BR112019013208A2 - composto, composição de adoçante, alimento ou bebida, planta, extrato, método para produzir o composto, uso do composto, e, agente de controle do sabor - Google Patents

Abstract

o propósito da presente invenção é determinar a estrutura de um glicosídeo de esteviol inovador que é detectado em cultivares contendo uma abundância de reb.c (também denominado dulcosídeo b) e que afeta a qualidade de gosto em uma pequena quantidade, e identificar a qualidade das propriedades de gosto. de acordo com a presente invenção, um composto representado pela fórmula (1), ou um derivado, sal, ou hidrato dos mesmos é provido.

Description

COMPOSTO, COMPOSIÇÃO DE ADOÇANTE, ALIMENTO OU BEBIDA, PLANTA, EXTRATO, MÉTODO PARA PRODUZIR O COMPOSTO, USO DO COMPOSTO, E, AGENTE DE CONTROLE DO SABOR

CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção se refere a um glicosídeo de esteviol inovador, um método para produzir o mesmo e uma composição de adoçante contendo o mesmo. Além do mais, a presente invenção também se refere a um alimento ou bebida, uma planta, um extrato da mesma e um agente de controle de sabor contendo o glicosídeo de esteviol inovador.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA [002] Folhas de Stevia rebaudiana contêm um metabólito secundário chamado Esteviol que é um tipo de diterpenoides, onde glicosídeo de esteviol provê doçura que é quase 300 vezes a doçura do açúcar e é, desta forma, utilizado como um adoçante sem calorias na indústria alimentícia. A demanda por adoçantes sem calorias está crescendo dia a dia, uma vez que a obesidade tem se tornado um problema social sério em todo mundo e também para a promoção da saúde e redução das despesas médicas. Atualmente, aspartame e acessulfame de potássio, que são derivados de aminoácido artificialmente sintetizado, são utilizados como adoçantes artificiais, mas espera-se que os adoçantes sem calorias naturais, como os glicosídeos de esteviol, sejam mais seguros e mais prováveis de ganhar aceitação do público.

[003] Os glicosídeos de esteviol principais de estévia são finalmente glicosilados a um glicosídeo chamado rebaudiosídeo A (Reb.A) que tem quatro frações de açúcar (Figura 1). Esteviosídeo, a saber, um glicosídeo de esteviol triglicosilado e um precursor de Reb.A, é o glicosídeo mais abundante. Estes dois glicosídeos são as principais substâncias responsáveis pela doçura da estévia. Esteviosídeo é responsável pelo maior teor em folhas de estévia e é conhecido por prover doçura que é cerca de 250 a 300 vezes a

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2/60 doçura do açúcar. Reb. A é um glicosídeo tetraglicosilado de este viol que tem forte doçura (350 a 450 vezes o açúcar) com boa qualidade de sabor. Eles chamaram a atenção como adoçantes sem calorias. Além deles, é conhecida a existência de glicosídeos que são considerados intermediários de reação e análogos com diferentes tipos de frações de açúcar. Por exemplo, embora todas as quatro frações de açúcar de glicosídeo de Reb.A sejam glicose, rebaudiosídeo C (Reb.C) é conhecido por ter ramnose em vez de glicose ligada ao C-2 da glicose em C-13, e rebaudiosídeo F (Reb.F) é conhecido por ter xilose ligada na mesma posição.

[004] Até hoje, foram feitas tentativas de obter uma planta de estévia com um maior teor de Reb.A que as plantas de estévia tipo selvagem por melhoramento genético ou semelhantes, uma vez que a qualidade do sabor de Reb.A, em que todas as quatro frações de açúcar de glicosídeo são glicose, é boa (por exemplo, Documento de patente 1).

DOCUMENTO DA TÉCNICA ANTERIOR

Documento de patente [005] Documento de patente 1: Patente japonesa No. 3436317

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Problema a ser resolvido pela invenção [006] No entanto, alguns dos cultivares de estévia resultantes de melhoramento genético podem conter uma quantidade diminuta de um glicosídeo de este viol cuja estrutura não é ainda identificada, em que a presença de tal glicosídeo de esteviol presente em quantidade diminuta pode potencialmente estar contribuindo com o sabor característico do extrato de estévia. Entretanto, embora pesquisas tenham sido feitas até então em glicosídeos de esteviol obtidos afixando adicionalmente glicose a Reb.A e aos cultivares contendo os mesmos, poucas pesquisas foram feitas neste ponto em um cultivar contendo uma quantidade abundante de um glicosídeo de esteviol tendo ramnose tipo Reb.C e em um glicosídeo de esteviol como esse.

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3/60 [007] Dessa maneira, o objetivo da presente invenção é determinar a estrutura de um glicosídeo de esteviol inovador presente em quantidade diminuta que afeta a qualidade do gosto, e para identificar as características de sua qualidade do gosto. Além do mais, objetivos adicionais da presente invenção são prover um glicosídeo de esteviol inovador, um método para produzir o mesmo, e uma composição de adoçante contendo o mesmo.

Meios para Resolver o Problema [008] Os presentes inventores fizeram investigação extensiva direta par resolver o problema supradescrito, e em decorrência do que sucedeu em determinação da estrutura do glicosídeo de esteviol inovador presente em quantidade diminuta que afeta a qualidade do gosto. A presente invenção foi feita com base nas observações supradescritas.

EFEITO DA INVENÇÃO [009] A presente invenção pode prover um glicosídeo de esteviol inovador presente em quantidade diminuta que afeta a qualidade do gosto. Além do mais, a presente invenção pode também prover um método para produzir o glicosídeo de esteviol inovador, e uma composição de adoçante, um alimento ou bebida, uma planta, um extrato da mesma e um agente de controle de sabor contendo o glicosídeo de esteviol inovador.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0010] A Figura 1 ilustra um diagrama mostrando estruturas e nomes de glicosídeos de esteviol.

[0011] A Figura 2 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma de íons selecionado da Amostra 1 a m/z de 1273,5.

[0012] A Figura 3 ilustra diagramas mostrando espectros de massa fragmentados de MS/MS e MS³ de rebaudiosídeo N e do composto representado pela Fórmula (1).

[0013] A Figura 4 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro ΉNMR do Composto 11 (800MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um

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[0014] A Figura 5 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro COSY Ή-Ή do Composto 11 (800MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro HSQC do Composto 11 (800MHz, Pyr-d5).

[0015] A Figura 6 ilustra diagramas mostrando um procedimento para identificar um glicosídeo de esteviol inovador contido em um extrato de uma planta.

[0016] A Figura 7 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma de íons selecionado de uma amostra obtida por biossíntese a m/z de 1273,5.

[0017] A Figura 8 ilustra diagramas mostrando resultados de avaliações sensoriais para comparação entre o glicosídeo de esteviol inovador e rebaudiosídeo A.

[0018] A Figura 9 ilustra gráficos mostrando resultados de avaliação de um efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar o sabor remanescente prolongado de Reb.A.

[0019] A Figura 10 ilustra gráficos mostrando resultados de avaliação de um efeito de um agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar o sabor remanescente prolongado de Reb.D.

[0020] A Figura 11 ilustra gráficos mostrando resultados de avaliação de um efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para intensificar a doçura de açúcar (sacarose).

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO [0021] Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhes. A modalidade a seguir é provida para ilustrar a presente invenção e não com a intenção de limitar a presente invenção apenas a essa modalidade. A presente invenção pode ser realizada em vários modos sem fugir do escopo da mesma. Todos os documentos, relatórios descritivos, relatórios descritivos de patente e outros documentos de patente citados aqui são incorporados aqui pela referência.

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5/60 [0022] Os termos “rebaudiosídeo” e “Reb.” como usado aqui têm o mesmo significado e ambos se referem a “rebaudiosídeo”. Similarmente, os termos “dulcosídeo” e “dulcosídeo” como usado aqui têm o mesmo significado e amos se referem a “dulcosídeo”.

1. Glicosídeo de esteviol inovador [0023] Pela primeira vez, os presentes inventores identificaram a estrutura de uma quantidade diminuta de um glicosídeo de esteviol inovador que afeta a qualidade do gosto. O glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção (em seguida, também referido como o “glicosídeo da presente invenção”) é um composto representado pela Fórmula (1):

ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.

[0024] Como representado anteriormente, o glicosídeo da presente invenção tem uma cadeia de açúcar contendo três frações de glicose em C-19 de esteviol e uma cadeia de açúcar contendo duas frações de glicose e uma fração de ramnose em C-13.

[0025] O glicosídeo da presente invenção pode não ser apenas o composto representado pela Fórmula (1), mas pode também ser um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. O termo “derivado” como usado aqui se refere a um composto resultante de uma mudança estrutural de uma fração secundária do composto, por exemplo, um composto no qual alguns dos grupos hidroxila são substituídos com outros substituintes. Portanto, derivados do composto representado pela Fórmula (1) incluem compostos nos

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6/60 quais alguns dos grupos hidroxila contidos no composto foram substituídos com um substituinte selecionado de hidrogênio, um halogênio, um grupo alquila, um grupo alquenila, um grupo alquinila, um grupo arila, um grupo amino, um grupo ciano ou similares. Como usado aqui, um “sal do composto representado pela Fórmula (1)” se refere a um sal fisiologicamente aceitável, por exemplo, um sal de sódio, do composto representado pela Fórmula (1). Além do mais, um “hidrato do composto representado pela Fórmula (1)” como usado aqui se refere a um composto resultante de adição de uma molécula de água ao composto representado pela Fórmula (1).

[0026] Embora o glicosídeo da presente invenção não seja particularmente limitado, ele pode ser um produto derivado de planta, um produto quimicamente sintetizado ou um produto biossintético. Por exemplo, ele pode ser isolado e purificado de uma planta com Reb.C abundante, ou ele pode ser obtido por síntese ou bios síntese química. Detalhes de um método para produzir um glicosídeo da presente invenção serão descritos posteriormente aqui.

[0027] O glicosídeo da presente invenção é mais doce que açúcar (sacarose), tem qualidade do gosto de bom sabor remanescente de doçura prolongado, e pode afetar a qualidade do gosto de alimentos/bebidas em uma pequena quantidade. Assim, o glicosídeo da presente invenção pode ser usado como um adoçante inovador.

[0028] Entretanto, em um outro aspecto da presente invenção, o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção é um composto representado pela Fórmula (a):

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ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.

2. Composição de adoçante contendo glicosídeo de esteviol inovador [0029] Em um aspecto da presente invenção, é provida uma composição de adoçante contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo (em seguida, também referida como a “composição de adoçante da presente invenção”). A composição de adoçante da presente invenção não é particularmente limitada, desde que ela contenha o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, e ela pode ser uma composição contendo um extrato contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.

[0030] A quantidade do glicosídeo da presente invenção contida na composição de adoçante da presente invenção não é particularmente limitada.

[0031] Altemativamente, a composição de adoçante da presente invenção é preferivelmente uma composição contendo o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que a quantidade em um estévia ou extrato de estévia tipo selvagem em pelo menos 0,01%. Como mencionado anteriormente, o glicosídeo da presente invenção foi detectado pela primeira vez em um cultivar contendo Reb.C abundante, e ele não está contido em uma estévia ou um extrato tipo selvagem da mesma absolutamente ou, se estiver, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos.

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8/60 [0032] A composição de adoçante da presente invenção pode conter adicionalmente outros glicosídeos de esteviol. Por exemplo, a composição de adoçante da presente invenção pode conter, além do glicosídeo da presente invenção, um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.

[0033] Em um caso onde outro glicosídeo de esteviol está contido, a razão da composição do glicosídeo da presente invenção e outro glicosídeo de esteviol é preferivelmente 0,01:9,99-6:4 em uma razão em massa.

[0034] A composição de adoçante da presente invenção pode conter adicionalmente um adoçante geral. Exemplos de um adoçante geral como esse incluem adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutoseglicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii, e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sucralose, neotame, aspartame e sacarina. Dentre eles, adoçantes naturais são preferivelmente usados a partir do aspecto de conferir gosto puro, facilidade de beber, sabor natural e gosto moderadamente rico, em que frutose, glicose, maltose, sacarose e açúcar são em particular preferivelmente usados. Tanto um único tipo quanto uma pluralidade de tipos desses ingredientes de doçura pode ser usado.

