CN101146440A - 甜菊甜味剂 - Google Patents

甜菊甜味剂 Download PDF

Info

Publication number
CN101146440A
CN101146440A CNA2006800071369A CN200680007136A CN101146440A CN 101146440 A CN101146440 A CN 101146440A CN A2006800071369 A CNA2006800071369 A CN A2006800071369A CN 200680007136 A CN200680007136 A CN 200680007136A CN 101146440 A CN101146440 A CN 101146440A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rebaudioside
sweetener
sweet
dna
keeping
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006800071369A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101146440B (zh
Inventor
守田丰重
守田幸司
驹井功一郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morita Kagaku Kogyo Co Ltd
Original Assignee
Morita Kagaku Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morita Kagaku Kogyo Co Ltd filed Critical Morita Kagaku Kogyo Co Ltd
Publication of CN101146440A publication Critical patent/CN101146440A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101146440B publication Critical patent/CN101146440B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/10—Natural spices, flavouring agents or condiments; Extracts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A23L27/36—Terpene glycosides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Seasonings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供相对于1重量份蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊苷A的甜菊品种的新型植物体，可以容易地由该植物体或其干燥叶制备质量优良的甜味剂。

Description

甜菊甜味剂
技术领域
本发明涉及新蛇菊苷A的含有比例比蛇菊苷高的属于甜菊品种的植物体、由该植物体和/或其干燥叶中提取的甜味剂的制备方法。
本发明进一步涉及由该甜味剂制备高纯度新蛇菊苷A的方法。
背景技术
甜菊是原产地为南美巴拉圭的菊科多年生植物，学名甜菊(Steviarebaudiana Bertoni)。甜菊含有具砂糖的300倍以上的甜味的甜味成分，因此，为提取该甜味成分作为天然甜味剂使用而对其进行栽培。
甜菊的甜味成分已知有蛇菊苷(C38H60O18)、新蛇菊苷A(C44H70O23)、新蛇菊苷C、D、E、杜尔可苷A(dulcoside A)等。通常栽培的甜菊品种中，上述甜味成分中的蛇菊苷(ST)为主要成分，新蛇菊苷A(RA)的含量为蛇菊苷的10分之3～4左右，新蛇菊苷C的含量比这还少，但根据品种的不同，也有以新蛇菊苷C为主要成分的各种品种。
在涩味、辣味等用舌头感知的味道中，甜味的性质非常微妙。蛇菊苷具有砂糖300倍的甜度，因此在食品工业界中作为天然甜味剂使用。其甜味与砂糖较类似，但是后味残留有苦味等令人不快的味道。因此，作为甜味剂，并不优选大量含有蛇菊苷。与此相对，新蛇菊苷A具有良好的甜味性质以及甜度为蛇菊苷的1.3倍～1.5倍。
需要进一步开发降低新蛇菊苷A的生产成本、保持稳定的干燥叶的收获量、高含量含有甜味性质优异的新蛇菊苷A作为甜味剂原料的甜菊品种，同时保持它们的延续，以其为基础制造优异的甜味剂。
本发明人等对由以往的品种反复杂交筛选，进行品种改良，得到了与蛇菊苷(ST)相比，新蛇菊苷A(RA)显示高含有比例的甜菊品种，从这些植物中提取甜味成分，制备了新蛇菊苷A的含有比例比蛇菊苷高的优异的甜味剂(参照后述专利文献1-1至1-3)，但是，人们希望更进一步开发新蛇菊苷A更为稳定的含有比例更高的优异的品种。
另一方面，在甜菊植物的品种改良中，确定甜菊植物的方法也有问题。作为改良的甜菊植物的识别方法，可以根据植株高度、叶片形状等进行识别，但是甜菊有自交不亲合性，容易形成杂种，不可能只通过植株高度、叶片形状等进行识别。
另外，也可通过甜菊对特有的病原菌的抗病性来比较确定，但是在甜菊中特有地表现的叶枯病、黑斑病起因于壳针孢、链格孢，这些菌是在土壤中生活的菌，如果仅凭这些症状来确定品种，由于不仅是日本，而是世界性发生，因此只凭这些特性确定品种是不够的。
对于甜味成分的含量高、新蛇菊苷A的含有比例比蛇菊苷高的改良品种也可以采用通过其含有比例进行确定的方法，但是由于生长期间的气象条件、收获时期等的原因，甜味成分的比例不可避免地发生变化，因此该方法也缺乏现实性。
最近，还有人开发了使用引物混合物(primer mix)的RAPD法、通过DNA鉴定进行识别的方法(参照后述专利文献2)，但是是否可适用于本发明的植物体的鉴定尚未明确。
