglII sublinhado):

’ -ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3 ’ (SEQ ID

NO: 18)

Sal-UGT85C2-R (sítio de reconhecimento de Sail sublinhado):

’ -TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3 ’ (SEQ ID

NO: 19)

SrUGT91D2

NotI-UGT91DIL3-F (sítio de reconhecimento de Notl sublinhado):

’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ (SEQ ID NO:20)

Pac-UGT91D1L3-R (sítio de reconhecimento de PacI sublinhado):

5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ (SEQ ID NO:21) Conjunto SrUGT74Gl

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Not-UGT74G1-F (sítio de reconhecimento de Notl sublinhado):

’ - AAGCGGCCGC ATGGCGGAAC AAC AAAAGATC AAG-3 ’ (SEQ ID NO:22)

Pac-UGT74G1-R (sítio de reconhecimento de PacI sublinhado):

’ -CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3 ’ (SEQ ID NO:23)

Conjunto SrUGT76Gl

Bam-UGT76G1-F (sítio de reconhecimento de BamHI sublinhado):

’ -AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3 ’ (SEQ ID NO:24)

Sal-UGT76G1-R (sítio de reconhecimento de Sall sublinhado):

5’GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA3’ (SEQ ID NO:25)

Conjunto AtRHM2

Bam-AtRHM2-F (sítio de reconhecimento de BamHI sublinhado):

’ -GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3 ’ (SEQ ID

NO:26)

Xho-AtRHM2-R (sítio de reconhecimento de Xhol sublinhado):

5’-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3’ (SEQ ID NO:27) [00161] As combinações de gabaritos e iniciadores, isto é, conjunto de gabaritos UGT85C2 e SrUGT85C2, conjunto de gabaritos UGT91D2 e SrUGT91D2, conjunto de gabaritos UGT74G1 e SrUGT74Gl, conjunto de gabaritos UGT76G1 e SrUGT76Gl, e conjunto de gabaritos AtAHM2 e AtAHM2, foram usadas para amplificação por PCR usando KOD DNA polimerase (TOYOBO) resistente ao calor e introdução dos sítios de enzima de em ambas as extremidades de cada ORF. O fragmento de DNA resultante foi subclonado usando o kit de clonagem Zero Blunt-TOPO PCR (Invitrogen), e sequenciado usando o sequenciador de DNA modelo 3100

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63/68 (Applied Biosystems) por um processo de caminhada de iniciador com um iniciador de oligonucleotídeo confirmado para confirmar cada dos genes UGT de interesse foi clonado.

[00162] A fim de permitir expressões dos genes escritos acima em leveduras usando o sistema de expressão em levedura pESC (Stratagene), os seguintes vetores de expressão foram construídos.

(1) Construção de plasmídeo pESC-URA-UGT56 [00163] UGT85C2 foi clivado com enzimas de restrição BglII e Sail, e ligado ao vetor pESC-URA (Stratagene) que tinha sido clivado com enzimas de restrição BamHI e Sail para dar o plasmídeo pESC-URA-UGT-5. Este plasmídeo pESC-URA-UGT-5 foi clivado com enzimas de restrição Notl e PacI enquanto UGT91D2 foi clivado também com enzimas de restrição Notl e PacI. Os resultantes foram ligados para dar pESC-URA-UGT56.

(2) Construção de plasmídeo pESC-HIS-UGT78 [00164] UGT76G1 foi clivado com enzimas de restrição BamHI e Sail, e ligado ao vetor pESC-HIS (Stratagene) que tinha sido clivado com as mesmas enzimas de restrição para dar o plasmídeo pESC-HIS-UGT-8. Este plasmídeo pESC-HIS-UGT-8 foi clivado com enzimas de restrição Notl e PacI enquanto UGT74G1 foi clivado também com Notl e PacI. Os resultantes foram ligados para dar pESC-HIS-UGT78.

(3) Construção de plasmídeo pESC-TRP-AtRHM2 [00165] AtAHM2 foi clivado com enzimas de restrição BamHI e Xhol enquanto o vetor pESC-TRP (Stratagene) foi clivado com as mesmas enzimas de restrição. Os resultantes foram ligados para dar plasmídeo pESC-TRPAtAHM2.

Transformação de levedura [00166] Plasmídeos mostrados na tabela 2 foram introduzidos na cepa Saccharomyces cerevisiae YPH499 (ura3-52 Iys2-80l^amberade2-l0l^ochre trplΔ63 his3-A200 Ieu2-Al a) como um hospedeiro por técnica de acetato de

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64/68 lítio. Como cepas transformadas, aquelas que sobreviveram em meio ágar SCTrp-Ura-His (6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose, 1,3 g de mistura de pó de aminoácidos Trp-Ura-His e 20 g de ágar Bacto por 1L) foram selecionados.