3. Alimento ou bebida contendo glicosídeo de esteviol inovador

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9/60 [0035] Em um aspecto da presente invenção, um alimento ou bebida contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo (em seguida, também referido como o “alimento ou bebida da presente invenção”) é provido. O alimento ou bebida da presente invenção não é particularmente limitado, desde que ele contenha o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, e ele pode ser um alimento ou bebida contendo um extrato contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. Como usado aqui, um alimento ou bebida se refere a alimentos e bebidas. Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção provê um alimento ou bebida inovador, e um método para produzir o dito alimento ou bebida.

[0036] Embora a quantidade do glicosídeo da presente invenção contida no alimento ou bebida da presente invenção difira dependendo do alimento ou bebida específico, ela é preferivelmente em tomo de 0,0004%0,8% e em particular preferivelmente 0,04%-0,4%. Desde que o teor fique nessa faixa, o sabor remanescente prolongado pode vantajosamente ser suprimido.

[0037] O alimento ou bebida da presente invenção pode conter adicionalmente outros glicosídeos de esteviol. Por exemplo, a composição de adoçante da presente invenção pode conter, além do glicosídeo da presente invenção, um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.

[0038] Em um caso onde outro glicosídeo de esteviol está contido, a

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10/60 razão da composição do glicosídeo da presente invenção e outro glicosídeo de esteviol é preferivelmente 0,01:9,99-6:4 em uma razão em massa.

[0039] O alimento ou bebida da presente invenção pode conter adicionalmente um adoçante geral. Exemplos de um adoçante geral como esse incluem adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutoseglicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii, e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina. Entre eles, adoçantes naturais são preferivelmente usados do aspecto de conferir gosto puro, facilidade de beber, sabor natural e gosto moderadamente rico, em que frutose, glicose, maltose, sacarose e açúcar são em particular preferivelmente usados. Tanto um único tipo quanto uma pluralidade de tipos desses ingredientes de doçura pode ser usado.

[0040] Exemplos do alimento da presente invenção incluem, mas particularmente não se limitando a uma confecção, um pão, farinha de cereal, macarrão, arroz, um alimento agrícola/silvicultura, processado um produto de animais de fazenda processado, um produto de pesca processado, um produto de leite/laticínio, um produto de óleo e gordura/óleo e gordura processados, condimento ou outro material de alimento.

[0041] Exemplos da bebida da presente invenção incluem, mas particularmente não se limitando a uma bebida carbonada, uma bebida não carbonada, uma bebida alcoólica, uma bebida não alcoólica, uma bebida de café, uma bebida de chá, uma bebida de cacau, uma bebida nutritiva e uma bebida funcional.

[0042] A bebida da presente invenção pode ser esterilizada e embalada a quente para ser preparada como uma bebida embalada. Exemplos

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11/60 de tal embalagem incluem, mas particularmente não se limitando a uma garrafa PET, uma lata de alumínio, um lata de aço, uma embalagem de papel, um copo resfriado, e uma garrafa. Em um caso onde esterilização térmica tem de ser realizada, o tipo de esterilização térmica não é particularmente limitado. Por exemplo, esterilização térmica pode ser realizada empregando uma técnica comum tais como esterilização UHT, esterilização por retorta ou similares. Embora a temperatura durante o processo de esterilização térmica não seja particularmente limitado, ela é, por exemplo, 65-130°C, e preferivelmente 85-120°C, por 10-40 minutos. Esterilização, entretanto, pode ser realizada a uma temperatura apropriada por diversos segundos, por exemplo, 5-30 segundos, sem problema, desde que o mesmo valor esterilizante como aquele nas condições supradescritas possa ser obtido. Planta contendo glicosídeo de esteviol inovador e extrato da mesma [0043] Em um aspecto da presente invenção, uma planta contendo o glicosídeo de esteviol inovador e um extrato da mesma são providos. Além do mais, em um outro aspecto da presente invenção, um alimento ou bebida, preferivelmente uma bebida, contendo a planta da presente invenção ou um extrato da planta é provido. Embora a quantidade do glicosídeo da presente invenção contido na planta da presente invenção não seja particularmente limitada, ela é preferivelmente 0,001%-1,000% e mais preferivelmente 0,01%-0,80%.

[0044] Preferivelmente, a planta da presente invenção é uma planta que contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem em 0,01% ou mais. Como descrito anteriormente, o glicosídeo de esteviol da presente invenção não está contido em uma estévia tipo selvagem absolutamente ou, se estiver, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos.

[0045] A expressão “contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem em 0,01%

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12/60 ou mais” significa que, com relação a uma quantidade (concentração) do glicosídeo da presente invenção contido por quantidade unitária (por exemplo, 10 mL) de um extrato líquido de folhas frescas (folhas não secas) de uma planta de estévia tipo selvagem, uma quantidade (concentração) do glicosídeo da presente invenção contido em uma quantidade unitária igual de um extrato líquido de folhas frescas (folhas não secas) da planta da presente invenção (a mesma quantidade daquela do extrato líquido das folhas da planta de estévia tipo selvagem) é maior em 0,01% ou mais. Aqui, a planta da presente invenção pode conter o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que de uma espécie de estévia tipo selvagem em 0,02% ou mais, 0,03% ou mais, 0,04% ou mais, 0,05% ou mais, 0,07% ou mais, 0,09% ou mais, 0,10% ou mais, 0,15% ou mais, 0,20% ou mais, 0,40% ou mais, 0,60% ou mais, 0,80% ou mais, 1,0% ou mais, 1,50% ou mais, 2,00% ou mais, 4,00% ou mais, 6,00% ou mais, 8,00% ou mais, ou 10,00% ou mais.

[0046] Além disso, a expressão “a proporção do glicosídeo da presente invenção dentre os glicosídeos de este viol totais é 0,01% ou mais” significa que o glicosídeo da presente invenção existe a uma porcentagem de 0,01% ou mais com relação ao teor total dos glicosídeos de este viol existentes no extrato líquido das folhas frescas (folhas não secas) da planta de estévia da presente invenção. Aqui, os glicosídeos de esteviol totais nem contêm glicosídeos desconhecidos de esteviol nem nenhum glicosídeo de esteviol existente em uma quantidade menor que o limite de detecção. Preferivelmente, os glicosídeos de esteviol totais consistem de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.

[0047] Embora o teor do glicosídeo da presente invenção na planta da

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13/60 presente invenção seja como descrito anteriormente, em um caso onde folhas secas são obtidas da planta da presente invenção, o glicosídeo da presente invenção pode existir em uma quantidade de 0,01% em peso ou mais, 0,02% em peso ou mais, 0,03% em peso ou mais, 0,04% em peso ou mais, 0,05% mais, 0,15% mais, 0,50% mais, 1,00% mais, 6,00% peso peso peso peso ou ou ou ou em em em em em peso peso peso peso ou ou ou ou mais, 0,10% mais, 0,30% mais, 0,80% mais, 4,00% em em em em peso peso peso peso ou ou ou ou em em em em mais, 0,07% mais, 0,20% mais, 0,60% mais, 2,00% mais, 8,00% em peso ou mais, ou 10,00% em peso ou mais com ou peso relação ao peso das ditas folhas secas.

[0048] Aqui, folhas secas da planta da presente invenção se referem àquelas obtidas secando folhas frescas da planta da presente invenção para reduzir seu teor de água até 10% em peso ou menos, 7% em peso ou menos, 5% em peso ou menos, 4% em peso ou menos, 3% em peso ou menos, 2% em peso ou menos, ou 1% em peso ou menos. Preferivelmente, o teor de água das folhas secas da planta da presente invenção é 3-4% em peso.

[0049] Um exemplo da planta da presente invenção inclui uma planta com Reb.C abundante. Como descrito anteriormente, o glicosídeo de esteviol da presente invenção não está contido em uma estévia tipo selvagem ou um extrato da mesma absolutamente ou, se estiver, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos. No entanto, os presentes inventores observaram que o glicosídeo de esteviol da presente invenção está contido em uma maior quantidade em uma planta tendo Reb.C abundante. Portanto, o glicosídeo de esteviol inovador e o extrato da mesma também compreendem uma planta como essa com Reb.C abundante e um extrato da mesma.

[0050] Um exemplo de uma planta como essa com Reb.C abundante incluem, mas particularmente não se limitando a uma planta de estévia não recombinante contendo alto rebaudiosídeo C que contém rebaudiosídeo C em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem por 20% ou

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14/60 mais, e cuja proporção de rebaudiosídeo C dentre os glicosídeos de esteviol totais é 40% ou mais (em seguida, também referido como uma “planta de alto Reb.C”).

[0051] Um exemplo de uma planta de alto Reb.C como essa incluem uma planta de estévia não recombinante contendo alto rebaudiosídeo C que contém rebaudiosídeo C em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem em 20% ou mais, e cuja proporção de rebaudiosídeo C dentre os glicosídeos de esteviol totais é 40% ou mais.

[0052] Uma planta de alto Reb.C é um cultivar derivado de uma planta de uma estévia tipo selvagem, na qual mutação genética ocorreu para aumentar rebaudiosídeo C. Exemplos de mutação genética como essa incluem, mas particularmente não se limitando a mutação genética induzida em condições de ocorrência natural, mutação genética induzida por uma técnica não recombinacional e mutação genética induzida por recombinação genética.

[0053] Uma planta de alto Reb.C pode ser classificada, por exemplo, detectando polimorfismo genético no tecido da planta. Aqui, “classificação” significa identificar uma planta de alto Reb.C dentre outras plantas e selecionar a planta de alto Reb.C.

[0054] A planta de alto Reb.C pode também ser classificada de acordo com um método de classificação que inclui uma etapa de identificar um polimorfismo de A no tipo selvagem sendo alterado para T no 60° nucleotídeo da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 11 no genoma de uma planta de teste.

[0055] A planta da presente invenção não apenas compreende toda a planta, mas pode também incluir órgãos de planta (por exemplo, folha, pétala, tronco, raiz, semente, etc.), tecidos de planta (por exemplo, epiderme, pólen, parênquima, xilema, feixes vasculares, tecido paliçado, tecido esponjoso, etc.), várias formas de células de planta (por exemplo, células cultivadas em

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15/60 suspensão), um protoplasto, uma parte da folha, calo e similares.

[0056] Além do mais, a planta da presente invenção pode também compreender uma cultura de tecido ou uma cultura de célula de planta. Isto se dá em virtude de uma cultura de tecido ou cultura de célula de planta como essa poder ser cultivada para regenerar uma planta. Exemplos da cultura de tecido ou da cultura de célula de planta da planta da presente invenção incluem, mas não se limitando a um embrião, células meristemáticas, pólen, uma folha, uma raiz, um ápice de raiz, uma pétala, um protoplasto, uma parte da folha e calo.

[0057] Um extrato da planta da presente invenção pode ser obtido reagindo uma folha fresca ou uma folha seca da planta da presente invenção com um solvente apropriado (um solvente aquoso tal como água ou um solvente orgânico tais como álcool, éter ou acetona). Para condições para extração, vide um método descrito em WO2016/090460 ou um método descrito no exemplo a seguir.

[0058] Preferivelmente, o extrato da planta da presente invenção contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma estévia tipo selvagem em 0,01% ou mais, onde a proporção do glicosídeo da presente invenção dentre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais. Aqui, a expressão “contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma estévia tipo selvagem em 0,01% ou mais” significa o mesmo como descrito anteriormente. Similarmente, expressão a “proporção do glicosídeo da presente invenção dentre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais” também significa o mesmo descrito anteriormente.

5. Agente de controle de sabor contendo glicosídeo de esteviol inovador [0059] Embora o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção esteja contido em um extrato de estévia em uma quantidade diminuta, ele é considerado ter uma influência no sabor do extrato de estévia. Embora não se ligando a nenhuma teoria, adição de uma pequena quantidade do glicosídeo

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16/60 de esteviol da presente invenção é presumivelmente capaz de controlar ο sabor de um alimento ou bebida. Portanto, em um aspecto da presente invenção, um agente de controle de sabor contendo o composto supradescrito representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo é provido.

[0060] Como usado aqui, um “agente de controle de sabor” se refere a uma substância que pode ser adicionada a um alimento ou bebida para controlar o sabor do alimento ou bebida. Preferivelmente, o agente de controle de sabor da presente invenção pode ser adicionado a um alimento ou bebida de maneira a controlar o sabor do alimento ou bebida por si mesmo, sem que os consumidores reconheçam o gosto do próprio agente de controle de sabor. Por exemplo, uma vez que o glicosídeo de esteviol da presente invenção tem bom sabor remanescente de doçura prolongado comparado aos glicosídeos de esteviol convencionais, ele pode ser usado como um agente de controle de sabor para controlar o sabor remanescente de doçura prolongado do alimento ou bebida.

