KR101527237B1 - 용매/역용매 결정화를 이용한 정제된 레바우디오사이드 ａ 조성물의 제조 방법 - Google Patents

용매/역용매 결정화를 이용한 정제된 레바우디오사이드 ａ 조성물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 스테비아 레바우디아나의 글리코사이드를 포함하는 혼합물로부터 레바우디오사이드 A를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 레바우디오사이드 A 농도가 전형적으로 상당히 낮은 미정제 스테비아 출발 조성물로부터 고순도의 레바우디오사이드 A를 제조하는 데 유용하다. 고순도의 레바우디오사이드 A 조성물은 먹거나 씹을 수 있는 조성물, 예컨대 음식, 음료수, 약물, 캔디, 추잉껌 등의 비칼로리성 감미제로서 유용하다.

Description

용매/역용매 결정화를 이용한 정제된 레바우디오사이드 Ａ 조성물의 제조 방법{METHOD OF PRODUCING PURIFIED REBAUDIOSIDE A COMPOSITIONS USING SOLVENT/ANTISOLVENT CRYSTALLIZATION}
관련 출원의 교차 참조
본 발명은 용매/역용매 결정화를 이용한 정제된 레바우디오사이드 A 조성물의 제조 방법(METHOD OF PRODUCING PURIFIED REBAUDIOSIDE A COMPOSITIONS USING SOLVENT/ANTISOLVENT CRYSTALLIZATION)의 발명의 명칭으로 2007년 1월 22일자로 출원된 미국 특허 가출원 60/881,798호, 및 용매/역용매 결정화를 이용한 정제된 레바우디오사이드 A 조성물의 제조 방법(METHOD OF PRODUCING PURIFIED REBAUDIOSIDE A COMPOSITIONS USING SOLVENT/ANTISOLVENT CRYSTALLIZATION)의 발명의 명칭으로 2007년 12월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 61/008,163호로부터 우선권을 주장하며, 상기 특허 가출원의 전체는 본 원에서 참조 인용된다.
기술 분야
본 발명은 용매/역용매 결정화를 이용한 식물 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)의 미정제 추출물로부터 레바우디오사이드 A를 정제하는 것에 관한 것이다.
스테비아 레바우디아나('스테비아') 종은 비칼로리 감미제로서 잠재성을 갖는 스테비아의 특정한 자연 발생적 스위트 글리코사이드의 정제와 관련된 상당한 연구 및 개발의 주제였다. 스테비아로부터 추출될 수 있는 스위트 글리코사이드는 6개의 레바우디오사이드(즉, 레바우디오사이드 A∼F), 스테비오사이드(야생형 스테비아로부터의 추출물 중 주요 글리코사이드), 둘코사이드 및 스테레빈을 포함한다.
레바우디오사이드 A는 수크로스의 감미도(sweetness)보다 대략 250∼450배인, 스테비아의 글리코사이드의 최대로 감미로운 맛이다. 상기 글리코사이드 중, 레바우디오사이드 A는 이의 선호되는 단맛 프로파일, 규제 승인, 고객 허용성 및 최소의 쓴 뒷맛으로 인해 비칼로리성 감미제로서 사용되는 데 가장 바람직하다는 것이 일반적으로 동의된다.
스테비아 추출물을 함유하는 미정제 레바우디오사이드 A로부터 레바우디오사이드 A를 정제하는 것에 대해서 다양한 방법이 보고되어 왔다.
일본 공개 56121454호에는 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A를 결정화에 의해 높은 순도 및 수율로 분리하는 방법이 보고되어 있다. 상기 방법에서, 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A의 혼합물은 통상의 방법에 의해 스테비아 레바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎 및 줄기로부터 추출된다. 상기 추출물은 에탄올의 ≥ 70% 수용액에 용해되고, 레바우디오사이드 A는 상기 용액으로부터 선택적으로 결정화된다.
일본 특허 63173531호에는 스테비아 레바우디아나 식물로부터 스위트 글리코사이드를 추출하는 방법이 기술되어 있다. 상기 방법의 제1 방법은 스테비아 레바 우디아나 식물로부터 스위트 글리코사이드의 액체 용액을 추출하는 것이다. 제2로, 스위트 글리코사이드의 액체 용액을 비극성 다공질 수지에 통과시키고, 수용성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올에 의해 용리시킨다. 제3으로, 상기 용리된 용액을 농축시키고, 건조시켜 분말 물질을 산출한다. 상기 절차는 스위트 글리코사이드의 혼합물을 단리시키지만, 레바우디오사이드 A와 같은 단일의 순수한 스위트 글리코사이드를 단리시키지 않는다.
U.S. 특허 출원 공개 2006/0083838호(Jackson 등)에는 시판되는 스테비아 레바우디아나 출발 물질로부터 레바우디오사이드 A를 단리 및 정제하는 방법이 보고되어 있다. 상기 방법은 (1) 선택된 EtOH 용매를 제제화시키는 EtOH 제제화 단계, (2) 스테비아 출발 물질을 사용하는 제1 환류 단계 및 환류된 혼합물 또는 교반된 세정 혼합물로부터 단리된 잔류물을 이용하는 추가의 임의 환류 단계, (3) 임의의 1 이상의 교반 세정 단계, 및 (4) 에탄올 퍼지 및 건조 단계를 포함한다. 저품질의 스테비아 출발 물질을 사용하는 실시양태에서, 제2 환류 단계는 전형적으로 교반 세정 단계 이전에 추가하여 레바우디오사이드 A 최종 생성물의 순도를 최대화한다. 상기 보고된 방법에서, EtOH 제제화 단계를 실시하여 상기 환류 단계(들)에서 사용하기 위한 소정의 환류 용매를 제제화한다. 전형적으로, 환류 용매는 약 5 부피% ∼ 15 부피%의 물을 갖는, 에탄올과 물의 혼합물이다. 상기 방법은 전형적으로 약 89∼90℃의 온도에서 약 1 시간 동안 실시되는 1 이상의 에너지 집약적 환류 단계를 포함한다. 상기 방법은 100% 순수한 수용성 레바우디오사이드 A를 생성하는 것으로 알려져 있다.
U.S. 특허 5,962,678호(Payzant 등)에는 스테비아 레바우디아나 식물로부터 선택된 스위트 글리코사이드를 추출하는 방법이 보고되어 있다. 상기 보고된 방법에서, 스위트 글리코사이드는 스테비아 식물로부터 추출되고 다단계 공정에서 가공되어 개별 성분을 산출한다. 제1, 스테비아 식물을 처리하여 혼합된 스위트 글리코사이드를 함유하는 액체 수용액을 추출한다. 일련의 이온 교환 수지를 이용하여, 불순물이 섞인 비스위트 글리코사이드를 혼합된 스위트 글리코사이드로부터 분리하고, 이를 건조시킨다. 이어서, 여전히 불순물을 함유하는 상기 건조된 혼합 스위트 글리코사이드는 수용성 유기 용매, 예컨대 무수 메탄올에 용해시켜 용액을 형성한다. 상기 용액을 환류시키고, 냉각시켜 제1 스위트 글리코사이드 성분을 침전시킨다. 전형적으로 스테비오사이드인 상기 제1 스위트 글리코사이드 성분을 여과에 의해 회수할 수 있으며, 제2 성분에 대해 기술된 방법에 의해 추가로 정제할 수 있다.
