ES2626501T3 - D-psicosa 3-epimerasa mutante con estabilidad térmica mejorada, y producción continua de D-psicosa utilizando la misma - Google Patents

D-psicosa 3-epimerasa mutante con estabilidad térmica mejorada, y producción continua de D-psicosa utilizando la misma Download PDF

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Abstract

Una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicación de Patente Coreana Nº 10-2011-0035805A o un fragmento funcional, en la que la isoleucina (Ile) de la posición 33 de la secuencia de aminoácidos se sustituye con un aminoácido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cisteína (Cys) y valina (Val), o una secuencia de aminoácido en la que la serina (Ser) de la posición 213 de la secuencia de aminoácidos se sustituye con cisteína.

Description

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DESCRIPCION
D-psicosa 3-epimerasa mutante con estabilidad termica mejorada, y produccion continua de D-psicosa utilizando la misma
Campo Tecnico
La presente invencion se refiere a una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada derivada de Agrobacterium tumefaciens y un metodo de produccion de D-psicosa utilizando la misma.
Tecnica antecedente
La D-psicosa es un monosacarido conocido como un azucar raro debido a que se encuentra escasamente en materiales naturales o esta presente en pequenas cantidades. La D-psicosa tiene una densidad energetica ultra baja y su sabor dulce es similar al azucar, y por lo tanto se utiliza ampliamente como un edulcorante funcional.
La D-psicosa es un epfmero de fructosa y tiene un grado de dulzor y sabor muy similar a la fructosa. Sin embargo, a diferencia de la fructosa, la D-psicosa apenas se metaboliza en el cuerpo y por lo tanto tiene casi cero calonas. La D-psicosa se puede utilizar como un ingrediente eficaz para alimentos de dieta ya que la D-psicosa tiene la capacidad de inhibir la actividad de una enzima implicada en la smtesis de lfpidos y reducir la obesidad abdominal. Ademas, Los azucares alcoholicos tales como xilitol, y similares que se utilizan ampliamente como sustitutos de azucar pueden tener efectos secundarios tales como que producen diarrea en el caso de un sobre consumo. Por el contrario, la D-psicosa se conoce por no tener sustancialmente efectos secundarios (Matsue, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori, y H. Suzuki. 2001. Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 10:233-237.; Matsuo, T., y K. Izumori. 2004. D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 13:S127).
Por dicha razon, la D-psicosa atrae una atencion entusiasta como edulcorante de dieta, y hay una creciente necesidad de desarrollar un metodo para producir D-psicosa eficazmente en la industria alimentaria. Como ha aumentado la necesidad de desarrollar la D-psicosa, se han llevado a cabo muchas investigaciones para producir D- psicosa a partir de fructosa utilizando metodos biologicos convencionales. Como enzimas capaces de convertir la fructosa en D-psicosa, se conocen la D-psicosa 3-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens y D-tagatosa 3-epimerasa derivada de Pseudomonas cichorii o Rhodobacter sphaeroides. La D-psicosa 3-epimerasa se conoce por tener una actividad mayor que la D-tagatosa 3-epimerasa.
Las cepas que pertenecen al genero Corynebacterium son microorganismos industriales que produce materiales qmmicos incluyendo L-lisina, L-treonina y varios acidos nucleicos que tienen diversos usos en piensos forrajeros, productos farmaceuticos, alimentos y similares. Dichas cepas del genero Corynebacterium son cepas GRAS (Reconocidas Generalmente como Seguras), y tienen propiedades que son faciles de modificarse geneticamente y cultivarse en masa. Ademas, las cepas del genero Corynebacterium tienen una alta estabilidad en distintas condiciones del procedimiento y una estructura de membrana celular relativamente fuerte en comparacion con otras bacterias. Por estas razones, las cepas tienen propiedades biologicas que como que las celulas bacterianas existen en un estado estable bajo una alta presion osmotica debido a una alta concentracion de azucar y similares.
Documentos de la tecnica anterior
1) Patente coreana N° 10-0744479 B1 (publicada el 1 de agosto de 2007)
2) Publicacion de patente coreana N° 10-2011-0035805A (publicada el 6 de Abril 6 de 2011)
3) Wanmeng et al., J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 7785-7792 desvela la clonacion, expresion y caracterizacion de la actividad enzimatica de una D-Psicosa 3-Epimerasa (DTEasa) de Clostridium cellulolyticum H10. Particularmente, dicha enzima se investiga y se compara con otras enzimas tales como la DTEasa de Agrobacterium tumefaciens.
