KR20100106509A - 신규 스테비아종 및 감미료의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 순도가 높은 스테비오사이드 감미료를 제공한다. 교배와 선별에 의한 품질 개량을 실시하고, DNA 감정법을 이용하여, 스테비아 레바우디아나 베르토니의 품종을 특정하였다. 그리고 이들 교배에 의해, 특정한 품종이 계속하여 재배 가능한 신품종을 개발하였다(수탁 번호 FERM BP-10870). 상기 품종의 건조엽을 추출하면, 스테비오사이드를 고농도로 포함하는 단맛 성분이 안정적으로 얻어지고, 이에 의해 바람직한 각종 스테비오사이드 감미료를 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 스테비오사이드의 함유 비율이 매우 높고, 이러한 형질을 갖는 식물체를 종자에 의해 계속적으로 생산할 수 있는 스테비아 레바우디아나 베르토니의 품종에 속하는 식물체, 상기 식물체로부터 얻어지는 종자를 이용한 식물체, 및/또는 그의 건조엽으로부터 추출되는 감미료의 제조 방법, 및 이들 감미료로부터 α-글루코실스테비오사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
스테비아는 남미 파라과이를 원산지로 하는 국화과 다년생 식물로, 학명을 스테비아 레바우디아나 베르토니(Stevia Rebaudiana Bertoni)라고 한다. 스테비아는 설탕의 300배 이상의 단맛을 갖는 성분을 포함하기 때문에, 이 단맛 성분을 추출하여 천연 감미료로서 이용하기 위해 재배되고 있다.
스테비아의 단맛 성분으로서는 스테비오사이드(C38H60O18), 레바우디오사이드 A(C44H70O23), 레바우디오사이드 C, D, E, 둘코사이드 A 등이 알려져 있다. 일반적으로 재배되고 있는 스테비아 품종으로서는 상기 단맛 성분 중 스테비오사이드(이하, ST)가 주성분으로, ST 100 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A(이하, RA)의 함유량은 40 중량부 정도, 레바우디오사이드 C의 함량은 그것보다 약간 적다. 그러나, 품종에 따라서는 레바우디오사이드 C를 주성분으로 하는 것 등도 있고, 다양하다.
ST는 설탕의 300배의 감미도를 갖기 때문에 천연 감미료로서 식품 공업계에서 널리 이용되고 있고, 그의 단맛은 비교적 설탕에 유사하지만, RA와 비교하면 쓴맛 등의 불쾌미가 뒷맛에 남는 것이 알려져 있다. 이것에 대하여, RA는 양질의 감미질과 ST에 대하여 1.3배 내지 1.5배의 감미도를 갖기 때문에, 일반적으로는 ST보다도 RA의 함유율이 높은 스테비아 감미료가 바람직하다고 되어 있다.
예를 들면, 본 발명자들은 종래 품종에서 교배 선발을 반복하여 품종 개량을 행하고, RA에 대하여 ST가 극미량밖에 함유되지 않은 스테비아 품종을 얻어, 이들 품종으로부터 얻어진 종자에 의한, 육묘가 용이하고 단맛 성분 내용을 계속 재배할 수 있는 신품종을 개발하였다(후술 특허 문헌 1, 2 참조).
그러나, 떫은맛, 매운맛 등의 혀로 지각되는 맛 중에서도 단맛의 질은 매우 미묘하다. RA와 비교한 경우 쓴맛 등의 불쾌미가 뒷맛에 남는다고 하는 ST라도, 그의 농도, 순도를 높임으로써 잡맛이 제거되어 단맛의 질이 개선되고, 감미료로서의 용도가 넓어진다. 예를 들면 ST의 뒷맛에 느끼는 감미질은 염성 식품에 사용함으로써 염에 의한 미각 자극을 마스킹할 수 있다. 또한, 과즙의 떫은맛이나 유기산, 그의 염류의 마스킹제로서의 이용이 가능하여, RA와는 다른 감미료로서 ST 감미료도 식품 분야에서 필요로 되고 있다.
