KR20070120943A - 스테비아 감미료 - Google Patents

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고지 모리타
고이찌로 고마이
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모리타 가가쿠 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명에 의해, 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 4 중량부 이상 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종의 새로운 식물체가 제공되며, 상기 식물체 또는 그 건조엽으로부터 양질인 감미료를 용이하게 제조할 수 있다.
스테비아 감미료, 스테비오사이드, 레바우디오사이드 A

Description

스테비아 감미료{STEVIA SWEETENER}
본 발명은 스테비오사이드에 대하여 레바우디오사이드 A의 함유 비율이 높은 스테비아 레바우디아나 베르토니의 품종에 속하는 식물체, 상기 식물체 및/또는 그 건조엽으로부터 추출되는 감미료의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 감미료로부터 고순도 레바우디오사이드 A를 제조하는 방법에 관한 것이다.
스테비아는 남미 파라과이를 원산지로 하는 국화과 다년생 식물이며, 학명을 스테비아 레바우디아나 베르토니(Stevia Rebaudiana Bertoni)라고 한다. 스테비아는 설탕의 300배 이상의 감미를 갖는 감미 성분을 포함하기 때문에, 이 감미 성분을 추출하여 천연 감미료로서 사용하기 위해 재배되고 있다.
스테비아의 감미 성분으로서는, 스테비오사이드(C38H60O18), 레바우디오사이드 A(C44H70O23), 레바우디오사이드 C, D, E, 둘코사이드 A 등이 알려져 있다. 일반적으로 재배되고 있는 스테비아 품종에서는 상기 감미 성분 중 스테비오사이드(ST)가 주성분이고, 레바우디오사이드 A(RA)의 함유량은 스테비오사이드의 약 10분의 3 내지 4, 레바우디오사이드 C의 함량은 그보다 약간 적지만, 품종에 따라 레바우디오사이드 C를 주성분으로 하는 것 등 다양하다.
쓴맛, 떫은맛 등의 혀로 지각되는 맛 중에서도 단맛의 질은 매우 미묘하다. 스테비오사이드는 설탕의 300배의 감미도를 갖기 때문에 천연 감미료로서 식품 공업계에서 사용되고 있다. 그 감미는 비교적 설탕과 유사하지만, 쓴맛 등의 불쾌한 뒷맛이 입에 남는다는 결점이 있다. 그렇기 때문에 스테비오사이드를 다량으로 포함하는 것은 감미료로서 바람직한 것이 아니다. 이에 비해, 레바우디오사이드 A는 양질의 감미질과 스테비오사이드의 1.3배 내지 1.5배의 감미도를 갖는다.
레바우디오사이드 A의 생산 비용의 삭감과 안정적인 건조엽의 수확량을 유지하며, 감미료 원료로서 감미질이 우수한 레바우디오사이드 A를 고함유한 스테비아 품종을 개발하고, 동시에 이들을 계속적 공급을 유지하여, 이들을 기초로 우수한 감미료를 제조할 필요가 있다.
본 발명자들은 종래 품종으로부터 교배 선발을 반복하여 품종 개량을 행하며, 스테비오사이드(ST)에 대하여 레바우디오사이드 A(RA)가 높은 함유 비율을 나타내는 스테비아 품종을 얻고, 이들 식물로부터 감미 성분을 추출하여 스테비오사이드에 대하여 레바우디오사이드 A의 함유비가 높은 우수한 감미료를 제조하였지만(후술하는 특허 문헌 1-1 내지 1-3 참조), 레바우디오사이드 A가 안정적이고, 함유비가 보다 높은 우수한 품종의 개발이 요구되었다.
한편, 스테비아 식물의 품종 개량에서 스테비아 식물을 특정하는 방법이 문제가 된다. 개량된 스테비아 식물의 식별 방법으로서, 초장(草丈), 엽형(葉形) 등에 의한 식별을 생각할 수 있지만, 스테비아는 자가 불화합성이며, 잡종이 되기 쉽기 때문에, 초장, 엽형 등에 의한 식별만으로는 불가능하다.