[0061] O agente de controle de sabor (intensificação) da presente invenção preferivelmente contém, além do composto supradescrito representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, um ou mais tipos de outros adoçantes. Exemplos de tal adoçante incluem: um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo K e rebaudiosídeo J; adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutose-glicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de

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Thaumatococcus danielliv, e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina.

[0062] Em um aspecto da presente invenção, o agente de controle de sabor da presente invenção é um agente de controle de sabor que melhora o sabor remanescente prolongado e que contém o composto representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. Embora Brix de alimentos ou bebidas comercialmente disponíveis (por exemplo, bebidas refrescantes) seja normalmente até em torno de 15, redução na quantidade de açúcar em alimentos ou bebidas foi considerada, devido ao crescimento recente de consciência de saúde e o introdução de taxa de açúcar. Onde a quantidade de açúcar é reduzida, o uso de um adoçante não açúcar (por exemplo, um adoçante não calórico) tem sido tentado para compensar a perda de Brix devido à redução de açúcar. Por exemplo, se a quantidade de açúcar em um alimento ou bebida originalmente tendo Brix de 10 for reduzida pela metade, Brix será 5. Portanto, existe uma necessidade de adicionar um adoçante não açúcar para tomar o nível de doçura correspondente a Brix de 5. Muitos dos adoçantes não açúcar, entretanto, têm sabores exclusivos que diferem de açúcar, em que um de tais sabores característicos é sabor remanescente de doçura prolongado mim. Uma vez que o glicosídeo de esteviol da presente invenção tem bom sabor remanescente de doçura prolongado, um agente de controle de sabor contendo o glicosídeo de esteviol da presente invenção pode ser usado como um agente de controle de sabor para melhorar o sabor remanescente prolongado. Aqui, “Brix” é uma escala de um nível de doçura de um alimento ou bebida, ou seja, um valor da concentração do teor de sólido solúvel expresso em uma concentração de porcentagem em peso em uma solução de sacarose a 20°C. Dessa maneira, ela é representada por uma quantidade de sacarose (g) em 100 g de uma solução de sacarose aquosa. Por exemplo, Brix de 5 representa um nível de doçura correspondente ao nível de doçura de 5 g de sacarose em 100 g de uma

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18/60 solução de sacarose aquosa.

[0063] O agente de controle de sabor da presente invenção é preferivelmente adicionado ao adoçante não açúcar contido em um alimento ou bebida em uma quantidade de 1% em massa - 15% em massa com base na massa do adoçante. O agente de controle de sabor da presente invenção é adicionado mais preferivelmente em uma quantidade de 1,5% em massa 12% em massa, e ainda mais preferivelmente em uma quantidade de 3,5% em massa - 11% em massa com base na massa do adoçante. O teor do adoçante não açúcar no alimento ou bebida adicionado com o agente de controle de sabor da presente invenção é preferivelmente 5-13, mais preferivelmente 5-12 e ainda mais preferivelmente 5-7 em termos de Brix. Aqui, a expressão “o teor do adoçante não açúcar é 5 em termos de Brix” se refere a um teor que dá a doçura da solução aquosa contendo o adoçante não açúcar equivalente a Brix de 5. Por exemplo, se o nível de doçura de um adoçante não açúcar for mais doce que açúcar por 200 vezes, a quantidade que dá “o teor do adoçante não açúcar para ser 5 em termos de Brix” é 0,025 g em 100 g de uma solução aquosa contendo o adoçante não açúcar. Em um aspecto preferível da presente invenção, um agente de controle de sabor da presente invenção é adicionado ao adoçante não açúcar contido no alimento ou bebida em uma quantidade de 1% em massa - 15% em massa com base na massa do adoçante, em que o teor do adoçante não açúcar é 5,5-12 em termos de Brix. Em outro aspecto preferível da presente invenção, o agente de controle de sabor da presente invenção é adicionado ao adoçante não açúcar contido no alimento ou bebida em uma quantidade de 1,5% em massa - 12% em massa com base na massa do adoçante, em que o teor do adoçante não açúcar é 5-13 em termos de Brix.

[0064] Exemplos de outro adoçante contido no alimento ou bebida incluem, mas não se limitando a um ou mais tipos de glicosídeo de esteviol selecionado do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O,

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19/60 rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo K e rebaudiosídeo J; adoçantes naturais tais como frutose, xarope de frutose-glicose, glicose, maltose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorií), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii; e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina.

[0065] Em um outro aspecto da presente invenção, um agente de controle de sabor da presente invenção é um agente de controle de sabor contendo o composto supradescrito representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo para intensificar a doçura. Um agente de controle de sabor para intensificar a doçura se refere a um agente de controle de sabor que pode ser adicionado a um alimento ou bebida contendo um adoçante de maneira tal que ele possa conferir doçura mais forte ao alimento ou bebida do que uma simples soma da doçura do agente de controle de sabor a isso. Por exemplo, quando um agente de controle de sabor de uma quantidade equivalente a Brix de 0,1 é adicionado a um alimento ou bebida com doçura equivalente a Brix de 9, o agente de controle de sabor deve ser capaz de conferir um nível de doçura excedendo Brix de 9,1 (por exemplo, Brix de 9,2) ao alimento ou bebida. O uso de um agente de controle de sabor como esse para intensificar a doçura pode reduzir a quantidade total dos adoçantes usados, e assim vantajoso em realizar redução de caloria e redução de custo.

[0066] Se o nível de doçura do adoçante alvejado para intensificação de doçura for 1-10, o agente de controle de sabor para intensificar a doçura da presente invenção é preferivelmente adicionado em uma quantidade de 0,05% em massa - 2,0% em massa, mais preferivelmente adicionado em uma quantidade de 0,1% em massa - 1,5% em massa, e ainda mais preferivelmente

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20/60 adicionado em uma quantidade de 0,2% em massa - 1,2% em massa com base na massa do adoçante alvejado para intensificação de doçura.

[0067] Exemplos do adoçante alvejado para intensificação de doçura incluem, mas particularmente não se limitando a um ou mais tipos de glicosídeo de esteviol selecionado do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo K e rebaudiosídeo J; adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutose-glicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorit), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii; e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina.

6. Método para produzir glicosídeo de esteviol inovador [0068] Como descrito anteriormente, o glicosídeo de esteviol da presente invenção pode ser produzido por (A) isolamento/purificação de uma planta, (B) uma síntese química, ou (C) uma biossíntese. Em seguida, cada um deles será descrito.

[0069] (a) Isolamento/purificação de planta

Uma vez que a planta da presente invenção contém o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção, o glicosídeo de esteviol inovador pode ser isolado/purificado da dita planta. Uma folha fresca ou seca da planta da presente invenção é deixada reagir com um solvente apropriado (um solvente aquoso tal como água ou um solvente orgânico tais como álcool, éter ou acetona) para extrair o glicosídeo de esteviol inovador em um extrato estado líquido. Para condições de extração e mais, vide o método descrito em WO2016/090460 ou o método descrito no exemplo a seguir.

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21/60 [0070] Além do mais, o extrato líquido resultante pode ser submetido a um método conhecido tais como um gradiente de acetato de etila ou outro solvente orgânico: água, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), ou cromatografia de líquida de ultra (alto) desempenho (UPLC) para isolar/purificar o glicosídeo de esteviol inovador.

[0071] O teor do glicosídeo de esteviol inovador na planta pode ser determinado pelo método descrito em WO2016/090460 ou pelo método descrito no exemplo a seguir. Especificamente, o teor pode ser medido amostrando folhas frescas da planta da presente invenção e submetendo as folhas a LC-MS/MS.

(2) Síntese química [0072] Um método para sintetizar o glicosídeo de esteviol da presente invenção será descrito em detalhes a seguir.

[0073] Glicosídeos de esteviol têm estruturas nas quais diferentes frações de açúcar (glicose, ramnose, xilose, etc.) são afixadas ao aglicônio, isto é, esteviol, por meio de várias formas de ligação (posições e conformação de ligação). Portanto, um glicosídeo de esteviol de interesse pode ser obtido por meio de vários caminhos dependendo do material de partida selecionado. Versados na técnica aos quais a presente invenção diz respeito, entretanto, entenderíam que o tempo e o rendimento para obter o composto de interesse variam bastante dependendo dos caminhos sintéticos.

[0074] Desta vez, os presentes inventores encontraram um método inovador para produzir um glicosídeo de esteviol da presente invenção com maior seletividade e maior rendimento por meio de um caminho sintético específico. De acordo com o método para sintetizar o glicosídeo de esteviol da presente invenção, um síntese química do glicosídeo de esteviol se dá separando o glicosídeo de esteviol em um “glicosídeo de esteviol” e uma “forma hemiacetal de açúcar” como mostrado no Esquema 1.

Esquema 1: Método inovador para sintetizar glicosídeo de esteviol

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[0075] O glicosídeo de esteviol pode ser preparado por derivação de uma substância natural existente (rebaudiosídeo, dulcosídeo, esteviosídeo, biosídeo de esteviol, rubusosídeo, etc.). No entanto, a forma hemiacetal de açúcar pode ser preparada tanto a partir de uma substância natural existente quanto por uma síntese química. Os presentes inventores observaram que o glicosídeo de esteviol de interesse pode ser obtido com bom rendimento e βseletividade extremamente alta condensando o glicosídeo de esteviol e a forma hemiacetal de açúcar através da reação de Mitsunobu.

[0076] Em um aspecto da presente invenção, um método para produzir o composto representado pela Fórmula (1) é provido, onde o método compreende as etapas de:

(A) sintetizar um composto representado pela Fórmula (3) a seguir:

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(em que, PGs cada qual independentemente representa um grupo protetor) de rebaudiosídeo C representado pela Fórmula (2) a seguir:

(B) sintetizar um composto representado pela Fórmula (4) a seguir

Petição 870190058844, de 25/06/2019, pág. 34/85 / 60 (em que, PGs cada qual independentemente representa um grupo protetor) de um derivado de glicopiranosídeo.

[0077] Em um outro aspecto da presente invenção, o método para produzir o composto representado pela Fórmula (1) é provido, em que o método compreende adicionalmente uma etapa de permitir reação entre o composto representado pela Fórmula (3) anterior e o composto representado pela Fórmula (4) anterior na presença de um reagente de fosfina e um composto azo para obter um composto representado pela Fórmula (5) a seguir

(em que, PGs cada qual independentemente representa um grupo protetor).

[0078] Aqui, exemplos do grupo protetor incluem um grupo protetor acila, um grupo silila trissubstituído, um grupo protetor acetal e um grupo protetor éter. Exemplos preferíveis incluem um grupo silila trissubstituído (um grupo trimetilsilila, um grupo trietilsilila, um grupo t-butildimetilsilila, etc.) e um grupo protetor acila (um grupo acetila, um grupo benzoíla, etc.).

(A) Primeira etapa (síntese de glicosídeo de esteviol) [0079] Um glicosídeo de esteviol pode ser obtido, por exemplo, seguindo o Esquema 2 a seguir usando rebaudiosídeo de ocorrência natural C (dulcosídeo B) como uma matéria-prima.

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Esquema 2: Síntese de glicosídeo de esteviol

Rebaudiosídeo C (1) 2

Glicosídeo de esteviol (3) [0080] Primeiramente, rebaudiosídeo C é dissolvido em um solvente tais como metanol e água, adicionado com uma base forte tal como hidróxido de sódio, e refluxado a 60°C-120°C por 2 horas ou mais de maneira tal que a molécula de glicose é removida de C-19 de rebaudiosídeo C para dar o Composto 2 anteriormente. Assim procedendo, o solvente pode ser evaporado após neutralização da solução da reação com uma resina de troca catiônica ou similares.

[0081] O Composto 2 é dissolvido adicionalmente em um solvente tal como piridina, e adicionado com anidrido acético ou similares para proteger os grupos hidroxila contidos no Composto 2, por meio disso obtendo o Composto 3.

[0082] (B) Segunda etapa (síntese de trissacarídeo hemiacetal)

O trissacarídeo hemiacetal pode ser obtido, por exemplo, seguindo o Esquema 3 a seguir usando um derivado de glicopiranosídeo comercialmente disponível como uma matéria-prima.