专利文献1：日本特开昭59-045848号公报
专利文献2：日本特开昭60-160823号公报
专利文献3：日本特开昭61-202667号公报
专利文献4：日本特开2003-9878号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于：培育甜味成分含量和甜味成分含有比优异的品种，并为了保持其特征而通过RAPD法进行基因识别、使其与其它系统、其它品种的甜菊植物区别，由此提供甜味性质优异的甜味剂及其制备方法。
解决课题的方法
本发明的第一方面是相对于1重量份蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊苷A的甜菊品种。如后所述，重复进行杂交筛选，培育了相对于1重量份蛇菊苷至少含有4重量份以上新蛇菊苷A的属于甜菊品种的新型植物体。
本发明的第二方面是相对于1重量份蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊苷A的甜味剂的制备方法，其特征在于：将上述植物体或其干燥叶用水或含水溶剂进行提取。
本发明的第三方面是高纯度甜味剂的制备方法，所述高纯度甜味剂是相对于1重量份蛇菊苷含有40重量份以上新蛇菊苷A，所述制备方法是将上述所得的甜味剂进行重结晶，制备相对于1重量份蛇菊苷含有40重量份以上新蛇菊苷A、且它们的含量为92％以上的甜味剂。
通过杂交和筛选进行品种改良中，确定所筛选的品种的方法具有重要的意义。本发明人等通过RAPD法、对通过DNA鉴定的确定方法进行了研究。
发明效果
本发明提供甜味性质优异的甜味剂及其制备方法。
附图简述
图1是守田品种、SS和SN的DNA核苷序列的电泳图。箭头部分可见特征性的核苷序列。
图2是守田品种和SN的DNA核苷序列的电泳图。箭头部分可见特征性的核苷序列。
符号说明
图1中的符号a～h分别如下所述。
a：Hind III标志
b、e：SN品种
c、f：守田品种
d、g：SS品种
h：l kbp DNA序列梯标志
图2中的符号如下。
守：守田品种
SN：SN品种
M：DNA标志(100 bp序列梯)
实施发明的最佳方式
本发明的识别中所使用的RAPD法(随机扩增多态性DNA法)是DNA的分析方法之一，是使用多种引物进行PCR(聚合酶链反应)，使与所使用的引物相同或类似的序列所夹持的DNA的区域被扩增，通过电泳对该扩增的DNA的图谱进行分析的方法。另外，鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)是具有长链烷基的季铵碱，与核酸等聚阴离子形成不溶性的复合物，因此可用于核酸的分离。
根据DNA的不同来识别品种的方法是：从植物体中分离基因组DNA，除去核糖核酸(RNA)，然后使用引物混合物，通过PCR法得到PCR扩增产物，将其进行琼脂糖凝胶电泳，根据所得的DNA指纹图谱的不同进行区别。本发明的植物体中，如后所述，可以确认在2000bp下方显示特征性的核苷序列。
实际上，对于原料植物体，以选择性沉淀的基因组DNA为模板，使用例如A06(核苷序列；ACTTGGCCGAGGG)和A48(核苷序列；CCGCAGGGACCA)组以及rTaq(TAKARA)作为引物，以94℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(120秒)进行35个循环反应，然后在72℃下反应10分钟。然后将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳法确认，可通过特定的DNA条带确认植物体。
甜味剂的制备中，是用水或含水有机溶剂从该植物体和/或其干燥叶中提取，接着将提取液直接浓缩，或者根据需要，用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、活性碳除去离子性杂质，使甜味成分吸附于吸附树脂上，用亲水性溶剂洗脱，将洗脱液浓缩、干燥，可得到甜味剂。甜味剂的制备方法可适当实施其它脱色等常用的纯化方法，获得高纯度新蛇菊苷A的方法可适当实施膜分离、醇提、结晶等常用方法。另外，结晶的方法是在乙醇、甲醇等有机溶剂中根据需要加入水作为结晶溶剂，适当使用。所得甜味剂可以加入其它天然、人工甜味剂，稀释剂等。
以较高浓度含有新蛇菊苷A的品种的育种过程
育种是通过将含有较高新蛇菊苷A的品种的杂交筛选进行，首先，将高浓度含有新蛇菊苷A的SF5-1、SF5-2(记载于日本特开平10-271928号)进行人工杂交，由所得种子中选择TD-1(记载于日本特开2003-9878号)，再将它们进行人工杂交，由所得种子中选择对壳针孢、链格孢具有抗性的品种，分析其甜味成分，筛选相对于蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊苷A、甜味含量高、抗病性较为优异的植株。进一步重复确认甜味成分含量、甜味成分比例、生长发育状况，以此作为守田品种，检索其基因。
申请人对于本发明的守田品种已经完成了国际保藏(保藏编号FERM BP-10353)。因此，可容易地从该保藏的守田品种的种子获得本发明的植物体。甜菊是自交不亲和性，不一定由该种子总是获得目标植物体，但是，根据本发明所记载的DNA鉴定，可以容易地进行目标物的选择。还可根据需要，与其它高品质甜菊品种(例如TD-1)进行杂交，按照后述实施例1进行筛选，可以极容易地获得高浓度含有新蛇菊苷A的植物体。这些植物体均包含在由国际保藏的品种、即守田品种的种子得到的植物体中。
实施例
以下，对育种过程及其特性等具体描述。本发明并不限于本育种过程、栽培方法。
实施例1
于1995年，在新见工厂内的大棚内，将由较高浓度含有蛇菊苷A的品种杂交获得的种子中筛选的含有新蛇菊苷A的SF-1、SF5-2品种(记载于日本特开平10-27 1928号)进行人工杂交，将所得种子于96年3月播种于新见工厂内的大棚内，将发芽的苗移植到育苗盆中，5月上旬，对工厂内苗圃按照每10公亩施肥各20 kg氮、磷、钾肥料成分，两周后将600株苗高8 cm左右以上的苗移植入工厂内苗圃。7月上旬进行追肥，每10公亩各追肥10kg氮、磷、钾肥料成分。