또한, 스테비아 특유의 병원균에 대한 내병성에 따른 비교 특정도 있는데, 스테비아에 특유하게 발현하는 고엽, 흑반점병은 셉토리아(Septoria) 균, 알터나리아(Alternaria) 균에 기인하여 발생하지만, 이들 균은 토양에 생식하는 균이다. 따라서, 이들 증상은 일본 뿐만 아니라 세계적으로 발생하기 때문에, 이들 특성만으로 품종을 특정하기에는 불충분하다.
감미 성분의 함유량이 높고, 스테비오사이드에 대하여 레바우디오사이드 A의 함유 비율이 높은 개량 품종에서는, 그 함유 비율에 의한 특정 방법을 생각할 수 있지만, 생육 기간의 기상 조건, 수확 시기 등에 의해 감미 성분 비율이 변동되는 것은 피할 수 없기 때문에, 이 방법도 현실성이 불충분하다.
최근, 프라이머 믹스를 사용하는 RAPD법을 기반으로 하는 DNA 감정에 의해 식별을 행하는 방법(후술하는 특허 문헌 2 참조)도 개발되었지만, 본 발명의 식물체의 감정에 이를 적용할 수 있는 지의 여부는 분명하지 않다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (소)59-045848호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (소)60-160823호 공보
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 (소)61-202667호 공보
특허 문헌 4: 일본 특허 공개 제2003-9878호 공보
<발명이 해결하고자 하는 과제>
본 발명은 감미 성분 함량과 감미 성분 함유비가 우수한 품종을 창조하고, 그 특징을 유지하기 위해 RAPD법으로 유전자를 식별함으로써 다른 품종의 스테비아 식물과 구별한 후, 감미질이 우수한 감미료 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 국면은, 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 4 중량부 이상 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종이다. 이 때문에, 후술하는 바와 같이 교배와 선별을 반복하여 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 4 중량부 이상 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종에 속하는 새로운 식물체를 창조하였다.
본 발명의 제2 국면은, 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 4 중량부 이상을 포함하는 감미료의 제조 방법이며, 상기 제조 방법은 상술한 식물체 또는 그 건조엽을 물 또는 함수 용매로 추출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제3 국면은, 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 40 중량부 이상 포함하는 고순도 감미료의 제조 방법이며, 상기 제조 방법은 상기에서 얻어진 감미료를 재결정하는 것을 특징으로 하는, 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 40 중량부 이상 포함하고 그의 함량이 92％ 이상인 감미료의 제조 방법이다.
교배와 선별을 통한 품종 개량에서는, 선별된 품종의 특정 방법이 중요한 의미를 갖는다. 본 발명자들은 RAPD법에 의해, DNA 감정에 의한 특정 방법을 검토하였다.
<발명의 효과>
본 발명은 감미질이 우수한 감미료 및 그의 제조 방법을 제공한다.
[도 1] 모리타 품종, SS 및 SN의 DNA 염기 서열의 전기 영동도이다. 화살표 부분에 특징적인 염기 서열이 관찰된다.
[도 2] 모리타 품종 및 SN의 DNA 염기 서열의 전기 영동도이다. 화살표 부분에 특징적인 염기 서열이 관찰된다.
<부호의 간단한 설명>
도 1에서의 기호 a 내지 h는 각각 하기와 같다.
a: Hind III 마커
b, e: SN 품종
c, f: 모리타 품종
d, g: SS 품종
h: 1 kbp DNA 래더(ladder) 마커
도 2에서의 기호는 이하와 같다.
모리타: 모리타 품종
SN: SN 품종
M: DNA 마커(100 bp 래더)
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명의 식별에 사용되는 RAPD법(Random Amplified Polymorphic DNA method)은 DNA의 분석 방법 중 하나이고, 복수의 프라이머를 사용하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)을 행하면, 사용한 프라이머와 동일하거나 유사한 서열 사이에 끼인 DNA의 영역이 증폭되고, 이 증폭된 DNA의 패턴을 전기 영동으로 분석하는 방법 이다. 또한, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)는 장쇄 알킬기를 갖는 4급 암모늄염이고, 이는 핵산과 같은 폴리 음이온과 불용성의 복합체를 형성하므로 핵산의 단리에 이용할 수 있다.