Esquema 3: Síntese de forma hemiacetal de trissacarídeo

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PhCH(OMe)_;>

CSA

AcOAcO*’ AcO*

CH₂CI₂

MS4A

R.T ό o-fcX-a OAc AcO \

Α«0“7**24^Γ-“<> ^OAc (1) p-TsOH gtOH/HjO RT

---------------------------(2} AcgO Pyr. RT

CAN

MeCN/H₂O =4/1

0°C

[0083] Primeiramente, 4-metoxifenil β-D-glicopiranosídeo (4) é dissolvido em um solvente tal como acetonitrila, adicionado com dimetil acetal benzaldeído e ácido canforsulfônico (catalisador ácido), e agitado a 25°C-80°C por 2 horas ou mais para dar o Composto 5. Subsequentemente, o Composto 5, 2,2,2-tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-3-Do glicosipiranosila(6) e peneiras moleculares 4A são dissolvidos em um solvente tal como diclorometano, adicionados com trifluormetanossulfonato de trimetililsilila a uma baixa temperatura (por exemplo, 0°C), e agitados à temperatura ambiente por 2 horas ou mais para dar o Composto 7.

[0084] O Composto 7 é dissolvido em um solvente tal como etanol, adicionado com ácido P-toluenossulfônico à temperatura ambiente, agitado a 60°C-80°C por 2 horas ou mais para completar a reação, então neutralizado com trietilamina, e concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante é dissolvido em um solvente tal como piridina, e adicionado com anidrido acético ou similares para dar o Composto 8 com grupos hidroxila protegidos. O Composto 8 é dissolvido em acetonitrila e água, adicionado com um oxidante tal como nitrato de cério e amônio, e agitado por 5 minutos a 2 horas, por meio disso obtendo o Composto 9.

[0085] (C) Terceira etapa (Síntese do composto representado pela

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Fórmula (1))

O composto representado pela Fórmula (1) pode ser sintetizado, por exemplo, seguindo o Esquema 4 a seguir usando os

Compostos 3 e 9 obtidos nas Etapas 1 e 2 anteriormente.

Esquema 4: Síntese do composto representado pela Fórmula (1) (Composto

11)

1,5 <?q.

TMAD

1Q

MeOK/THF RT quarsh

[0086]

Primeiramente, a forma hemiacetal de trissacarídeo e o glicosídeo de esteviol obtidos nas Etapas 1 e 2 são deixados passar pela reação de Mitsunobu de maneira tal que apenas o Composto 10 na forma β possa ser seletivamente obtido com rendimento muito alto (45% ou mais). Especificamente, esses compostos são dissolvidos em 1,4-dioxano, adicionados com um reagente de fosfina tal como tributilfosfina ou trifenilfosfina e um composto azo tal como l,l’-azobis (N,N’dimetilformamida) (TMAD) à temperatura ambiente, e agitados a 50°C-80°C por 2 horas ou mais para dar apenas o Composto 10 na forma β. Finalmente, os grupos protetores do composto 10 são desprotegidos para dar o composto representado pela Fórmula (1) (Composto 11).

(3) Biossíntese [0087] O glicosídeo de esteviol da presente invenção pode também

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28/60 ser gerado transferindo um polinucleotídeo que codifica para uma proteína predeterminada em uma célula hospedeira derivada de uma bactéria, uma planta, um inseto, um mamífero não humano ou similares, e usando esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose e/ou UDP-ramnose como um substrato. Esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose ou UDP-ramnose como o substrato podem ser tanto provido quanto biossintetizado na célula. Embora exemplos da proteína predeterminada incluam UGT85C2 derivado de estévia (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2), UGT74G1 (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:4), UGT91D2 (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:6), UGT76G1 (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:8) e UDP-ramnose sintase AtRHM2 derivada de Arabidopsis thaliana (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10), ela não está limitada a esses desde que ela tenha uma atividade equivalente.

[0088] A proteína supradescrita é uma enzima derivada de Arabidopsis thaliana ou estévia, que espera-se seja altamente ativa em um ambiente fora das células de planta tais como Arabidopsis thaliana e estévia (por exemplo, em um ambiente extracelular, ou dentro de uma célula hospedeira sem ser estévia). Neste caso, o polinucleotídeo que codifica a proteína supradescrita (por exemplo, gene UGT85C2 é representado por SEQ ID NO:1, gene UGT74G1 é representado por SEQ ID NO:3, UGT91D2 gene é representado por SEQ ID NO:5, gene UGT76G1 é representado por SEQ ID NO:7 e gene AtRHM2 é representado por SEQ ID NO:9) é transferido para uma célula hospedeira derivada de uma bactéria, um fungo, uma planta, um inseto ou um mamífero não humano de maneira a permitir expressão da proteína da presente invenção, na qual esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose ou UDP-ramnose como o substrato é provido para gerar o composto da presente invenção. Alternativamente, dependendo do hospedeiro, a proteína supradescrita é expressa na célula hospedeira, na qual

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29/60 um substrato apropriado é provido para gerar o composto da presente invenção.

[0089] Em um aspecto da presente invenção, um método para produzir o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção é provido, onde o método é caracterizado por uso de um transformante não humano que foi introduzido com pelo menos um dos polinucleotídeos (a) a (g) a seguir.

[0090] (a) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 e que tem uma atividade de adicionar glicose ao grupo hidroxila em ΟΙ 3 do glicosídeo de esteviol.

[0091] (b) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e que tem uma atividade de adicionar glicose ao ácido carboxílico em C-19 do glicosídeo de esteviol.

[0092] (c) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adicionar ramnose a glicose afixada a C-13 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>2.

[0093] (d) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, um polinucleotídeo contendo uma sequência de

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30/60 nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adicionar glicose a C-3 da glicose em C-13 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>3.

[0094] (e) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adicionar glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>2.

[0095] (f) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adicionar glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>3.

[0096] (g) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:9, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:9, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 e que tem uma atividade de gerar UDP-ramnose a partir de UDPglicose.

Em um aspecto preferível da presente invenção, podem ser usados polinucleotídeos independentemente tendo 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou

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31/60 mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais, 99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais, ou 99,9% ou mais identidade de sequência com as sequências de nucleotídeos dos números de sequência mencionados em (a) a (g) anteriormente.

[0097] Em um outro aspecto preferível da presente invenção, podem ser usadas proteínas que têm independentemente uma sequência de aminoácidos tendo 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais, 99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais, ou 99,9% ou mais identidade de sequência com as sequências de aminoácidos do número de sequência mencionado em (a) a (g) anteriores e que tem a atividade predeterminada descrita em (a) a (g) anteriormente.

[0098] Preferivelmente, um polinucleotídeo que codifica a proteína supradescrita é introduzido em um hospedeiro sendo ao mesmo tempo inserido em um vetor de expressão apropriado. Os polinucleotídeos podem individualmente ser inseridos em vetores separados.

[0099] Um vetor de expressão apropriado é geralmente produzido para conter:

(i) um promotor que permite transcrição na célula hospedeira;

(ii) um polinucleotídeo da presente invenção ligado ao dito promotor; e (iii) um cassete expressão que é envolvido em terminação de transcrição e poliadenilação de moléculas de RNA e que contém, como um componente dos mesmos, um sinal que funciona na célula hospedeira.

[00100] Exemplos de um método para preparar um vetor de expressão incluem, mas particularmente não se limitando a um método que usa um plasmídeo, um fago, um cosmídeo ou similares, e moléculas de DNA tendo componentes necessários.

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32/60 [00101] O tipo do vetor não é particularmente limitado, e qualquer vetor que permita a expressão na célula hospedeira pode adequadamente ser selecionado. Especificamente, uma sequência promotora é adequadamente selecionada de acordo com o tipo da célula hospedeira para assegurar expressão do polinucleotídeo da presente invenção, e um vetor obtido integrando essa sequência promotora e o polinucleotídeo da presente invenção em um plasmídeo ou similares é usado como um vetor de expressão.

[00102] O vetor de expressão da presente invenção inclui regiões de controle de expressão (por exemplo, um promotor, um terminador e/ou uma origem de replicação e similares) dependendo do tipo do hospedeiro no qual ele é introduzido. Um promotor usado em um vetor de expressão bacteriana pode ser um promotor comum (por exemplo, um promotor trc, um promotor tac, um promotor lac, etc.), um promotor usado para uma levedura pode ser, por exemplo, um promotor gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, promotor PH05, um promotor GAL1/10 ou similares, e um promotor para fungos filamentosos pode ser, por exemplo, amilase, trpC ou similares. Entretanto, exemplos de um promotor para expressar o gene de interesse em uma célula de planta incluem um promotor 35S RNA do vírus do mosaico da couve-flor, um promotor do gene rd29A, um promotor rbcS, e um promotor mac-1 nos quais a sequência intensificadora do promotor 35S RNA do vírus do mosaico da couve-flor é provido no terminal 5’ de uma sequência promotora de manopina sintase derivada de Agrobacterium. Um promotor para uma célula hospedeira animal pode ser um promotor viral (por exemplo, um promotor precoce SV40, um promotor tardio SV40 etc.). Exemplos de um promotor que é indutivamente ativado em resposta a estímulo externo incluem um promotor do vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), um promotor responsivo a tetraciclina, um promotor de metalotioneína e um promotor de proteína de choque térmico.

Preferivelmente, o vetor de expressão contém pelo menos um

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33/60 marcador selecionável. Como um marcador como esse, um marcador autotrófico (LEU2, URA3, HIS3, TRP1, ura5, niaD), um marcador de resistência a fármaco (higromicina, zeocina), um gene de resistência a geneticina (G418r), um gene de resistência a cobre (CUP1) (Marin et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 81, p. 337, 1984), um gene de resistência a cerulenina (fas2m, PDR4) (Junji Inokoshi et al., Journal of Japanese Biochemical Society, vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991, respectivamente) ou similares podem ser usados.

[00103] Como um método para transformar uma célula hospedeira, um método conhecido geralmente empregado pode ser empregado. Por exemplo, um método de eletroporação (Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000), um método de distribuição de partícula (Relatório Descritivo de Patente não Examinado japonês No. 2005287403), um método de esferoplasto (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), um método de acetato de lítio (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983), um método descrito em Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, ou similares podem ser realizados embora a presente invenção não esteja limitada a isso.

[00104] Além do mais, como para processos biológicos moleculares gerais, vide “Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”, “Methods in Yeast Genetics, manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)” e similares.

[00105] Um transformante não humano obtido como descrito anteriormente pode ser cultivado de maneira a permitir que o transformante não humano produza um glicosídeo de esteviol. Um transformante não humano como esse é preferivelmente uma levedura. Entretanto, o transformante não humano é preferivelmente cultivado em um meio contendo esteviol. O glicosídeo de esteviol acumulado pode ser extraído/purificado para

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34/60 obter o glicosídeo de este viol da presente invenção.

EXEMPLO [Isolamento de glicosídeo de esteviol inovador] [00106] Extratos obtidos a partir das folhas de quatro linhagens de plantas de estévia inovadoras (Amostra 1 (EM3-4), Amostra 2 (EM2-27-8), Amostra 3 (EM2-27-15) e Amostra 4 (EM2-11)) desenvolvidos em Suntory Global Innovation Center (SIC) foram submetidos a espectrometria de massa (MS) por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para a análise de classificação do glicosídeo de esteviol contido com base no pesos moleculares de um glicosídeo de esteviol que teve uma cadeia de açúcar formada de Dglicopiranosil (glc), L-ramnopiranosila (rha) e xilopiranosila (xyl). Aqui, Amostra 1 é uma planta de alto Reb.C tendo um polimorfismo de genoma de A no tipo selvagem sendo alterado para T no 60° nucleotídeo da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 11 no genoma de uma planta de teste. Uma análise estatística da correlação dentre o fenótipo tendo uma alta concentração de RebC e o polimorfismo da SEQ ID NO: 11 revelou que o dito polimorfismo teve uma correlação estatística com o fenótipo tendo uma alta concentração de RebC.

[00107] Um processo para preparar um líquido de teste foi como a seguir: 10,0 mg cada qual das folhas de estévia secas liofilizada foram pesados em um frasco de vidro, no qual 1,0 mL de água/metanol (1/1 vol/vol) foi adicionado como um solvente de extração, e então o resultante foi submetido a irradiação ultrassônica em um limpador ultrassônico (AS ONE, AS52GTU) a um temperatura definida de 25°C por 20 minutos, por meio disso obtendo um extrato líquido de um glicosídeo de esteviol das folhas de estévia. O resultante foi adicionalmente 10 vezes diluído com água/metanol e filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 pm (Nacalai tesque, filtro S Cosmonice (solvente)) antes de ser submetido a HPLC-MS.