Tabela 2

Cepa transformada	Plasmídeos introduzidos	Genes introduzidos
A-5678	pESC-URA-UGT-56 pESC-HIS-UGT-78 pESC-TRP-AtAHM2	SrUGT85C2, SrUGT91D2 SrUGT74Gl, SrUGT76Gl AtAHM2

[00167] Aqui, a mistura de pó de aminoácidos Trp-Ura-His foi preparada misturando sulfato de adenina (2,5 g), cloridrato de L-arginina (1,2 g), ácido L-aspártico (6,0 g), ácido L-glutâmico (6,0 g), L-leucina (3,6 g), Llisina (1,8 g), L-metionina (1,2 g), L-fenilalanina (3,0 g), L-serina (22,5 g), Ltreonina (12 g), L-tirosina (1,8 g) e L-valina (9,0 g).

Indução e análise de expressão de transgene [00168] As cepas transformadas resultantes foram cultivadas como a seguir.

[00169] Primeiro, para cultura preliminar, cada cepa transformada foi semeada em 10 ml de um meio líquido SC-Trp-Ura-His (meio ágar SC-TrpUra-His sem ágar Bacto) e cultivada com agitação a 30°C durante um dia. Subsequentemente, para cultura principal, 1 ml da solução de cultura principal foi cultivado em 10 ml de meio líquido SG-Trp-Ura-His (6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos, 20 g de galactose e 1,3 g de mistura de pó de aminoácidos Trp-Ura-His, por 1L) e cultivados com agitação 30°C durante dois dias.

[00170] A fim de confirmar se o gene introduzido foi expressado ou não na cepa transformada, células foram cultivadas da solução de cultura para purificar o RNA total com Mini Kit RNeasy.

[00171] Com 1 pg de RNA total, cDNA foi sintetizado usando transcriptase reversa SuperScript II (Thermo Fischer Scientific) e hexâmetro aleatório como um iniciador.

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65/68 [00172] A fim de confirmar a expressão do transgene, os seguintes iniciadores foram preparados.

Para confirmar expressão de UGT85C2

UGT85C2-rl:

5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ (SEQ ID NO:28)

Para confirmar expressão de UGT91D2

UGT91DlL3-rl:

5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ (SEQ ID NO:29)

Para confirmar expressão de UGT74G1

UGT74Gl-rl:

5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ (SEQ ID NO:30)

Para confirmar expressão de UGT76G1

UGT76Gl-rl:

5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ (SEQ ID NO:31)

Para confirmar expressão de AtAHM2

AtAHM2-rl

5’-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3’ (SEQ ID NO:32) região GALI Op (região promotora)

PGAL10-f3:

5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ (SEQ ID NO:33) região GAL Ip (região promotora)

PGALl-f3:

5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ (SEQ ID NO:34) [00173] Expressão de cada transgene foi confirmada realizando PCR usando ExTaq (Taraka Bio) com a combinação seguinte de iniciadores e o cDNA previamente sintetizado com um gabarito e submetendo o produto resultante à eletroforese em gel de agarose.

UGT85C2: UGT85C2-rl (SEQ ID NO:28) e PGALl-f3 (SEQ ID NO:34) UGT91D2 ou UGT91D2L3: UGT91DlL3-rl (SEQ ID NO:29) e PGAL10-f3

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66/68 (SEQ ID NO:33)

UGT74G1: UGT74Gl-rl (SEQ ID NO:30) e PGAL1-Í3 (SEQ ID NO:34) UGT76G1: UGT76Gl-rl (SEQ ID N0:31) e PGAL10-Í3 (SEQ ID NO:33) AtAHM2: AtAHM2-rl (SEQ ID NO:32) e PGAL10-Í3 (SEQ ID NO:33) [00174] Consequentemente, expressão do transgene na cepa transformada foi confirmada.

Produção do novo glicosídeo de esteviol [00175] Cultivo foi realizado sob as mesmas condições como descrito acima, exceto que 0,5 pg ou 2 pg de esteviol (ChromaDex Inc.) foram adicionados ao meio líquido para a cultura principal por 1 ml do meio. Após o cultivo, a solução de cultura foi separada em sobrenadantes e células por centrifugação. O sobrenadante da cultura foi lavado com acetonitrila, então submetido a uma coluna Sep-Pak Cl8 equilibrada com água, lavado com 20% acetonitrila, eluído com 80% acetonitrila, seco para solidificar, e então dissolvido em uma pequena quantidade de acetonitrila a 80% para preparar uma amostra de glicosídeo. A amostra de glicosídeo foi submetida a seguinte análise.