DNA의 차이에 따라 품종 식별하는 수단은 CTAB에 의해 식물체로부터 게놈 DNA를 단리하고, 리보핵산(RNA)을 제거하며, 프라이머 믹스를 사용하여 PCR법에 의해 얻어진 PCR 증폭 산물을 아가로스 겔 전기 영동법에 의해 얻어지는 DNA 지문의 차이에 따라 구별한다. 본 발명의 식물체의 경우, 후술하는 바와 같이 2000 bp 하부에 특징적인 염기 서열을 나타낸다는 것이 확인되었다.
실제로는, 원료의 식물체에 대하여 선택적으로 침전시킨 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머로서 예를 들면 A06(염기 서열; ACTGGCCGAGGG)과 A48(염기 서열; CCGCAGGGACCA)의 세트 및 rTaq(TAKARA)를 사용하여 94도(30초), 55도(30초), 72도(120초)에서 35 사이클 반응을 행한 후, 72도에서 10분간 반응시킨다. 그 후, PCR 증폭 산물을 아가로스 전기 영동법에 의해 확인하고, 특정한 DNA 밴드에 의해 식물체를 확인할 수 있다.
감미료의 제조에는, 해당 식물체 또는 그 건조엽으로부터 물 또는 함수 용매로 추출하고, 이어서 추출액을 그대로 농축하거나, 또는 필요에 따라 음이온 교환 수지, 양이온 교환 수지 또는 활성탄으로 이온성 불순물을 제거하고, 흡착 수지에 감미 성분을 흡착시켜 친수성 용매로 용리하며, 용리액을 농축, 건조하여 감미료를 얻는다. 감미료의 제조 방법은 이외에 탈색 등의 관용의 정제 수단을 필요에 따라 적절하게 포함할 수 있고, 고순도 레바우디오사이드 A를 얻는 방법은 막 분리, 알 코올 추출, 결정화 등의 관용 수단을 포함할 수 있다. 또한, 결정화 방법은 결정 용매로서 에탄올, 메탄올 등의 유기 용매에 물을 첨가하여, 적절하게 사용할 수 있다. 이렇게 얻어진 감미료에 다른 천연, 인공 감미료, 희석제 등을 첨가할 수도 있다.
레바우디오사이드 A를 비교적 고농도로 함유하는 품종의 육종 과정
육종은 레바우디오사이드 A를 비교적 고농도로 함유하는 품종의 교배 선발로 행하며, 우선 레바우디오사이드 A를 고농도로 함유하는 SF5-1 및 SF5-2(일본 특허 공개 (평)10-271928호 기재)를 인공적으로 교배하고, 얻어진 종자로부터 TD-1(일본 특허 공개 제2003-9878호 기재)을 선택하며, 이들을 추가로 인공적으로 교배하고, 얻어진 종자로부터 셉토리아균 및 알터나리아균에 내성을 갖는 품종을 선발하고, 그 감미 성분을 분석하여, 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 4 중량부 이상 포함하며, 감미 함유량이 높고, 내병성이 비교적 우수한 식물주(株)를 선발하였다. 또한, 감미 성분 함량, 감미 성분 비율 및 생육 상황을 반복 확인하여, 모리타 품종으로 명명하고 그 유전자를 검색하였다.
또한 출원인은, 금회 본 발명에 따른 모리타 품종에 대하여, 이미 국제 기탁을 완료하였다(수탁 번호 FERM BP-10353). 따라서, 이 기탁에 따른 모리타 품종의 종자로부터, 용이하게 본 발명의 식물체를 입수할 수 있다. 스테비아는 자가 불화합성이며, 해당 종자로부터 목적으로 하는 식물체가 항상 얻어지지는 않지만, 본원에 기재된 DNA 감정에 따라 목적 식물을 용이하게 선별할 수 있다. 또한 필요하면, 다른 고품질 스테비아종(예를 들면, TD-1)과 교배하여, 후술하는 실시예 1에 준하여 선별을 행하면, 레바우디오사이드 A를 고농도로 함유하는 식물체를 용이하게 입수할 수 있다. 이들 식물체는 전부 국제 기탁을 행한 품종, 즉 모리타 품종의 종자로부터 얻어질 수 있는 식물체에 포함된다.