[00108] Para HPLC, parte de HPLC-MS, Nexera LC-30AD (Shimadzu

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Corporation) foi usada como uma bomba de LC de unidade de distribuição de líquido, e SM-C18 (4,6x 250 mm) (da Imtakt) como uma coluna de separação. Distribuição de líquido da fase móvel LC foi realizada usando água Milli-Q contendo ácido acético 0,2% como fase móvel A e metanol como fase móvel B, em que o gradiente binário foi de maneira tal que a concentração da fase móvel B fosse constantemente mantida a 10% por 0-5 minutos, a concentração da fase móvel B foi deslocada del0%a70% nos 15 minutos seguintes, então de 70% a 100% nos 5 minutos seguintes, e finalmente terminou mantendo a concentração da fase móvel B a 100% por 5 minutos. A vazão da fase móvel foi 0,4 mL/min, e o extrato líquido de folha de estévia diluído e filtrado com um filtro foi injetado por 5 pL.

[00109] Para a parte de MS, foi usado espectrômetro de massa triplo quadrupolo LCMS-8030 (Shimadzu Corporation) equipado com uma fonte de íon de ionização por eletropulverização (ESI). A medição de espectrometria de massa foi realizada em um modo de monitoramento do íon selecionado (SIM) selecionando o modo de medição de íon negativo e os valores m/z. Os valores m/z foram selecionados por cálculo com base nos pesos moleculares de um glicosídeo de esteviol que teve uma cadeia de açúcar formada de Dglicopiranosil (glc), L-ramnopiranosila (rha) e xilopiranosila (xyl). Dessa maneira, m/z = 641,2 (glc (2)), 773,2 (glc (2), xila (1)), 787,2 (glc (2), rha (1)), 803,2 (glc (3)), 935,3 (glc (3), xila (1)), 949,3 (glc (3), rha (1)), 965,3 (glc (4)), 1.095,4 (glc (3), rha (2)), 1.097,4 (glc (4), xila (1)), 1.111,4 (glc (4), rha (1)), 1.127,4 (glc (5)), 1.257,5 (glc (4), rha (2)), 1.259,5 (glc (5), xila (1)),

1.273,5 (glc (5), rha (1)), 1.289,5 (glc (6)), 1.435,6 (glc (6), rha (1)) foram selecionados. Além do mais, um reagente de alta pureza disponível, rebaudiosídeos A, B, D, F, Μ, N e O, esteviosídeo, e dulcosídeos A e B foram também medidos nas mesmas condições de maneira a confirmar os valores m/z de íon negativo e o tempo de retenção de HPLC. As áreas de pico (unidade arbitrária) dos glicosídeos de esteviol principalmente detectados são

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36/60 mostrados na Tabela 1.

[Tabela 1]

Tabela 1: Áreas de pico (unidade arbitrária) observadas por medição de

STM em HPLC-MS

Nome do composto	Rebaudiosídeo A	Rebaudiosídeo C	Rebaudiosídeo D	Rebaudiosídeo M	Composto representado pela Fórmula (1)	Rebaudiosídeo N
Tempo de retenção (min)	29,60	29,96	28,00	28,66	27,70	28.18
Área de pico	29.669.582	30.122.062	1.428.384	1.030.603	140.947	772,570
(Amostra 1)	46,97%	47,69%	2,26%	1,63%	0,22%	1,22%
Área de pico	23.762.676	24.201.473	2.253.735	1.029.837	97.388	1,211,504
(Amostra 2)	45,21%	46,05%	4,29%	1,96%	0,19%	2.31%
Área de pico	15.386.726	5.872.656	3.585.775	3.296.579	89.988	896.549
(Amostra 3)	52,82%	20,16%	12,31%	11,32%	0,31%	3.08%
Área de pico	16.070.017	10.339.094	1.404.429	74.413	0	308,709
(Amostra 4)	56,99%	36,67%	4,98%	0,26%	0,00%	1,09%

[00110] Dois picos foram observados no cromatograma de íons selecionado do glicosídeo de esteviol (m/z 1.273,5) nos quais a cadeia de açúcar modificado conteve cinco frações de glicose (glc) e uma fração de ramnose (rha). O cromatograma de íons selecionado da Amostra l(EM3-4) a m/z de 1.273,5 é mostrado na Figura 1.

[00111] Dos dois picos mostrados na Figura 2, o pico visto no tempo de retenção (Rt) de 28,23 minutos corresponde a amostra padrão de rebaudiosídeo N em termos do valor de massa e do tempo de retenção. No entanto, não foi ainda reportado nenhum glicosídeo de esteviol com uma massa equivalente à do rebaudiosídeo N. Dessa maneira, o pico a Rt 27,73 minutos dos dois picos mostrados na Figura 2 foi considerado de uma substância desconhecida. Para Amostra 4 cujo teor de rebaudiosídeo C foi menor que o teor de rebaudiosídeo A e cujo alongamento da cadeia de açúcar foi menor que outras amostras, o valor do pico a Rt 27.73 foi menor que o limite de detecção.

[Análise estrutural de glicosídeo de esteviol inovador] [00112] De acordo com a presente invenção, uma análise estrutural do glicosídeo de esteviol inovador detectado em um cultivar com alto teor de

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37/60 rebaudiosídeo C foi realizada como a seguir.

(i) dedução estrutural por uma análise de fragmentação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-espectrometria de massa de alta resolução (MS) e MS/MS, e fragmentação iônica de três estágios (fragmentação MS³), (ii) síntese química do produto padrão de glicosídeo de esteviol deduzido por meio de reação química, (iii) confirmação estrutural pela correspondência com o produto padrão quimicamente sintetizado com relação ao tempo de retenção e o padrão fragmentado de HPLC-MS de alta resolução e fragmentação MS³ [00113] Em seguida, cada qual das Etapas (i)-(iii) anteriores será descrita em detalhes.

[00114] (i) Dedução estrutural por uma análise de fragmentação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-espectrometria de massa de alta resolução (MS) e MS/MS, e fragmentação iônica de três estágios (fragmentação MS³)

Um processo para preparação de líquidos de teste foi como a seguir: 10,0 mg cada qual de folhas de estévia secas liofilizadas foi pesada em um frasco de vidro, no qual 1,0 mL de água/metanol (1/1 vol/vol) foi adicionado como um solvente de extração, e então o resultante foi submetido a irradiação ultrassônica em um limpador ultrassônico (AS ONE, AS52GTU) a uma temperatura definida de 25°C por 20 minutos, por meio disso obtendo o extrato líquido de um glicosídeo de esteviol das folhas de estévia. O resultante foi adicionalmente 10 vezes diluído com água/metanol e filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 qm (Nacalai tesque, filtro S Cosmonice (solvente)) antes de ser submetido a HPLC-MS.

[00115] Em uma configuração de equipamento para cromatografia líquida de alto desempenho- ionização por eletropulverização-espectrometria de massa precisa (HPLC-ESI-HRMS), equipamento para HPLC foi

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38/60 configurado usando Prominence LC-20AD (Shimadzu Corporation) como uma bomba de LC de unidade de distribuição de líquido e SM-C18 (4,6x 250 mm) (da Imtakt) como uma coluna de separação. A fase móvel LC foi distribuída usando água Milli-Q contendo ácido acético 0,2% como fase móvel A e metanol como fase móvel B, em que o gradiente binário foi de maneira tal que a concentração da fase móvel B fosse constantemente mantida a 10% por 0-5 minutos, a concentração da fase móvel B foi deslocada de 10% a 70% nos 15 minutos seguintes, e adicionalmente de 70% a 100% nos 5 minutos seguintes. Finalmente, a concentração da fase móvel B foi mantida a 100% por 5 minutos até o fim. A vazão da fase móvel foi 0,4 mL/min, e o extrato líquido de folha de estévia diluído e subsequentemente filtrado com um filtro foi injetado por 5 pL. Para a parte de espectrometria de massa, Orbitrap Elite MS (da Thermo Fisher Scientific) equipada com uma fonte de ion ESI foi usado. A medição de espectrometria de massa foi realizada em um modo de medição de íon negativo a m/z em uma faixa de 150-2.000 com resolução definida a 60.000. A medição de MS/MS foi realizada selecionando o m/z alvejado de 1.273,5 e em um modo CID em que fragmentação foi induzida por colisão com um gás inerte. Irradiação de energia exigida para fragmentação foi realizada a uma energia de colisão padrão exclusiva para o aparelho, isto é, 35.

[00116] A fim de estudar o padrão fragmentado do glicosídeo de esteviol inovador, rebaudiosídeos A, D e M de amostras padrões com estruturas conhecidas foram submetidos a análises padrões de MS/MS e fragmentação MS³. Em decorrência disso, MS/MS do glicosídeo de esteviol inovador deu dados mostrando que a intensidade de íon mais alta apareceu no pico onde toda a cadeia de açúcar afixada a C-19 por meio de uma união de éster foi liberada. Esse resultado mostra o peso molecular total da cadeia de açúcar afixada ao carbono de C-19 por meio de uma união de éster.

[00117] Os espectros de massa fragmentados MS/MS e MS³ de

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39/60 rebaudiosídeo Neo glicosídeo de esteviol inovador são mostrados na Figura

3. Quando os espectros MS/MS de rebaudiosídeo N e o glicosídeo de esteviol inovador tendo o mesmo valor de MS foram comparados, rebaudiosídeo N teve o pico principal a m/z de 803,37 correspondendo à liberação de duas frações de glc e uma fração de rha. Por outro lado, no espectro MS/MS do glicosídeo de esteviol inovador, o pico principal foi detectado a m/z de 787,38 correspondendo à liberação de três frações de glc. A fim de adquirir informação estrutural adicional, um espectro MS³ foi adquirido fragmentando o pico principal a m/z de 787,4 obtido por MS/MS. Em decorrência disso, um espectro tendo o mesmo padrão de pico que o espectro do MS³ de rebaudiosídeo C (949,4^787,4^) foi adquirido. Dessa maneira, a cadeia de açúcar afixada a C-13 foi suposta ser mesma do rebaudiosídeo C. Considerando que as folhas de estévia desta amostra também contiveram rebaudiosídeo M, a estrutura da cadeia de açúcar afixada a C-19 do glicosídeo de esteviol inovador supostamente foi a mesma da estrutura de rebaudiosídeo M com base no potencial de biossíntese das folhas de estévia. A estrutura deduzida é mostrada na Figura 3.

[00118] (1) Esboço de caminhos sintéticos

Esquema 5: Estratégia para sintetizar glicosídeo de esteviol inovador

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Forma hemiacetal de trissacarideo ¢9)

Doador de glicose (6)

Aceptor de glicose (5)

[00119] Como pode ser percebido pelo Esquema 5, para a síntese do glicosídeo de esteviol inovador (11), o glicosídeo de esteviol (3) e a forma hemiacetal de trissacarideo (9) foram condensados por meio da reação de Mitsunobu para obter a espinha dorsal do glicosídeo de esteviol inovador (11). Para síntese do glicosídeo de esteviol (3), uma substância natural conhecida, rebaudiosídeo C (1), foi comprada da Ark Pharm, a união de éster em C-19 de esteviol foi submetida a hidrólise alcalina e então os grupos hidroxila da cadeia de açúcar foram protegidos com grupos acetila (Ac) para obter o glicosídeo de esteviol (3). Para síntese da forma hemiacetal de trissacarideo (9), uma espinha dorsal de trissacarideo foi produzida por reação de condensação dentre o aceptor de glicose apropriadamente protegido (5) e o

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41/60 doador de glicose (6), e o grupo protetor no carbono anomérico da extremidade redutora foi desprotegido para dar a forma hemiacetal de trissacarídeo (9). O glicosídeo de esteviol resultante (3) e a forma hemiacetal de trissacarídeo (9) foram submetidos a condensação por meio da reação de Mitsunobu, em que uma reação com β-seletividade boa e completa de 47% (apenas a forma β) se deu. Os grupos protetores do composto resultante foram desprotegidos, por meio disso obtendo o glicosídeo de esteviol inovador (11). [00120] Em seguida, cada qual das etapas da síntese será descrita. [00121] (2) Síntese de glicosídeo de esteviol

Esquema 6: Síntese de glicosídeo de esteviol

Rebaudiosídeo C (1) 2 Glicosídeo de esteviol (3) [00122] Como pode ser percebido pelo Esquema 6, para síntese do glicosídeo de esteviol (3), rebaudiosídeo C (1) (1,0 g, 1,05 mmol) comprado da Ark Pharm foi dissolvido em metanol (10 mL) e água (10 mL), adicionado com 4 mol/L de hidróxido de sódio (2,6 mL, 10,5 mmol) à temperatura ambiente, e refluxado a 100°C por 20 horas. O término da reação foi confirmado por TLC (clorofórmio/metanol/água = 5/4/0,1, valor de Rf = 0,9) antes de a solução da reação ter sido neutralizada com forma de hidrogênio Dowex MAC-3 de resina de troca catiônica (SIGMA-ALDRICH) (pH 7). Após a resina ter sido removida por filtração, o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi seco por 18 horas usando uma bomba de vácuo para dar o Composto 2 (828 mg, quant.).