Divulgacion
Problema tecnico
Los presentes inventores eran conscientes de los problemas de la D-psicosa 3-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens que tema poca utilidad debido a su baja termoestabilidad a pesar de su alta actividad, y desarrollaron una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada de manera que la D-psicosa atrae actualmente una gran atencion como un importante material alimentario que se puede producir industrialmente a gran escala, proporcionando de esta manera un metodo para producir continuamente D-psicosa utilizando dicha variante. Basandose en dicha investigacion, los presentes inventores han llegado a la presente invencion.
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Espedficamente, la presente invencion tiene el objetivo de proporcionar una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada sustituyendo un aminoacido en una posicion espedfica de una secuencia de aminoacidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre.
Una realizacion de la presente invencion tambien tiene el objetivo de proporcionar un vector de expresion recombinante que incluye un gen de la variante de D-psicosa 3-epimerasa y una cepa recombinante transformada con el vector de expresion recombinante.
Ademas, la presente invencion tiene el objetivo de proporcionar un reactor de lecho empaquetado que utiliza la variante de D-psicosa 3-epimerasa inmovilizada o la cepa recombinante, y un metodo para producir continuamente D-psicosa utilizando el reactor inmovilizado.
La invencion se define en las reivindicaciones.
Solucion tecnica
La presente descripcion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada sustituyendo un aminoacido en una posicion espedfica de una secuencia de aminoacidos de una D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre. Ademas, la presente invencion proporciona un vector de expresion recombinante que incluye un gen de la variante de D-psicosa 3-epimerasa, y una cepa recombinante transformada con el vector de expresion recombinante. Ademas, la presente descripcion proporciona un reactor inmovilizado que se prepara utilizando la variante de D-psicosa 3- epimerasa o la cepa recombinante, y un metodo para producir continuamente D-psicosa utilizando el reactor inmovilizado.
Mas espedficamente, una realizacion de la presente invencion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A (Fig. 5) o un fragmento funcional en el que la isoleucina (Ile) de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con un aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cistema (Cys) y valina (Val), o una secuencia de aminoacidos en la que la serina (Ser) de la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos se sustituye por una cistema.
Otra realizacion de la presente invencion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A o un fragmento funcional en el que la isoleucina (Ile) de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye por un aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cistema (Cys) y valina (Val), y la serina (Ser) en la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos se sustituye por cistema.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un vector de expresion recombinante que incluye un gen que codifica la variante de D-psicosa 3-epimerasa.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 transformada con el vector de expresion recombinante.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un metodo para producir D-psicosa a partir de fructosa utilizando la variante de D-psicosa 3-epimerasa.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un metodo para producir D-psicosa a partir de fructosa utilizando el Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 recombinante.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un reactor inmovilizado para producir D-psicosa que comprende una columna cargada con una perla en la que se inmoviliza la variante de D-psicosa 3-epimerasa.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un metodo para producir D-psicosa introduciendo una solucion de fructosa en el reactor inmovilizado.
Efectos ventajosos
La presente invencion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa en la que el aminoacido en una posicion espedfica de la secuencia de aminoacidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre se ha sustituido. La variante de D-psicosa 3-epimerasa de la invencion tiene las ventajas de que la variante tiene una termoestabilidad significativamente mejorada a la vez que mantiene su actividad enzimatica, permitiendo de esta manera que la D- psicosa actualmente atraiga una gran atencion como un material alimentario importante que se va a producir mas eficazmente e industrialmente a gran escala.
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Espedficamente, la variante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la presente invencion tiene una semivida sorprendentemente extensa a la temperatura de reaccion enzimatica general en comparacion con una D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre, permitiendo de esta manera que la D-psicosa 3-epimerasa que se prepara se utiliza durante mucho tiempo en la produccion de D-psicosa. Por lo tanto, la variante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la presente invencion puede reducir el tiempo de produccion y el coste, mejorando de esta manera la eficacia de produccion.
Ademas, la presente invencion proporciona un vector recombinante para su uso en la expresion de la variante de D- psicosa 3-epimerasa, y una cepa recombinante, el Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 transformado con el vector de expresion recombinante de la invencion. Por lo tanto, la presente invencion tiene la ventaja de proporcionar un metodo para producir continuamente D-psicosa a gran escala formando un reactor inmovilizado utilizando la variante de D-psicosa 3-epimerasa o la cepa recombinante.
Descripcion de los dibujos
La Fig. 1 representa un vector de expresion recombinante que incluye un gen de variante de D-psicosa 3- epimerasa derivado de Agrobacterium tumefaciens.