이하에, 육종 과정 및 그 특성 등을 구체적으로 기재한다. 그러나, 본 발명은 본 육종 과정 및 재배 방법으로 한정되지 않는다.
실시예 1
레바우디오사이드 A를 비교적 고농도로 함유하는 품종의 교배로 얻어진 종자로부터, 레바우디오사이드 A를 함유하는 SF-1 및 SF5-2 품종(일본 특허 공개 (평)10-271928호 기재)을 니이미 공장 내 비닐 하우스 내에서 인공적으로 교배하여, 얻어진 종자를 파종하고, 발아한 모종을 육묘 포트에 이식하고, 5월 상순에 길이 약 8 ㎝ 이상의 모종 600개를 공장 내 포장(圃場)에 1 아르(are) 당 질소, 인, 칼륨의 비료 성분 각 약 20 ㎏을 시비(施肥)하고 이식하였다. 7월 상순에 추가로 1 아르당 질소, 인, 칼륨의 비료 성분 각 10 ㎏을 시비하였다.
9월 상순에 조사하여 그 감미 성분을 분석하고, 스테비오사이드에 대하여 레바우디오사이드 A를 3배 이상 포함하는 주 TD-1 품종(일본 특허 공개 제2003-9878호 기재)을 선발하였다.
1998년에 TD-1 품종을 니이미 공장 내 비닐 하우스에서 인공적으로 교배하고, 얻어진 종자를 1999년 3월에 니이미 공장 내의 비닐 하우스에 파종, 발아한 모종을 육묘 포트에 이식하고, 5월 상순에 길이 약 7 ㎝ 이상의 모종 300개를 공장 내 포장에 1 아르당 질소, 인, 칼륨의 비료 성분 각 약 20 ㎏을 시비하여 이식하였다. 7월 상순에 추가로 1 아르당 질소, 인, 칼륨의 비료 성분 각 10 ㎏을 시비하였다.
9월 상순에 조사하여 그 감미 성분을 분석하고, 스테비오사이드에 대하여 레바우디오사이드 A를 4 중량부 이상 포함하며, TD-1 품종보다 내병성이 우수하고, 생육이 양호한 주를 선발하였다. 2000년 4월 중순에 이들로부터 맹아한 싹을 100개 삽목하였다. 5월 상순에 마찬가지로 공장 내 포장에 이식하며, 7월 말에 내병성, 생육을 재차 조사하여 감미 성분비, 함량의 우수함을 확인하였다. 또한, 2001년부터 3년에 걸쳐서 내병성, 감미 성분비, 감미 성분 함량, 건조엽 수량의 우수함, 및 생육 및 성분 변화의 유무를 확인하여, 모리타 품종으로 명명하였다.
모리타 품종, TD -1 및 SN 의 비교 시험
모리타 품종과 다른 품종의 비교를 위해, 레바우디오사이드 A를 주성분으로 하는 TD-1(TD), 스테비오사이드를 주감미 성분으로 하고, 레바우디오사이드 A를 부감미 성분으로 하는 일반적인 스테비아 품종(SN) 각 40개도 마찬가지로 삽목하여, 마찬가지로 공장 내 포장에 이식하였다.
상기한 5월 상순에 포장에 이식한, 삽목에 의해 증식시킨 모리타 품종의 모종 200개와, TD 품종, SN 모종 각 40개 중, 6월 상순에 임의로 선택한 각 품종 10개 중에서의 발병의 유무를 조사한 후, 모리타, TD, SN의 각 품종을 지상으로부터 15 ㎝로 수확한 후, 엽부를 분리하여 건조 후 분석 시료로 하였다.
분석 결과는 다음과 같았다.
Figure 112007063927828-PCT00001
모리타 품종, TD 및 SN 의 비교 시험 2
7월 중순에 추가로 비료를 주고, 각 품종 1구획 20주를 선택하여 셉토리아균, 알터나리아균의 발병 조건을 조사한 후, 각 품종을 지상부로부터 수확한 후, 엽부를 분리하여 건조 후 분석 시료로 하였다.