또한, α-글루코실화와 그것에 계속되는 당쇄 조정에 의해 스테비아 추출물의 단맛을 개선하는 방법은 알려져 있다(후술 특허 문헌 3 참조). 이러한 방법에 의해 얻어지는 α-글루코실스테비오사이드를 주체로 하는 감미료는 일반적인 스테비아 추출물에 비교하여, ST 이외의 단맛 성분에 의한 감미질의 방해가 적은 것이 특징이다.
원래부터 ST는 스테비아 감미료의 주성분이므로, 그의 이용을 촉진하는 것은 자원의 유효 활용의 관점에서도 바람직하다.
종래, 고순도의 ST를 얻기 위해서는 재결정을 반복하는 수밖에 방법이 없었다. 재결정에서는 스테비아에 포함되는 ST 이외의 성분이 재결정 수율을 저하시키는 원인이 되고 있고, 그 중에서도 RA는 ST에 이어 스테비아의 단맛 성분인 점에서, 고순도 ST의 생산 비용의 삭감과 안정된 수량을 유지하기 위해서는 RA 함량이 낮은 스테비아 신품종의 개발이 요구되고 있었다.
또한, 스테비아 식물의 품종 개량에 있어서는 초장(草丈) 잎 형태만으로서는 그의 식별이 불가능하고, 또한 스테비아 식물은 자가 불화합성에 의해 잡종화가 용이하게 생기기 때문에 종자를 이용한 재배에서는 단맛 성분을 일정하게 유지하는 것은 불가능하다고 되어 있었다.
본 발명자들은 종래 품종으로부터 교배 선발을 반복하여 품종 개량을 행하여, ST에 대하여 RA를 극미량밖에 함유하지 않은 스테비아품종을 얻어, 그로부터 종자에 의한 육묘가 용이하고, 단맛 성분 내용을 계속하여 재배할 수 있는 품종의 개발에 성공하였다.
본 발명의 스테비아 신품종의 건조엽으로부터 얻어지는 스테비아 추출물은 RA의 함량이 낮고 ST의 함량이 높기 때문에, 한번 재결정하면 실질상 RA를 포함하지 않는 고순도의 ST 감미료가 얻어진다. 또는 해당 추출물을 효소 처리함으로써 감미질이 개선된 ST 감미료를 얻을 수 있다.
본 발명의 제1의 양태는 ST 100 중량부에 대하여 RA를 8 중량부 이하로 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종이다. 이 때문에, 후술하는 바와 같이 교배와 선별을 반복하여 ST 100 중량부에 대하여 RA를 8 중량부 이하로 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종에 속하는 새로운 식물체를 창조하여, 특정한 프라이머를 이용한 DNA 해석에 의하여 그의 품종을 특정하였다.
본 발명의 제2의 양태는 ST 100 중량부에 대하여 RA를 8 중량부 이하로 포함하는 고순도 ST 감미료의 제조 방법으로, 상기한 식물체 또는 그의 건조엽을 물, 또는 함수 용매로 추출하여, 얻어진 조 생성물을 재결정하는 감미료의 제조 방법이다.
본 발명의 제3의 양태는 α-글루코실화 스테비오사이드 감미료의 제조 방법으로서, 상기한 식물체 또는 그의 건조엽을 물, 또는 함수 용매로 추출하여, 얻어진 조 생성물 또는 상기 조 생성물의 재결정에 의해 얻어진 고순도 ST에 예를 들면 시클로덱스트린글루코실트랜스퍼라아제를 작용시켜, 글루코오스를 α 부가시키는 방법이다.
본 발명의 제4의 양태는 당쇄 조정을 행한 α-글루코실화 스테비오사이드 감미료의 제조 방법으로서, 상기 제3의 양태에서 얻어지는 감미료를 예를 들면 글루코아밀라아제와 같은 α-1,4-글루코시다아제로 처리하여, 부가하는 당쇄를 제조하는 방법이다.