제1 침전된 스위트 글리코사이드의 결정화로부터의 여과물을 추가로 처리하여 상기 여과물을 가열에 의해 농축시킴으로써 제2 스위트 글리코사이드 성분을 수득할 수 있다. 상기 용액의 냉각 시, 제2 스위트 글리코사이드 성분이 침전하고, 이는 회수될 수 있다. 상기 제2 스위트 글리코사이드 성분은 전형적으로 레바우디오사이드 A이다. 이를, 소량의 물을 임의로 함유할 수 있는 수용성 유기 용매, 예컨대 메탄올에 용해시킴으로써 추가로 정제할 수 있다. 상기 용액을 가열하고, 환류시키고, 최종적으로 냉각시켜 제2 스위트 글리코사이드 성분을 고순도로 침전시킨다. 상기 침전물은 여과에 의해 회수할 수 있다. 상기 정제 공정은 소정 순도의 최종 결정화 고체가 수득될 때까지 반복할 수 있다. 상기 방법은 레바우디오사이드 A 순도 수준이 90% 이상 또는 95% 이상임을 나타내다.
U.S. 특허 4,361,697호(Dobberstein 등)에는 스테비아 레바우디아나 식물로부터의 디테르펜 글리코사이드를 회수하는 방법이 보고되어 있다. 상기 방법은 순차적으로 식물 물질을 중간 극성의 제1 용매에 의해 추출하여 글리코사이드의 액체 크로마토그래피 분리를 방해하는 경향이 있는 식물 물질을 추출한 후, 높은 극성의 제2 용매에 의해 추출하여 글리코사이드를 추출하며, 무기 지지체에 규소 원자를 통해 공유 결합된 산소 함유 유기 고정상의 팩킹을 갖는 액체 크로마토그래피 칼럼에 상기 추출된 글리코사이드를 투입하여 이를 크로마토그래피에 의해 분리하는 단계들을 포함한다. 상기 글리코사이드는 제1 용매의 극성보다는 높지만 제2 용매의 극성보다는 낮은 극성의 용매에 의해 용리시킨다.
U.S. 특허 4,892,938호 (Giovanetto)에는 추출 및 정제 의해 스테비아 레바우디아나 베르토니의 건조 식물 물질로부터 스테비오사이드를 회수하는 방법이 보고되어 있다. 추출물은 교반과 함께 실온 내지 약 65℃의 물에서 처리한 후, 여과 및 원심 분리에 의해 수득한다. 상기 추출물은 수산화칼슘에 의해 처리하고, 이때 여과 또는 원심 분리에 의해 침전물이 수득된다. 상기 침전물을 강산 산성의 이온 교환 수지에 의해 처리한 후, 약한 염기성의 이온 교환 수지에 의해 처리하고 여과 및 건조시킨다.
U.S. 특허 4,082,858호(DuBois)에는 스테비아 레바우디아나 식물의 잎으로부터 레바우디오사이드 A를 회수하는 방법이 보고되어 있다. 최종 정제는 액체 크로 마토그래피 후, 물 및 1∼3개의 탄소 원자를 갖는 알칸올, 바람직하게는 메탄올에 의한 초기 추출에 의해 실시하였다. 초기 용매로서 물을 사용할 수 있고, 상기 단계에서 이의 바람직하 용매는 1∼4개의 탄소 원자를 갖는 액체 할로알칸이라는 것이 또한 개시되어 있다. 바람직한 제2 용매는 1∼3개의 탄소 원자를 갖는 알칸올인 반면에, 바람직한 제3 용매는 1∼4개의 탄소 원자를 갖는 알칸올 및 임의의 소량의 물이다.
U.S. 특허 출원 2006/0134292호(Abelyan 등)에는 스테비아 레바우디아나 식물 물질로부터 스위트 글리코사이드를 회수하는 방법이 보고되어 있다. 건조 및 분말된 잎을 펙티나제, 셀룰라제 및 알파-아밀라제의 존재 하에 물로 처리한다. 이러한 효소의 사용은 추출 속도를 상당히 증가시키고 정제의 다음 단계를 촉진시키는 것으로 보고되어 있다. 생성된 추출물을 수산화칼슘에 의한 처리 및 한외여과를 이용하여 정제한다. 투과물을 벤토나이트로 팩킹된 칼럼에 통과시키고 진공 하의 시럽 상태로 농축한다. 에탄올에 의한 처리로 상기 혼합물로부터 실질적으로 순수한 레바우디오사이드 A를 분리할 수 있다. 고순도의 상기 레바우디오사이드 A는 상기 결정을 88∼95%의 에탄올로 세정한 후에 수득된다.
U.S. 특허 5,972,120호(Kutowy 등)에는 칼럼 추출 후, 여과에 의한 정제에 의해 스테비아 레바우디아나 베르토니로부터 스위트 화합물을 추출하는 방법이 보고되어 있다. 상기 추출은 0∼25℃ 범위의 온도에 있다. 바람직하게는, 미세여과의 전처리 단계를 적용하여 추출물을 정화한다. 정제는 한외여과 후, 나노여과에 의한다. 상기 여과 조건은 스위트 화합물의 회수를 최적화하도록 제어된다.
다른 기법으로는 아지노모토 컴파니, 인코포레이티드(Ajinomoto Company, Inc)로 할당된 일본 공개 56121454호; 56121455호; 52062300호; 및 56121453호, 및 하일린 스테비아 레바우디움 수거(Hailin Stevia Rebaudium Sugar)로 할당된 중국 공개 1243835호에서 보고된 기법을 들 수 있다.
스테비아 레바우디아나('스테비아')로부터 레바우디오사이드 A를 정제하는 가능한 기법 및 방법에서의 개선이 요망되고 있다. 특히 가열 또는 냉각 또는 에너지 집약적 환류에 대한 필요성 없이 실온에서 실시할 수 있는 방법이 요망된다.
발명의 개요
본 발명은 식물 스테비아 레바우디아나('스테비아')의 글리코사이드를 포함하는 혼합물로부터 레바우디오사이드 A를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 레바우디오사이드 A 농도가 전형적으로 상당히 낮은 미정제 스테비아 출발 조성물로부터 고순도의 레바우디오사이드 A를 제조하는 데 유용하다. 고순도의 레바우디오사이드 A 조성물은 먹거나 씹을 수 있는 조성물, 예컨대 음식, 음료수, 약물, 캔디, 추잉껌 등의 비칼로리성 감미제로서 유용하다.
이롭게는, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 에너지 집약적 환류, 가열 및/또는 냉각 단계에 대한 필요 없이 실온 또는 거의 실온에서 완전히 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 고순도의 레바우디오사이드 A 조성물을 제공하기 위해 크로마토그래피 분리를 필요로 하지 않는다. 그러나, 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 레바우디오사이드 A 조성물을 정제하여 소정 수준의 순도를 달성하기 위해 (i) 가열, (ⅱ) 냉각, 및 (ⅲ) 크로마토그래피 칼럼 분리 중 1 이상을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 방법은
(a) 레바우디오사이드 A; 및
레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 F, 스테비오사이드 및 둘코사이드 중 1 이상
을 포함하는 스테비아 출발 조성물을 제공하는 단계,
(b) 상기 스테비아 출발 조성물을 (i) 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜)과 물의 혼합물, 또는 (ⅱ) 저급 카르복실산(예를 들어, 아세트산)과 물의 혼합물을 포함하는 용매에 용해시켜 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 글리코사이드 용액으로부터 상기 레바우디오사이드 A의 적어도 일부를 스테비아 출발 성분보다 높은 수준의 순도를 갖는 정제된 레바우디오사이드 A 조성물의 형태로 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하는 단계
를 포함한다.
많은 실시양태에서, 스테비아 출발 조성물은 약 40 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함한다. 예를 들어, 스테비아 출발 조성물은 약 40 ∼ 약 80 중량%의 레바우디오사이드 A 또는 약 40 ∼ 약 60 중량%의 레바우디오사이드 A를 포함할 수 있다.