9月上旬进行调查，分析其甜味成分，筛选相对于蛇菊苷含有3倍以上新蛇菊苷A的植株TD-1品种(记载于日本特开2003-9878号)。98年，在新见工厂内的大棚内人工杂交TD-1品种，于99年3月，将所得种子播种于新见工厂内的大棚内，将发芽的苗移植到育苗盆中，5月上旬，对工厂内苗圃按照每10公亩施肥各20 kg氮、磷、钾肥料成分，两周后将300株苗高7 cm左右以上的苗移植入工厂内苗圃。7月上旬进行追肥，每10公亩各追肥10 kg氮、磷、钾肥料成分。
9月上旬进行调查，分析其甜味成分，筛选相对于蛇菊苷含有4重量份以上新蛇菊苷A、比植株TD-1品种的抗病性更为优异、生长发育良好的植株。2000年4月中旬，将它们所萌发的芽扦插100株。5月上旬，同样地种植于工厂苗圃内，于7月末再次调查抗病性、生长发育情况，确认甜味成分比、含量是否优异，并且由2001年起经过三年均确认其抗病性、甜味成分比、甜味成分含量、干燥叶的收量优异，生长发育、成分没有变化，以此作为守田品种。
守田品种、TD-1和SN的比较试验1
为了对守田品种与其它品种进行比较，于2003年4月中旬，将各40株以新蛇菊苷A为主要成分的TD-1(TD)，以蛇菊苷为主要甜味成分、以新蛇菊苷A为副甜味成分的通常的甜菊品种(SN)同样地进行扦插，同样地栽种于工厂苗圃。
6月上旬，从上述5月上旬移植到苗圃中的200株插条增殖的守田品种苗、以及各40株TD品种、SN苗中任意选择10株各品种，调查是否有发病，然后将守田、TD、SN各品种自地面切取15 cm，分离叶部，干燥后作为分析试样。
分析结果如下所述。
[表1]
    品种名     黄色、黑变叶的表现     ST(％)     RA(％)     RA/ST
    守田     0株黑斑     2.3     9.3     4.04
    TD     1株黑斑     2.5     9.1     3.64
    SN     7株发生     6.9     2.8     2.46
守田品种、TD和SN的比较试验2
于7月中旬进行追肥，于9月上旬选择每种品种选择1个区域20株，调查壳针孢、链格孢的发病状况，然后将各品种由地上部切取，分离叶部，干燥后作为分析试样。
分析结果如下。
[表21]
  品种名   黄色、黑变叶的表现   ST(％)   RA(％)   RA/ST   收量
  守田   3株下部叶黑斑   1.1   13.1   11.9   12.9 g/株
  TD   5株下部叶黑斑   1.1   11.1   10.0   11.7 g/株
  SN   12株下部叶干枯   9.8   3.9   0.39   9.3 g/株
守田品种的下部叶黑斑发病比例较低，甜味成分含量、干燥叶收量也比其它品种优异。TD品种与守田品种相比，壳针孢导致的下部叶黑斑较多，叶片由于壳针孢而已经开始黄变，由于壳针孢，SN品种下部叶至第3节的部分均可见壳针孢导致的黄变，地上第一节的叶片成为干枯叶。
04年3月，将由守田品种发芽的穗尖扦插200株，在4月下旬移植到苗圃中，于5月末、6月末、7月末、8月末、9月末、开花后的10月末割取地上部，只分离叶片，然后干燥，测定甜味成分含量。
甜味成分的测定通过高效液相色谱仪进行。
[表3]
    割取时期     ST(％)     RA(％)     RA/ST
    5月末     2.2     9.1     4.1
    6月末     2.3     9.6     4.2
    7月末     1.9     12.6     6.6
    8月末     1.5     12.8     8.5
    9月末     1.0     13.2     13.2
    10月末     1.0     10.1     10.1
守田品种根据生长发育期间的长短，其甜味成分含量、甜味成分比不同，随着生长发育期间的延长，甜味成分含量增加，而蛇菊苷含量可见减少倾向。开花期的10月末则可见甜味成分含量减少。
基因核苷序列的确定(之一)
从甜味成分含量、甜味成分比、收量看，守田品种最为优异，因此通过PCR法识别守田品种。
在干热灭菌的乳钵中加入约0.2 g守田品种的叶片，加入液氮，用乳棒捣碎，用药匙(spatula)将约0.05 g分别装入微量离心管中。加入300 μl 2％CTAB溶液(2％CTAB溶液(50 ml)：组成为100 mM Tris-HCl(pH 8.0)、20 mM EDTA(pH 8.0)、2％CTAB、1.4 M NaCl)，颠倒混合，然后将离心管转移至加热至65℃的热台上，加温30分钟。加入等量(300μl)的氯仿/异戊醇(24∶1)，适度搅拌5分钟。以14000 rpm离心15分钟，然后将分成两层的内容物的上层的水层转移至新的离心管中。
再重复一次上述氯仿/异戊醇以后的操作，将水层转移到新的离心管中。加入400μl 1％CTAB溶液(1％CTAB溶液(50 ml)：组成为2.5ml1 M Tris-HCl、1.0 ml 0.5 M EDTA、0.5 g 1％CTAB)，颠倒混合15分钟，然后在室温下静置1小时，以14000rpm离心15分钟。
舍去上清，加入400μl1 M CsCl，吹吸液体，使沉淀完全溶解。加入900μl 100％乙醇，颠倒混合，然后在-20℃下静置20分钟，以14000pm离心15分钟。舍去上清，向沉淀中加入400μl 70％乙醇，以14000 rpm离心15分钟，将该操作重复进行，然后舍去上清，用真空干燥机干燥沉淀，溶解于30μl的超纯水中。将溶液进行琼脂糖凝胶电泳，确认分离了DNA。
为除去RNA，用500 μl RNase溶液(组成：100 μl上述DNA分离溶液、5 μl RNase(5 g/ml))在37℃反应1小时，向反应液中等量加入PCI溶液(组成：苯酚/氯仿/异戊醇、以25∶24∶1适度混合，然后以13000 rpm离心5分钟，分离水层所得的溶液)。盖上盖，适度混合，然后以13000rpm离心5分钟。