분석 결과는 다음과 같았다.
Figure 112007063927828-PCT00002
모리타 품종은 하엽 흑반점의 발병 비율이 비교적 낮고, 감미 성분 함량 및 건조엽 수량도 다른 품종보다 우수하였다. TD 품종은 모리타 품종보다 셉토리아균에 의한 하엽 흑반점이 많고, 이미 잎이 셉토리아균에 의해 황색으로 변색되기 시작하였다. SN 품종은 하엽의 3마디까지의 부분에서 셉토리아균에 의한 황변이 관찰되었고, 지상으로부터 첫째 마디의 잎은 시들어 있었다.
2004년 3월에 모리타 품종으로부터 맹아한 이삭 끝을 200개 삽목하고, 4월 하순에 포장에 이식하여 5월 말, 6월 말, 7월 말, 8월 말, 9월 말, 개화 후의 10월 말에 지상부를 수확하며, 잎만을 분리한 후 건조하여, 감미 성분 함량을 측정하였다.
감미 성분의 측정은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 행하였다.
Figure 112007063927828-PCT00003
모리타 품종은 생육 기간에 따라 감미 성분 함량 및 감미 성분비가 상이하고, 생육 기간이 길어짐에 따라 감미 성분 함량이 증가하며, 한편 스테비오사이드 함량이 감소하는 경향을 보였다. 개화 시기인 10월 말에는 감미 성분 함량이 감소하였다.
유전자 염기 서열의 특정(1)
감미 성분 함량, 감미 성분비 및 수량의 측면에서 모리타 품종이 가장 우수하기 때문에, 모리타 품종을 PCR법에 의해 식별하였다.
건열 멸균한 막자 사발에 모리타 품종의 잎을 약 0.2 g 넣고, 액체 질소를 첨가하여 막자로 으깨고, 마이크로 튜브에 스파튤러로 한번에 약 0.05 g씩 넣었다. 300 ㎕의 2％ CTAB 용액(2％ CTAB 용액(50 ㎖): 조성 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 mM EDTA(pH 8.0), 2％ CTAB, 1.4 M NaCl)을 첨가하여 전도 혼화한 후, 65℃로 가열한 가열 블록으로 튜브를 옮겨, 30분간 가온하였다. 등량(300 ㎕)의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 첨가하고, 천천히 교반하였다. 14000 rpm에서 15분간 원심 분리한 후, 2층으로 분리된 내용물의 상층의 수층을 새로운 튜브로 옮긴다.
상술한 클로로포름/이소알루미늄알코올 이후의 조작을 다시 한 번 반복하여, 수층을 새로운 튜브로 옮긴다. 400 ㎕의 1％ CTAB 용액(1％ CTAB 용액(50 ㎖): 조성 1 M Tris-HCl 2.5 ㎖, EDTA 1.0 ㎖, 1％ CTAB 0.5 g)을 첨가하여 15분간 전도 혼화한 후, 1시간 동안 실온에서 정치하고, 14000 rpm에서 15분간 원심 분리를 행한다.
상청액을 버리고 400 ㎕의 1 M CsCl을 첨가하며, 피펫팅을 행하여 침전물을 완전히 용해한다. 900 ㎕의 100％ 에탄올을 첨가하여 전도 혼화한 후, -20℃에서 20분 이상 정치하고, 14000 rpm에서 15분간 원심 분리를 행한다. 상청액을 버리고 침전물에 400 ㎕의 70％ 에탄올을 첨가하여 14000 rpm에서 15분간 원심 분리를 행하며, 이 조작을 반복한 후 상청액을 버리고, 침전물을 진공 건조기로 건조하여, 30 ㎕의 초순수에 용해한다. 용액을 아가로스 겔 전기 영동하여, DNA가 단리되어 있다는 것을 확인하였다.