[00123] Composto 2 (828 mg, 1,05 mmol) foi dissolvido em piridina (20 mL), adicionado com anidrido acético (5 mL) à temperatura ambiente e

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42/60 agitado por 48 horas à temperatura ambiente. Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,5), uma solução de hidrogenocarbonato de sódio saturada (5 mL) foi adicionada, e a solução da reação foi concentrada sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de silica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 2/1) foi usado para dar o Composto 3 (1,1 g, 92%).

[Composto 3]

RMN Ή (CDC1₃, 400 MHz) δ 0,81 (m, 2H), 0,83-1,45 (complexo, 19H), 1,39-1,91 (complexo, 24H), 1,91-2,35 (s, 30H), 3,58 (m, 1H), 3,71-3,81 (complexo, 4H), 3,95-4,12 (complexo, 7H), 4,34-4,46 (complexo, 3H), 4,56-4,66 (complexo, 4H), 4,69-4,92 (complexo, 7H), 5,Οδό, 14 (complexo, 5H), 5,23-5,38 (complexo, 6H), 5,45 (s, 1H); RMN ¹³C (CDC1₃, 100 MHz) δ 15,9, 17,3, 19,1, 20,5, 20,7, 20,8, 20,9, 21,1, 21,5, 21,7,

29,1, 37,8, 38,0, 39,5, 40,7, 41,4, 42,2, 43,8, 48,4, 53,8, 56,8, 61,6, 63,0, 65,5,

66,8, 68,0, 68,6, 69,3, 69,6, 69,8, 70,5, 70,9, 71,6, 71,9, 72,4, 72,8, 73,9, 74,9,

81,3, 87,3, 96,6, 96,8, 99,2, 99,4, 125,4, 128,3, 129,1, 137,9, 151,9, 168,9,

169,2, 169,5, 169,6, 169,8, 170,1, 170,2, 170,3, 170,6, 170,9, 176,8, 183,4 [00124] (3) Síntese de forma hemiacetal de trissacarídeo

Esquema 7: Síntese de forma hemiacetal de trissacarídeo

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PhCH(OMe)₂

CSA

MeCN

RT

77% (cristalino) ch₂ci₂

MS4A

RT

(1) p-TsOH

EtOH/H₂O

RT

-----► (2) Ac₂O Pyr. RT 54% (3 etapas)

CAN --------*MeCN/H₂O =471 o°c 29%

ronna hemiacetal cie tiissacaiidec ($) [00125] Como pode ser percebido pelo Esquema 7, para síntese da forma hemiacetal de trissacarídeo (9), 4-metoxifenil β-D-glicopiranosídeo (4) (4,0 g, 13,9 mmol) comprado da Tokyo Chemical Industry foi dissolvido em acetonitrila (70 mL), adicionado com dimetil acetal benzaldeído (3,1 mL, 20,9 mmol) e ácido canforsulfônico (323 mg, 1,39 mmol) à temperatura ambiente, e agitado a 50°C por 18 horas. Após confirmar o término da reação por TLC (clorofórmio/metanol = 10/1, valor de Rf = 0,5), o resultante foi neutralizado com trietilamina (1 mL) (pH 8) e concentrado sob uma baixa pressão. O resíduo resultante foi cristalizado (etanol) para dar o Composto 5 (4,0 g, 77%).

[Composto 5]

RMN Ή (CDC1₃, 400 MHz) δ 3,58 (m, 1H, H-5), 3,65 (t, 1H, H-4), 3,78 (m, 5H, H-2, H-6, OMe), 3,92 (t, 1H, H-3), 4,38 (dd, 1H, H-6’), 4,92 (d, J = 7,6 Hz, 1H, H-l), 5,57 (s, 1H, CHPh), 6,84 (dd, 4H, OMePh), 7,49 (m, 5H, Ph); RMN ¹³C (CDC1₃, 100 MHz) δ 31,1, 55,8, 66,7, 68,8, 73,4, 74,6, 80,5, 102,2, 102,5, 114,8, 118,8, 126,4, 128,5, 129,5, 136,9, 150,9,

155,9

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44/60 [00126] O Composto 5 (1,0 g, 2.67 mmol), 2,2,2-tricloroacetimidato de

3,4,6-tetra-O-acetil-3-D-glicosipiranosila (6) (2,9 g, 5,88 mmol) comprado da o

Tokyo Chemical Industry e peneiras moleculares 4A (2,0 g) foram dissolvidos em diclorometano (171 mL), adicionados com trifluormetanossulfonato de trimetililsilila (48 pL, 0,27 mmol) a 0°C, e agitados à temperatura ambiente por 1,5 hora. Após confirmar o término da reação por TLC (tolueno/acetato de etila =1/1, valor de Rf = 0,7), o resultante o

foi neutralizado com trietilamina (100 pL) (pH 8), peneiras moleculares 4A foram removidas por filtração, e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de silica gel e um eluato (tolueno/acetato de etila = 2/1) foi usado para dar o Composto

7.

[00127] O Composto 7 (1,9 g, 1,84 mmol) foi dissolvido em etanol (18 mL), adicionado com ácido P-toluenossulfônico (35 mg, 0,184 mmol) à temperatura ambiente, e agitado a 60°C por 5,5 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,1), o resultante foi neutralizado com trietilamina (5,0 mL) (pH 8) e concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi dissolvido em piridina (18 mL), adicionado com anidrido acético (347 pL, 3,68 mmol) à temperatura ambiente, e agitado à temperatura ambiente por 18 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,7), destilação azeotrópica com tolueno (30 mL) foi repetida por três vezes, e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de silica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 1/1 —> 2/1) foi usado para dar o Composto 8 (1,5 g, 54%, 3 etapas).

[Composto 8]

RMN Ή (CDC1₃, 400 MHz) δ 1,94-2,17 (complexo, 30H, OAc), 2,91 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 3,71 (m, 1H), 3,76 (m, 5H), 3,94 (t, 1H),

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45/60

4,09-4,17 (complexo, 5H), 4,31 (dd, 1H), 4,88 (m, 3H), 4,96-5,08 (complexo, 4H), 5,18 (m, 2H), 5,26 (t, 1H), 6,84 (dd, OMePh); RMN ¹³C (CDC1₃, 100 MHz) δ 20,6 x 2, 20,7 x 4, 20,8 x 2, 20,9, 21,1, 55,8, 60,3, 60,5, 61,8, 62,6, 67,6, 68,3, 71,4, 71,6, 71,9, 71,0, 72,1, 72,7, 73,1, 82,3, 98,5, 98,7 x 2, 114,9,

116.1, 150,1, 155,4, 168,9, 169,4x2, 169,5, 170,2, 170,3, 170,4, 170,5 [00128] Composto 8 (1,3 g, 1,26 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (20 mL) e água (5,0 mL), adicionado com nitrato de cério e amônio (1,4 g, 2,52 mmol) a 0°C e agitado a 0°C por 15 minutos, Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,3), o resultante foi diluído com acetato de etila, e a camada orgânica foi lavada com água e uma solução de hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada e seco com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de silica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 2/1) foi usado para dar o Composto 9 (343 mg, 29%).

[Composto 9]

RMN Ή (CDC1₃, 400 MHz) δ 1,95-2,33 (complexo, 55H, OAc), 3,61 (m, 6H), 3,73 (m, 1H), 3,91-4,31 (complexo, 12H), 4,40 (m, 2H), 4,61 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 4,73 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,85-4,98 (complexo, 4H), 5,01-5,21 (complexo, 9H), 5,41 (d, J = 3,2 Hz, 1H); RMN ¹³C (CDC1₃, 100 MHz) δ 20,8, 20,9 x 3,

21.1, 21,2, 21,5, 29,4, 29,8, 61,6, 61,7 x 2, 61,9, 62,4, 62,5, 67,3, 67,5, 67,9, 68,1 x 2, 68,2, 68,3, 71,6, 71,8, 71,9 x 2, 71,1, 72,2, 72,3, 72,8, 73,0, 74,8,

77,4, 78,3, 81,7, 82,8, 92,2, 95,6, 98,9, 99,5, 100,1, 101,5, 125,4, 128,3,

129.1, 137,9, 168,9, 169,4, 169,5 x 2, 169,9, 170,0, 170,1 x 2, 170,3 x 2 [00129] (4) Síntese do composto 11

Esquema 8: Síntese do composto 11

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:i .5 eq.

Forma hemiacetal de tiissaearideo (S')

P8u_s TMAD

1,4-dioxaiio ^:'C

47%

Apenas β

NaOMe ....................>MeOH/THF

RT quant.

Composto 1± [00130] Como pode ser percebido pelo Esquema 8, para síntese do composto 11, Composto (9) (343 mg, 0,371 mmol) e Composto (3) (289 mg, 0,247 mmol) foram dissolvidos em 1,4-dioxano (12 mL), adicionado com tributilfosfina (185 pL, 0,741 mmol) e l,l’-azobis (N,N’-dimetilformamida) (TMAD) (128 mg, 0,741 mmol) à temperatura ambiente, e agitado a 60°C por 18 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (tolueno/acetato de etila = 1/2, valor de Rf = 0,6), o resultante foi diluído com acetato de etila, e a camada orgânica foi lavada com água, uma solução de hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada e salina saturada, e seco com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de silica gel e um eluato (tolueno/acetato de etila = 1/1) foi usado para dar o Composto 10 (240 mg, 47%).

[Composto 10]

RMN Ή (CDC1₃, 400 MHz) δ 0,50-1,05 (complexo, 7H), 1,19 (d, 3H, H-6 de Rham), 1,23 (s, 3H), 1,35-2,30 (complexo, 80H), 3,59 (m, 1H), 3,72 (m, 5H), 3,92-4,11 (complexo, 10H), 4,21 (dd, 1H), 4,31 (dd, 1H), 4,42

Petição 870190058844, de 25/06/2019, pág. 57/85 /60 (m, 3H), 4,60 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,71-4,95 (complexo, 9H), 5,07 (m, 6H),

5.19 (t, 1H), 5,29 (m, 4H), 5,59 (d, J = 7,6 Hz, 1H); RMN ¹³C (CDC1₃, 100 MHz) δ 16,7, 17,4, 20,5, 20,7 x 3, 20,8, 20,9 x 4, 21,1 x 2, 21,6, 29,2, 39,5,

42,5, 44,2, 53,8, 57,4, 61,9, 66,7, 68,0, 68,3, 68,4, 68,5, 69,7, 71,1, 71,5, 71,8,

71.9, 72,0, 72,2, 72,3, 72,4, 72,9, 73,0, 75,0, 80,1, 86,8, 91,3, 96,4, 96,9, 99,2,

99.3, 99,5, 125,4, 128,3, 129,2, 152,8, 169,0, 169,1, 169,3, 169,5 x 2, 169,6, 170,1 x 2, 170,2 x 2, 170,5, 170,6, 170,9, 174,8 [00131] O Composto (10) (220 mg, 0,106 mmol) foi dissolvido em metanol (2,0 mL) e THF (2,0 mL), adicionado com metóxido de sódio (0,5 M em MeOH) (0,2 mL, 0,106 mmol) à temperatura ambiente, e agitado à temperatura ambiente por 48 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (clorofórmio/metanol/água = 5/4/1, valor de Rf = 0,3), o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a coluna de filtração de gel (GE Healthcare, Sephadex LH-20, etanol) e liofilizado com água para dar o Composto 11 (135 mg, quant.).