将水层(上层)转移到新的微量离心管中，等量加入在室温下保存的CIA溶液(组成：氯仿/异戊醇，容量比24∶1)，适度混合，然后以15000rpm离心3分钟，将水层转移至新的微量离心管中，再一次进行CIA处理，加入所得上清的1/10倍量的3 M乙酸钠和2.5倍量的100％乙醇，充分混合，然后在-20℃下冷却20分钟以上，以15000 rpm离心15分钟，将DNA制成片状沉淀(pellet)，舍去上清，向片状沉淀中加入1 ml冷却的70％乙醇，然后用15000 rpm离心1 5分钟，舍去上清，再加入1 ml冷却的70％乙醇，然后以15000 rpm离心15分钟，舍去上清，用减压干燥器干燥5分钟。
将所得基因组DNA作为模板，按照PCR用组合物(表4)，以94℃30秒、55℃30秒、72℃1 20秒进行35个循环的反应，然后在72℃反应1 0分钟。反应后保持在4℃，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳，确认DNA条带，如图1的守田所示，大约在2000 bp下方可确认特征性的DNA片断。
[表4]
PCR用组合物(20μl)
模板DNA(1 ng/μl)引物混合物(各16 pmol/μl)A06*(SEQ ID NO.1：ACTGGCCGAGGG)A48*(SEQ ID NO.2：CCGCAGGGACCA)dNTP(各2.5mM)10×缓冲液蒸馏水rTaq(TAKARA)*：A06和A48引物由BEX公司制备MgCl2 5 ul各0.5 ul1.6 μl2μl7.9 μl0.5 μl2 μl
同样，将以蛇菊苷为主要成分、以新蛇菊苷A为副成分的SN品种(SN)和SS品种(SS)与上述同样处理，所得DNA条带如图1所示。
守田品种在大约2000 bp下方具有特征性的核苷序列，将DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，可以容易地与其它品种进行区别。
基因核苷序列的确定(之二)
使用与上述不同的引物，对守田品种和SN品种进行比较。
<DNA提取>
DNA提取按照CTAB法进行。将各约0.5 g守田品种、SN品种的叶片在乳钵中用液氮冷冻，用乳棒粉碎。粉碎的样品在50 ml Falcon管(塑料尖底培养管)中与20 ml 2％CTAB溶液(100 mM Tris-HCl pH8.0、20 mM EDTA pH 8.0、2％CTAB、1.4 M NaCl、1％PVP)混合，在65℃下温育30分钟。加入等量的氯仿/异戊醇(24∶1)，搅拌10分钟，然后以3500 rpm离心15分钟，将水层转移到另外的50 ml Falcon管中。
再加入等量的100％异丙醇，以3500rpm离心15分钟，用钩(hook)收集沉淀，转移至1.5 ml微量离心管中。将沉淀用75％乙醇冲洗，然后使其干燥，用600 μl TE缓冲液溶解。加入1 μl RNase溶液(1 mg/ml)，在37℃下温育1小时，然后加入等量的TE饱和苯酚，混合，然后以15000rpm离心30分钟。将水层转移至另外的微量离心管中，加入1/10量的3M乙酸钠和等量的异丙醇，混合，以15000rpm离心30分钟。将所得沉淀用75％乙醇冲洗两次，然后干燥，溶解于50 μl TE缓冲液中，制成DNA样品。
<PCR分析>
以所得DNA样品为模板，按照以下的反应液组成进行PCR。PCR循环是在96℃反应30秒后，以96℃10秒、42℃2分钟、72℃2分钟进行35个循环，再在72℃反应4分钟。反应后，PCR产物通过1.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，EtBr染色后，在UV照射下进行拍摄。结果，在引物UBC-66中，在约2000 bp附近可以确认守田品种的特异性条带。在引物UBC-72中、在约600 bp附近，在UBC-106中、在约700 bp附近可见SN品种的特异性条带。该结果表明，守田品种和SN品种是遗传性不同的系统，通过RAPD分析可以容易地检测出其差异。
反应液组成(50 μl中)
10×PCR缓冲液    5 μl
dNTP(2.0 mM)    5 μl
RAPD引物※(1 0 mer)    5 μl(5 μM)
Blend Taq(商标)(TOYOBO)    0.5μl(2.5 U/μl)
甜菊DNA    1 μl(30 ng/μl)
灭菌水    33.5μl
*引物使用下述UBC-66、UBC-72或UBC-106。
UBC-66：GAGGGCGTGA
UBC-72：  GAGCACGGGA
UBC-106：CGTCTGCCCG
实施例2甜味剂的制备
将20 g于9月末得到的守田品种的干燥叶用20倍量的水提取数次，直至感觉不到甜味，将提取液过填充了20 ml阳离子交换树脂(Amberlite IR-120B)的柱和填充了20 ml阴离子交换树脂(Duolite A-4)、5 ml颗粒状活性碳的柱，将过柱的液体再过填充了100 ml吸附树脂(Diaion HP-20)的柱，吸附甜味成分，充分水洗，然后用300 ml乙醇洗脱。将洗脱液在减压下浓缩、干燥，得到淡黄白色的粉末。为了进行比较，由TD、SN进行同样处理，得到甜味成分，将其进行分析。
分析方法    高效液相色谱法
使用柱    Hibar Licrosorb NH25 μ 4mm(直径)×250 mm
流速    1.5 ml/分钟
展开溶剂    乙腈∶水＝82∶1 8
测定波长    210 nm
表5表示提取纯化物的分析结果。表中的ST为蛇菊苷、RA为新蛇菊苷A。
[表5]
    品种名     ST(％)     RA(％)     RA/ST     收量
    守田     5.7     75.9     13 .3     3.52 g
    TD     6.1     71.2     11.6     3.25 g
    SN     53.2     21.0     0.39     2.20 g
感官试验1
制备由实施例2得到的守田、SN淡黄色粉末的各0.1％溶液，由10名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。
[表6]