Análise por LC-MS [00176] Uma análise por LC-MS foi realizada como descrito no exemplo “Isolamento do novo glicosídeo de esteviol”.

[00177] Os resultados são mostrados nas Figuras 18 e 19. Geração de novos glicosídeos de esteviol 1 e 2 foi confirmada na cepa A-5678. Estes resultados foram correspondentes aos glicosídeos de esteviol resultantes da síntese química descrita acima.

Avaliação do nível de doçura do novo glicosídeo de esteviol [00178] A fim de avaliar o nível de doçura do novo glicosídeo de esteviol, amostras foram preparadas por adição de sacarose em água para dar Brix de 0,5 a 3, em incrementos de 0,5. Uma amostra foi preparada por adição de Composto 17 tendo a mesma estrutura que o novo glicosídeo de esteviol

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67/68 em água pura 1.700 ppm. Aqui, a razão da forma α e da forma β contida no Composto 17 era 1: 10 (α: β, razão molar).

[00179] Avaliação foi conduzida selecionando a amostra adicionada com sacarose tendo uma intensidade de doçura equivalente à da amostra adicionada com o novo glicosídeo de esteviol, onde avaliação sensorial foi conduzida por panelistas treinados sobre os atributos sensoriais de edulcorantes (5 membros). Como um resultado, a amostra preparada pela adição do novo glicosídeo 2 foi verificada como tenda doçura equivalente ao da amostra adicionada com sacarose com Brix de 1. Portanto, o novo glicosídeo de esteviol da invenção foi verificado como tendo um nível de doçura de 14,7 com relação à sacarose. Embora um nível de doçura preciso não tenha sido obtido para o novo glicosídeo de esteviol 1, já que ele não se dissolve suficientemente em água, o novo glicosídeo de esteviol foi confirmado também como tenda doçura como será descrito abaixo.

Avaliação do novo glicosídeo de esteviol (Composto 17) [00180] A fim de avaliar a qualidade do sabor de vários glicosídeos de esteviol, Reb.A, Reb.D e Composto 17 tendo a mesma estrutura que o novo glicosídeo de esteviol 2 foram adicionados em água pura nas quantidades indicadas na Figura 20 para preparar amostras de bebidas. Todas as amostras de bebida foram ajustadas para ter um Brix final de 2 em termos de sacarose, desde que os níveis de doçura fossem Reb.A: 300, Reb.D: 250 e novo glicosídeo 2 (Composto 17): 14,7.

[00181] As amostras de bebida resultantes foram submetidas a avaliação sensorial para atributos de faixas, isto é, início da doçura, persistência da doçura, doçura total, sabor não refinado, e sabor persistente não refinado. Sabor não refinado, como usado, aqui refere-se a aroma indesejado diferente de doçura, tal como amargor e adstringência. Panelistas treinados sobre atributos sensoriais de edulcorantes (7 membros: Suntory Beverage and Food Ltd.) avaliados com base nos seguintes critérios de

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68/68 avaliação. Muito fraco (-3), fraco (-2), levemente fraco (-1), normal (0), levemente forte (+1), forte (+2) e muito forte (+3). Os resultados são mostrados na Figura 20. Os escores de avaliação mostrados no diagrama são os escores médios dos escores dos 7 panelistas.

[00182] Como um resultado da avaliação sensorial, Composto 17 tendo a mesma estrutura que o novo glicosídeo de esteviol 2 foi verificado como tendo início mais rápido da doçura do que os edulcorantes convencionais Reb.A e Reb.D e persistência da doçura tão boa quanto a do açúcar. Ele foi verificado também como tenda doçura total em comparação com Reb.D.

Avaliação de aromas dos novos glicosídeos de esteviol (Compostos 15 e 17) em formas de pó [00183] Aromas dos novos glicosídeos de esteviol 1 e 2 em formas de pó foram avaliados. Especificamente, os Compostos 15 (correspondendo ao novo glicosídeo de esteviol 1) e 17 (correspondendo ao novo glicosídeo de esteviol 2) obtidos por síntese química foram submetidos a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para isolar apenas a forma β, que foi feita em forma de pó e submetida a avaliação de aroma. Panelistas treinados sobre atributos sensórias de edulcorantes (3 membros: Suntory Beverage and Food Ltd.) fizeram a avaliação. Os resultados são mostrados na tabela 3.