본 발명의 제5의 양태는 후술하는 바와 같이 특정한 프라이머를 이용한 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA; 증폭 단편 다형 DNA)법에 의한 DNA 해석이다.
이들 목적을 달성하기 위해서 본 발명자들은 교배와 선별에 의한 품종 개량을 실시하였다. 이 경우, 선별된 품종의 특정 방법이 중요한 의미를 갖는다. 상술한 대로 스테비아는 자가 불화합성이 강하기 때문에 특정된 품종 사이에서의 교배가 중요하여, 본 발명자들은 RAPD법에 의해서, DNA 감정에 의한 품종의 특정 방법을 검토하였다.
RAPD법은 DNA의 해석 수법의 하나이고, 복수의 프라이머를 이용하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)을 행하면, 이용한 프라이머와 동일 또는 유사한 배열 사이의 DNA의 영역이 증폭되기 때문에, 그 증폭된 DNA의 패턴을 전기 영동으로 해석하는 방법이다. 또한, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)는 장쇄 알킬기를 갖는 제4급 암모늄 염기이고, 핵산과 같은 폴리 음이온과 불용성의 복합체를 형성하기 위해서 핵산의 단리에 이용할 수 있다.
DNA의 차이에 의해 품종 식별하는 수단은 CTAB에 의해 식물체로부터 게놈 DNA를 단리하여, 리보핵산(RNA)을 제거하고, 프라이머 믹스를 이용하여 PCR법에 의해 얻어진 PCR 증폭산물을 아가로스겔 전기 영동법에 의해서 얻어지는 DNA 핑거 프린트의 차이에 의해 구별한다. 본 발명의 식물체의 경우, 후술하는 바와 같이 210 bp 상부에 특징적인 염기 서열을 나타내는 것이 확인되었다.
실제로는 원료의 식물체에 대해서, 선택적으로 침전시킨 게놈 DNA를 모형으로 하고, 프라이머로서 예를 들면
순방향 프라이머: CACGCGAACTCCTCGACTCGACC
역방향 프라이머: GCTGCATGCTTGCATGCATGAAATC
를 이용하여 96 ℃ 10초, 65 ℃ 30분, 72 ℃ 30초 35 사이클, 또한 72 ℃에서 2분간 반응시켰다. 반응 후, PCR 산물을 6％ 변성 폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 분획하여, SYBR Gold에 의해 염색 후, 청색 광 트랜스 일루미네이터에서 가시화하였다. 그 결과, 공시한 10품종에서는 약 190 bp 및 210 bp의 위치에 다형을 나타내는 밴드가 검출되고, F1 타입의 유전자형이 확인되었다. 이들 밴드는 재현성 좋게 증폭되는 것을 확인하고, 특정한 DNA 밴드에 의해 식물체를 확인할 수 있다.
감미료의 제조에는 해당 식물체 및/또는 그의 건조엽으로부터 물, 또는 함수 유기 용매로 추출하고, 이어서 추출액을 그대로 농축하거나, 또는 필요에 따라서 양이온 교환 수지, 음이온 교환 수지, 활성탄 등으로 이온성 불순물을 제거하여, 흡착 수지에 단맛 성분을 흡착시켜 친수성 용매로 용리하고, 필요에 따라서 양이온 교환 수지, 음이온 교환 수지, 활성탄 등으로 처리하고 용리액을 농축, 건조하여 감미료가 얻어진다. 감미료의 제조 방법은 기타 탈색 등의 관용 정제 수단을 적절하게 실시할 수 있고, 고순도 ST를 얻는 방법은 막 분리, 알코올 추출, 결정화 등의 관용 수단을 적절하게 실시할 수 있다. 또한, 결정화의 방법은 결정 용매로서 에탄올, 메탄올 등의 유기 용매에 필요하면 물을 가하여, 적절하게 사용할 수 있다. 얻어진 감미료는 다른 천연, 인공 감미료, 희석제 등을 가할 수도 있다.