苦味 认为守田品种有苦味的人数 认为SN品种有苦味的人数
0  10
涩味 认为守田品种有涩味的人数 认为SN品种有涩味的人数
0  10
甜味性质 认为守田品种的甜味性质优异的人数 认为SN品种的甜味性质优异的人数
10  0
各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异。
感官试验2
制备由实施例2得到的守田、TD淡黄色粉末的各0.1％溶液，由10名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。
[表7]
苦味 认为守田品种有苦味的人数 认为TD品种有苦味的人数
2  8
涩味 认为守田品种有涩味的人数 认为TD品种有涩味的人数
3  7
甜味性质 认为守田品种的甜味性质优异的人数 认为TD品种的甜味性质优异的人数
9 1
各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异。
实施例3高纯度新蛇菊苷A甜味剂的制备
将2 g实施例2得到的提取纯化物(守田品种)在10倍量的95％甲醇中加热溶解，然后在4℃冷却放置6天，分离所得晶体，用冷甲醇洗涤，然后减压干燥，得到1.2 g白色晶体。为了进行比较，TD、SN同样处理，分别得到0.9 g和0.6 g白色晶体，对其进行分析。
分析方法    高效液相色谱法
使用柱    Hibar Licrosorb NH2 5μ4 mm(直径)×250 mm
流速    1.5 ml/分钟
展开溶剂    乙腈∶水＝82∶18
测定波长    210 nm
表8表示提取纯化物的分析结果。表中的ST为蛇菊苷、RA为新蛇菊苷A。
[表8]
  品种名   ST(％)   RA(％)   RA/ST   收量
  守田   2.3   92.1   40.0   1.2 g
  TD   3.7   87.9   23.7   0.9 g
  SN   94.2   2.0   0.02   0.6 g
感官试验3
制备由实施例3得到的SN白色粉末的各0.1％溶液，由10名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。
[表9]
苦味 认为守田品种有苦味的人数 认为SN品种有苦味的人数
0 10
涩味 认为守田品种有涩味的人数 认为SN品种有涩味的人数
0 10
甜味性质 认为守田品种的甜味性质优异的人数 认为SN品种的甜味性质优异的人数
10 0
各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异，高纯度产品的回收率也优异。
感官试验4
制备由实施例3得到的TD的白色粉末的各0.1％溶液，由10名精通甜菊甜味剂甜味性质的评价人员比较其苦味、涩味、甜味性质。
[表10]
苦味 认为守田品种有苦味的人数 认为TD品种有苦味的人数
2 8
涩味 认为守田品种有涩味的人数 认为TD品种有涩味的人数
2 8
甜味性质 认为守田品种的甜味性质优异的人数 认为TD品种的甜味性质优异的人数
10 0
各试样中，守田品种的苦味、涩味比其它试样得到改善，甜味性质优异，高纯度产品的回收率也优异。实施例4高纯度新蛇菊苷A甜味剂的制备
将2 g实施例2得到的提取纯化物(守田品种)在5倍量的75％甲醇中加热溶解，然后在4℃冷却放置7天，分离所得晶体，用冷甲醇洗涤，然后减压干燥，得到0.9 g白色晶体，对其进行分析。
[表11]
  品种名   ST(％)   RA(％)   RA/ST   收量
  守田   0.1   97.2   972   0.9 g
<110>守田化学工业株式会社
<120>甜菊甜味剂
<130>  666169
<1 50>JP 2005-060930
<151>  2005-03-04
<160>  5
<210>  1
<211>  12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>  1
actggccgag gg    12
<210>  2
<211>  12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>2
ccgcagggac ca     12
<210>  3
<211>  10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>  3
 gagggcgtga    10
<210>    4
<211>  10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>4
gagcacggga    10
<210>  5
<211>  10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：引物
<400>  5
cgtctgcccg    10
|申请人或代理人档案号666169 国际申请号PCT/JP2006/303992
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
A.对说明书第5页，第22-23行所述的已保藏的微生物或其他生物材料的说明
B.保藏事项    更多的保藏在附加页说明□
保藏单位  名称IPOD(独)产业技术综合研究所 专利生物保藏中心(IPOD)
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)日本国邮编305-8566茨城县筑波市東1丁目1番地1中央第6
保藏日期2005年06月20日(20.06.2005)  |保藏号IPOD FERM BP-10353
C.补充说明(必要时)    更多信息在附加页中  □
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
Figure A20068000713600201
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)