RNA를 제거하기 위해 RNase 용액 500 ㎕(조성: 상기 DNA 단리 용액 100 ㎕, RNase(5 g/㎖) 5 ㎕)로 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 반응액에 PCI 용액(조성: 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 25:24:1을 혼합한 후, 13000 rpm에서 5분간 원심하여, 수층을 분리한 용액)을 등량 첨가한다. 마개를 덮고 천천히 혼합한 후, 13000 rpm에서 5분간 원심하였다.
수층(상층)을 새로운 마이크로 튜브에 옮기고, 실온에서 보존하고 있었던 CIA 용액(조성: 클로로포름/이소아밀 알코올, 용량비 24:1)을 등량 첨가하여 천천히 혼합한 후, 15000 rpm에서 3분간 원심하여 수층을 새로운 마이크로 튜브로 옮기고, 다시 한 번 CIA 처리를 행하여 얻어진 상청액의 1/10배량의 3 M 아세트산나트륨과 2.5배량의 100％ 에탄올을 첨가하여 잘 혼합한 후, -20℃에서 20분 이상 냉각하고, 15000 rpm에서 15분간 원심하고, DNA를 펠릿화하여 상청액을 버리고, 펠릿에 냉각한 70％ 에탄올을 1 ㎖를 첨가한 후, 15000 rpm에서 15분간 원심하고, 상청액을 버리고, 다시 한 번 냉각한 70％ 에탄올을 1 ㎖ 첨가한 후, 15000 rpm에서 15분간 원심하고, 상청액을 버리고, 감압 데시케이터를 사용하여 5분간 건조시켰다.
얻어진 게놈 DNA를 주형으로서 PCR용 조성물(표 4)로, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 120초간 35 사이클 반응을 행한 후, 72℃에서 10분간 반응시킨다. 반응한 후, 4℃로 유지하여 PCR 증폭 산물을 얻었다. PCR 증폭 산물의 DNA 밴드를 1％ 아가로스 겔 전기 영동으로 확인하면, 도 1의 모리타가 나타내는 바와 같이, 대략 2000 bp 하측에 특징적인 DNA 단편을 확인할 수 있었다.
Figure 112007063927828-PCT00004
마찬가지로, 스테비오사이드를 주성분으로 하고, 레바우디오사이드 A를 부성분으로 하는 SN 품종(SN) 및 SS 품종(SS)을 상기와 동일하게 처리하여 수득한 DNA 밴드를 도 1에 나타낸다.
모리타 품종은 대략 2000 bp 하부에 특징적인 염기 서열을 가지므로, DNA를 아가로스 겔 전기 영동으로 검출함으로써 다른 품종과 용이하게 구별할 수 있다.
유전자 염기 서열의 특정(2)
상기와 상이한 프라이머를 사용하여, 모리타 품종 및 SN 품종의 비교를 행하였다.
<DNA 추출>
DNA 추출은 CTAB법에 의해 행하였다. 모리타 품종, SN 품종 각각의 잎 약 0.5 g을 막자 사발 중에서 액체 질소에 의해 동결하고, 막자로 분쇄하였다. 분쇄한 샘플은 50 ㎖ 팔콘 튜브 중에서 20 ㎖의 2％ CTAB 용액(100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 mM EDTA(pH 8.0), 2％ CTAB, 1.4 M NaCl, 1％ PVP)과 혼화하여, 65℃에서 30분간 배양하였다. 등량의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 첨가하여 10분간 교반한 후, 3500 rpm에서 15분간 원심 분리하고, 수층을 별도의 50 ㎖ 팔콘 뷰트로 옮겼다.
또한 등량의 100％ 이소프로판올을 첨가하고, 3500 rpm에서 15분간 원심 분리하며, 침전물을 훅으로 모아 1.5 ㎖ 마이크로 튜브로 옮겼다. 침전물을 75％ 에탄올로 린스한 후, 건조시켜 600 ㎕의 TE 버퍼에 용해하였다. RNase 용액(1 ㎎/㎖)을 1 ㎕ 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 등량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 혼화하고 나서 15000 rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 수층을 별도의 마이크로 튜브로 옮겨 1/10량의 3 M 아세트산나트륨과 등량의 이소프로판올을 첨가하고, 혼화하여 15000 rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 얻어진 침전물을 75％ 에탄올로 2회 린스한 후, 건조시켜 50 ㎕의 TE 버퍼에 용해하여 DNA 샘플로 하였다.