La Fig. 2 es un grafico que representa un perfil de temperatura de fusion aparente de D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y variantes (S213C, I33L, e I33L-S213C) derivadas de Agrobacterium tumefaciens utilizando DSC (calonmetro de exploracion diferencial). La parte del pico del grafico representa una temperatura de fusion aparente de la enzima.
La Fig. 3 representa fotograffas de los resultados del modelado molecular de D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y variantes (S213C, I33L, e I33L-S213C) derivadas de Agrobacterium tumefaciens (a) y (b) representan una estructura secundaria del tipo silvestre y la variante I33L-S213C, respectivamente. (c) y (d) representan los enlaces hidrogeno estimados que rodean el aminoacido de la posicion 213 (serina (Ser) en el caso del tipo silvestre y un a cistema (Cys) en el caso de la variante S213C de la secuencia de aminoacidos dl tipo silvestre y variante S213C, respectivamente. (e) y (f) representan las interacciones entre los grupos aromaticos del tipo silvestre y la variante I33L, respectivamente.
La Fig. 4 es un grafico que representa la estabilidad de operacion a una temperatura de reaccion de 50 0C de un reactor inmovilizado utilizando variantes en un metodo de acuerdo con una realizacion de la presente invencion. La Fig. 5 es la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011- 0035805A (D-psicosa 3-epimerasa tipo silvestre).
Modo para la invencion
La presente descripcion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con una termoestabilidad mejorada sustituyendo un aminoacido en una posicion espedfica de una secuencia de aminoacido de una D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre. Ademas, la presente invencion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A o un fragmento funcional en el que la isoleucina (Ile) en la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con un aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina(Leu), cistema (Cys) y valina (Val), o una secuencia de aminoacidos en la que la serina (Ser) de la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con cistema. Ademas, la presente invencion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A o un fragmento funcional en la que la isoleucina (Ile) de la posicion 33 de la secuencia de aminoacido se sustituye con un aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cistema (Cys) y valina (Val), y la serina (Ser) de la posicion 213 de la secuencia de aminoacido se sustituye con cistema. Ademas, la presente invencion proporciona un vector de expresion recombinante que incluye un gen de la variante de D-psicosa 3- epimerasa, y una cepa recombinante transformada con el vector de expresion recombinante. Ademas, la presente invencion proporciona un reactor inmovilizado para producir una D-psicosa que comprende una columna cargada con un veldculo al que se une la variante de D-psicosa 3-epimerasa, y un metodo para producir una D-psicosa introduciendo una solucion de fructosa en el reactor inmovilizado. Ademas, la presente descripcion proporciona un reactor inmovilizado que se prepara utilizando la variante de D-psicosa 3-epimerasa o la cepa recombinante, y un metodo para producir continuamente D-psicosa utilizando el reactor inmovilizado.
De aqrn en adelante, se describiran realizaciones de la presente invencion con mas detalle. Las descripciones o detalles evidentes para un experto que tiene un conocimiento habitual en la tecnica o campo relevante se omitiran en el presente documento.
Una realizacion de la presente invencion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con una termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A o un fragmento funcional en la que la isoleucina (Ile) de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con un aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cistema (Cys) y valina (Val), o una secuencia de aminoacidos en la que la serina (Ser) de la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con cistema.
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El Agrobacterium tumefaciens es una cepa bien conocida, y el Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970 se puede utilizar como un ejemplo.
De acuerdo con la invencion, la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre, derivada de Agrobacterium tumefaciens, tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A (Fig. 5) o un fragmento funcional de la misma. Como se utiliza en el presente documento, la expresion “fragmento funcional” puede hacer referencia a un fragmento que incluye mutaciones debido a una sustitucion, una insercion o una eliminacion de aminoacidos parciales de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y que tiene la actividad de convertir la fructosa en D-psicosa.
La variante de D-psicosa 3-epimerasa se refiere a una enzima que tiene una secuencia de aminoacidos en la que se sustituye un aminoacido en una posicion espedfica de la secuencia de aminoacidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre derivada de Agrobacterium tumefaciens.
La variante de D-psicosa 3-epimerasa representa que la isoleucina de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con leucina.
Otra realizacion de la presente invencion proporciona una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A o un fragmento funcional en el que la isoleucina (Ile) de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con un aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cistema (Cys) y valina (Val), y la serina (Ser) de la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con cistema.
Mas preferentemente, la variante de D-psicosa 3-epimerasa representa que la isoleucina de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos esta sustituida con leucina, y la serina de la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos esta sustituida con cistema.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un vector de expresion recombinante que incluye un gen de variante de D-psicosa 3-epimerasa (Fig. 1).
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona el Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 transformado con el vector de expresion recombinante.
La cepa recombinante Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 se deposito con el numero de acceso KCCM 11204P en la KCCM (Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos) localizado en Hongje 1-dong, Seodaemun-ku, Seul, Corea el 18 de agosto de 2011 de acuerdo con el tratado de Budapest.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un metodo para producir D-psicosa a partir de fructosa utilizando la variante de D-psicosa 3-epimerasa o el Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 recombinante.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un reactor inmovilizado para producir D-psicosa que comprenden una columna cargada con una perla en la que esta inmovilizada la variante de D-psicosa 3-epimerasa o el Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 recombinante.
La expresion “reactor inmovilizado” se refiere a un reactor en el que se lleva a cabo la reaccion para producir la D- psicosa por una cepa encapsulada en una perla de alginato, o mediante una columna cargada con una cepa o una enzima encapsulada en una perla de alginato. A saber, la inmovilizacion significa que una sustancia que proporciona una actividad biologica, en este caso, la D-psicosa 3-epimerasa o una cepa que incluye la misma esta inmovilizada en un vehmulo.
Como vehmulo para inmovilizar la variante de enzima o la cepa recombinante, se puede utilizar cualquiera de los vehmulos capaces de utilizarse para la inmovilizacion de enzimas o cepas en la tecnica relacionada sin limitacion. Preferentemente, se puede utilizar el alginato sodico.
El alginato sodico es un polisacarido coloidal natural que se encuentra abundantemente en las membranas celulares de algas y consiste en acido p-D-manuronico y acido a-L-guluronico. El alginato sodico forma enlaces beta-1,4 aleatoriamente en terminos de contenido y se pueden utilizar ventajosamente para la inmovilizacion de cepas o enzimas.
Otra realizacion mas de la presente invencion proporciona un metodo para producir D-psicosa introduciendo una solucion de fructosa en el reactor inmovilizado.
El termino “semivida” como se utiliza en el presente documento se refiere al periodo que se necesita para que la actividad relativa de la reaccion enzimatica inicial de una enzima o una variante de enzima se reduzca a 50, cuando la actividad relativa de la reaccion enzimatica inicial de la enzima o variante de enzima se asume que es de 100.
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La expresion “estabilidad de operacion” como se utiliza en el presente documento se refiere a un estado en el que un reactor se puede operar mientras se mantiene una productividad adecuada para producir continuamente un producto deseado (en la presente invencion, la D-psicosa) en comparacion con la actividad inicial. La estabilidad de operacion habitualmente se representa por el tiempo operacional (unidades de tiempo y similares).
De aqu en adelante, la presente invencion se describira con mas detalle en referencia a los siguientes ejemplos, y ejemplos comparativos. Se debena entender que estos ejemplos se proporcionan solo para ilustracion y no se consideran de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion.
Medicion de la actividad de la D-psicosa 3-epimerasa
La actividad de la D-psicosa 3-epimerasa se midio utilizando fructosa como sustrato de D-psicosa 3-epimerasa o se anadio una muestra que comprendfa D-psicosa 3-epimerasa a una solucion tampon de 50 mM de PIPES (piperazina-N,N'-bis (acido 2-etanosulfonico)) que contema 20 mM de sustrato, pH 8,0, seguido por una reaccion a 50 0C durante 10 minutos. A la reaccion que habfa reaccionado, se anadio acido clortndrico de manera que la concentracion final era de 200 mM para parar la reaccion. Se midieron las concentraciones de fructosa y D-psicosa utilizando una HPLC equipada con un detector RI (fndice de refraccion). El analisis HPLC se llevo a cabo con la condicion de que se inyectaba una muestra en un equipo de columna a 80 oc (columna BP-100 Ca2+ carbohidrato), se traspaso con agua destilada como fase movil a una velocidad de 0,5 ml/min. La unidad enzimatica se define como una cantidad que produce 1 mmol de D-psicosa por minuto en condiciones de pH 8,0 y 50 oc.
Ejemplo 1
Preparacion de la variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada por mutagenesis aleatoria
Se construyo una biblioteca de variantes de D-psicosa 3-epimerasa utilizando, como matriz, la D-psicosa 3- epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970 (que tiene una secuencia de aminoacidos identica a la SEQ ID NO: 1 desvelada en la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A, (Fig. 5) por medio de la reaccion en cadena de la polimerasa que tiende a errores (PCR tendente a error).
Espedficamente, se empleo un tfpico kit de mutagenesis por PCR que produce dos a tres mutaciones por 1000 pares de bases. Como cebador se utilizo un oligonucleotido, en el que se hadan introducido los sitios de las enzimas de restriccion Ncol y PstI, para ejecutar la reaccion en cadena de polimerasa, construyendo de esta manera una biblioteca genetica que codifica la variante de D-psicosa 3-epimerasa, que se inserto entonces en E. coli BL21.
El medio LB que contema 50 pg/ml de ampicilina se utilizo para cultivar E. coli BL21 que inclrna un plasmido en el que se habfa introducido un gen de una variante de la D-psicosa 3-epimerasa, seguido por cultivo a 37 oc durante 6 horas. Se tomo una parte de la solucion de cultivo, se transfirio a un medio que inclrna 50 pg/ml de ampicilina y 0,1 mM de IPTG (Isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosido), y luego se cultivo a 37 oc durante 6 horas para inducir la expresion de la enzima. La solucion de cultivo se trato por calor a 60 oc durante 5 minutos, seguido por la adicion de fructosa de manera que la concentracion fina lera de 15 mM, y luego se hizo reaccionar a 50 oc durante 30 minutos. Despues, utilizando un kit de ensayo de fructosa general, se midio la cantidad de fructosa residual y se seleccionaron 150 variantes que teman una actividad de aproximadamente 1,2 veces mayor que la enzima tipo silvestre comparando un total de 5000 variantes con la enzima de tipo silvestre.
Se indujeron las 150 variantes seleccionadas para que expresaran enzimas de nuevo de la misma manera que anteriormente. Las celulas cultivadas se sometieron a sonicacion para destruir las celulas. Las celulas destruidas se centrifugaron para obtener un sobrenadante que comprendfa D-psicosa 3-epimerasa. Despues, se midio la actividad enzimatica utilizando el “Metodo para medir la actividad de D-psicosa 3-epimerasa” mencionado anteriormente. Como resultado de la medicion, se re-seleccionaron 23 variantes que presentaban una alta semivida a temperatura de reaccion de 55 oc.
Los genes de las 23 variantes re-seleccionadas se transfirieron de pTrc99A a pET-24a(+), que se utilizo para transformar E. coli BL21. La cepa recombinante E. coli BL21 se cultivo en medio LB que contema 50 pg/ml de kanamicina a 37 oc. Cuando la DO600 alcanzo 0,6, se anadio IPTG (Isopropil-beta-tiogalactopiranosido) de manera que la concentracion final era 0,1 mM, seguido por el cultivo a 16 oc durante 16 horas. La solucion de cultivo se centrifugo para recolectar los componentes bacterianos, que entonces se re-suspendieron en 50 mM de solucion de tampon fosfato que inclrna 300 mM de KCl y 10 mM de imidazol. La solucion suspendida se sometio a ultrasonicacion para aplastar las celulas. La solucion celular destruida se centrifugo para recolectar un sobrenadante que inclrna la D-psicosa 3-epimerasa, que entonces se purifico utilizando una cromatograffa de afinidad de iones metalicos. Se retiro el imidazol de la enzima purificada empleando un cartucho de des-salado.
Se midio la semivida de las 23 variantes re-seleccionadas a 55 oc. Se seleccionaron las cinco variantes que presentaban la semivida mas alta. La actividad relativa y la semivida a 55 oc de las 5 variantes seleccionadas y la enzima de tipo silvestre se resumen en la Tabla 1.
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Tabla 1
D-psicosa 3-epimerasa
Actividad relativa (%) Semivida (min)
Tipo silvestre
100 ± 0,5 10 ± 2,3
S8T
29 ± 0,5 15 ± 0,3
I33L
88 ± 3,3 64 ± 0,2
G67C
8 ± 0,0 132 ± 0,4
V96A
51 ± 0,5 18 ± 0,2
S213C
103 ± 0,4 28 ± 0,7
Como resultado, se determinaron que eran, en orden descendente, G67C > I33L > S213C > V96A > S8T. En vista de la semivida junto con la actividad enzimatica, se identificaron dos variantes, I33L y S213C como las variantes mas preferidas.
Los nombres de las variantes enzimaticas que se utilizaron en el presente documento se explicaron utilizando, como ejemplo, I33L. El numero 33 significa que un aminoacido en la posicion 33 de una secuencia de aminoacidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre se ha sustituido, y las letras I y L a ambos lados del numero significan la letra inicial de los aminoacidos, respectivamente. En suma, I33L significa que la isoleucina (Ile) en la posicion 33 de una secuencia de aminoacidos de D-psicosa 3-epimerasa se ha sustituido con leucina (Leu).
Ejemplo 2
Preparacion de la variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada utilizando un diseno racional
De manera similar que en el Ejemplo 1, se seleccionaron las variantes S213C y I33L como variantes que teman una termoestabilidad mejorada sin reduccion significativa de la actividad. Basandose en las variantes seleccionadas se llevo a cabo la mutagenesis dirigida al sitio en las posiciones de aminoacido 33 y 213 de la secuencia de aminoacidos.
Espedficamente, la serina (Ser) en la posicion 213 que tiene polaridad y no carga se sustituyo con treonina (Thr), cistema (Cys) o metionina (Met) que tiene polaridad y no carga; una prolina (Pro) que es un aminoacido no polar; acido glutamico (Glu) que tiene una carga negativa; y lisina (Lys) que tiene una carga positiva, respectivamente.
La isoleucina en la posicion 33 que no tiene polaridad se sustituyo con cistema que tiene polaridad y no carga; valina (Val), leucina o prolina que es no polar; acido glutamico que tiene una carga negativa; y lisina que tiene una carga positiva, respectivamente.
Se midieron la actividad relativa y la semivida a 55 0C de las variantes, cuyos aminoacidos se sustituyeron como se menciona anteriormente, y de la enzima de tipo silvestre.
Como resultado, se obtuvieron las variantes I33L, I33C, I33V y S213C que teman una termoestabilidad mejorada sin afectar la actividad de las enzimas. Ademas, la variante S213c se combino con la variante I33L que era la variante mas preferida en vista de la actividad enzimatica y termoestabilidad entre las variantes que teman un aminoacido sustituido en la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos, obteniendo de esta manera una variante de D-psicosa 3-epimerasa (I33L-S213C) que tema una actividad excelente y una termoestabilidad extraordinariamente mejorada.
La Tabla 2 resume la actividad relativa y la semivida a 55 oc de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre derivada de Agrobacterium tumefaciens, las variantes en las que se habfan sustituido un aminoacido en la posicion 33 o 213, y las variantes en las que se habfan sustituido ambos aminoacidos de las posiciones 33 y 213.
Tabla 2
D-psicosa 3-epimerasa
Actividad relativa (%) Semivida (min)
Tipo silvestre
100 ± 0,5 10 ± 2,3
I33L
88 ± 3,3 63 ± 0,2
I33C
83 ± 2,0 24 ± 0,6
I33V
92 ± 2,2 12 ± 0,4
I33E
ND ND
I33K
ND ND
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25
30
35
40
D-psicosa 3-epimerasa
Actividad relativa (%) Semivida (min)
I33P
ND ND
S213C
103 ± 0,4 28 ± 0,7
S213P
95 ± 0,9 6 ± 0,2
S213T
68 ± 0,3 5 ± 0,1
S213M
22 ± 1,9 3 ± 0,3
S213E
19 ± 0,0 3 ± 0,1
S213K
ND ND
I33L-S213C
74 ± 1,1 265 ± 2,3
ND: No detectable
Ejemplo experimental comparativo 1
Comparacion de la temperatura de fusion aparente de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y variantes de D- psicosa 3-epimerasa de acuerdo con el Ejemplo 2.
Con el fin de determinar la termoestabilidad de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y las variantes de D- psicosa 3-epimerasa de acuerdo con el Ejemplos 2, es decir, I33L, S213C y I33L-S213C, se midio la temperatura de fusion aparente (Tm) de cada enzima (o variante).
Como resultado se podfa ver que la temperatura de fusion aparente, en orden ascendente era, tipo silvestre < S213C < I33L < I33L-S213C (Fig. 2). Espedficamente, al compararse con el tipo silvestre, la temperatura de fusion aparente estaba aumentada en aproximadamente 4,3 0C en el caso de la variante S213C, y aproximadamente 7,6 0C en el caso de la variante I33L-S213C.
Ejemplo experimental comparativo 2
Comparacion de tasa de reaccion enzimatica de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y las variantes de D- psicosa 3-epimerasa de acuerdo con el Ejemplo 2
Con el fin de determinar la tasa de reaccion enzimatica de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y las variantes de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con el Ejemplo 2, a saber, I33L, S213C e I33L-S213C, se observaron los parametros cineticos de cada enzima (o variante) a una temperatura de reaccion de 50 oc.
Los resultados de la medicion se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3
D-psicosa 3-epimerasa
Km (mM) kcat (min-1) kcat/Km
Tipo silvestre
44 ± 0,4 4338 ± 6 99 ± 0,9
S213C
42 ± 1,0 4194 ± 63 101 ± 3,0
I33L
40 ± 0,7 4240 ± 65 105 ± 2,5
I33L-S213C
31 ± 0,1 4135 ± 99 134 ± 3,2
Como resultado de la medicion de los parametros cineticos de cada enzima, la enzima de tipo silvestre y las variantes I33L y S213C presentaban valores similares, mientras que la variante I33L-S213C presentaba una eficacia catalftica enzimatica (kcat/Km) que era aproximadamente de 1,5 veces mayor que la de la enzima de tipo silvestre y las variantes I33L y S213C. Esto es debido a que I33L-S213C forma un enlace de hidrogeno adicional en comparacion con las otras variantes o la enzima de tio silvestre, y una nueva interaccion acumulada de grupos aromaticos que no se encuentran en la enzima de tipo silvestre, formando de esta manera una estructura mas dura y densa que a su vez aumenta la afinidad por el sustrato (Fig. 3).
Mas espedficamente, en vista de los resultados de modelado molecular, a diferencia de la enzima de tipo silvestre que tiene una serina en la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos y una isoleucina en la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos, que no existen en el sitio activo sino en la superficie de la enzima, se descubrio que la I33L-S213C forma una interaccion de superenrollamiento entre la cistema de la posicion 213 y la leucina (Leu) en la
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posicion 33 de la secuencia de aminoacidos (Fig. 3 (a), (b)). Se sabe que dicha interaccion de superenrollamiento estabiliza la estructura de las protemas.
Ademas, se sabe que la serina en la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos de la enzima forma dos supuestos enlaces de hidrogeno. Sin embargo, para S213C donde la serina en la posicion 213 de la secuencia de aminoacido se sustituye con cistema, se podfa ver que los supuestos enlaces de hidrogeno estaban aumentados a seis [Fig. 3 (c), (d)], que se determino que tambien hadan mas densa la estructura de la proterna, contribuyendo al aumento de la termoestabilidad.
Ademas, en el modelado molecular, la enzima de tipo silvestre parece que no tiene interacciones entre los grupos aromaticos. Por el contrario, se podfa ver que la variante I33L presentaba interacciones acumuladas entre los grupos aromaticos (Fig. 3 (e), (f)). Se determino que la interaccion acumulada entre grupos aromaticos es un factor de aumento de la termoestabilidad.
Ejemplo 3
Preparacion y cultivo de una cepa recombinante transformada con un vector recombinante que incluye un gen de la variante I33L-S213C de acuerdo con el Ejemplo 2
(1) Preparacion de la cepa recombinante
Se amplifico un gen que codifica la D-psicosa 3-epimerasa mediante una reaccion en cadena de polimerasa utilizando el ADN de la variante I33L-S213C de acuerdo con el Ejemplo 2 como matriz y un oligonucleotido en el que se introdujeron secuencias de sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion PstI y Xbal como cebador. Con el fin de expresar la D-psicosa 3-epimerasa codificada por el gen amplificado a gran escala, se construyo un vector de expresion pFIS-1-ATPE-2 recombinante (Fig. 1) insertando el producto PCR amplificado cortado por las enzimas de restriccion PstI y Xbal en un vector lanzadera pCJ-1 (depositado en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM), que es un deposito internacional, el 8 de noviembre de 2004 con el numero de acceso KCCM-10611) derivado de una bacteria perteneciente al genero Corynebacterium.
El vector de expresion recombinante se introdujo en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 por transformacion utilizando electroporacion para preparar una cepa recombinante capaz de expresar un gen que codificaba D-psicosa 3-epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens.
La cepa recombinante se denomino Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 y se deposito en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 18 de agosto de 2011 con el numero de acceso KCCM 11204P.
(2) Cultivo de la cepa recombinante
La cepa recombinante que se obtiene en (1) anteriormente se inoculo en un medio MB que contema 10 pg/ml de kanamicina (10 g/l de Bacto-triptona, 5 g/l de extracto de Bacto-levadura, 5 g/l de NaCl, 5 g/l de Soytone) con una concentracion inicial de DO600 = 0,1 seguido por el cultivo a 30 0C durante 24 horas para inducir la expresion de variantes de D-psicosa 3-epimerasa. La solucion de cultivo obtenida se inoculo en un fermentador cargado con un medio de mutacion (8 g/l de glucosa, 20 g/l de soytone, 10 g/l de (NH^SO4, 1,2 g/l de KH2PO4, 1,4 g/l de MgSO4) que contema 10 pg/ml de concentracion de kanamicina a DO600 = 0,6, y se cultivo a 30 oc durante 20 horas.
Ejemplo 4
Inmovilizacion de la cepa recombinante de acuerdo con el Ejemplo 3 y preparacion continua de D-psicosa mediante el reactor inmovilizado
Tras el cultivo de la cepa recombinante de acuerdo con el Ejemplo 3, las celulas bacterianas se recolectaron por centrifugacion de la solucion de cultivo. Las celulas recolectadas se suspendieron en 50 mM de solucion de tampon EPPS (pH 8,0) de manera que la concentracion de las celulas recolectadas era del 20 %. Las celulas bacterianas de la cepa recombinante suspendida se anadieron a una solucion acuosa del 2 % (v/v) de alginato sodico. La solucion mixta se anadio gota a gota en 100 mM de CaCl2 mediante una bomba con jeringa y una bomba de vaco para generar el conjugado celulas bacterianas-alginato donde las celulas bacterianas se atraparon en una perla de alginato sodico. La D-psicosa se preparo continuamente utilizando un reactor inmovilizado formado cargando una columna de lecho empaquetado con la cepa recombinante inmovilizada en alginato sodico.
Ejemplo experimental comparativo 3
Comparacion de la estabilidad de operacion de un reactor inmovilizado utilizando una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y un reactor inmovilizado de acuerdo con el Ejemplo 4
Con el fin de medir la estabilidad de operacion de un reactor inmovilizado utilizando una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre y un reactor inmovilizado de acuerdo con el Ejemplo 4, la temperatura de reaccion se fijo a 50 0C, y en los respectivos reactores, se preparo la D-psicosa continuamente durante dos meses, y luego se midio la actividad de D-psicosa. La concentracion de fructosa era de 480 g/l y el caudal era de 850 ml/h.
5
Como resultado, al compararse con un reactor inmovilizado que utiliza el tipo silvestre, se podfa ver que el reactor inmovilizado que utiliza variantes con termoestabilidad mejorada y actividad enzimatica manteman una estabilidad de operacion alta durante mas de dos meses. Espedficamente, el reactor inmovilizado que utiliza el tipo silvestre presentaba una semivida de aproximadamente 30 dfas de semivida, mientras que el reactor inmovilizado que utiliza 10 la variante I33L-S213C presentaba una semivida de aproximadamente 77 dfas (Fig. 4).
Por lo tanto, se espera que las enzimas de acuerdo con la presente invencion se pueden utilizar durante mucho tiempo, reduciendo de esta manera los costes de produccion de la D-psicosa.
15

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene una secuencia de
    aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A o un fragmento
    funcional, en la que la isoleucina (Ile) de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con un
    aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cistema (Cys) y valina (Val), o una
    secuencia de aminoacido en la que la serina (Ser) de la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con cistema.
  2. 2. Una variante de D-psicosa 3-epimerasa con termoestabilidad mejorada, donde la variante tiene una secuencia de
    aminoacidos de SEQ ID NO: 1 de la Publicacion de Patente Coreana N° 10-2011-0035805A o un fragmento
    funcional, en la que la isoleucina (Ile) de la posicion 33 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con un
    aminoacido que se selecciona de entre el grupo que consiste en leucina (Leu), cistema (Cys) y valina (Val), y la serina (Ser) de la posicion 213 de la secuencia de aminoacidos se sustituye con cistema.
  3. 3. Un vector de expresion recombinante que comprende un gen que codifica la variante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2.
  4. 4. Un Corynebacterium glutamicum pFIS-1-ATPE-2 transformado con el vector de expresion recombinante de acuerdo con la reivindicacion 3.
  5. 5. Un metodo de produccion de D-psicosa a partir de fructosa utilizando la variante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2.
  6. 6. Un metodo de produccion de D-psicosa a partir de fructosa utilizando el Corynebacterium glutamicum pFIS-1- ATPE-2 recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4.
  7. 7. Un reactor inmovilizado para producir D-psicosa que comprende una columna cargada con un vehmulo en el que se inmoviliza la variante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2.
  8. 8. Un metodo de produccion de D-psicosa introduciendo una solucion de fructosa en el reactor inmovilizado de acuerdo con la reivindicacion 7.
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