Claims (6)

1.植物体，该植物体是相对于1重量份蛇菊苷至少含有4重量份以上新蛇菊苷A的甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)品种，在通过RAPD法进行的DNA分析中，在2000bp下方显示特征性的核苷序列。
2.权利要求1的植物体，该植物体由国际保藏(保藏号FERM BP-10353)的种子获得。
3.甜味剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1的植物体或其干燥叶用水或含水溶剂提取。
4.甜味剂的制备方法，其特征在于：将权利要求2的植物体或其干燥叶用水或含水溶剂提取。
5.由按照权利要求3的方法得到的甜味剂中获得相对于1重量份蛇菊苷至少含有40重量份以上新蛇菊苷A、且纯度为92％以上的高纯度新蛇菊苷A的方法。
6.由按照权利要求4的方法得到的甜味剂中获得相对于1重量份蛇菊苷至少含有40重量份以上新蛇菊苷A、且纯度为92％以上的高纯度新蛇菊苷A的方法。
CN2006800071369A 2005-03-04 2006-03-02 制备高纯度新蛇菊苷a的方法 Expired - Fee Related CN101146440B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005060930 2005-03-04
JP060930/2005 2005-03-04
PCT/JP2006/303992 WO2006093229A1 (ja) 2005-03-04 2006-03-02 ステビア甘味料