얻어진 감미료는 캔디, 젤리, 음료, 분말 음료, 인스턴트면, 잼, 빙과, 츄잉검, 화과자, 건강 식품, 초코렛, 탁상 감미료, 구운 과자, 진미, 물반죽 식품, 유산 음료, 유산균 음료, 커피 음료, 코코아 음료, 차 음료, 리큐어, 와인, 샤베트, 씨리얼 식품, 식물 섬유 함유 식품, 소스, 간장, 된장, 식초, 드레싱, 마요네즈, 케첩, 카레, 스프, 쌀과자, 뻥튀기 과자(아라레), 쌀과자류, 빵류, 비스켓, 크래커, 핫 케익의 소, 과일 통조림, 야채 통조림, 식육 제품, 어육 반죽 제품, 염성 식품, 절인 채소, 복합 조미료, 기호성 식품, 화장품 등에 사용함으로써, 칼로리 저하, 당류 삭감, 융점 강하, 감미질 개선, 및 마스킹 효과 등이 얻어지고, 또한 다른 감초 글리시리진, 나한과, 토마틴 등의 고감미도 천연 감미료, 사이클라민산 소다, 사카린나트륨, 아스파탐, 수크랄로스, 네오테임 등에 인공 감미료, 올리고당류, 당 알코올류, 당류, 덱스트린 등의 희석제 등을 추가로 첨가할 수도 있다.
〔ST를 고농도로 함유하는 품종의 육종 과정〕
육종은 종래 스테비아 품종의 교배에 의한 선발로 행하고, 우선 ST를 종래품보다도 고농도로 함유하는 품종 SS를 교배하여, 얻어진 종자로부터 비교적 ST를 많이 포함하는 품종 SS-1을 선택하고, 이들을 추가로 인공적으로 교배하여 얻어진 종자로부터, 추가로 RA의 함유 농도가 낮은 품종끼리를 교배하여, ST 100 중량부에 대하여 RA를 5 중량부 이하밖에 포함하지 않는 품종을 10품종 개발하여, 그 중 1품종은 내한성이 나쁜 점에서 다른 9품종을 F1ST-1 내지 F1ST-9의 고 ST 품종으로 하였다.
이들 고 ST에서 얻어진 종자를 파종하여, 식물체를 육성하고 이들로부터 얻어진 건조엽을 분석하여, 단맛 성분이 고 ST 품종과 차가 없는 것을 확인하고, 그의 유전자를 검색하여, 동일 유전자를 갖는 품종을 F1ST 품종으로 하였다.
또한 출원인은 이번 본 발명에 관한 F1ST 품종에 의해 얻어진 종자에 대해서, 이미 국제 기탁을 완료하였다(독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터: 이바라키현 쯔꾸바시 히가시 1초메 1반찌 1 중앙 제6, 2007년 7월 13일, 수탁 번호 FERM BP-10870). 따라서, 그의 기탁에 따른 F1ST 품종의 종자로부터, 용이하게 본 발명의 식물체를 용이하게 입수할 수 있다. 스테비아는 자가 불화합성이고, 종자로부터 항상 목적의 식물체가 얻어진다고는 한정할 수 없다고 되어 있었지만, 본원에 기재된 DNA 감정에 따라서 선별한 품종에 의한 교배에서는 항상 목적으로 하는 식물체를 얻을 수 있다.
또한 필요하면, 다른 스테비아종과 교배하여, 후술하는 실시예 1에 준하여 선별을 행하면, ST를 고농도로 함유하는 식물체를 매우 용이하게 입수할 수 있다. 이들 식물체는 전부, 국제 기탁을 한 ST 품종의 종자로부터 얻어지는 식물체에 포함된다.