Tabela 3: Resultados da avaliação de aromas de novos glicosídeos de esteviol (apenas forma β) em formas de pó _________________________________

	Presença de doçura	Características de aroma
Novo glicosídeo de esteviol 1 (Composto 15)	Presente	•Nível de doçura foi inferior ao do novo glicosídeo de esteviol 2 Sabor persistente após ingestão foi mais forte do que o do glicosídeo de esteviol 2, mas com boa finalização
Novo glicosídeo de esteviol 2 (Composto 17)	Presente	Aroma lembrava a mistura •Sem

[00184] A partir dos resultados acima, tanto os novos glicosídeos de esteviol 1 e 2 tinham doçura e foram verificados como sendo utilizáveis em edulcorantes. Além disso, ambos os glicosídeos tinham menos aroma indesejável tal como amargor. Composto 17 tinha um aroma que lembrava uma mistura das formas α e β usadas para avaliar o nível de doçura.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto, caracterizado pelo fato de ser representado pela fórmula (1):

ou um sal ou um hidrato do mesmo, em que R representa uma cadeia de açúcar de fórmula (2) ou (3);e glc(1-3)—-glc-1— rha(1-2)’ glc-1— rha(1-2) glc representa glicose, e rha representa ramnose.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é um produto derivado de planta, um produto sintetizado quimicamente ou um produto biossintético.
3. Alimento ou bebida, caracterizado pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Composição edulcorante, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1 ou 2.
5. Composição edulcorante de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados a partir do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, dulcosídeo C, rubusosídeo,

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2/5 esteviol, monosideo de esteviol, biosideo de esteviol e esteviosideo.
6. Alimento ou bebida, caracterizado pelo fato de que compreende a composição edulcorante como definida na reivindicação 4 ou 5.
7. Alimento ou bebida de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser uma bebida.
8. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1.
9. Extrato da planta como definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1.
10. Alimento ou bebida, caracterizado pelo fato de que compreende a planta como definida na reivindicação 8 ou o extrato da planta como definido na reivindicação 9.
11 Alimento ou bebida de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser uma bebida.
12. Método para produzir o composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(A) preparar o intermediário 1 representado pela fórmula (5):

em que p-glc representa glicose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, e p-rha representa ramnose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, a partir de rebaudiosídeo C representado pela fórmula (4):

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3/5

em que glc representa glicose e rha representa ramnose;

(B) preparar o intermediário 2 representado pela fórmula (6) ou intermediário 3 representado pela fórmula (7) a partir de um derivado de glicopiranosídeo:

p-glc-1p-rha(1-2)^Z p-glc(1 -3)—p-glc-1p-rhaíl-Z)/ _{( 7}) em que p-glc representa glicose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, e p-rha representa ramnose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor; e (C) permitir que o intermediário 1 reaja com o intermediário 2 ou 3 na presença de um reagente de fosfina e um composto azo para obter o intermediário 4 representado pela fórmula (8):

em que Ri representa uma cadeia de açúcar de fórmula (9) ou

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4/5 (10): e p-glc-1p-rha(1-2) _(g) p-glc(1-3)—p-glc-1p-rha(1-2)^// r j θ _} p-glc representa glicose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor, e p-rha representa ramnose em que pelo menos um grupo hidroxila é protegido por um grupo protetor.
13. Uso do composto como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser como um edulcorante.
14. Método para produzir o composto como definido na reivindicação 1, o método caracterizado pelo uso de um transformante não humano que foi introduzido com pelo menos um dos polinucleotídeos (a) a (g):

(a) um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e que tem uma atividade de adição de glicose ao grupo hidroxila em C-13 do glicosídeo de esteviol;

(b) um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 e que tem uma atividade de adição de glicose ao ácido carboxílico em C-19 do glicosídeo de esteviol;

(c) um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adição de ramnose à glicose fixada em C-13 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>2;

(d) um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem

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90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adição de glicose à C-3 de glicose em C-13 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>3;

(e) um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adição de glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>2;

(f) um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adição de glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol via uma ligação 1—>3; e (g) um polinucleotídeo codificante para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e que tem uma atividade de gerar UDP-ramnose a partir de UDPglicose.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o transformante não humano é uma levedura.
16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o transformante não humano é cultivado em um meio contendo esteviol.