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101146440A true CN101146440A (zh) 2008-03-19
CN101146440B CN101146440B (zh) 2012-01-11

Family

ID=36941258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800071369A Expired - Fee Related CN101146440B (zh) 2005-03-04 2006-03-02 制备高纯度新蛇菊苷a的方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US7884265B2 (zh)
EP (1) EP1856967A4 (zh)
JP (2) JPWO2006093229A1 (zh)
KR (1) KR20070120943A (zh)
CN (1) CN101146440B (zh)
AU (1) AU2006219311B2 (zh)
BR (1) BRPI0608458A2 (zh)
CA (1) CA2598109C (zh)
MX (1) MX2007010819A (zh)
RU (2) RU2409937C2 (zh)
WO (1) WO2006093229A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113677195A (zh) * 2019-04-11 2021-11-19 三得利控股株式会社 花粉形成能力低的甜菊植物

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9101160B2 (en) 2005-11-23 2015-08-11 The Coca-Cola Company Condiments with high-potency sweetener
US8017168B2 (en) 2006-11-02 2011-09-13 The Coca-Cola Company High-potency sweetener composition with rubisco protein, rubiscolin, rubiscolin derivatives, ace inhibitory peptides, and combinations thereof, and compositions sweetened therewith
CN102118964A (zh) 2008-01-22 2011-07-06 守田化学工业株式会社 新的甜叶菊变种和制备甜味剂的方法
KR101918422B1 (ko) 2008-10-03 2018-11-13 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 신규 스테비올 배당체
US9131718B2 (en) 2009-06-16 2015-09-15 Epc (Beijing) Natural Products Co., Ltd. Process for rebaudioside D
US9578895B2 (en) 2010-08-23 2017-02-28 Epc (Beijing) Natural Products Co., Ltd. Rebaudioside A and stevioside compositions
US20130347140A1 (en) * 2010-12-31 2013-12-26 Qibin Wang High Rebaudioside-A Plant and Methods of Producing the Same and Uses Thereof
US20160338396A1 (en) * 2010-12-31 2016-11-24 Glg Life Tech Corporation High Rebaudioside-A Plant and Methods of Producing the Same and Uses Thereof
EP3395184A1 (en) 2011-01-28 2018-10-31 Tate & Lyle Ingredients Americas LLC Stevia blends containing rebaudioside b
US8962698B2 (en) 2011-01-28 2015-02-24 Tate & Lyle Ingredients Americas Llc Rebaudioside-mogroside V blends
US9795156B2 (en) 2011-03-17 2017-10-24 E.P.C (Beijing) Plant Pharmaceutical Technology Co., Ltd Rebaudioside B and derivatives
FR2984742A1 (fr) 2011-12-23 2013-06-28 Oreal Utilisation de steviol, d'un derive glycoside du steviol, ou d'un de leurs isomeres, pour prevenir, reduire et/ou traiter une alteration du teint de la peau.
FR2984743B1 (fr) 2011-12-23 2014-08-22 Oreal Utilisation cosmetique du steviol, d'un derive glycoside du steviol, ou un de leurs isomeres pour stimuler, restaurer ou reguler le metabolisme des cellules de la peau et des semi-muqueuses.
GB201217700D0 (en) 2012-08-01 2012-11-14 Tate & Lyle Ingredients Sweetener compositions containing rebaudioside B
KR101404728B1 (ko) 2013-02-28 2014-06-09 씨제이제일제당 (주) 스테비오사이드로부터 리바우디오사이드 a를 제조하는 방법
US10264811B2 (en) 2014-05-19 2019-04-23 Epc Natural Products Co., Ltd. Stevia sweetener with improved solubility
GB2526383B (en) 2014-05-20 2018-01-31 Tate & Lyle Ingredients Americas Llc Improved sweetener
US10357052B2 (en) 2014-06-16 2019-07-23 Sweet Green Fields USA LLC Rebaudioside A and stevioside with improved solubilities
US10485256B2 (en) 2014-06-20 2019-11-26 Sweet Green Fields International Co., Limited Stevia sweetener with improved solubility with a cyclodextrin
EP3677122A1 (en) 2014-09-30 2020-07-08 Suntory Holdings Limited Carbonated beverage, syrup used for preparing carbonated beverage, method for manufacturing carbonated beverage, and method for suppressing foaming in carbonated beverage
USPP27937P3 (en) 2014-11-30 2017-04-25 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 107’
USPP27815P3 (en) 2014-12-08 2017-03-28 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 201’
KR20170118932A (ko) 2015-03-11 2017-10-25 모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤 감미료 조성물 및 이를 포함하는 식품
USPP28373P3 (en) 2015-11-17 2017-09-12 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 129’
JP6109353B1 (ja) 2016-01-05 2017-04-05 サントリー食品インターナショナル株式会社 飲料、飲料の製造方法、及び飲料の泡立ちを抑制する方法
WO2017172401A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 S&W Seed Company Stevia plant named 'sw 227'
USPP28977P3 (en) 2016-03-31 2018-02-20 S&W Seed Company Stevia plant named ‘SW 227’
KR102546737B1 (ko) 2020-11-25 2023-06-22 씨제이제일제당 주식회사 포도당 전이 스테비아를 포함하는 감미질이 개선된 조성물

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5945848A (ja) 1982-09-09 1984-03-14 Morita Kagaku Kogyo Kk 新天然甘味料の製造方法
JP3102865B2 (ja) 1983-12-29 2000-10-23 中里 隆憲 ステビア新品種に属する植物
JPS61202667A (ja) 1985-03-04 1986-09-08 Morita Kagaku Kogyo Kk 新天然甘味料
JPS6296025A (ja) 1985-10-14 1987-05-02 中里　隆憲 乾燥葉
RU2111969C1 (ru) * 1995-11-08 1998-05-27 Республиканская научно-исследовательская лаборатория по биологически активным веществам Способ получения стевиозида
USPP10564P (en) 1996-05-29 1998-08-18 Royal-Sweet International Technologies Ltd. Stevia plant named `RSIT 94-751`
US5962678A (en) 1996-09-13 1999-10-05 Alberta Research Council Method of extracting selected sweet glycosides from the Stevia rebaudiana plant
JP2002262822A (ja) 1997-01-30 2002-09-17 Morita Kagaku Kogyo Kk 種子栽培可能なステビア品種の植物体から得られる甘味料
JPH10271928A (ja) 1997-01-30 1998-10-13 Morita Kagaku Kogyo Kk ステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する新植物
US5972120A (en) * 1997-07-19 1999-10-26 National Research Council Of Canada Extraction of sweet compounds from Stevia rebaudiana Bertoni
CN1212827A (zh) 1997-09-29 1999-04-07 胡广志 高瑞保替甙含量的甜菊杂交制种方法
US6255557B1 (en) 1998-03-31 2001-07-03 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Ministerof Agriculture And Agri-Food Canada Stevia rebaudiana with altered steviol glycoside composition
JP2000032859A (ja) 1998-07-22 2000-02-02 Morita Kagaku Kogyo Kk ステビア植物の新品種
CN1102141C (zh) * 2000-05-18 2003-02-26 泰兴市化工七厂 3.5－二甲基苯甲酸提纯方法
JP4776107B2 (ja) * 2001-07-02 2011-09-21 守田化学工業株式会社 ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別
CN1129354C (zh) 2001-07-11 2003-12-03 青岛创升生物科技有限公司 甜叶菊杂交种子的培育方法
CN1547893A (zh) 2003-05-18 2004-11-24 杨有钊 一种甜叶菊单株育成新品种改良工艺
CN101213935A (zh) 2008-01-08 2008-07-09 江苏省中国科学院植物研究所 双无性系优良f1代甜菊制种方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113677195A (zh) * 2019-04-11 2021-11-19 三得利控股株式会社 花粉形成能力低的甜菊植物