스테비아 출발 조성물을 (i) 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜)과 물의 혼합물; 또는 (ⅱ) 저급 카르복실산(예를 들어, 아세트산)과 물의 혼합물을 포함하는 용매 조성물에 용해시켜 글리코사이드 조성물을 형성한다. 유용한 저급 알콜의 예로는 메탄올, 에탄올 및 프로판올(n-프로판올 및 i-프로판올)을 들 수 있다. 많은 실시양태에서, 용매 조성물은 저급 알콜과 물의 혼합물을 포함하고, 여기서 저급 알콜 부분은 용매 조성물의 약 30 ∼ 70 중량% 포함하고, 물 부분은 용매 조성물의 약 30 ∼ 약 70 중량% 포함한다. 예시적 실시양태에서, 용매 조성물은 약 50 중량%의 에탄올 및 50 중량%의 물을 포함한다. 저급 카르복실산(예를 들어, 아세트산)과 물의 용매 조성물을 또한 사용할 수 있다. 용매로서 사용되는 경우, 저급 카르복실산은 전형적으로 약 30 ∼ 약 90 중량% 범위의 양으로 존재하고, 물은 전형적으로 약 10 ∼ 약 70 중량%의 양으로 존재한다. 더욱 전형적으로 저급 카르복실산은 약 50 ∼ 약 90 중량%의 양으로 존재하고, 물은 약 10 ∼ 약 50 중량%의 양으로 존재한다.
용해도 한계 이하의 임의의 양이 사용될 수 있지만, 스테비아 출발 조성물은 상기 용매 조성물에 용해시켜 약 15 ∼ 약 50 중량%의 스테비아 출발 조성물 및 약 50 ∼ 약 85 중량%의 용매 조성물을 포함하는 글리코사이드 용액을 제공하는 것이 전형적이다. 예를 들어, 예시적 글리코사이드 용액은 약 30 중량%의 용해된 스테비아 출발 조성물 및 약 70 중량% 용매 조성물을 포함하며, 여기서 상기 용매 조성물의 약 50%가 에탄올이고, 상기 용매 조성물의 약 50 중량%가 물이다.
스테비아 출발 조성물을 용매 조성물에 용해시킨 후, 유효량의 역용매를 글리코사이드 용액에 첨가하여 레바우디오사이드 A의 결정화를 개시한다. 상기 역용매는 레바우디오사이드 A 농도가 과포화되도록(즉, 이의 용해도 한계 이상이 되도록) 생성된 용액에 레바우디오사이드 A의 평형 용해도를 변경하는 작용을 한다. 레바우디오사이드 A는 이의 평형 용해도 한계 위에 있기 때문에, 레바우디오사이드 A는 정제된 레바우디오사이드 A 결정의 형태로 용매 조성물로부터 결정화한다.
저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜)과 물의 혼합물을 용매로서 사용하는 경우, 역용매는 전형적으로 저급 알콜, 예컨대 C1-C3 알콜을 포함한다. 대표적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올(예를 들어, n-프로판올 및 i-프로판올), 아세톤 및 아세트산에틸을 들 수 있다. 상기 역용매는 상기 용매에 사용되는 동일한 C1-C3 알콜일 수 있거나, 상이한 C1-C3 알콜일 수 있다. 예를 들어, 용매는 에탄올과 물을 포함할 수 있고, 역용매는 메탄올을 포함할 수 있다. 저급 카르복실산 및 물이 용매로서 사용되는 경우, 유용한 역용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올(예컨대, n-프로팔올 및 i-프로파올), 아세톤 및 아세트산에틸을 들 수 있다.
용매 조성물의 질량과 관련하여, 역용매의 질량은 전형적으로 약 0.5:1 ∼ 약 9:1, 더욱 전형적으로는 약 2:1 ∼ 약 3:1 범위에 있다.
역용매는 단일 첨가(즉, 전체 부피의 역용매의 단일 첨가)로 첨가할 수 있거나, 다중 첨가로 첨가할 수 있으며, 각각은 요구되는 전체량의 역용매 분율을 제공한다. 역용매의 낮은 속도의 첨가 또는 다중 소량 첨가는, 상기 역용매를 단일 첨가로 첨가하는 경우보다 고순도의 레바우디오사이드 A 조성물을 제공할 수 있다.
역용매의 첨가 후, 생성된 조성물은 약 실온에서 교반하여 레바우디오사이드 A의 결정화가 발생하도록 하는 것이 전형적이다. 임의로, 상기 용액은 매우 순수한 레바우디오사이드 A를 포함하는 시드 결정을 첨가함으로써 시딩 처리할 수 있다. 전형적으로, 결정화는 역용매의 첨가 후 약 24 시간 내에 발생한다. 일반적인 규칙으로서, 결정화 시간은 레바우디오사이드 A 출발 조성물의 순도가 증가함에 따라 감소한다. 예를 들어, 출발 조성물이 레바우디오사이드 A가 상대적으로 순수한 경우(예를 들어, 80% 레바우디오사이드 A), 결정화는 1 시간 미만이 걸릴 수 있다. 많은 실시양태에서, 결정화는 약 1∼4 시간이 걸린다.
결정화 후, 정제된 레바우디오사이드 A는 여과 또는 원심분리와 같은 공지된 기법을 이용해 회수할 수 있다. 회수 후에, 정제된 레바우디오사이드 A 결정은 저급 알콜, 예를 들어 메탄올 또는 에탄올로 세정하여 추가로 정제할 수 있다.
많은 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 90 중량% 이상의 레바우디오사이드 A, 예를 들어 약 95 중량% 이상의 레바우디오사이드 A, 약 96 중량% 이상, 약 97 중량% 이상 또는 약 98.5 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 정제된 레바우디오사이드 A 조성물을 생성한다. 많은 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 2.5 중량% 이하의 레바우디오사이드 B, 예를 들어 약 2 중량% 이하의 레바우디오사이드 B 또는 약 1 중량% 이하의 레바우디오사이드 B를 포함하는 정제된 레바우디오사이드 A 조성물을 생성한다. 많은 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 1 중량% 이항의 레바우디오사이드 D, 예를 들어 약 0.5 중량% 이하의 레바우디오사이드 D를 포함하는 정제된 레바우디오사이드 A 조성물을 생성한다. 최종 수준의 레바우디오사이드 A, B 및 D는 전형적으로 초기 공급 물질에 존재하는 상기 물질들의 양에 따라 다르게 된다.
또다른 양태에서, 본 발명은 레바우디오사이드 A 및 레바우디오사이드 D를 포함하는 고체를 세정하여 레바우디오사이드 D의 적어도 일부를 상기 고체 조성물로부터 제거하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 레바우디오사이드 A 및 레바우디오사이드 D를 포함하는 고체를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 고체를 C1-C3 알콜에 의해 세정하여 레바우디오사이드 D의 적어도 일부를 상기 고체 조성물로부터 제거하는 단계를 포함한다. 용매의 예로는 C1-C3 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 프로판올을 들 수 있다. 많은 실시양태에서, 메탄올이 레바우디오사이드 D를 감소시키는 데에 바람직하다.
도면의 간단한 설명
도 1은 역용매로서 메탄올을 사용하는 에탄올/물의 용매로부터의 결정화에 의해 생성되는 레바우디오사이드 A 결정에 대한 X 선 회절 패턴이다.
도 2는 역용매로서 메탄올을 이용하는 에탄올/물의 용매로부터의 결정화에 의해 생성되는 레바우디오사이드 A 결정의 광현미경 이미지이다.