[Composto 11]

RMN Ή (piridina-d5, 800 MHz) δ 0,68 (m, 1H), 0,86 (m, 1H), 0,97 (m, 1H), 1,04 (m, 4H), 1,28 (m, 1H), 1,43 (m, 5H), 1,63 (s, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,93-2,20 (complexo, 8H), 2,40 (d, 1H), 2,84 (d, 1H), 3,64 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,94-4,15 (complexo, 13H), 4,17-4,35 (complexo, 14H), 4,45-4,59 (complexo, 5H), 4,88 (m, 2H), 4,99 (d, J = 7,2 Ηζ,ΙΗ), 5,07 (s, 1H), 5,14 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,65 (s, 1H), 5,72 (d, J = 8,0 Hz, 1H),

6.20 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,48 (s, 1H); RMN ¹³C (piridina-d5, 200 MHz) δ 17,0, 19,1, 20,2, 20,9, 22,3, 29,4, 37,7, 38,5, 39,9, 40,8, 41,9, 42,7, 43,4, 44,7,

48.4, 49,8, 54,1, 57,7, 61,9, 62,4, 62,5, 62,6, 63,6, 69,4, 69,8 x 2, 71,6, 71,7,

72.5, 72,8, 74,1, 75,2, 75,5, 76,0, 76,4, 77,5, 77,6, 78,5 x 2, 78,6 x 2, 78,8 x 2,

86.9, 88,5, 89,8, 93,5, 98,4, 101,9, 103,9, 104,4, 104,8, 105,2, 154,5, 176,1 [00132] Composto 11

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48/60

[a]_D = -35,5° (c 1,0, MeOH)

MALDI-TOF-MS m/z encontrado [M + Na]⁺ 1297, C56H90O32 calculado para [M + Na]⁺ 1297.

[00133] (iii) Determinação estrutural correspondendo com o produto padrão quimicamente sintetizado com relação ao tempo de retenção e ao padrão fragmentado de HPLC-MS de alta resolução/MS/MS e fragmentação de MS³ [00134] O produto quimicamente sintetizado (Composto 11) e líquidos de extrato de folha de estévia foram comparados por HPLC-MS de alta resolução/MS e fragmentação MS³ nas mesmas condições de (i). Em decorrência disso, os picos do produto quimicamente sintetizado e o extrato líquido de folha de estévia correspondido ao pico com o tempo de retenção de 28,19 minutos (Figura 6). A partir desse resultado, o glicosídeo de esteviol inovador obtido a partir do extrato líquido da planta foi confirmado ter a mesma estrutura do Composto 11.

[Biossíntese de glicosídeo de esteviol inovador

Um glicosídeo de esteviol inovador foi gerado a partir de esteviol em levedura. Primeiramente, uma levedura capaz de coexpressar quatro tipos de genes de enzima glicosilada UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 e UGT76G1 derivados de estévia e gene UDP-ramnose sintase AtRHM2 derivado de Arabidopsis thaliana foram produzidos.

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49/60 [00135] A menos que de outra forma especificada os processos biológicos moleculares empregados neste exemplo seguiram os métodos descritos em Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001).

[00136] A fim de clonar os quatro genes de enzima glicosilada derivados de estévia, os conjuntos de oligonucleotídeo iniciador a seguir foram sintetizados para realizar PCR usando cDNA preparado a partir das folhas de estévia como um molde.

Conjunto de iniciador para gene UGT85C2 amplificação [00137] CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw (Ndel-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3 ’ (SEQ ID NO: 12)

BglII-SrUGT85C2-Rv (BglII-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3 ’ (SEQ ID NO: 13)

Conjunto de iniciador para amplificação do gene UGT91D2

SrUGT91D2-pET15b-FW ’ -TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3 ’ (SEQ ID NO:35)

SrUGT91D2-pET15b-RV

5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’ (SEQ ID NO:36)

Conjunto de iniciador para amplificação do gene UGT74G1 CACC-NdeI-SrUGT74Gl-Fw (Ndel-sítio de reconhecimento sublinhado):

’ -CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3 ’ (SEQ ID NO: 14)

BamHI-SrUGT74Gl-Rv (BamHI-sítio de reconhecimento

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50/60 sublinhado):

’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTC ACTTAC AAATT3’ (SEQ ID NO: 15)

Conjunto de iniciador para amplificação do gene UGT76G1

CACC-NdeI-SrUGT76Gl-Fw (Ndel-sítio de reconhecimento sublinhado):

5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’ (SEQ ID NO: 16)

BamHI-SrUGT76Gl-Rv (BamHI-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’ (SEQ ID NO: 17) [00138] cDNA de folha de estévia foi obtido extraindo RNA total das folhas de estévia usando RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN), e submetendo 0,5 pg delas a reação de transcrição reversa (RT) usando oligonucleotídeo iniciador Random Oligo-dT.

[00139] A solução da reação de PCR (50 pL) teve a composição a seguir: 1 pL de cDNA derivado de folha de estévia, 1 x KOD mais tampão (TOYOBO), dNTPs 0,2 mM, 0,4 pmol/pL de cada oligonucleotídeo iniciador, MgSO₄ 1 mM e KOD resistente a calor 1U mais polimerase. Reação de PCR consistiu de reação a 95°C por 5 minutos, seguido por amplificação por um total de 30 ciclos de reação a 94°C em 0,5 minutos, 50°C em 0,5 minutos e 68°C por 2 minutos. Cada produto de PCR foi submetido a eletroforese com 0,8% de gel de agarose e manchamento com brometo de etídio, pelo qual uma banda de amplificação de praticamente 1,4 kb de tamanho foi obtida como presumido de cada DNA do molde.

[00140] Este produto de PCR foi subclonado no vetor pENTR-TOPO Directional (Invitrogen) de acordo com um método recomendado pelo fabricante. Modelo de Sequenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems) foi

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51/60 usado para sequenciar por um processo de caminhada do oligonucleotídeo iniciador com um oligonucleotídeo iniciador sintetizado, por meio disso confirmando que todos os genes de interesse UGT, a saber, UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 e UGT76G1 foram clonados.

Construção de vetor de expressão de levedura

Os conjuntos de oligonucleotídeo iniciador a seguir foram projetados para integrar esses genes UGT e UDP derivado de Arabidopsis thaliana-gene de ramnose sintase AtRHM2 (J Biol Chem 2007, Oka et. al) em um vetor de expressão de levedura.

conjunto SrUGT85C2

Bgl2-UGT85C2-F (BglII-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3 ’ (SEQ ID NO: 18)

Sal-UGT85C2-R (Sall-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3 ’ (SEQ ID NO: 19) conjunto SrUGT91D2

NotI-UGT91DIL3-F (NotI-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ (SEQ ID NO:20)

Pac-UGT91D1L3-R (Pacl-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ (SEQ ID NO:21)

SrUGT74Gl set

Não-UGT74G1-F (NotI-sítio de reconhecimento sublinhado):

’ - AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3 ’ (SEQ ID NO:22)

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52/60

Pac-UGT74G1-R (Pacl-sítio de reconhecimento sublinhado):

’ -CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3 ’ (SEQ ID NO:23) conjunto SrUGT76Gl

Bam-UGT76G1-F (BamHI-sítio de reconhecimento sublinhado):

’ -AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3 ’ (SEQ ID NO:24)

Sal-UGT76G1-R (Sall-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTA

A-3’ (SEQ ID NO:25)

Conjunto AtRHM2

Bam-AtRHM2-F (BamHI-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3 ’ (SEQ ID NO:26)

Xho-AtRHM2-R (Xhol-sítio de reconhecimento sublinhado):

’-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3’ (SEQ ID NO:27) [00141] As combinações de moldes e oligonucleotídeos iniciadores, a saber, molde UGT85C2 e conjunto SrUGT85C2, molde UGT91D2 e conjunto SrUGT91D2, molde UGT74G1 e SrUGT74Gl set, molde UGT76G1 e connjunto SrUGT76Gl, e molde AtAHM2 e conjunto AtAHM2, foram usados para amplificação de PCR usando KOD DNA polimerase resistente a calor (TOYOBO) e introdução dos sítios enzima de restrição em ambas as extremidades de cada ORF. O fragmento de DNA resultante foi subclonado usando kit de clonagem de PCR Zero Blunt-TOPO (Invitrogen), e sequenciado com Modelo de Sequenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems) por um processo de caminhada do oligonucleotídeo iniciador

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53/60 com um oligonucleotídeo iniciador sintetizado para confirmar que cada qual dos genes UGT de interesse foi clonado.

[00142] A fim de expressar os genes supradescritos em leveduras usando sistema de expressão de levedura pESC (Stratagene), os seguintes vetores de expressão foram construídos.

(1) Construção de plasmídeo pESC-URA-UGT56

UGT85C2 foi clivado com enzimas de restrição BglII e Sail, e ligado ao vetor pESC-URA (Stratagene) que foi clivado com enzimas de restrição BamHI e Sail para dar plasmídeo pESC-URA-UGT-5. Este plasmídeo pESC-URA-UGT-5 foi clivado com enzimas de restrição Notl e PacI enquanto UGT91D2 foi também clivado com enzimas de restrição Notl e PacI. Os resultantes foram ligados para dar pESC-URA-UGT56.

(2) Construção de plasmídeo pESC-HIS-UGT78

UGT76G1 foi clivado com enzimas de restrição BamHI e Sail, e ligado ao vetor pESC-HIS (Stratagene) que foi clivado com as mesmas enzimas de restrição para dar plasmídeo pESC-HIS-UGT-8. Este plasmídeo pESC-HIS-UGT-8 foi clivado com enzimas de restrição Notl e PacI enquanto UGT74G1 foi também clivado com Notl e PacI. Os resultantes foram ligados para dar pESC-HIS-UGT78.

(3) Construção de plasmídeo pESC-TRP-AtRHM2

AtAHM2 foi clivado com enzimas de restrição BamHI e Xhol enquanto o vetor pESC-TRP (Stratagene) foi clivado com as mesmas enzimas de restrição. Os resultantes foram ligados para dar plasmídeo pESC-TRPAtAHM2.

[00143] Transformação de levedura

Plasmídeos mostrados na Tabela 2 foram introduzidos em cepas YPH499 de Saccharomyces cerevisiae (ura3-52 ^2-801^^^62101 ochre ΐψΐ_Δ63 his3-A200 Ieu2-Al a) como um hospedeiro por técnica de acetato de lítio. Como cepas transformada, aquelas que sobreviveram em um

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54/60 meio ágar SC-Trp-Ura-His (6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose, 1,3 g de mistura de pó de aminoácido -Trp-UraHis e 20 g de ágar Bacto per 1L) foram selecionados.

[Tabela 2]

Tabela 2

Cepas transformadas	Plasmídeos introduzidos	Genes introduzidos
A-5678	pESC-URA-UGT-56 pESC-HIS-UGT-78 pESC-TRP-AtAHM2	SrUGT85C2, SrUGT91D2 SrUGT74Gl, SrUGT76Gl AtAHM2

[00144] Aqui, a mistura de pó de aminoácido-Trp-Ura-His foi preparada misturando sulfato de adenina (2,5 g), cloridrato de L-arginina (1,2 g), ácido L-aspártico (6,0 g), ácido L-glutâmico (6,0 g), L-leucina (3,6 g), Llisina (1,8 g), L-metionina (1,2 g), L-fenilalanina (3,0 g), L-serina (22,5 g), Ltreonina (12 g), L-tirosina (1,8 g) e L-valina (9,0 g).

[00145] Indução e análise de expressão de transgene

A cepa transformada resultante foi cultivada como a seguir.

Primeiramente, para cultura preliminar, cada qual cepa transformada foi semeada em 10 mL de um His meio líquido SC-Trp-Ura(meio ágar SC-Trp-Ura-His sem ágar Bacto) e agitação cultivada a 30°C por um dia. Subsequentemente, para cultura principal, 1 mL da solução de cultura preliminar foi semeada em 10 mL de meio líquido SG-Trp-Ura-His (6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 g de galactose, e 1,3 g de mistura-Trp-Ura-His de pó de aminoácido por 1L) e agitação cultivada a 30°C por dois dias.

[00146] A fim de confirmar se o gene introduzido foi ou não expresso na cepa transformada, células foram colhidas da solução da cultura para purificar RNA total com RNeasy Mini Kit.

[00147] Com 1 pg de RNA total, cDNA foi sintetizado usando transcriptase reversa SuperScript II (Thermo Fischer Scientific) e hexâmero aleatório como um oligonucleotídeo iniciador.

[00148] A fim de confirmar expressão do transgene, os

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55/60 oligonucleotídeos iniciadores seguintes foram preparados.

Para confirmar a expressão de UGT85C2

UGT85C2-rl:

5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ (SEQ ID NO:28) Para confirmar expressão de UGT91D2

UGT91DlL3-rl:

5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ (SEQ ID NO:29) Para confirmar expressão de UGT74G1

UGT74Gl-rl: 5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ (SEQ ID

NO:30)

Para confirmar expressão de UGT76G1

UGT76Gl-rl:

5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ (SEQ ID NO:31) Para confirmar expressão de AtAHM2

AtAHM2-rl

5’-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3’ (SEQ ID

NO:32)região GALlOp (região de promotor)

PGAL10-f3:

5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ (SEQ ID

NO:33) região GALlp (região promotora)

PGALl-f3:

’ -CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3 ’ (SEQ ID NO:34) [00149] Expressão de cada transgene foi confirmada realizando PCR usando ExTaq (Taraka Bio) com a combinação a seguir de oligonucleotídeos iniciadores e o cDNA previamente sintetizado como um molde e submetendo o produto resultante a eletroforese em gel de agarose.