<실시예>
이하에, 육종 과정 및 그의 특성 등을 구체적으로 기재한다. 본 발명은 본 육종 과정, 재배 방법에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
ST를 비교적 고농도로 함유하는 품종의 교배로 얻어진 종자에 의해, 2001년에 ST를 비교적 고함유하는 품종을 선발하여, 모리타 가가꾸 고교(주) 니이미 공장 내 비닐하우스 내에서 인공적으로 교배하여, 얻어진 종자를 2002년 3월에 니이미 공장 내의 비닐하우스에 파종하고, 발아한 모종을 육묘 포트에 이식하여, 5월 상순에 모종 길이 8 cm 정도 이상의 모종 500개를 공장 내 밭에 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 20 kg을 시비하여 2주간 후에 이식하였다. 7월 상순에 추비로서 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 10 kg을 추비하였다.
9월 상순에 조사하여, 그의 단맛 성분을 분석하고, ST 100부에 대하여 RA를 30부 이하밖에 포함하지 않는 주(株) SS 품종을 선발하였다. 2002년에 SS 품종을 니이미 공장 내 비닐하우스 내에서 인공적으로 교배하여, 얻어진 종자를 2003년 3월에 니이미 공장 내의 비닐하우스에 파종하고, 발아한 모종을 육묘 포트에 이식하여, 5월 상순에 모종 길이 7 cm 정도 이상의 모종 300개를 공장 내 밭에 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 20 kg을 시비하여 2주간 후에 이식하였다. 7월 상순에 추비로서 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 10 kg을 추비하였다.
9월 상순에 조사하여, 그의 단맛 성분을 분석하고, ST 100부에 대하여 RA를 15 중량부 이하밖에 포함하지 않는 주 SS-1을 선발하여, 2003년에 이들을 교배시켜 얻어진 종자를 2004년 3월에 니이미 공장 내의 비닐하우스에 파종하여, 발아한 모종을 육묘 포트에 이식하고, 5월 상순에 모종 길이 7 cm 정도 이상의 모종 300개를 공장 내 밭에 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 20 kg을 시비하여 2주간 후에 이식하였다. 7월 상순에 추비로서 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 10 kg을 추비하였다.
9월 상순에 조사하여, 그의 단맛 성분을 분석하고, ST 100부에 대하여 RA를 8 중량부 이하밖에 포함하지 않는 주 9주를 F1ST 품종으로 하고, 2004년에 F1ST 품종을 교배하여 얻어진 종자를 2005년 3월에 니이미 공장 내의 비닐하우스에 파종하고, 발아한 모종을 육묘 포트에 이식하여, 5월 상순에 모종 길이 7 cm 정도 이상의 모종 1000개를 공장 내 밭에 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 20 kg을 시비하여 2주간 후에 이식하였다. 7월 상순에 추비로서 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 10 kg을 추비하였다.
9월 상순에 모두 수확하고, 그의 건조엽의 단맛 성분을 분석하여, ST 100부에 대하여 RA를 8 중량부 이하밖에 포함하지 않는 것을 확인하였다.
비교 시험 1(5월)
ST 품종과의 다른 품종 SN과의 비교를 위해, 2006년 3월에 F1ST 품종, SN 품종으로부터 얻어진 종자 각 1500알을 니이미 공장 내의 비닐하우스에 파종하고, 발아한 모종을 육묘 포트에 이식하여, 5월 상순에 생육의 동일 정도의 모종 각 400개를 공장내 밭에 10 아르당 질소, 인, 칼리의 비료 성분 각 20 kg을 시비하여 2주간 후에 이식하였다.
5월 중순에 F1ST, SN의 각 품종 200개의 엽부를 분리하여, 건조 후 분석 시료로 하였다.
단맛 성분의 측정은 하기 조건의 고속 액체 크로마토그래피에 의해 행하였다.
고속 크로마토그래피 분석 방법
사용 칼럼 리크로솔브 NH2 5 μ 4 mm×250 mm
유속 1.5 ml/분
전개 용매 아세토니트릴:물=82:18
측정 파장 210 nm
분석 결과는 다음과 같았다.
비교 시험 2(9월)
7월 중순에 추비를 행하여, 9월 상순에 각 품종 150개를 지상부에서 수확한 후, 엽부를 분리하고, 건조 후 평균 단맛 성분을 측정하여, 분석 시료로 하였다.
분석 결과는 다음과 같았다.
F1ST, SN 품종은 생육에 따라서 단맛 성분 함량이 증가하는 경향이 보였지만, F1ST 품종에서는 RA의 함량에 큰 증가는 보이지 않았다.
유전자 염기 서열의 특정
<DNA 추출>
DNA 추출은 CTAB법에 의해 행하고, 각 샘플로부터 채취한 잎, 약 0.2 g을 유발 중에서 액체 질소에 의해 동결하여, 유봉으로 분쇄하였다. 분쇄한 샘플은 1.5 ml 마이크로 튜브 중에서 0.5 ml의 2％ CTAB 용액(100 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM EDTA pH 8.0, 2％ CTAB, 1.4M NaCl, 1％ PVP)과 혼화하여, 65 ℃에서 30분 인큐베이트하였다. 0.5 ml의 클로로포름/이소아밀알코올(24:1)을 가하여, 10분간 교반한 후, 15000 rpm에서 15분 원심 분리하고, 수층을 별도의 1.5 ml 마이크로 튜브에 옮겼다. 추가로 등량의 100％ 이소프로판올을 가하여, 15000 rpm에서 15분 원심 분리하여, 침전을 75％ 에탄올로 린스한 후, 건조시켜 400 μl의 TE 버퍼로 용해하였다. RNase 용액(1 mg/ml)을 1 μl 가하여, 37 ℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 등량의 TE 포화페놀을 가하여 혼화하고 나서 15000 rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 수층을 별도의 마이크로 튜브에 옮겨 1/10 양의 3M 아세트산나트륨과 등량의 이소프로판올을 가하고, 혼화하여 15000 rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 얻어진 침전을 75％ 에탄올로 2회 린스한 후 건조시키고 50 μl의 TE 버퍼에 용해하여 DNA 샘플로 하였다.
<PCR 분석>
얻어진 DNA 샘플을 주형으로서 하기의 반응액 조성에서 PCR 반응을 행하였다. PCR 사이클은 96 ℃에서 30초 반응시킨 후, 96 ℃ 10초, 65 ℃ 30분, 72 ℃ 30초 35 사이클, 추가로 72 ℃에서 2분 반응시켰다. 반응 후, PCR 산물은 6％ 변성 폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 분획하고, SYBR Gold에 의해 염색 후, 청색 광 트랜스 일루미네이터에서 가시화하였다. 그 결과, 공시한 10 품종에서는 약 190 bp 및 210 bp의 위치에 다형을 나타내는 밴드가 검출되고, F1ST 타입의 유전자형이 확인되었다. 이들 밴드는 재현성 좋게 증폭되는 것이 확인되고 있어, 식별 마커로서 유효하다.
실시예 2 고순도 ST 감미료의 제조
(1) 추출
5월 및 9월에 F1ST 1 내지 9 품종으로부터 얻어진 건조엽 각 2 g을 각각 혼합하여 18 g로 하고, 20배량의 물로 단맛이 느껴지지 않게 될 때까지 수회 추출하였다. 음이온 교환 수지(듀오라이트 A-4) 20 ml, 및 입상 활성탄 5 ml를 충전한 칼럼에 통액하고, 이어서 통과액을 흡착 수지(다이어 이온 HP-20) 100 ml를 충전한 칼럼에 통해서 단맛 성분을 흡착시키고, 충분히 수세 후 메탄올 300 ml에서 용리하였다. 용리액을 감압하에 농축하고, 건조하여 담황백색의 분말을 얻었다.