발명의 상세한 설명
한 양태에서, 본 발명은 레바우디오사이드 A를 포함하는 조성물의 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 이용하여 먹거나 씹을 수 있는 조성물, 예컨대 음식, 음료수, 약물, 캔디, 추잉검 등의 저칼로리 감미제로서 적합한 고순도의 레바우디오사이드 A 조성물을 제조할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 글리코사이드의 혼합물로부터 레바우디오사이드 A를 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은
(a) 레바우디오사이드 A; 및
레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 F, 스테비오사이드 및 둘코사이드 중 1 이상
을 포함하는 스테비아 출발 조성물을 제공하는 단계,
(b) 상기 글리코사이드 출발 조성물을 (i) 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜)과 물의 혼합물, 또는 (ⅱ) 저급 카르복실산(예를 들어, 아세트산)과 물의 혼합물을 포함하는 용매에 용해시켜 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 글리코사이드 용액으로부터 상기 레바우디오사이드 A의 적어도 일부를 정제된 레바우디오사이드 A 조성물의 형태로 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하는 단계
를 포함한다.
단계 (a):
본 발명의 방법은 레바우디오사이드 A를 포함하는 출발 조성물을 정제하여 고순도의 레바우디오사이드 A 조성물을 형성하는 데 유용하다. 전형적으로, 상기 출발 물질은 공지된 기법, 예컨대 지방성 및/또는 기타 화합물의 추출과 같은 전처리가 임의로 선행되는, 물 또는 용매-물 용액을 이용한 스테비아 잎으로부터의 디테르펜 글리코사이드의 추출을 이용하여 스테비아 레바우디아나 식물로부터 유도한다. 전처리 조작은 정화 및 탈색 단계(예를 들어, 응고제, 흡착제 및/또는 용매 추출을 이용함)을 포함할 수 있고, 임의로 이온 교환에 의한 애쉬(ash) 제거를 포함할 수 있다. 이후, 추가 정제를 선택적 흡착, 용매 처리 또는 배합에 의해 실시할 수 있다. 최종적으로 출발 물질은 결정화에 의한 정제하고 건조시킬 수 있다. 유용한 출발 물질 조성물은 레바우디오사이드 A를 포함하고, 또한 1 이상의 다른 글리코사이드, 예컨대 레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 F, 스테비오사이드 및 둘코사이드를 포함한다.
많은 실시양태에서, 출발 조성물은 약 40 중량% 이상의 레바우디오사이드 A, 예를 들어 약 40 중량% ∼ 약 95 중량%의 레바우디오사이드 A를 포함한다. 스테비오사이드가 또한 출발 조성물에 존재하는 것이 전형적이다. 일부 실시양태에서, 스테비오사이드는 출발 조성물의 약 40 중량% 이하로 존재한다. 출발 조성물 중에 존재할 수 있는 다른 글리코사이드로는, 예를 들어 레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 D 및 레바우디오사이드 F를 들 수 있다. 전형적인 출발 조성물은, 예를 들어 약 8 중량% 이하의 레바우디오사이드 B, 약 10 중량% 이하의 레바우디오사이드 C, 약 2 중량% 이하의 레바우디오사이드 F, 약 1 중량% 이하의 둘코사이드 및 약 4 중량% 이하의 레바우디오사이드 D를 포함한다. 레바우디오사이드 E가 또한 출발 조성물 중에 존재할 수 있다.
이롭게는, 본 발명의 방법을 이용하여 낮은 순도 수준의 레바우디오사이드 A를 갖는 출발 조성물로부터 레바우디오사이드 A를 정제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 이용하여 약 60 중량% 미만의 레바우디오사이드 A, 예를 들어 약 40 중량% ∼ 약 60 중량%의 레바우디오사이드 A를 갖는 출발 조성물로부터 정제된 레바우디오사이드 A를 생성할 수 있다.
단계 (b):
본 발명의 방법에서, 출발 조성물을 용매 조성물에 용해시켜 용액을 형성한다. 전형적으로, 출발 조성물을 용매 조성물에 첨가하고, 상기 용매 조성물을 교반하여 출발 조성물을 용매 조성물에 용해시킨다. 출발 조성물을 시간에 걸쳐 상대적으로 일정하게 상기 용매 조성물에 첨가하거나, 1 이상의 개별 첨가로 첨가할 수 있다. 전형적으로, 출발 조성물을 대략 실온, 예를 들어 약 20 ∼ 약 25℃에서 용매 조성물에 용해시킨다. 상기 용매 조성물을 약간 가열하여 다소 출발 조성물의 용해를 돕는 것이 본 발명의 범위 내에 또한 존재한다. 예를 들어, 용매 조성물을 약 20 ∼ 약 70℃ 범위, 더욱 전형적으로는 약 60 ∼ 약 70℃의 범위의 온도로 가열할 수 있다.
유용한 용매 조성물은 (i) 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜)과 물의 혼합물; 또는 (ⅱ) 저급 카르복실산과 물의 혼합물을 포함한다. 저급 알콜의 예로는 메탄올, 에탄올 및 프로판올(예를 들어, n-프로판올 및 i-프로판올)을 들 수 있다. 2 이상의 알콜과 물의 혼합물을 또한 사용할 수 있다. 많은 실시양태에서, 용매 조성물은 용매 조성물의 총중량을 기준으로 약 20 중량% ∼ 약 80 중량%의 저급 알콜 및 약 20 중량% ∼ 약 80 중량%의 물을 포함한다. 더욱 전형적으로, 용매 조성물은 약 30 중량% ∼ 약 70 중량%의 저급 알콜 및 약 30 중량% ∼ 약 70 중량%의 물을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 용매 조성물은 약 40 중량% ∼ 약 60 중량%의 저급 알콜 및 약 40 중량% ∼ 약 60 중량%의 물, 또는 약 45 중량% ∼ 약 55 중량%의 저급 알콜 및 약 45 중량% ∼ 약 55 중량%의 물을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 출발 조성물은 약 50 중량% 에탄올 및 약 50 중량%의 물을 포함한다.
다른 저급 카르복실산을 또한 사용할 수 있지만 저급 카르복실산의 예로는 아세트산, 포름산 및 프로피온산을 들 수 있다. 용매로서 사용되는 경우, 저급 카르복실산은 전형적으로 약 30 중량% ∼ 약 90 중량% 범위의 양으로 존재하고, 물은 전형적으로 약 10 중량% ∼ 약 70 중량%의 양으로 존재한다. 더욱 전형적으로 저급 카르복실산은 약 50 중량% ∼ 약 90 중량% 범위의 양으로 존재하고, 물은 약 10 중량% ∼ 약 50 중량% 범위의 양으로 존재한다. 예시적 실시양태에서, 용매 조성물은 50 중량%의 아세트산 및 50 중량%의 물이다.
용매 조성물은 레바우디오사이드 A 출발 조성물의 첨가 전에 개별 성분들을 서로 혼합하여 제조하는 것이 전형적이다. 그러나, 레바우디오사이드 A 출발 조성물을 용매 조성물 중 하나의 성분에 용해시킨 후, 제2 성분을 첨가하여 용매 조성물을 메이크업 처리하는 것이 또한 가능하다.
출발 조성물을 용매 조성물에 용해시킬 시, 생성된 글리코사이드 용액은 전형적으로 약 15 중량% ∼ 약 50 중량%의 출발 조성물 중 용해된 고체 및 약 50 중량% ∼ 약 85 중량%의 용매를 포함한다. 일부 실시양태에서, 글리코사이드 용액은 약 30 중량% ∼ 약 50 중량%의 용해된 고체 및 약 50 중량% ∼ 약 70 중량%의 용매를 포함한다.
단계 (c):
글리코사이드 용액의 형성 후, 유효량의 역용매를 글리코사이드 용액에 첨가하여 레바우디오사이드 A의 결정화를 유도한다. 유효량의 역용매 첨가 시, 생성된 글리코사이드 용액(역용매 포함)은 레바우디오사이드 A의 용해도 한계를 초과하여 레바우디오사이드 A가 글리코사이드 용액으로부터 결정화되도록 한다. 글리코사이드 용액에 존재할 수 있는 다른 글리코사이드는 이의 용해도 한계 이하로 존재하기 때문에 레바우디오사이드 A가 상기 용액으로부터 우선적으로 결정화된다.
유용한 역용매는 글리코사이드 용액 중 레바우디오사이드 A의 용해도 한계를 변경하는 데 효과적인 물질을 포함한다. 더욱 구체적으로, 효과적인 역용매는 글리코사이드 용액에 혼화성이고 용액의 유전 상수를 낮춤으로써 물의 용매화능을 감소시킬 수 있다. 전형적으로, 역용매는 수혼화성이고 전형적으로 물보다 덜 극성인 액체이다. 역용매의 대표적인 예로는 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜), 예컨대 메탄올, 에탄올 및 프로판올 (n-프로판올 및 i-프로판올)을 들 수 있다. 또한 아세톤 및 아세트산에틸이 유용하다. 역용매는 용매 조성물에 존재하는 동일한 저급 알콜일 수 있거나, 상이한 저급 알콜일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 역용매를 글리코사이드 조성물에 존재하는 레바우디오사이드 A의 적어도 일부의 결정화를 유도하는 유효량으로 글리코사이드 용액에 첨가한다. 필요한 역용매의 양은, 예를 들어 역용매 조성물의 메이크업, 출발 물질의 조성, 조성물에 존재하는 레바우디오사이드 A의 양, 용액 내 다른 글리코사이드 불순물의 양, 결정화 온도 및 용해 온도를 비롯한 몇몇 인자에 따라 다를 수 있다. 전형적으로, 첨가되는 역용매의 질량 대 글리코사이드 용액 중 용매의 질량은 약 0.5:1 ∼ 약 9:1 범위에 있다. 더욱 전형적으로, 역용매의 질량 대 글리코사이드 용액의 질량은 약 2:1 ∼ 약 3:1 범위에 있다.
레바우디오사이드 A의 결정화는 회분식 결정화 방법 또는 연속 결정화 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 회분식 방법에서, 출발 조성물, 용매 및 역용매는 모두 결정화가 일어나는 단일 용기에 첨가된다. 결정을 수집한 후에 상기 방법을 반복할 수 있다. 연속 결정화에서, 공급 글리코사이드의 혼합물은 용매 용액에 용해된다. 생성된 혼합물은 결정화 용기에 연속으로 펌프 처리된다. 동시에, 역용매는 용매와 용질 혼합물과 혼합될 시의 소정의 최종 역용매 농도를 생성하게 되는 양으로 결정화 용기로 펌프 처리된다. 결정화는 이러한 용기에서 발생하며, 이는 전형적으로 시드 결정의 연속 존재로 인해 회분식 용기에서보다 높은 속도인 것인 전형적이다. 생성물 슬러리를 용매와 역용매 유입물의 합계와 동등한 속도로 상기 용기 밖으로 연속 펌프 처리하여 결정화기 내에 일정한 부피를 유지한다. 생성된 슬러리는 여과되거나 원심분리된 후, 건조되어 최종 생성물을 제공한다. 상기 방법에 사용되는 용매는 증류에 의해 회수될 수 있다. 결정화 종료 시의 용해된 용질을 회수할 수 있고, 공급물로 재순환시키거나 개별적으로 사용할 수 있다.
상기 역용매는 글리코사이드 용액에 단일 첨가(즉, 단일 첨가로 첨가되는 전체량)로 첨가될 수 있거나, 다중 첨가로 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 역용매는 시간에 걸쳐 일정한 첨가 속도로 글리코사이드 용액에 첨가된다. 역용매의 글리코사이드 용액으로의 첨가 속도는 형성되는 레바우디오사이드 A 결정의 순도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 단일 첨가로 역용매를 첨가하여 레바우디오사이드 A가 글리코사이드 용액으로부터 신속히 결정화하도록 할 수 있으며, 이는 역용매가 글리코사이드 용액에 시간에 걸쳐 천천히 또는 다중 소량 첨가로 첨가되는 경우에 형성되게 되는 것보다 순도가 낮은 레바우디오사이드 A 결정을 유도한다.
전형적으로, 역용매는 글리코사이드 용액에, 상기 두 물질이 약 실온, 예를 들어 약 25±5℃로 유지되는 동안 첨가된다. 역용매의 첨가 후에, 생성된 글리코사이드 용액을 온건 내지 적당한 교반과 함께 대략 실온에서 정치시켜 레바우디오사이드 A가 글리코사이드 용액으로부터 결정화하도록 할 수 있다. 전형적으로 레바우디오사이드 A는 역용매 첨가 후에 약 24 시간 내에 결정화한다. 결정화의 속도는 전형적으로 레바우디오사이드 A 출발 물질의 순도가 감소함에 따라 감소한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 글리코사이드 용액을 냉각시켜 글리코사이드 용액으로부터의 레바우디오사이드 A의 결정화를 촉진하는 단계를 추가로 포함한다. 글리코사이드 용액은 역용매 첨가 전에, 역용매 첨가와 동시에, 또는 역용매 첨가 후에 냉각될 수 있다. 상기의 조합을 또한 실행할 수 있다. 글리코사이드 용액을 레바우디오사이드 A의 결정화를 촉진하는 데 유용한 임의의 온도로 냉각시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 글리코사이드 용액을 약 0℃ ∼ 약 -10℃의 온도로 냉각시킬 수 있다. 냉각 속도는 임의의 유용한 속도일 수 있으나, 전형적으로 약 1℃/분 ∼ 약 5℃/분 범위에 있다.
일부 실시양태에서, 용액을 시딩 처리하여 결정화를 촉진시키고 결정화된 레바우디오사이드 A의 순도를 증대시킨다. 시딩 처리는 전형적으로 소량의 고순도 레바우디오사이드 A(예를 들어, 총질량을 기준으로 장입된 시드가 약 0.2 중량% ∼ 약 10 중량%)를 첨가함으로써 실시한다.
결정화 후, 정제된 레바우디오사이드 A는 공지된 기법 및 물질을 사용한 여과에 의해 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 결정은 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜), 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 프로판올(n-프로판올 또는 i-프로판올), 또는 이들의 혼합물을 이용하여 세정한다. 저급 알콜에 의한 세정은 용매에 용해된 임의의 글리코사이드와 함께 잔류 용매를 제거하는 데 효과적일 수 있다. 전형적으로, 습윤 필터 케이크의 액체 부분에 존재하는 글리코사이드는 습윤 필터 케이크의 고체 부분에서보다 레바우디오사이드 A 조성이 낮다. 상기 세정은 글리코아시드를 몰어내어, 필터 케이크가 건조되는 즉시 전체 레바우디오사이드 A 농도가 증가한다. 또한, 상기 세정은 원치 않는 글리코사이드를 우선적으로 제거할 수 있다(예를 들어, 레바우디오사이드 B 및 레바우디오사이드 D를 레바우디오사이드 A 결정으로부터 제거함).
본 발명의 방법을 이용하여 정제된 레바우디오사이드 A 조성물을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 약 90 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함한다. 다른 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 약 95 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 약 97 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 약 98 중량% 이상, 또는 약 99 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함한다. 많은 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 약 2.5 중량% 이하의 레바우디오사이드 B 또는 약 2 중량% 이하의 레바우디오사이드 B를 포함한다. 많은 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 약 1 중량% 이하의 레바우디오사이드 D 또는 약 0.5 중량% 이하의 레바우디오사이드 D를 포함한다. 많은 실시양태에서, 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 약 0.1 중량% 이하의 스테비오사이드를 포함한다.
본 발명의 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 음식, 음료수, 약물, 담배, 약학 및 개인 관리 제품의 단독 감미제로서 사용되거나, 상기 제품 중 다른 감미제와 (즉, '공동감미제'로서) 혼합될 수 있다. 1 이상의 감미제를 사용하여 특정 미각 프로파일 및/또는 물리적 특성을 수득하는 것이 전형적이다. 이러한 감미제는 통상의 감미제(감자당, 사탕무당, 꿀, 시럽 및 기타 '천연' 감미제) 및 고강도의 감미제(시클라메이트, 사카린, 수크랄로스, 아스파르탐, 스테비아 및 기타 화학적으로 생성된 및/또는 천연 고강도 감미제)를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 용매/역용매 결정화를 이용한 스테비오사이드의 결정화 방법을 제공한다. 레바우디오사이드 A 및 스테비오사이드를 포함하는 글리코사이드 조성물로부터 스테비오사이드를 결정화시키는 것은 정제된 스테비오사이드 조성물을 형성하고 또한 출발 조성물에 비해 레바우디오사이드 A가 농후한 용해된 글리코사이드 조성물을 제공하는 데 유용할 수 있다. 레바우디오사이드 A가 농후한 경우(예를 들어, 약 20 중량% ∼ 약 50 중량%의 레바우디오사이드 A), 전술한 방법에서 농후된 레바우디오사이드 A 조성물을 출발 물질로서 사용하여 정제된 레바우디오사이드 A 조성물을 형성할 수 있다.
많은 실시양태에서, 용매/역용매 결정화에 의한 스테비오사이드의 침전 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 레바우디오사이드 A 및 스테비오사이드(다른 글리코사이드가 전형적으로 또한 존재함)를 포함하는 글리코사이드 조성물을 제공하는 단계;
(b) 상기 글리코사이드 조성물을 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜) 및 물을 포함하는 용매에 용해시켜 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 글리코사이드 용액으로부터 상기 스테비오사이드의 적어도 일부를 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하여 단계 (b)의 글리코사이드 용액에 비해 레바우디오사이드 A가 농후한 글리코사이드 조성물을 형성하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(d) 결정화된 스테비오사이드를 여과시키고 단계 (c)의 글리코사이드 용액으로부터 레바우디오사이드 A가 농후한 조성물을 회수하는 단계;
(e) 단계 (d)의 상기 농후된 글리코사이드 조성물을 저급 알콜(예를 들어, C1-C3 알콜)과 물을 포함하는 용매에 용해시켜 제2 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
(f) 상기 단계 (e)의 스위트 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 스위트 글리코사이드 용액으로부터 상기 레바우디오사이드 A의 적어도 일부를 정제된 레바우디오사이드 A 조성물의 형태로 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하는 단계.
본 발명은 하기 비한정 실시예를 참조하여 설명하게 된다.
출발 물질
표 1은 실시예 전반에 걸쳐 사용된 다양한 출발 물질 조성물을 나타낸다.
물질 둘코사이드 (%) 스테비오사이드 (%) 레바우디오사이드 A (%) 레바우디오사이드 B (%) 레바우디오사이드 C (%) 레바우디오사이드 F (%) 레바우디오사이드 D (%)
59 RA40 0.6 39.1 44.4 1.0 10.0 1.8 3.1
58 RA60 0.6 29.7 56.6 1.5 7.6 1.5 2.5
26 RA80 0.2 9.3 79.2 3.6 3.4 1.0 3.2
70 RA80 0.1 2.6 86.5 8.1 1.2 1.2 0.4
RA 20 1.6 74.1 16.0 0.0 7.0 0.7 0.6
실시예 1
우선, 출발 조성물 70 RA80(표 1 참조)을 50 중량%의 에탄올 및 50 중량%의 물을 포함하는 용매 조성물에 30 중량%로 용해시켰다. 생성된 용액이 실온에서 밤새 평형을 유지하도록 하였다. 평형 후, 역용매 메탄올을 스위트 글리코사이드 조성물에 표 2에 기재된 양으로 첨가하여 결정화를 개시하였다. 역용매의 첨가 후에, 결정화가 실온에서 밤새 진행되도록 하였다. 결정화 후 상기 용액을 여과시키고, 생성된 필터 케이크를 2 중량의 에탄올로 세정하였다. 이어서, 필터 케이크 및 상청액 샘플을 건조시키고, 건조된 케이크를 HPLC에 의해 분석하여 글리코사이드 조성을 측정하였다. 결과는 표 2에 보고되어 있다.
물질 역용매 세정 질량 수율 (%) 레바우디오사이드 A 수율 (%) 둘코사이드
(%)		 스테비오사
이드 (%)		 레바우디오
사이드 A
(%)		 레바우디오
사이드 B
(%)		 레바우디오
사이드 C
(%)		 레바우디오
사이드 F
(%)		 기타* (%)
70 RA80
 0.25 중량 MeOH 2 중량 EtOH
 0.0 0.0 -- -- -- -- -- -- --
0.0 0.0 -- -- -- -- -- -- --
0.0 0.0 -- -- -- -- -- -- --
70 RA80
 0.50 중량 MeOH 2 중량 EtOH
 38.1 42.0 0.0 0.2 95.5 3.9 0.1 0.2 0.2
0.0 0.0 -- 0.2 -- -- -- -- --
0.0 0.0 -- 0.2 -- -- -- -- --
70 RA80
 1 중량 MeOH 2 중량 EtOH
 57.7 62.7 0.0 0.0 94.1 5.1 0.0 0.3 0.1
57.5 63.2 0.0 0.0 95.0 4.3 0.0 0.3 0.1
58.9 64.0 0.0 0.1 94.1 5.0 0.0 0.3 0.3
70 RA80
 2 중량 MeOH
 2 중량 EtOH
 62.0 70.2 0.0 0.2 98.0 1.5 0.0 0.2 0.4
62.1 70.4 0.0 0.1 98.1 1.4 0.0 0.1 0.4
62.2 70.6 0.0 0.0 98.3 1.1 0.0 0.2 0.3
70 RA80
 3 중량 MeOH
 2 중량 EtOH
 65.6 73.5 0.0 0.0 96.9 2.3 0.0 0.2 0.4
64.1 72.2 0.0 0.0 97.4 1.9 0.0 0.2 0.4
64.7 73.2 0.0 0.0 97.9 1.6 0.0 0.2 0.4
70 RA80
 4 중량 MeOH 2 중량 EtOH 64.2 72.2 0.0 0.0 97.3 2.1 0.0 0.2 0.4
64.5 72.7 0.0 0.0 97.5 1.9 0.0 0.2 0.4
60.8 68.4 0.0 0.0 97.4 2.0 0.0 0.2 0.4

* 기타 = 레바우디오사이드 A 및 레바우디오사이드 B 사이의 피크의 합계, 이는 레바우디오사이드 D 및 스테비올비오사이드를 포함하는 것으로 생각됨.
실시예 2
우선, 표 3에서 확인되는 출발 물질을 50 중량%의 에탄올 및 50 중량%의 물을 포함하는 용매 조성물에 30 중량%로 용해시켰다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 평형을 유지하도록 하였다. 평형 후, 2 부피의 역용매를 스위트 글리코사이드 조성물에 첨가하여 결정화를 개시하였다. 역용매의 첨가 후에, 결정화가 실온에서 밤새 진행되도록 하였다. 2 부피의 역용매를 첨가하여 80% 레바우디오사이드 A에서 결정화가 발생하는지 확인하였다. 그러나, 출발 물질은 60% 또는 40% 레바우디오사이드 A 출발 조성물로부터 제조된 스위트 글리코사이드 조성물에 결정화를 유도하지 않았다. 추가 부피의 역용매를 60% 및 40% 레바우디오사이드 A 출발 조성물로부터 제조된 글리코사이드 조성물에 첨가하였다. 추가 부피의 에탄올 역용매는 60% 레바우디오사이드 A에 의해 제조된 3개의 샘플 중 2개에서 결정화를 발생시켰다. 추가 부피의 에탄올 역용매는 40% 레바우디오사이드 A에 의해 제조된 샘플 그 어느 것에도 결정화를 발생시키지 않았다. 추가 부피의 메탄올 역용매는 40% 레바우디오사이드 A에 의해 제조된 3개의 모든 샘플 및 60% 레바우디오사이드 A에 의해 제조된 3개의 모든 샘플에서 결정화를 발생시켰다. 결정화 후에, 용액을 여과시키고, 생성된 필터 케이크를 2 부피의 에탄올로 세정하였다. 이어서, 필터 케이크를 건조시키고, 건조된 케이크를 HPLC에 의해 분석하여 글리코사이드 조성을 측정하였다. 결과는 표 3에 보고되어 있다.
물질 역용매 세정 질량 수율 (%) 레바우디오사이드 A 수율 (%) 둘코사이드
(%)		 스테비오사
이드 (%)		 레바우디오
사이드 A
(%)		 레바우디오
사이드 B
(%)		 레바우디오
사이드 C
(%)		 레바우디오
사이드 F
(%)		 기타* (%)
70 RA80
 2 중량 EtOH 2 중량 EtOH
 50.1 55.8 0.1 0.0 98.3 1.4 0.0 0.2 0.0
46.0 51.3 0.1 0.0 98.4 1.4 0.0 0.1 0.0
46.9 52.6 0.1 0.0 98.9 1.0 0.0 0.1 0.0
70 RA80
 2 중량 MeOH 2 중량 EtOH
 38.1 42.0 0.1 0.0 97.6 1.8 0.0 0.2 0.3
-- -- 0.1 0.0 97.7 1.8 0.1 0.2 0.1
-- -- 0.3 0.0 97.6 1.8 0.1 0.2 0.0
70 RA60
 3 중량 EtOH 2 중량 EtOH
 57.7 62.7 0.4 0.0 95.5 2.9 0.1 0.2 0.8
57.5 63.2 0.3 0.0 96.1 2.6 0.1 0.3 0.6
58.9 64.0 -- -- -- -- -- -- --
70 RA60
 3 중량 MeOH
 2 중량 EtOH
 62.0 70.2 0.2 0.0 97.5 1.4 0.1 0.3 0.4
62.1 70.4 0.3 0.0 97.8 1.1 0.2 0.3 0.3
62.2 70.6 0.4 0.0 97.8 0.9 0.2 0.3 0.3
70 RA40
 3 중량 EtOH
 65.6 73.5 -- -- -- -- -- -- --
64.1 72.2 -- -- -- -- -- -- --
64.7 73.2 -- -- -- -- -- -- --
70 RA40
 3 중량 MeOH 2 부피 EtOH 64.2 72.2 0.3 0.0 98.1 0.6 0.2 0.4 0.4
64.5 72.7 0.2 0.0 98.2 0.6 0.2 0.5 0.3
60.8 68.4 0.6 0.0 97.6 0.6 0.3 0.4 0.4

* 기타 = 레바우디오사이드 A 및 레바우디오사이드 B 사이의 피크의 합계, 이는 레바우디오사이드 D 및 스테비올비오사이드를 포함하는 것으로 생각됨.
실시예 3
RA 20(표 1 참조)를 50%의 에탄올 및 50%의 물의 용액에 용해시켜 30 중량%의 RA 20을 함유하는 용액을 생성하였다. 상기 용액을 3 중량의 메탄올로 희석시키고, 여과하며, 2 중량의 메탄올로 세정하였다. 결정은 기존 물질의 56 중량%를 구성하였고, 스테비오사이드가 농후하였다. 여과물은 상기 물질의 나머지를 구성하였으며, 레바우디오사이드 A가 농후하였다. 생성된 결정 및 여과물의 순도는 표 4에 제시되어 있다.
둘코사
이드 		스테비
오사
이드 		레바우
디오
사이드
A		 레바우
디오
사이드
B 		레바우
디오
사이드
C 		레바우
디오
사이드
F 		기타*
결정 0.0% 93.2% 3.9% 0.1% 0.5% 0.0% 2.2%
여과물 0.0% 29.8% 40.8% 60.0% 21.9% 4.1% 2.8%

* 기타 = 레바우디오사이드 A 및 레바우디오사이드 B 사이의 피크의 합계, 이는 레바우디오사이드 D 및 스테비올비오사이드를 포함하는 것으로 생각됨.
실시예 4
약 60 중량%의 레바우디오사이드 A를 함유하는 스테비올 글리코사이드의 원료를 65 중량%의 에탄올 및 35 중량%의 물을 함유하는 용매에 용해시켜 56 중량%의 스테비올 글리코사이드를 함유하는 용액을 생성하였다. 상기 용액을 모든 글리코사이드가 용해되는 약 70℃로 가열하였다. 역용매로서 100% 에탄올을 용매의 최종 조성이 89.3 중량% 에탄올이 되도록 첨가하였다. 에탄올의 첨가와 동시에, 상기 용액을 2 시간에 걸쳐 실온으로 천천히 냉각시켰다. 생성된 결정을 상기 용액으로부터 여과시키고, 2 케이크 중량의 95% 에탄올로 세정시키며, 건조시켰다. 필터 케이크는 건량 기준으로 95∼97%의 레바우디오사이드 A를 함유하였다. 상기 용액 중 레바우디오사이드 A의 약 75%가 결정화에서 회수되었다.
실시예 5
약 80 중량%의 레바우디오사이드 A를 함유하는 스테비올 글리코사이드의 원료를 85 중량%의 에탄올 및 15 중량%의 물을 함유하는 용매에 용해시켜 15 중량%의 스테비올 글리코사이드를 함유하는 용액을 생성하였다. 상기 용액을 모든 글리코사이드가 용해되는 약 70℃로 가열하였다. 역용매로서 100% 에탄올을 용매의 최종 조성이 89.3 중량% 에탄올이 되도록 첨가하였다. 에탄올의 첨가와 동시에, 상기 용액을 2 시간에 걸쳐 실온으로 천천히 냉각시켰다. 생성된 결정을 상기 용액으로부터 여과시키고, 2 케이크 중량의 95% 에탄올로 세정시키며, 건조시켰다. 필터 케이크는 건량 기준으로 94∼95%의 레바우디오사이드 A를 함유하였다. 상기 용액 중 레바우디오사이드 A의 95% 이상이 결정화에서 회수되었다.