Also Published As

Publication number Publication date
CA2598109A1 (en) 2006-09-08
CA2598109C (en) 2014-03-25
AU2006219311A1 (en) 2006-09-08
EP1856967A1 (en) 2007-11-21
MX2007010819A (es) 2008-01-14
JPWO2006093229A1 (ja) 2008-08-07
RU2463780C2 (ru) 2012-10-20
EP1856967A4 (en) 2008-12-10
WO2006093229A1 (ja) 2006-09-08
AU2006219311B2 (en) 2012-02-02
KR20070120943A (ko) 2007-12-26
US7884265B2 (en) 2011-02-08
CN101146440B (zh) 2012-01-11
BRPI0608458A2 (pt) 2010-01-05
RU2010140045A (ru) 2012-04-10
RU2409937C2 (ru) 2011-01-27
JP2012090629A (ja) 2012-05-17
RU2007131961A (ru) 2009-04-10
JP5140755B2 (ja) 2013-02-13
US20090214753A1 (en) 2009-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101146440B (zh) 制备高纯度新蛇菊苷a的方法
Jobin-Decor et al. RAPD and isozyme analysis of genetic relationships between Carica papaya and wild relatives
US11109548B2 (en) Application of high flavonoid elite germplasm ‘CSR6R6-777’ in breeding for functional apple
CN105950736B (zh) 与绿豆抗豆象基因VrPGIP共分离的分子标记及其应用
US20170290285A1 (en) High rebaudioside-c plant varietal and compositions extracted therefrom with high rebaudioside-c and total steviol glycoside content
JPWO2009093610A1 (ja) 新規ステビア種および甘味料製造方法
CN106688878A (zh) 利用长雄野生稻无性繁殖特性培育多年生稻的方法
Ureshino et al. Appearance of albino seedlings and ptDNA inheritance in interspecific hybrids of azalea
Perry et al. DNA Isolation and AFLP™ Genetic Fingerprinting of shape Theobroma cacao (L.)
Ogero et al. Degeneration of cleaned-up, virus-tested sweetpotato seed vines in Tanzania
Tryphone et al. Introgression of common bacterial blight (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) resistance to common bean (Phaseolus vulgaris L.) adapted to Tanzania facilitated by marker assisted selection
CN104531764A (zh) 一种运用花粉管通道转化技术培育耐盐水稻的方法
JP4776107B2 (ja) ステビア品種のｄｎａ鑑定による識別
Ludhar et al. Deployment of yellow mosaic disease resistance in mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] through interspecific hybridization
KR20180055416A (ko) 당질미 품종인 신품종 벼
CN108703063A (zh) 一种利用单片段置换系聚合改良水稻抽穗扬花期及灌浆期耐热性的分子育种方法
CN108504770B (zh) 与豇豆抗锈病基因紧密连锁的caps标记及其应用
Bhutta et al. Identification of RAPD markers linked to salinity tolerance in wheat
KR19990069344A (ko) Rapd marker를 이용한 벼의 유묘내냉성에 관여하는양적형질유전자 지도(qtl)와 저온저항성 벼 품종 선발방법
US5557036A (en) Dark red kidney bean variety and method of production
CN105779610A (zh) 转基因抗虫玉米hgk60外源插入片段的旁侧序列及其检测方法
Singh et al. Research Article Marker-Assisted Introgression of Saltol QTL Enhances Seedling Stage Salt Tolerance in the Rice Variety “Pusa Basmati 1”
Ngugi Marker assisted breeding to transfer Striga resistance in sorghum from a mapped donor source N13 to a farmer preferred Kenyan variety Ochuti
Bisztray et al. A complex system for the production of pathogen-free grapevine propagating material
Kanya Gene flow between cultivated rice (oryza sativa) and the wild rice (oryza longistaminata), and its potential ecological consequences in Kenya

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120111

Termination date: 20160302

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee