TW202342764A

TW202342764A - 用於製備甜菊糖雙苷d及甜菊糖雙苷m的方法

Info

Publication number: TW202342764A
Application number: TW111139468A
Authority: TW
Inventors: 金貞銀; 朴晟喜; 金兌慶; 吳京美
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2021-10-19
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2023-11-01
Also published as: AR127393A1; WO2023068722A1; CA3235251A1; KR20230057275A

Abstract

本申請案係有關藉由二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶之反應來製備甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M的方法；及用於製備甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M之組成物，其包含二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶。

Description

用於製備甜菊糖雙苷D及甜菊糖雙苷M的方法

本申請案係有關藉由二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶之反應來製備甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M的方法；及用於製備甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M之組成物，其包括二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶。

隨著世界衛生組織(World Health Organization)(WHO)憂心因糖攝取造成疾病(肥胖症)而建議降低每日糖攝取量，已開發國家的政府正針對降低糖攝取量而積極討論各種不同政策。因此，隨著市場上對開發各種不同替代甜味劑來取代糖及高果糖的需求逐漸增加，因此需要持續開發替代甜味劑並商品化。

替代甜味劑為以合成的高甜度甜味劑(例如：糖精、阿斯巴甜(aspartame)、蔗糖素(sucralose)，等等)、合成之糖醇(例如：甘露糖醇及木糖醇)、及高甜度甜味劑(例如：甜菊糖雙苷 A及甘草)的形式持續變化的標的。儘管如此，由於擔心合成性甜味劑的安全性，消費者對天然甜味劑的需求已經持續增加；然而，因為受到天然甜味劑獨特風味性質(亦即變味及敗味)的限制，天然甜味劑無法完全取代現有以合成性甜味劑為基礎的低卡及零卡產品。

近年來受到相當重視的天然高甜度甜味劑為來自甜菊(Stevia)葉的甜菊萃取物。已有報告指出甜菊不會產生卡路里，因此有潛力使用作為替代甜味劑，其對血糖及胰島素濃度為正面影響，且對身體沒有副作用；然而，由於甜菊帶有苦味，而在用於降低糖用量時受到限制。

甜菊為原生於南美巴拉圭的多年生菊科(Asteraceae)植物，其學名為 Stevia rebaudianaBertoni。甜菊葉包含甜化組份，其甜度為糖的200至300倍，且萃取甜化組份用為天然甜味劑。甜菊萃取物之甜化組份包含各種不同甜菊醇糖苷，如：甜菊糖苷、甜菊糖雙苷 A、甜菊糖雙苷 C、甜菊糖雙苷 D、甜菊糖雙苷 M、甜菊糖雙苷 I、及甜菊糖雙苷 E，等等。

在甜菊萃取物的甜化組份中，甜菊葉包含相當高量的甜菊糖苷(STV)、甜菊糖雙苷 A(Reb A)、及甜菊糖雙苷 C(Reb C)，因此，已推出有高純度之萃取及純化的工業產品，但其等由於帶有苦味，而在用於降低糖用量時受到限制。

同時，甜菊糖雙苷 D(Reb D)及甜菊糖雙苷 M(Reb M)具有的苦味低於STV、甜菊糖雙苷 A、及甜菊糖雙苷 C，且具有優異的甜化品質，因此具有作為替代甜味劑的高度價值。然而，甜菊葉中僅包含極少量的甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M，因此具有缺點在於從葉子萃取及純化甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M及生產其等的方法需要高成本。 [ 先前技術文獻 ] [ 發明 專利文獻 ]

(發明專利文獻0001) 韓國發明專利第1404728號

[ 技術問題 ]

本申請案一個目的為提供一種製備甜菊糖雙苷 D之方法，其包括：由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖雙苷 A於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 D，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

本申請案另一個目的為提供一種製備甜菊糖雙苷 M之方法，其包括：由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖雙苷 A於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 D；並由甜菊糖雙苷 D與鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 M，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B) 為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

本申請案再一個目的為提供一種從甜菊糖雙苷 A製備甜菊糖雙苷 D 之方法，其包括：由蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、蔗糖合成酶與二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)於原位反應以製備甜菊糖雙苷 D。

本申請案再一個目的為提供一種從甜菊糖雙苷 A製備甜菊糖雙苷 M之方法，其包括：由蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、甜菊糖雙苷 D、蔗糖合成酶、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)與二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)於原位反應以製備甜菊糖雙苷 M。

本申請案甚至再一個目的為提供一種用於製備甜菊糖雙苷 D之組成物，其包括二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)。

本申請案再另一個目的為提供一種用於製備甜菊糖雙苷 M之組成物，其包括：二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)。 [ 技術解決方案 ]

下文將更詳細說明本申請案。同時，本文所揭示之各說明及實施例可以分別應用在其他說明及實施例中。亦即本文所揭示各種不同元素之所有組合均落於本申請案之範圍內。此外，本申請案範圍不受下文明確說明之限制。另外，本說明書已引用許多報告及專利文獻。所引用報告及專利文獻之內容已以全文引用方式併入本文中，且將更清楚說明本申請案所屬技術領域之程度及本申請案內容。

本申請案一個態樣係提供一種製備甜菊糖雙苷 D之方法，其包括：由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖雙苷 A於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 D，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

本文所採用術語「二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶(UGT)」為一種催化單糖部份體從醣基供體轉移至醣基受體分子的酵素，且具體言之，其意指利用UDP-糖作為醣基供體的酵素。本申請案中，UDP-醣基轉移酶可以與UGT交換使用。

UDP-醣基轉移酶可為由經過包含醣基轉移酶基因之載體轉形之重組大腸桿菌( E. coli)、芽孢桿菌( Bacillus)、酵母、棒狀桿菌( Corynebacterium)或農桿菌( Agrobacterium) 生產者，且UDP-醣基轉移酶可在由大腸桿菌或類似物生產之後進一步純化，或可購買及使用商業製造的產品，但UDP-醣基轉移酶不受此限制。另外，UDP-醣基轉移酶係所屬技術領域習知者，且UDP-醣基轉移酶之蛋白質及基因序列可以得自已知之資料庫，例如：NCBI (National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術資訊中心) 之GenBank等等，但不受此限制。

本申請案中，已新研發一種新穎之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)，其係選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質，其具有將甜菊糖雙苷 A轉化成甜菊糖雙苷 D之酵素活性，藉以提供UGT-B之新穎用途。

具體言之，本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)可具有及/或包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列、SEQ ID NO：2之胺基酸序列或SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或基本上由該等胺基酸序列組成或係由該等胺基酸序列組成。

另外，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)可包括與SEQ ID NO：1之胺基酸序列、SEQ ID NO：2之胺基酸序列、或SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%、或99.9%或更高之同源性或相等性之胺基酸序列。另外，顯見的是只要該胺基酸序列具有此等同源性或相等性，並展現對應於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之效果，任何二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)具有之胺基酸序列中已被刪除、修飾、取代、保留取代、或添加部份序列時，亦仍落在本申請案範圍內。

如本文所採用，雖然被說明為「包括由具體序列編號說明之胺基酸序列之多肽或蛋白質」、「由具體序列編號說明之胺基酸序列組成之多肽或蛋白質」、或「具有由具體序列編號說明之胺基酸序列之多肽或蛋白質」，但顯見的是任何蛋白質具有之胺基酸序列中已被刪除、修飾、取代、保留取代、或添加部份序列時，仍可用在本申請案中，即使其具有與對應序列編號之胺基酸序列所組成之多肽相同或對應活性。例如：其可能的情形為其中胺基酸序列之N-末端及/或C-末端添加有一個不會改變蛋白質功能的序列、天然發生的突變、其潛在突變(靜默突變)、或保留取代。

例如：其可能的情形為在胺基酸序列之N-末端、C-末端及/或內部添加或被刪除不會影響本申請案的二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之功能的序列、天然發生的突變、其潛在突變(靜默突變)、或保留取代。

本文所採用術語「保留取代」係指胺基酸被另一個具有類似結構及/或化學性質的胺基酸取代。此等胺基酸取代通常可依據殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、及/或兩親性等性質的相似性而發生。例如，帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸、及組胺酸；帶負電荷(酸性)胺基酸包括麩胺酸及天冬胺酸；芳香系胺基酸包括苯基丙胺酸、色胺酸、及酪胺酸；及疏水性胺基酸包括丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、及色胺酸。另外，胺基酸可以分類成具有帶電荷側鏈的胺基酸及具有不帶電荷側鏈的胺基酸，且具有帶電荷側鏈的胺基酸實例包括天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、及組胺酸。具有不帶電荷側鏈的胺基酸可以進一步分成非極性胺基酸或極性胺基酸。非極性胺基酸實例為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、脯胺酸，且極性胺基酸實例包括絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸、及麩醯胺酸。通常，保留取代對所形成多肽之活性的影響很小或沒有影響。通常，保留取代可能對蛋白質或多肽之活性的影響很小或沒有影響。

另外，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)亦可包括被刪除或添加對多肽之性質及二級結構影響最小的胺基酸。例如多肽可以在涉及共同轉譯或轉譯後蛋白質之轉移之N-末端接合單一(或前導)序列。此外，多肽亦可接合另一個序列或連接子，以便判別、純化、或合成該多肽。

本文所採用術語「同源性」或「相等性」係指兩個指定胺基酸序列或核苷酸序列之間之相關性程度，且可以百分比表示。術語同源性及相等性經常可以彼此交換使用。

保留的多核苷酸或多肽序列之序列同源性或相等性可以採用標準對準演算法決定，且可與使用程式已建立的預設空位罰分(default gap penalty) 一起使用。實質上，通常預期同源或相等的序列在中度或高度嚴苛條件下與所有或部份序列雜交。多核苷酸之雜交顯然亦包括與包含常用密碼子或簡併密碼子之多核苷酸的雜交。

任何兩個多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性、或相等性均可例如藉由已知電腦演算法，如「FASTA」程式(Pearson等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444)採用預設參數決定。或者，可利用Needleman–Wunsch演算法決定(Needleman及Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443–453)，其係使用EMBOSS組合之Needleman程式(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等人2000, Trends Genet.16:276–277) (較佳為5.0.0或以後的版本) (GCG程式組合(Devereux, J.等人 Nucleic Acids Research12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S. F.等人 J MOLEC BIOL215:403 (1990)； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop編輯，Academic Press, San Diego, 1994、及CARILLO等人(1988) SIAM J Applied Math48:1073)進行。例如可以使用國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)之BLAST或ClustalW決定同源性、相似性或相等性。

多核苷酸或多肽之同源性、相似性、或相等性可以例如依Smith及Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482所揭示，採用例如，如Needleman等人(1970), J Mol Biol.48:443之GAP電腦程式，藉由比對序列資訊來決定。總言之，GAP程式係由相似的經對準之符號(亦即核苷酸或胺基酸)的數目除以兩個序列中較短序列的符號總數所得數值來界定同源性、相似性、或相等性。GAP程式之預設參數可包括(1) Gribskov等人(1986), Nucl . Acids Res.14:6745之一元比對矩陣(包含相等性的數值1及非相等性的數值0)及加權比對矩陣，其揭示於Schwartz及Dayhoff編輯之 Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353–358 (1979) (或EDNAFULL 取代矩陣(NCBI NUC4.4之EMBOSS版))；(2) 每個空位罰分3.0及每個空位中每個符號再加罰分0.10 (或空位開放罰分10及空位延伸罰分0.5)；及(3) 終端空位沒有罰分。

本申請案之一項實例中，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)可具有將甜菊糖雙苷 A轉化成甜菊糖雙苷 D之活性。

本文所採用術語「對應於」係指位在肽中所述位置之胺基酸殘基，或與肽中所述殘基類似、相等或同源之胺基酸殘基。判別對應位置上之胺基酸可以決定表示特定序列之序列中之特定胺基酸。本文所採用「對應區」通常指在相關蛋白質或參考蛋白質中之相似或對應位置。

例如任何胺基酸序列與SEQ ID NO：1對準，並依據該對準，胺基酸序列的每個胺基酸殘基可以參照對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基之胺基酸殘基之編號位置進行編號。例如，諸如本文所說明之序列對準演算法可以判別胺基酸位置或較之查詢序列(亦稱為「參考序列」)發生修飾，如取代、嵌插或被刪除之位置。

對準之實例可以由Needleman-Wunsch演算法決定(Needleman及Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443–453)，其係採用EMBOSS組合之Needleman程式(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等人2000, Trends Genet.16:276–277)等進行，但不受此限制，且可適當採用所屬技術領域習知之諸如配對序列比對演算法等序列對準程式。

另外，編碼本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之多核苷酸不僅為編碼上述各 SEQ ID NOS所代表胺基酸之核苷酸序列，而且亦為展現與上述序列具有80%或更高，較佳為90%或更高，更佳為95%或更高，甚至更佳為98%或更高，及最佳為99%或更高同源性之核苷酸序列，且包括編碼展現與上述各蛋白質具有相同或對應效能之蛋白質之任何基因序列而沒有限制。另外，其中已被刪除、修飾、取代、或添加部份序列的任何核苷酸序列顯然亦可落於本申請案範圍，只要該核苷酸序列具有此等同源性即可。

本文所採用術語「多核苷酸」係由核苷酸單體利用共價鍵連結成長鏈所構成之核苷酸聚合物，其係具有至少相當長度之DNA或RNA股。更具體言之，其可指編碼二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之多核苷酸片段。

該編碼本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之多核苷酸可包括編碼SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3之胺基酸序列之核苷酸序列。作為本申請案之實例之一，多核苷酸可具有或包括SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8之序列。另外，該多核苷酸可以由或基本上可以由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8之序列組成。

因為密碼子簡併或考量較適合要表現本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之生物體之密碼子，本申請案之多核苷酸可以在不改變本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之胺基酸序列的範圍內，在編碼區進行各種不同修飾。具體言之，本申請案之多核苷酸可具有或包括與SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8之序列具有70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、及100%或以下之同源性或相等性之核苷酸序列，或可由或基本上可由與SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8之序列具有70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、及100%或以下之同源性或相等性之核苷酸序列組成，但不受此限制。

另外，本申請案之多核苷酸可包括可由已知基因序列製備之探子，該序列為例如可於嚴苛條件下與本申請案之多核苷酸序列之全部或一部份互補之序列雜交之任何序列而沒有限制。「嚴苛條件」係指容許多核苷酸之間特異性雜交之條件。此等條件明確說明於文獻中(J. Sambrook等人 Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel等人 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50–9.51, 11.7–11.8)。例如嚴苛條件可包括讓具有70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、或99%或更高之高同源性或相等性之基因彼此雜交並讓具有同源性或相等性低於上述同源性或相等性之基因彼此不雜交的條件，或南方雜交法(Southern hybridization)之洗滌條件，亦即在對應於60°C、1×SSC、0.1% SDS，具體言之60°C、0.1×SSC、0.1% SDS ，及更具體言之68°C、0.1×SSC、0.1% SDS之鹽濃度及溫度下洗滌一次，具體言之兩次或三次。

雜交要求兩個核酸包含互補序列，但隨雜交之嚴苛性而定，鹼基之間可能有錯配。術語「互補」係用於說明可以彼此雜交之核苷酸鹼基之間之關係。例如以DNA而言，腺嘌呤係與胸腺嘧啶互補，及胞嘧啶係與鳥嘌呤互補。因此，本申請案之多核苷酸可包括與整個序列互補之單離核苷酸片段及其實質上相似之核酸序列。

具體言之，與本申請案之多核苷酸具有同源性或相等性之多核苷酸可以採用雜交條件檢測，包括在上述條件下之T _m值55°C下之雜交步驟。此外， T _m值可為60°C、63°C、或65°C，但不受此限制，且可由彼等習此所屬技術領域者隨其目的適當調整。

多核苷酸雜交之適當嚴苛性隨多核苷酸之長度及互補程度而定，且此等變數係所屬技術領域習知者(例如：Sambrook等人)。

本申請案之一實施例中，鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸可由蔗糖與二磷酸核苷酸於蔗糖合成酶之存在下反應來製備，但不受此限制。

本文所採用術語「蔗糖合成酶」在生產蔗糖時扮演的角色係在植物代謝中使鍵結至二磷酸核苷酸之葡萄糖經可逆性轉移至果糖。在本發明中，蔗糖合成酶證實其有藉由讓蔗糖與二磷酸核苷酸於5至10之pH範圍內反應，使鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與果糖分離之活性。

蔗糖合成酶可為衍生自米、玉米、小麥、竹、阿拉伯芥( Arabidopsis thaliana)、草、大麥、高粱或馬鈴薯者。較佳係蔗糖合成酶為衍生自米、玉米、小麥、或大麥者，及更佳為衍生自米，特定言之為水稻( Oryza sativa)。蔗糖合成酶可由經過包含蔗糖合成酶基因之載體轉形之重組大腸桿菌( Escherichia coli)、芽孢桿菌( Bacillus)、酵母、棒狀桿菌( Corynebacterium)或農桿菌( Agrobacterium)生產，且可在從大腸桿菌等生產後進一步純化。蔗糖合成酶可為所屬技術領域習知者或可自商業途徑購得，但不受此限制。

具體言之，本申請案之蔗糖合成酶可具有及/或包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，或可由或基本上可由該胺基酸序列組成。

蔗糖沒有特別限制，只要其可作為蔗糖合成酶之受質提供葡萄糖給二磷酸核苷酸即可。蔗糖之實例可包括原糖或糖而沒有限制。

本申請案中，可使用嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸作為二磷酸核苷酸。較佳係使用二磷酸尿苷作為二磷酸核苷酸，但二磷酸核苷酸不受此限制。

鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸可藉由本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)與甜菊糖雙苷 A反應以製備甜菊糖雙苷 D。

本申請案之一實施例中，甜菊糖雙苷 A可由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖苷於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)之存在下反應來製備，但不受此限制。

二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)可藉由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖苷反應來生產甜菊糖雙苷 A 。

二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)可為衍生自水稻( Oryza sativa)、甜菊( Stevia rebaudianaBertoni)、綠竹( Bambusa oldhamii)、二穗短柄草( Brachypodium distachyon)、大麥( Hordeum vulgare)、二色高粱( Sorghum bicolor)、玉米( Zea mays)、或阿拉伯芥( Arabidopsis thaliana)者。較佳係二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)可為衍生自水稻( Oryza sativa)、甜菊( Stevia rebaudianaBertoni)、或綠竹( Bambusa oldhamii)者。更佳係其可為衍生自甜菊( Stevia rebaudianaBertoni)者。二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)可為由經過包含醣基轉移酶基因之載體轉形之重組大腸桿菌( Escherichia coli)、芽孢桿菌( Bacillus)、酵母、棒狀桿菌( Corynebacterium)或農桿菌( Agrobacterium) 生產者，或可在從大腸桿菌等生產後進一步純化。二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)可為所屬技術領域習知者或可自商業途徑購得，但不受此限制。

具體言之，本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)可具有及/或包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列或可由或基本上可由該胺基酸序列組成。

甜菊糖苷為來自甜菊( Stevia rebaudiana)之熱水或乙醇水溶液萃取物或其純化材料，或為從萃取物生產甜菊糖雙苷 A後之副產物。甜菊糖苷可為具有甜菊糖苷含量為10 wt%或更高者，較佳為50 wt%或更高，特別佳為70 wt%或更高，及更特別佳為80 wt%或更高，其係以甜菊醇糖苷總重量計，但不受此限制。

本申請案之一實施例中，甜菊糖雙苷 D可依下列化學反應1所示方式製備，但不受此限制。 [化學反應1]

具體言之，該製備方法可以在原位連續進行。

本文所採用術語「原位」意指在單一反應系統中連續進行反應。

本申請案之製備方法提供連續反應系統，其中依據上述化學反應1，由一個葡萄糖特異性鍵結至甜菊糖苷13-O-葡萄糖之C-3′位置以合成高產量之甜菊糖雙苷 A，及由甜菊糖雙苷 A合成甜菊糖雙苷 D。

本申請案之一實施例中，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)可為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，且可進一步製備甜菊糖雙苷 D異構物，但不受此限制。

例如甜菊糖雙苷 D可具有下列結構，但不受此限制：

本申請案之另一態樣提供一種製備甜菊糖雙苷 M之方法，其包括由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖雙苷 A於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 D；及由甜菊糖雙苷 D與鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 M，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

二磷酸核苷酸、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)、甜菊糖雙苷 A、及甜菊糖雙苷 D係如上述說明者。

本申請案之一實施例中，鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸可由蔗糖與二磷酸核苷酸於蔗糖合成酶之存在下反應來製備，如上述化學反應1所示，但不受此限制。

本申請案之一實施例中，甜菊糖雙苷 A可由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖苷於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)之存在下反應來製備，如上述化學反應1所示，但不受此限制。

具體言之，本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)可具有及/或包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或可由或基本上可由該胺基酸序列組成。

本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)可藉由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖雙苷 D 反應來生產甜菊糖雙苷 M。

本申請案之一實施例中，甜菊糖雙苷 M可依下列化學反應2所示方式製備，但不受此限制。 [化學反應2]

具體言之，該製備方法可在原位連續進行。

本申請案之製備方法提供連續反應系統，其中依據上述化學反應2，由甜菊糖苷合成高產量之甜菊糖雙苷 A ，由甜菊糖雙苷 A合成甜菊糖雙苷 D，及由甜菊糖雙苷 D合成甜菊糖雙苷 M。

因此，本申請案之製備方法使用諸如甜菊糖苷及甜菊糖雙苷 A之原料，其等不昂貴且容易取得，並可將甜菊萃取物中所含苦味組份之甜菊糖苷及甜菊糖雙苷 A轉化成甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M，其等係口味極佳的組份，因此可以有效用於生產具有優異甜化性質之甜菊甜味劑。

本申請案之一實施例中，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)可為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，並可進一步製備甜菊糖雙苷 M異構物，但不受此限制。

例如甜菊糖雙苷 M 可具有下列結構，但不受此限制：

本申請案之又另一態樣提供一種由甜菊糖雙苷 A製備甜菊糖雙苷 D之方法，其包括：由蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、蔗糖合成酶及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)於原位反應以製備甜菊糖雙苷 D，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、蔗糖合成酶、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)、甜菊糖雙苷 D、及原位係如上述說明。

本申請案之一實施例中，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)可為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，及可進一步製備甜菊糖雙苷 D異構物，但不受此限制。

本申請案之再另一態樣提供一種由甜菊糖雙苷 A製備甜菊糖雙苷 M之方法，其包括：由蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、甜菊糖雙苷 D、蔗糖合成酶、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)於原位反應以製備甜菊糖雙苷 M，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、甜菊糖雙苷 D、蔗糖合成酶、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)、原位、及甜菊糖雙苷 M係如上述說明。

具體言之，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)可為由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之蛋白質，但不受此限制。

本申請案之一實施例中，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)可為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，及可進一步製備甜菊糖雙苷 M異構物，但不受此限制。

本申請案之甚至另一態樣提供一種用於製備甜菊糖雙苷 D之組成物，其包括二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)及甜菊糖雙苷 D 係如上述說明。

本申請案之一實施例中，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)可為由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3之胺基酸序列組成之蛋白質，及甜菊糖雙苷 D可為選自甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 D異構物所組成群中之至少一種，但不受此限制。

本申請案之再另一態樣提供一種用於製備甜菊糖雙苷 M之組成物，其包括二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)，其中二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)為由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之蛋白質，及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。

二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)、及甜菊糖雙苷 M係如上述說明。

本申請案之一實施例中，二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)可為由SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3之胺基酸序列組成之蛋白質，及甜菊糖雙苷 M可為選自甜菊糖雙苷 M及甜菊糖雙苷 M異構物所組成群中之至少一種，但不受此限制。

本申請案之組成物可進一步包括用於生產胺基酸之組成物中常用之任何合適賦形劑，且此等賦形劑可為例如防腐劑、濕化劑、勻散劑、懸浮劑、緩衝劑、安定劑、或等滲劑，但不受此限制。 [ 有利功效 ]

根據本申請案之使用二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)製備甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M之方法可以提供高純度及高產量之甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M而幾乎沒有副產物，因此可以有效用於大量生產甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M，因為其使用不昂貴的原料，且製程簡單及較省時而比較經濟。

下文將利用實例詳細說明本申請案。然而，此等實例僅為供例示目的之較佳實例，因此本申請案之範圍無意限制在此等實例或受到此等實例之限制。同時，熟悉本申請案相關技術領域或類似技術領域者均可充份了解並容易實施本文未說明之技術特徴。實例 1. 培養條件

重組微生物之製備係導入編碼本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之多核苷酸，然後在表現二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)後用於反應。重組微生物之培養條件如下。實例 1-1. 大腸桿菌 ( E. coli) 之培養條件

如下培養重組大腸桿菌( E. coli)：在包含5 mL 之LB培養基(其包含濃度50 μg/mL之卡納黴素(kanamycin))之試管中接種重組大腸桿菌( E. coli)，然後於37°C在培養箱中培養種菌，直到600 nm之吸收度達2.0。將種菌培養溶液添加至包含500 mL 之LB培養基(其包含濃度50 μg/mL之卡納黴素)之燒瓶中後進行培養。進一步添加0.1 mM IPTG (異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(thiogalactopyranoside))直到600 nm之吸收度達0.4，藉以誘發酵素大量表現。調整培養條件使得製程期間之攪拌速度為180 rpm及培養溫度為37°C，而在添加IPTG後之攪拌速度為120 rpm。實例 1-2. 棒狀桿菌 ( Corynebacteria) 之培養條件

將重組棒狀桿菌( Corynebacteria)接種至包含濃度10 μg/mL之卡納黴素之培養基 (Bacto-Trypton 10 g/L、Bacto-酵母萃取物 5 g/L、NaCl 5 g/L、大豆蛋白腖(Soytone)5 g/L)中，其初始濃度為O.D. ₆₀₀= 0.1，於30°C下培養24小時，以誘發酵素表現。將所得培養溶液接種至包含培養基(葡萄糖80 g/L、大豆蛋白腖20 g/L、(NH ₄) ₂SO ₄10 g/L、KH ₂PO ₄1.2 g/L、MgSO ₄1.4 g/L)(其包含濃度10 μg/mL之卡納黴素)之發酵槽中，其O.D. ₆₀₀= 0.6，並於30°C下培養24小時。實例 2. 量測二磷酸尿苷 (UDP)- 醣基轉移酶 B (UGT-B) 以甜菊糖雙苷 A 為原料時之酵素活性 實例 2-1. 二磷酸尿苷 (UDP)- 醣基轉移酶 B (UGT-B) 之純化

針對可使甜菊糖雙苷 A轉化成甜菊糖雙苷 D之本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B) (UGT-B；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3)，製備包含編碼二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)之基因(SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8)之各重組質體(載體-pET28a)，並選殖至大腸桿菌( E. coli)BL21 (DE3)中，以誘發各酵素大量表現，然後純化及使用該等酵素。

具體言之，在包含5 mL LB培養基之試管中接種重組菌株BL21(DE3)，然後於37°C在培養箱中培養種菌，直到600 nm之吸收度達2.0。將種菌培養溶液添加至包含500 mL LB培養基之燒瓶中後進行培養。進一步添加0.1 mM IPTG (異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)直到600 nm之吸收度達0.4，藉以誘發酵素大量表現。調整培養條件使得製程期間之攪拌速度為180 rpm及培養溫度為37°C，而在添加IPTG後之攪拌速度為120 rpm及培養溫度為16°C。將轉形菌株之培養溶液於6,000 g及4°C下離心20分鐘，以分離細胞上清液作為酵素溶液。為了確切判別酵素的性質，使用Ni-NTA 超流(superflow)管柱純化該酵素溶液。

使用包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8之重組質體大量表現之各酵素分別稱為UGT-B_6、UGT-B_7、及UGT-B_8。

同時，將重組棒狀桿菌( Corynebacteria)接種至包含濃度10 μg/mL之卡納黴素之培養基(Bacto-Trypton 10 g/L、Bacto-酵母萃取物 5 g/L、NaCl 5 g/L、大豆蛋白腖5 g/L)中，其初始濃度為O.D. ₆₀₀= 0.1，並於30°C下培養24小時，以誘發酵素表現。將所得培養溶液接種至包含培養基(葡萄糖80 g/L、大豆蛋白腖20 g/L、(NH ₄) ₂SO ₄10 g/L、KH ₂PO ₄1.2 g/L、MgSO ₄1.4 g/L)(其包含濃度10 μg/mL之卡納黴素)之發酵槽中，其O.D. ₆₀₀= 0.6，並於30°C下培養24小時。實例 2-2. 量測二磷酸尿苷 (UDP)- 醣基轉移酶 B (UGT-B) 以甜菊糖雙苷 A 為原料時之酵素活性

使用實例2-1製備之各酵素量測二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B) 以甜菊糖雙苷 A為原料時之酵素活性。

具體言之，酵素反應使用之原料為RebA (Daepyeong)，其溶於水中至濃度2 mM。使用在實例2-1中於微生物中表現及製備之各酵素在37°C下反應16小時，然後經HPLC分析。原料水溶液可包含2 mM之UDP-葡萄糖或UDP(二磷酸尿苷)。

HPLC分析條件如下： - 檢測器波長：210 nm - 流速：1 mL/min - 樣本注射體積：10 μL - 管柱：Capcell pak C18 MG II (資生堂，250 mm × 4.6 mm，粒度：5 μm) - 溶劑：乙腈30%

量測結果示於下表1及圖1至3。 [表 1]

樣本	甜菊糖雙苷 M 異構物含量 (%)	甜菊糖雙苷 D 異構物含量 (%)	甜菊糖雙苷 D 含量 (%)	甜菊糖雙苷 A 含量 (%)
原料 (反應時間：0)			0.3	99.7
UGT-B_6			39.5	60.5
UGT-B_7	31.5	14.1	44.0	10.4
UGT-B_8			76.1	23.9

如上表1及圖 1至3所示，證實甜菊糖雙苷 A已被本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶 B (UGT-B_6及UGT-B_8)轉化成甜菊糖雙苷 D，且甜菊糖雙苷A被二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B_7) A轉化成甜菊糖雙苷 M異構物、甜菊糖雙苷 D異構物、及甜菊糖雙苷 D。實例 3. 量測二磷酸尿苷 (UDP)- 醣基轉移酶 A (UGT-A) 及二磷酸尿苷 (UDP)- 醣基轉移酶 B (UGT-B) 以甜菊糖雙苷 A 為原料時之酵素活性

採用先前專利文獻(WO 2014/133248)揭示之方法純化二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)及蔗糖合成酶，其等之序列分別示於SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5。

二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)以甜菊糖雙苷 A為原料時之酵素活性係使用二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)、蔗糖合成酶、及實例2-1製備之各二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶 B (UGT-B)來量測。

具體言之，酵素反應所採用之原料為2 mM 甜菊糖苷(Haigen)及50 mM糖(CJ 第一製糖)水溶液。該反應係使用二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)、蔗糖合成酶、及實例2-1製備之各二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶 B (UGT-B)於37°C下進行24小時，其於微生物中表現後以HPLC進行分析。原料水溶液可包含濃度2 mM之UDP-葡萄糖或UDP (二磷酸尿苷)。

量測結果示於下表2及圖 4至6。 [表2]

樣本	甜菊糖雙苷 M 異構物 (%)	甜菊糖雙苷 D (%)	甜菊糖雙苷 M (%)	甜菊糖雙苷 I (%)	甜菊糖雙苷 A (%)	甜菊糖苷 (%)
原料 (反應時間：0)	0	0	0	0	4.6	95.4
UGT-B_6、UGT-A及蔗糖合成酶	0	24.3	12.1	1.8	61.8	0
UGT-B_7、UGT-A及蔗糖合成酶	37.5	35	16.7	10.8	0	0
UGT-B_8、UGT-A及蔗糖合成酶	0	31.0	34.3	4.7	30	0

如上表2及圖 4至6所示，已證實相對於莫耳濃度， 100%甜菊糖苷已轉化成甜菊糖雙苷 M異構物、甜菊糖雙苷 D、甜菊糖雙苷 M及甜菊糖雙苷 I、及甜菊糖雙苷 A。實例 4. 量測二磷酸尿苷 (UDP)- 醣基轉移酶 A (UGT-A) 以甜菊糖雙苷 D 為原料時之酵素活性

藉由實例3之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A) 量測自甜菊糖雙苷 D轉化成甜菊糖雙苷 M之轉化率。

具體言之，該酵素反應採用之原料為甜菊糖雙苷 D(Haigen)，其溶於水中至濃度1 mM。該反應使用在微生物中表現之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)，在37°C下進行16小時，然後經HPLC分析。原料水溶液可包含濃度2 mM之UDP-葡萄糖或UDP(二磷酸尿苷)。

量測結果示於圖7。

如圖7所示，其證實大部份甜菊糖雙苷 D已被本申請案之二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A(UGT-A)轉化成甜菊糖雙苷 M。實例 5. 甜菊糖雙苷 D 異構物及甜菊糖雙苷 M 異構物之液相層析質譜 (LC-MS/MS) 分析

為了證實實例2及3所轉化之化合物是否為甜菊糖雙苷 D異構物或甜菊糖雙苷 M異構物，利用液相層析質譜(LC-MS/MS)分析法將實例2及3所轉化之甜菊糖雙苷 D異構物及甜菊糖雙苷 M異構物分別與甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 M進行比較。

具體言之，採用Acquity UPLC (Waters)及Xe-vo G2-XS Q-Tof 質譜儀。LC-MS/MS分析條件示於下表3，溶析條件示於下表4，及MS 條件示於下表5。 [表3] LC-MS/MS分析條件

層析	Waters Acquity UPLC
管柱	Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1 mm × 150 mm
管柱溫度	40°C
流速	0.20 mL/min
樣本注射	1.0 µL
溶劑	A：蒸餾水 B：50% 乙腈

[表4] 溶析條件

時間 (min)	%A	%B
0	55.0	45.0
0.50	55.0	45.0
3.00	52.5	47.5
6.00	52.4	47.6
9.00	47.5	52.5
9.10	0.0	100.0
10.00	0.0	100.0
10.10	55.0	45.0
15.00	55.0	45.0

[表5] MS條件

離子化模式	ESI負電荷模式
毛細電壓	2.5 kV
錐電壓	30 V
源極溫度	120°C

結果如圖 8及9所示，比較RebD標準物與未知物波峰1顯示RebD標準物與未知物波峰1二者具有相同分子量，且其等之MSMS 片段彼此相符，但僅在波峰的滯留時間上有差異，因此證實該未知物波峰1為RebD之異構物。

另外，如圖10及11所示，比較RebM 標準物與未知物波峰2顯示RebM標準物與未知物波峰2二者具有相同分子量，且其等之MSMS 片段彼此相符，但僅在波峰的滯留時間上有差異，因此證實該未知物波峰2為RebM之異構物。

熟悉本申請案所屬技術領域者由上文即可了解本申請案可在不修改本申請案之技術觀念或基本特徵下，以其他明確形式具體實施。因此，本文所揭示實施例僅供例示說明的目的，不應解釋為限制本申請案之範圍。因此本申請案之範圍係由所附之申請專利範圍而非上述說明所指示。申請專利範圍之意義及等效之範圍內的所有變化均涵括在本申請案範圍內。

圖1示出甜菊糖雙苷 A被二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B_6) 轉化成甜菊糖雙苷 D之HPLC分析結果。

圖2示出甜菊糖雙苷 A被二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B_7) 轉化成甜菊糖雙苷 D、甜菊糖雙苷 D異構物、及甜菊糖雙苷 M異構物之HPLC分析結果。

圖3示出甜菊糖雙苷 A被二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B_8) 轉化成甜菊糖雙苷 D之HPLC分析結果。

圖4示出藉由二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B_6)、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)、及蔗糖合成酶自甜菊糖苷生產甜菊糖雙苷 D、甜菊糖雙苷 M、甜菊糖雙苷 I、及甜菊糖雙苷 A之HPLC分析結果。

圖5示出藉由二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B_7)、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)、及蔗糖合成酶自甜菊糖苷生產甜菊糖雙苷 M異構物、甜菊糖雙苷 D、甜菊糖雙苷 M、甜菊糖雙苷 I、及甜菊糖雙苷 A之HPLC分析結果。

圖6示出藉由二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B_8)、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)、及蔗糖合成酶自甜菊糖苷生產甜菊糖雙苷 D、甜菊糖雙苷 M、甜菊糖雙苷 I、及甜菊糖雙苷 A之HPLC分析結果。

圖7示出甜菊糖雙苷 D被二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)轉化成甜菊糖雙苷 M之HPLC分析結果。

圖8為甜菊糖雙苷 D異構物之LC-MS/MS分析結果。

圖9為甜菊糖雙苷 D 之LC-MS/MS分析結果。

圖10為甜菊糖雙苷 M異構物之LC-MS/MS分析結果。

圖11為甜菊糖雙苷 M 之LC-MS/MS分析結果。

TW202342764A_111139468_SEQL.xml

Claims

一種製備甜菊糖雙苷 D之方法，其包括：由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖雙苷 A於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 D，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。
如請求項1之方法，其中該鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸係由蔗糖與二磷酸核苷酸於蔗糖合成酶之存在下反應來製備。
如請求項1之方法，其中該甜菊糖雙苷 A係由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖苷於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)之存在下反應來製備。
如請求項2之方法，其中該蔗糖合成酶為由SEQ ID NO：5之胺基酸序列組成之蛋白質。
如請求項3之方法，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)為由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之蛋白質。
如請求項1之方法，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，且進一步製備甜菊糖雙苷 D異構物。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該方法係於原位連續進行。
一種製備甜菊糖雙苷 M之方法，其包括：由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖雙苷 A於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B(UGT-B)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 D；及由該甜菊糖雙苷 D與鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)之存在下反應以製備甜菊糖雙苷 M，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。
如請求項8之方法，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)為由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之蛋白質。
如請求項8之方法，其中該鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸係由蔗糖與二磷酸核苷酸於蔗糖合成酶之存在下反應來製備。
如請求項8之方法，其中該甜菊糖雙苷 A係由鍵結有葡萄糖之二磷酸核苷酸與甜菊糖苷於二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)之存在下反應來製備。
如請求項10之方法，其中該蔗糖合成酶為由SEQ ID NO：5之胺基酸序列組成之蛋白質。
如請求項11之方法，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)為由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之蛋白質。
如請求項8之方法，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，且進一步製備甜菊糖雙苷 M異構物。
如請求項8至14中任一項之方法，其中該方法係於原位連續進行。
一種由甜菊糖雙苷 A製備甜菊糖雙苷 D之方法，其包括：由蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、蔗糖合成酶及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)於原位反應以製備甜菊糖雙苷 D，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。
如請求項16之方法，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，且進一步製備甜菊糖雙苷 D異構物。
一種由甜菊糖雙苷 A製備甜菊糖雙苷 M之方法，其包括：由蔗糖、二磷酸核苷酸、甜菊糖雙苷 A、甜菊糖雙苷 D、蔗糖合成酶、二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)於原位反應以製備甜菊糖雙苷 M，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。
如請求項18之方法，，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)為由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之蛋白質
如請求項18之方法，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，且進一步製備甜菊糖雙苷 M異構物。
一種用於製備甜菊糖雙苷 D之組成物，其包含二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)，其為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質。
如請求項21之組成物，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，及該甜菊糖雙苷 D 為選自由甜菊糖雙苷 D及甜菊糖雙苷 D異構物所組成群中之至少一種。
一種用於製備甜菊糖雙苷 M之組成物，其包含：二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)，其為選自由SEQ ID NOS：1至3之胺基酸序列組成之蛋白質所組成群中之至少一種蛋白質；及二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶A (UGT-A)，其為由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之蛋白質。
如請求項23之組成物，其中該二磷酸尿苷(UDP)-醣基轉移酶B (UGT-B)為由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之蛋白質，及甜菊糖雙苷 M為選自由甜菊糖雙苷 M及甜菊糖雙苷 M異構物所組成群中之至少一種。