(2) 재결정
상기한 추출 정제물(F1ST 품종 5월, 9월) 각 10 g을 10배량의 95％ 메탄올로 가열 용해한 후에, 4 ℃에 6일간 냉각 방치하여 얻어진 결정을 분리하고, 냉메탄올로 세정 후, 감압 건조하여, 백색의 결정 7.5 g 및 7.4 g을 얻었다.
비교를 위해 SN에서도 동일한 처리를 하여 각각 백색의 결정(SN-CRY) 4.6 g을 얻어, 고속 액체 크로마토그래피(조건은 실시예 1과 동일)로 이것을 분석하였다.
표 3에 추출 정제물의 분석 결과를 나타내었다. 표 중의 ST는 스테비오사이드, RA는 레바우디오사이드 A이다.
본 발명의 F1ST 1 내지 9 품종으로부터 얻어진 ST를 한번 재결정하는 것만으로, 실질상 RA를 포함하지 않는 고순도의 ST 감미료가 얻어졌다.
관능 시험 1
실시예 2에서 얻어진 F1ST 5월 및 SN-CRY의 분말의 각 0.02％ 용액을 제조하여, 스테비아 감미료의 미질(味質)에 정통한 패널리스트 10명에 의해 쓴맛, 떫은맛, 및 감미질을 비교하였다.
각 시료에 있어서 쓴맛, 떫은맛에 큰 차이는 없지만, F1ST 품종은 미질의 끝맛이 다른 시료보다 개선되어 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 3 α-글루코실스테비오사이드 감미료의 제조
실시예 2에 준하여 얻어진 F1ST 9월, 실시예 3에서 얻어진 분말의 각 4 g과 α-글루코실 당화물로서 DE(전분 분해율): 10의 덱스트린 8 g을 물 20 ml에 가열 용해한 후, 70 ℃로 냉각하여, 염화칼슘을 기질 총량에 대하여 1 mmol이 되도록 첨가함과 동시에, pH를 6.0으로 조정하고 시클로덱스트린글루코실트랜스퍼라아제를 100 단위 가하여, 온도 70 ℃에서 24시간 반응시켰다. 그 후, 각 반응액을 95 ℃에 30분간 유지하여 효소를 가열 실활시켰다.
각 반응액을 여과하여 부유물을 제거한 후, 각각 여액을 합성 흡착 수지 다이어 이온 HP-20을 100 ml 충전한 칼럼에 통과시켜, 충분히 수세를 행한 후, 메탄올 300 ml에서 용리하였다. 용리액을 음이온 교환 수지(엠버라이트 IRA-94)를 충전한 칼럼에 통과시켜, 탈염, 탈색을 행한 후, 감압하에서 농축, 건조하여 α-글루코실스테비오사이드인 효소 처리 α-F1ST를 2.6 g 및 효소 처리 α-F1ST-CRY를 2.5 g, 각각 백색 분말로서 얻었다.
실시예 4 부가 당쇄의 조정
실시예 3의 효소 처리 α-F1ST와 효소 처리 α-F1ST-CRY 각 1 g에 시판의 글루코아밀라아제〔글루코침 나가세 산교(주) 제조〕를 고형분에 대하여 1％ 첨가하고, 온도 50 ℃에서 5시간 반응시켰다. 반응 후, 95 ℃에 30분간 가열하여 효소를 실활시켰다. 각 반응액을 여과하여 부유물을 제거한 후, 여액을 각각 합성 흡착 수지 다이어 이온 HP-20을 100 ml 충전한 칼럼에 통과시켜, 충분히 수세를 행한 후, 메탄올 300 ml에서 용리하였다. 용리액은 음이온 교환 수지(엠버라이트 IRA-94)를 충전한 칼럼에 통과시켜, 탈염, 탈색을 행한 후, 감압하에서 농축, 건조하여 부가 당쇄 조정이 끝난 α-F1ST를 0.7 g, 및 부가 당쇄 조정이 끝난 α-F1ST-CRY를 0.6 g, 각각 백색 분말로서 얻었다.