<PCR 분석>
얻어진 DNA 샘플을 주형으로서 이하의 반응액 조성으로 PCR 반응을 행하였다. PCR 사이클은 96℃에서 30초간 반응시킨 후, 96℃에서 10초, 42℃에서 2분, 72℃에서 2분간 35 사이클, 추가로 72℃에서 4분간 반응시켰다. 반응한 후, PCR 산물을 1.8％ 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분획하고, EtBr 염색한 후 UV 조사하에 촬영하였다. 그 결과, 프라이머 UBC-66에 의해 약 2000 bp 부근에 모리타 품종에서 특이적인 밴드를 확인할 수 있었다. 또한, 프라이머 UBC-72에 의해 약 600 bp 부근에, UBC-106에 의해 약 700 bp 부근에 SN 품종에서 특이적인 밴드가 확인되었다. 이 결과로부터 모리타 품종과 SN 품종은 유전적으로 상이한 계통이고, RAPD 분석에 의해 용이하게 그 차이를 검출할 수 있다는 것이 분명해졌다.
반응액 조성(50 ㎕ 중)
10x PCR 버퍼 5 ㎕
dNTP(2.0 mM) 5 ㎕
RAPD 프라이머 *(10 mer) 5 ㎕(5 μM)
블렌드 태크(Blend Taq)(등록상표)(TOYOBO) 0.5 ㎕(2.5 U/㎕)
스테비아 DNA 1 ㎕(30 ng/㎕)
멸균수 33.5 ㎕
*프라이머로서는 하기의 UBC-66, UBC-72 또는 UBC-106을 사용하였다.
UBC-66: GAGGGCGTGA
UBC-72:GAGCACGGGA
UBC-106:CGTCTGCCCG
실시예 2 감미료의 제조
9월 말에 얻어진 모리타 품종의 건조엽 20 g을 20배량의 물로 감미가 느껴지지 않을 때까지 수회 추출하고, 추출액을 양이온 교환 수지(엠버라이트 IR-120B) 20 ㎖를 충전한 칼럼 및 음이온 교환 수지(듀오라이트 A-4) 20 ㎖ 및 입상 활성탄 5 ㎖를 충전한 칼럼에 통액하여, 컬럼 통과액을 흡착 수지(다이아 이온 HP-20) 100 ㎖를 충전한 칼럼을 통해 통액시켜 감미 성분을 흡착시키며, 충분히 수세한 후 에탄올 300 ㎖에 용리시켰다. 수득한 용리액을 감압하에 농축하고, 건조하여 담황백색의 분말을 얻었다. 비교를 위해 TD, SN으로부터도 동일한 처리를 행하여 감미 성분을 얻고, 이것을 분석하였다.
분석 방법 고성능 액체 크로마토그래피법
사용 칼럼 Hibar Licrosorb NH2 5 μ 4 ㎜(직경)×250 ㎜
유속 1.5 ㎖/분
전개 용매 아세토니트릴:물=82:18
측정 파장 210 ㎚
표 5에 추출 정제물의 분석 결과를 나타낸다. 표 중의 ST는 스테비오사이드, RA는 레바우디오사이드 A이다.
Figure 112007063927828-PCT00005
관능 시험 1
실시예 2에서 얻어진 모리타 및 SN의 담황색의 분말의 각 0.1％ 용액을 제조하여, 스테비아 감미료의 미질에 정통한 패널리스트 10명에 의해 쓴맛, 떫은맛, 감미질을 비교하였다.
Figure 112007063927828-PCT00006
각 시료에서 모리타 품종은 쓴맛, 떫은맛이 다른 시료보다 개선되어 있었고, 감미질이 우수하였다.
관능 시험 2
실시예 2에서 얻어진 모리타 및 TD의 담황색의 분말의 각 0.1％ 용액을 제조하여, 스테비아 감미료의 미질에 정통한 패널리스트 10명에 의해 쓴맛, 떫은맛, 감미질을 비교하였다.