본 발명의 다른 실시양태가 상기 명세서를 고려할 시에 또는 본 원에 개시된 본 발명의 실행으로부터 당업자에게 명백하게 된다. 본 원에서 기술되는 실시양태 상의 변경예는 상기 설명을 읽을 시에 당업자에게 명백하게 된다. 본 발명자는 당업자가 이러한 변경예를 적절하게 이용하기를 기대하며, 본 발명이 본 원에서 구체적으로 설명된 것 이외에도 실행되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법 하에 허용되는 청구의 범위에 인용되는 해당 내용의 모든 변경예 및 동등예를 포함한다. 본 원에서 인용되는 모든 특허, 특허 문헌 및 공개물은 개별적으로 인용되는 바와 같이 본 원에서 참조 인용된다.

Claims (50)

  1. (a) 레바우디오사이드 A; 및
    레바우디오사이드 B, 레바우디오사이드 C, 레바우디오사이드 D, 레바우디오사이드 E, 레바우디오사이드 F, 스테비오사이드 및 둘코사이드 중 1 이상
    을 포함하는 글리코사이드 출발 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 글리코사이드 출발 조성물을 (i) C1-C3 알콜과 물의 혼합물, 또는 (ⅱ) C1-C3 카르복실산과 물의 혼합물을 포함하는 용매에 용해시켜 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 글리코사이드 용액으로부터 상기 레바우디오사이드 A의 적어도 일부를 정제된 레바우디오사이드 A 조성물의 형태로 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하는 단계
    를 포함하는, 글리코사이드 혼합물로부터 레바우디오사이드 A를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 레바우디오사이드 A를 포함하는 결정을 글리코사이드 용액에 첨가하여 단계 (c)의 글리코사이드 용액을 시딩 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 정제 방법.
  3. 제1항에 있어서, 회분식 결정화 방법으로서 실시하는 것인 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서, 연속 결정화 방법으로 실시하는 것인 정제 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 글리코사이드 출발 조성물은 40 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 글리코사이드 출발 조성물은 40 ∼ 80 중량%의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 글리코사이드 출발 조성물은 60 중량% 이하의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 글리코사이드 출발 조성물은 40 ∼ 60 중량%의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 C1-C3 알콜은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, i-프로판올 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것인 정제 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 C1-C3 알콜은 에탄올인 것인 정제 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 용매는 30 ∼ 70 중량%의 C1-C3 알콜 및 30 ∼ 70 중량%의 물을 포함하는 것인 정제 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 용매는 40 ∼ 60 중량%의 C1-C3 알콜 및 40 ∼ 60 중량%의 물을 포함하는 것인 정제 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 용매는 45 ∼ 55 중량%의 C1-C3 알콜 및 45 ∼ 55 중량%의 물을 포함하는 것인 정제 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 역용매는 C1-C3 알콜 또는 이의 혼합물을 포함하는 것인 정제 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 역용매는 메탄올, 에탄올, i-프로판올, n-프로판올, 아세톤, 아세트산에틸 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 정제 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 용매는 에탄올과 물을 포함하고, 상기 역용매는 에탄올을 포함하는 것인 정제 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 용매는 에탄올과 물을 포함하고, 상기 역용매는 메탄올을 포함하는 것인 정제 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 C1-C3 카르복실산은 아세트산, 포름산, 프로피온산 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 정제 방법.
  20. 제1항에 있어서, 역용매의 질량 대 글리코사이드 용액의 질량은 0.50:1 ∼ 9:1 범위에 있는 것인 정제 방법.
  21. 제1항에 있어서, 역용매의 질량 대 글리코사이드 용액의 질량은 1:1 ∼ 3:1 범위에 있는 것인 정제 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 글리코사이드 용액은 15 ∼ 50 중량%의 출발 조성물 및 50 ∼ 85 중량%의 용매를 포함하는 것인 정제 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물을 여과에 의해 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 정제 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물을 C1-C3 알콜 또는 이의 혼합물에 의해 세정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 정제 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 알콜은 에탄올인 것인 정제 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 알콜은 메탄올인 것인 정제 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 90 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 95 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 97 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 98 중량% 이상의 레바우디오사이드 A를 포함하는 것인 정제 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 2.5 중량% 이하의 레바우디오사이드 B를 포함하는 것인 정제 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 2 중량% 이하의 레바우디오사이드 B를 포함하는 것인 정제 방법.
  33. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 1 중량% 이하의 레바우디오사이드 D를 포함하는 것인 정제 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 정제된 레바우디오사이드 A 조성물은 0.5 중량% 이하의 레바우디오사이드 D를 포함하는 것인 정제 방법.
  35. 제1항에 있어서, 상기 역용매를 글리코사이드 용액에 단일 첨가로 첨가하는 것인 정제 방법.
  36. 제1항에 있어서, 상기 역용매를 글리코사이드 용액에 다중 첨가로 첨가하는 것인 정제 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 역용매를 글리코사이드 용액에 연속으로 첨가하는 것인 정제 방법.
  38. 제1항에 있어서, 상기 글리코사이드 용액 및 역용매는 온도가 15 ∼ 25℃ 범위에 있는 것인 정제 방법.
  39. 제1항에 있어서, 글리코사이드 용액의 형성 단계는 상기 용매를 60 ∼ 70℃ 범위의 온도로 가열하는 것을 포함하는 것인 정제 방법.
  40. 제1항에 있어서, 상기 글리코사이드 용액을 냉각시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 정제 방법.
  41. 제40항에 있어서, 글리코사이드 용액의 냉각 단계는 (i) 역용매의 첨가 전에; (ⅱ) 역용매의 첨가와 동시에; (ⅲ) 역용매의 첨가 후에; 또는 이들의 임의의 조합에 발생하는 것인 정제 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 글리코사이드 용액을 0 ∼ -10℃ 범위의 온도로 냉각시키는 것인 정제 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 글리코사이드 용액을 1℃/분 ∼ 5℃/분 범위의 속도로 냉각시키는 것인 정제 방법.
  44. 용매/역용매 결정화를 이용한 스테비오사이드의 선택적 결정화에 의한 글리코사이드 조성물의 레바우디오사이드 A 농후화 방법으로서,
    (a) 레바우디오사이드 A 및 스테비오사이드를 포함하는 글리코사이드 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 글리코사이드 조성물을 (i) C1-C3 알콜과 물의 혼합물, 또는 (ⅱ) C1-C3 카르복실산과 물의 혼합물을 포함하는 용매에 용해시켜 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 글리코사이드 용액으로부터 상기 스테비오사이드의 적어도 일부를 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하여 레바우디오사이드 A가 농후한 글리코사이드 용액 조성물을 형성하는 단계
    를 포함하는 농후화 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    (d) 단계 (c)의 글리코사이드 용액으로부터 농후된 글리코사이드 조성물을 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 농후화 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    (e) 단계 (d)의 스위트 글리코사이드 조성물을 C1-C3 알콜과 물을 포함하는 용매에 용해시켜 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
    (f) 단계 (e)의 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 글리코사이드 용액으로부터 상기 레바우디오사이드 A의 적어도 일부를 정제된 레바우디오사이드 A 조성물의 형태로 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 농후화 방법.
  47. 용매/역용매 결정화를 이용한 스테비오사이드의 결정화 방법으로서,
    (a) 레바우디오사이드 A 및 스테비오사이드를 포함하는 글리코사이드 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 글리코사이드 조성물을 (i) C1-C3 알콜과 물의 혼합물, 또는 (ⅱ) C1-C3 카르복실산과 물의 혼합물을 포함하는 용매에 용해시켜 글리코사이드 용액을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 글리코사이드 용액에 역용매를, 상기 글리코사이드 용액으로부터 상기 스테비오사이드의 적어도 일부를 결정화시키는 데 유효한 양으로 첨가하여 정제된 스테비오사이드 결정을 형성하는 단계
    를 포함하는 결정화 방법.
  48. 삭제
  49. 삭제
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