비교 시험으로서 실시예 2에서 얻어진 F1SN 품종으로부터 얻어진 담황백색의 분말을 동일하게 효소 처리 α-SN, 또한 당쇄 조정하여 부가 당쇄 조정 α-SN-CRY를 얻었다.
관능 시험 2
관능 시험 1과 동일하게 하여, 효소 처리 α-F1ST와 효소 처리 α-SN의 감미질을 비교하였다.
본 발명의 스테비아 신품종으로부터 얻어지는 ST는 그의 순도가 높기 때문에, α-글루코실화를 행함으로써 뒷맛 및 감미질이 개선된다.
관능 시험 3
관능 시험 1과 동일하게 하여, 당쇄 조정 α-ST-CRY와 당쇄 조정 α-SN-CRY의 감미질을 비교하였다.
본 발명의 스테비아 신품종으로부터 얻어지는 ST는 그의 순도가 높기 때문에, α-글루코실화 및 당쇄 조정을 함으로써 잡맛이 없고, 뒷맛 및 감미질이 개선된 ST 감미료를 제공한다.
본 발명의 스테비아 레바우디아나 베르토니 신품종은 RA의 함량이 낮고 ST의 함량이 높기 때문에, 이것을 육성하여 얻어지는 건조엽으로부터 각종 바람직한 스테비오사이드 감미료를 제조할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Morita Kagaku Kogyo Co.,Ltd.
<120> Novel Variety of Stevia and Mtehod of Preparing Sweetner
<130> 668736
<150> JP 2008-011756
<151> 2008-01-22
<160> 2
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Characteristic DNA sequence found in improved species of stevia
<400> 1
cacgcgaact cctcgactcg acc 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Characteristic DNA sequence found in improved species of stevia
<400> 2
gctgcatgct tgcatgcatg aaatc 25
Claims (11)
- 스테비오사이드 100 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 8 중량부 이하로 포함하는 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종으로서, RAPD법에 의한 DNA 해석에 있어서 210 bp의 위치에 특징적인 염기 서열을 나타내는 식물체.
- 제1항에 있어서, 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종(국제 기탁 번호: FERM BP-10870)의 종자로부터 얻어지는 식물체.
- 제1항에 기재된 식물체 또는 그의 건조엽을 물, 또는 함수 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 감미료의 제조 방법.
- 제2항에 기재된 식물체 또는 그의 건조엽을 물, 또는 함수 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 감미료의 제조 방법.
- 제3항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터, 스테비오사이드 100 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 5 중량부 이하로 포함하고, 또한 순도가 93％ 이상인 고순도 스테비오사이드를 얻는 방법.
- 제4항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터, 스테비오사이드 100 중량부에 대하여 레바우디오사이드 A를 5 중량부 이하로 포함하고, 순도가 93％ 이상인 고순도 스테비오사이드를 얻는 방법.
- 제3항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터 α-글루코실스테비오사이드를 얻는 방법.
- 제4항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터 α-글루코실스테비오사이드를 얻는 방법.
- 제7항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터, 부가 당쇄를 조정한 α-글루코실스테비오사이드를 얻는 방법.
- 제8항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 감미료로부터, 부가 당쇄를 조정한 α-글루코실스테비오사이드를 얻는 방법.
- 하기의 프라이머
순방향 프라이머: CACGCGAACTCCTCGACTCGACC
역방향 프라이머: GCTGCATGCTTGCATGCATGAAATC
를 이용하여 RAPD법에 의한 DNA 해석을 실시하여, 제1항에 기재된 스테비아 레바우디아나 베르토니 품종을 선택하는 방법.
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