Figure 112007063927828-PCT00007
각 시료에서 모리타 품종은 쓴맛, 떫은맛이 다른 시료보다 개선되어 있었고, 감미질이 우수하였다.
실시예 3 고순도 레바우디오사이드 A 감미료의 제조
실시예 2에서 얻어진 추출 정제물(모리타 품종) 2 g을 10배량의 95％ 메탄올에 가열 용해한 후, 4℃로 6일간 냉각 방치하였다. 이렇게 얻어진 결정을 분리하여 냉메탄올로 세정한 후, 감압 건조하여 백색의 결정 1.2 g을 얻었다. 비교를 위해 TD 및 SN에도 동일한 처리를 행하여 각각 백색의 결정 0.9 g 및 0.6 g을 얻고, 이것을 분석하였다.
분석 방법 고성능 액체 크로마토그래피법
사용 칼럼 Hibar licrosorb NH2 5 μ 4 ㎜(직경)×250 ㎜
유속 1.5 ㎖/분
전개 용매 아세토니트릴:물=82:18
측정 파장 210 ㎚
표 8에 추출 정제물의 분석 결과를 나타낸다. 표 중의 ST는 스테비오사이드, RA는 레바우디오사이드 A이다.
Figure 112007063927828-PCT00008
관능 시험 3
실시예 3에서 얻어진 SN 백색 분말의 각 0.1％ 용액을 제조하고, 스테비아 감미료의 미질에 정통한 패널리스트 10명에 의해 쓴맛, 떫은맛, 감미질을 비교하였다.
Figure 112007063927828-PCT00009
각 시료에서 모리타 품종은 쓴맛, 떫은맛이 다른 시료보다 개선되어 있었고, 감미질이 우수하였다. 고순도 제품의 회수율도 우수하였다.
관능 시험 4
실시예 3에서 얻어진 TD의 백색 분말의 각 0.1％ 용액을 제조하고, 스테비아 감미료의 미질에 정통한 패널리스트 10명에 의해 쓴맛, 떫은맛, 감미질을 비교하였다.
Figure 112007063927828-PCT00010
각 시료에서 모리타 품종은 쓴맛, 떫은맛이 다른 시료보다 개선되어 있었고, 감미질이 우수하였으며, 고순도 제품의 회수율도 우수하였다.
실시예 4 고순도 레바우디오사이드 A 감미료의 제조
실시예 2에서 얻어진 추출 정제물(모리타 품종)의 2 g을 5배량의 75％ 메탄올에 가열 용해한 후, 4℃로 7일간 냉각 방치하였다. 이렇게 얻어진 결정을 분리하여 냉메탄올로 세정한 후, 감압 건조하여 백색의 결정 0.9 g을 얻고, 분석하였다.
Figure 112007063927828-PCT00011
<110> Morita Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha <120> Stevia Sweetener <150> JP 2005-060930 <151> 2005-03-04 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Characteristic DNA sequence found in improved species of stevia <400> 1 actggccgag gg 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Characteristic DNA sequence found in improved species of stevia <400> 2 ccgcagggac ca 12

Claims (6)

  1. 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 4 중량부 이상 포함하며, RAPD법에 의한 DNA 분석에서 2000 bp 하부에 특징적인 염기 서열을 나타내는 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종 식물체.
  2. 제1항에 있어서, 국제 기탁(수탁 번호 FERM BP-10353)의 종자로부터 얻어질 수 있는 식물체.
  3. 제1항에 기재된 식물체 또는 그 건조엽을 물 또는 함수 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 감미료의 제조 방법.
  4. 제2항에 기재된 식물체 또는 그 건조엽을 물 또는 함수 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 감미료의 제조 방법.
  5. 제3항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터, 스테비오사이드 1 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 40 중량부 이상 포함하며, 순도가 92％ 이상인 고순도 레바우디오사이드 A를 얻는 방법.
  6. 제4항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터, 스테비오사이드 1 중량 부에 대하여 레바우디오사이드 A를 40 중량부 이상 포함하며, 순도가 92％ 이상인 고순도 레바우디오사이드 A를 얻는 방법.
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