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56/60

UGT85C2: UGT85C2-rl (SEQ ID NO:28) e PGAL1-Í3 (SEQ ID NO:34)

UGT91D2 ou UGT91D2L3: UGT91DlL3-rl (SEQ ID NO:29) e PGAL10-Í3 (SEQ ID NO:33)

UGT74G1: UGT74Gl-rl (SEQ ID NO:30) e PGAL1-Í3 (SEQ ID NO:34)

UGT76G1: UGT76Gl-rl (SEQ ID NO:31) e PGAL10-Í3 (SEQ ID NO:33)

AtAHM2: AtAHM2-rl (SEQ ID NO:32) e PGAL10-Í3 (SEQ ID NO:33)

Dessa maneira, expressão do transgene na cepa transformada foi confirmada.

[00150] Produção de glicosídeo de esteviol inovador

Cultura foi realizada nas mesmas condições como descrito anteriormente, exceto que 0,5 gg ou 2 gg de esteviol (ChromaDex Inc.) foram adicionados ao meio líquido para a cultura principal por 1 mL do meio. Após cultura, a solução da cultura foi separada em sobrenadante e células por centrifugação. O sobrenadante da cultura foi lavado com acetonitrila, então submetido a uma coluna Sep-Pak Cl8, equilibrada com água lavada com 20% de acetonitrila, eluído com 80% de acetonitrila, seco para solidificar, e então dissolvido em uma pequena quantidade de 80% de acetonitrila para preparar uma amostra de glicosídeo. Essa amostra de glicosídeo foi submetida à análise a seguir.

[00151] Análise por LC-MS

Uma análise por LC-MS foi realizada como descrito no exemplo em “Isolamento de glicosídeo de esteviol inovador”.

[00152] O resultado é mostrado na Figura 7. Geração do glicosídeo de esteviol inovador em cepas A-5678 foi confirmada. Este resultado corresponde àquele para o glicosídeo de esteviol resultante da síntese química

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57/60 supradescrita.

[00153] Avaliação de nível de doçura de glicosídeo de esteviol inovador

A fim de avaliar o nível de doçura do glicosídeo de esteviol inovador, amostras foram preparadas adicionando sacarose a água pura para dar Brix de 0,5 a 3 em incrementos de 0,5. Uma amostra foi preparada adicionando o glicosídeo de esteviol inovador q água pura q 415 ppm.

[00154] Avaliação foi conduzida pela seleção da amostra adicionada com sacarose tendo intensidade de doçura equivalente à da amostra adicionada com o glicosídeo de esteviol inovador, em que avaliação sensorial foi conduzida por palestrantes treinados em atributos sensoriais de adoçantes (5 membros). Em decorrência disso, observou-se que a amostra preparada adicionando o glicosídeo inovador tem doçura equivalente à da amostra adicionada com sacarose com Brix de 1. Portanto, observou-se que o glicosídeo de esteviol inovador da invenção tem um nível de doçura de 24 com relação a sacarose.

[00155] Avaliação sensorial de glicosídeo de esteviol inovador

A fim de avaliar a qualidade do gosto de vários glicosídeos de esteviol, Reb.A e o glicosídeo de esteviol inovador foram adicionados a água pura em quantidades indicadas na Figura 8 para preparar amostras de bebida. Todas as amostras de bebida foram ajustadas para ter Brix final de 2 em termos de sacarose, desde que os níveis de doçura fossem RebA: 300 e glicosídeo inovador: 24.

[00156] As amostras de bebida resultantes foram submetidas a avaliação sensorial para classificar atributos, a saber, fixação da doçura, amargor e sabor remanescente de doçura prolongado. Palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (5 membros) avaliaram com base nos seguintes critérios de avaliação. Muito fraco (-3), fraco (-2), ligeiramente fraco (-1), normal (0), ligeiramente forte (+1), forte (+2) e muito forte (+3).

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58/60 [00157] Em decorrência da avaliação sensorial, observou-se que ο glicosídeo de esteviol inovador tem amargor igual e menor sabor remanescente de doçura prolongado comparado ao adoçante Reb.A convencional.

[00158] Avaliação de agente de controle de sabor contendo glicosídeo de esteviol inovador para melhorar sabor remanescente prolongado (1) Medição de nível de doçura de adoçante alvejado para melhoria de sabor remanescente prolongado

Antes da avaliação do agente de controle de sabor, o nível de doçura do adoçante alvejado para melhoria de sabor remanescente prolongado foi medido. Reb.A (pureza 100%) e Reb.D (pureza 97%) foram usados como os adoçantes. Reb.A e Reb.D foram dissolvidos em água em quantidades indicadas na tabela a seguir para preparar soluções aquosas. No entanto, soluções aquosas padrões tendo Brix de 5-7 foram preparadas usando sacarose (açúcar), para a qual palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (6 membros) avaliaram qual solução aquosa padrão teve a doçura correspondente à da solução aquosa de Reb.A e da solução aquosa Reb.D. Os resultados são mostrados na tabela a seguir.

[Tabela 3]

Tabela 3

	Solução Reb. A aquosa	Solução Reb. D aquosa
Concentração de adoçante em solução aquosa	23,3 mg/100 mL	28 mg/100 mL
Brix de solução aquosa padrão correspondente (valor de avaliação médio por 5 palestrantes)	5,53	5,96
Número de vezes a doçura	237	213

Pelos resultados anteriores, avaliações nos testes seguintes foram conduzidas desde que a quantidade de vezes a doçura de Reb.A fosse 237 vezes e a quantidade de vezes a doçura de Reb.D foi 213 vezes. Aqui, a quantidade de vezes a doçura do glicosídeo de esteviol inovador usado para avaliação foi 24 vezes como descrito anteriormente.

[00159] (2) Avaliação do efeito de melhorar sabor remanescente

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59/60 prolongado de Reb.A

Soluções aquosas de três de níveis com Brix de 5, 7 e 11 foram usadas para avaliar o efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar sabor remanescente prolongado de Reb.A. Primeiramente, soluções aquosas de nível três com Brix de 5, 7 e 11 foram geradas, desde que o nível de doçura de Reb.A fosse 237 vezes. As quantidades adicionadas do agente de controle de sabor produzido do glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção foram 1, 3,5, 5 e 10% em massa em proporção com base na massa de Reb.A adicionada. Uma amostra de controle (Cont) foi adicionada com Reb.A apenas, e não foi adicionada com o agente de controle de sabor da presente invenção. Palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (7 membros) conduziram uma avaliação numérica na qual a máxima melhoria de sabor remanescente prolongado foi definida em 6 pontos, enquanto Cont foi definida em 3 pontos. Quanto mais o sabor remanescente prolongado foi melhorado, tanto maior foi o ponto. Os pontos de avaliação médios são mostrados nos gráficos na Figura 9.

[00160] (3) Avaliação de efeito de melhorar sabor remanescente prolongado de Reb.D [00161] Soluções aquosas de nível três com Brix de 5, 7 e 11 foram usadas para avaliar o efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar sabor remanescente prolongado de Reb.D. Primeiramente, soluções aquosas de nível três com Brix de 5, 7 e 11 foram geradas, desde que o nível de doçura de Reb.D fosse 213 vezes. As quantidades adicionadas do agente de controle de sabor feitas do glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção foram 1, 3,5, 5 e 10% em massa em proporção com base na massa de Reb.D adicionado. Uma amostra de controle (Cont) foi adicionada com Reb.D apenas, e não foi adicionada com o agente de controle de sabor da presente invenção. Palestrantes treinados a respeito de

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60/60 atributos sensoriais de adoçantes (7 membros) conduziram uma avaliação numérica na qual a máxima melhoria de sabor remanescente prolongado foi definida a 6 pontos enquanto Cont foi definida em 3 pontos. Quanto mais o sabor remanescente prolongado foi melhorado, tanto maior foi o ponto. Os pontos de avaliação médios são mostrados nos gráficos na Figura 10.

[0145] Avaliação de agente de controle de sabor contendo glicosídeo de esteviol inovador para intensificar a doçura

Soluções aquosas de dois níveis com Brix de 5 e 7 foram usadas para avaliar o efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para intensificar a doçura com relação a açúcar (sacarose). Primeiramente, soluções aquosas de dois níveis com Brix de 5 e 7 foram geradas usando açúcar. As quantidades adicionadas do agente de controle de sabor produzidas do glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção foram 0,10, 0,44 e 0,80% em massa em proporção em termos da quantidade do açúcar adicionada para Brix de 5, e 0,10, 0,44 e 0,57% em massa em proporção para Brix de 7. Palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (7 membros) avaliaram com base na taxa da intensidade de doçura. Os resultados são mostrados em gráficos na Figura 11. Os eixos geométricos verticais (intensidade de doçura) dos gráficos representam as taxas de intensidade de doçura realmente sentidas pelos palestrantes com relação ao nível total de doçura do açúcar e o agente de controle de sabor (calculado desde que o nível de doçura do agente de controle de sabor tivesse uma quantidade de vezes a doçura de 24). Para todas as amostras, uma intensificação de efeito de doçura de cerca 2-7% foi observada.

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composto, caracterizado pelo fato de que é como representado pela Fórmula (1):

   

   C I ) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, caracterizado pelo fato de que o composto ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo é um produto derivado de planta, um produto quimicamente sintetizado ou um produto bios sintético.
3. 3. Composição de adoçante, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.
4. 4. Composição de adoçante de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais tipos de glicosídeo de esteviol selecionado do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.

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5. 5. Alimento ou bebida, caracterizado pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.
6. 6. Alimento ou bebida de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é uma bebida.
7. 7. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 1, ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.
8. 8. Extrato, caracterizado pelo fato de que é da planta como definido na reivindicação 7.
9. 9. Alimento ou bebida, caracterizado pelo fato de que compreende a planta como definido na reivindicação 7 ou o extrato da planta como definido na reivindicação 8.
10. 10. Alimento ou bebida de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é uma bebida.
11. 11. Método para produzir o composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    (A) sintetizar um composto representado pela Fórmula (3) a seguir:

    PGO

    PG·

    

    (em que, PGs cada qual independentemente representam um grupo protetor)

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    3/6 de rebaudiosídeo C representado pela Fórmula (2) a seguir:

    

    (B) sintetizar um composto representado pela Fórmula (4) a seguir:

    

    ( 4) (em que, PGs cada qual independentemente representam um grupo protetor) de um derivado de glicopiranosídeo.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de permitir a reação entre o composto representado pela Fórmula (3) anterior e o composto representado pela Fórmula (4) anterior na presença de um reagente de fosfina e um composto azo para obter um composto representado pela Fórmula (5) a seguir:

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    (em que, PGs cada qual independentemente representam um grupo protetor).
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o rendimento da etapa de obtenção do composto representado pela Fórmula (5) acima é 40% ou mais.
14. 14. Uso do composto como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, caracterizado pelo fato de que é como um adoçante.
15. 15. Método para produzir o composto como definido na reivindicação 1, o método caracterizado pelo fato de que é pelo uso de um transformante não humano que foi introduzido com pelo menos um dos polinucleotídeos (a) a (g) a seguir:

    (a) um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:1, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 e que tem uma atividade de adicionar glicose ao grupo hidroxila em C-13 do glicosídeo de esteviol;

    (b) um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3, um polinucleotídeo contendo uma sequência de

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    5/6 nucleotídeos tendo 90% ou mais de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 e que tem uma atividade de adicionar glicose ao ácido carboxílico em C-19 do glicosídeo de esteviol;

    (c) um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:5, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:5, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adicionar ramnose à glicose afixada a C-13 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>2;

    (d) um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:7, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:7, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adicionar glicose a C-3 da glicose em C-13 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>3;

    (e) um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:5, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:5, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adicionar glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>2;

    (f) um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:7, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais de identidade com a sequência de

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    6/6 nucleotídeos de SEQ ID NO:7, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adicionar glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1—>3; e (g) um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:9, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais de identidade com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:9, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e que tem uma atividade de gerar UDP-ramnose a partir da UDP-glicose.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o transformante não humano é uma levedura.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o transformante não humano é cultivado em um meio contendo esteviol.
18. 18. Agente de controle do sabor, caracterizado pelo fato de que compreende o composto, ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo como definido na reivindicação 1.