CN111057719A - 一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用，其包括以下步骤：1)首先将293T细胞传代至60mm*15mm皿中，培养过夜，使其密度达到80％，按照目的质粒/psPAX2/pMD2.G的顺序以6/3/1的比例进行慢病毒的包装，以获得高滴度慢病毒，滴度为2～3×107TU/mL(总体积5mL)；2)取小鼠骨髓，加入鼠源M‑CSF(10ng/mL)进行巨噬细胞诱导，在诱导的第二天加入慢病毒，可以获得高转染效率。本发明在巨噬细胞诱导过程中加入慢病毒，不但能够提高了慢病毒的转染效率，同时还能在不影响巨噬细胞得率的情况下，缩短实验时间。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体为一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染方法及其应用。
背景技术：
转染是分子生物学和细胞生物学领域的重要实验技术，是将外来遗传物质转移到真核细胞中的专门技术。随着基因和蛋白质功能研究的深入，转染已成为现代分子生物学研究中常见的基本方法，将外源遗传物质引入细胞为细胞水平的基因功能研究奠定了基础。随着近年来基因工程技术的不断发展，出现了多种多样的转染技术，按外源遗传物质是否与基因组整合来分，转染技术为稳定转染和瞬时转染两大类；按转染实施手段来分，转染技术分为物理介导、化学介导和生物介导三大类。
物理介导的方法中比较常用的是电穿孔法，但细胞敏感性较高，且对细胞活力影响较大。目前实验室最常用的是化学介导方法，以脂质体转染法最为普遍，商品化脂质体转染试剂易于使用和购买，对于293T等容易转染的细胞，转染效率较高且毒性较低，但对于原代细胞及其他难转细胞，脂质体技术的转染效率较低，无法满足实验要求，限制了该方法的使用。生物介导的方法常用的是慢病毒转染技术和腺病毒转染技术，适用于较难转细胞如原代细胞，但制备过程较为复杂，且影响转染效率因素较多。针对不同模型，使用不同的转染方法，转染技术的不同影响着转染效率，从而影响到整个实验结果。因此在进行细胞转染前，需对转染方法及需转染的细胞等因素进行综合分析，筛选出转染的最适方法和条件，已达到最高转染效率，满足实验要求。
慢病毒载体是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)为基础发展起来的病毒载体，包含了病毒包装、基因转染、稳定整合基因组所需要的遗传信息，是慢病毒系统的主要组成部分。慢病毒载体可以感染处于有丝分裂活跃期的细胞，也可以感染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括神经干细胞、造血干细胞、肝实质细胞和处于分化终末的神经元等。在体外培养细胞实验和体内基因治疗实验中，由慢病毒载体携带需转入的目的基因以得到可以长期而稳定的表达。此外，经过改建后的慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，可以容纳约10kb左右的外源基因，因此大多数基因的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。这些优点使慢病毒载体成为体内和体外基因转染的一种有效工具。
巨噬细胞是单核-吞噬细胞系统中的重要成员，分布在身体的各个器官、组织中。巨噬细胞具有广泛的功能，包括吞噬、抗原递呈、防御微生物的细胞毒性作用，以及分泌生长因子、细胞因子、补体成分、溶菌酶、蛋白酶、凝血因子和前列腺素等，对机体的免疫功能、炎症反应、组织重塑和疾病产生等具有重要作用。巨噬细胞可以被多种刺激信号激活，如病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)，以及组织微环境中的细胞因子等，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。巨噬细胞还调控着炎症的起始和消退，在抗感染方面起到了“哨兵”的角色。同时巨噬细胞也可以促进机体正常发育，维持体内平衡状态，在特定的病理条件下也对疾病的形成起到关键作用，如自身免疫病、自身炎症性疾病、代谢性疾病以及肿瘤等。
体外将骨髓细胞诱导成巨噬细胞是研究巨噬细胞表型及功能的一个重要方法。骨髓来源的巨噬细胞相比于细胞株更贴合正常生理状态，同时相比腹腔巨噬细胞更偏向于静息状态，因此该细胞更加适用于巨噬细胞相关实验模型的构建。由于脂质体转染巨噬细胞，容易使其极化，从而影响后续实验结果，因此对于巨噬细胞转染时更多会采用慢病毒转染方式。骨髓来源巨噬细胞不具有增殖能力，为了保证后续实验结果准确，因此需要较高的转染效率。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种高效的小鼠骨髓来源巨噬细胞的慢病毒转染方法，该方法不仅提高了小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染效率，而且在不影响巨噬细胞得率的情况下，缩短实验时间。
本发明提供的小鼠来源巨噬细胞的慢病毒转染方法，包括以下步骤：
1.先将293T细胞传代至60mm*15mm皿中，37℃、5％CO2培养箱内培养过夜，使其密度达到80％。
2.将慢病毒包装质粒按照目的质粒/psPAX2/pMD2.G的顺序以6∶3∶1的比例进行慢病毒的包装，以获得高滴度慢病毒，滴度为2～3×107TU/ml(总体积5ml)，浓缩至体积100μl。
3.取小鼠骨髓，加入鼠源的M-CSF(20ng/mL)进行巨噬细胞诱导，在诱导的第二天加入慢病毒，第7天流式检测转染效率以及巨噬细胞诱导情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.优化了慢病毒包装体系，按照目的质粒/psPAX2/pMD2.G的顺序以6/3/1的比例进行慢病毒的包装，可以获得高滴度慢病毒。
2.在小鼠来源巨噬细胞诱导的第二天加入慢病毒，大大提高了小鼠骨髓来源巨噬细胞的转染效率，阳性转染率可达60％。
3.在不影响巨噬细胞得率的情况下，缩短实验时间为7天。
附图说明：
图1(A)检测五组1mL慢病毒包装体系的病毒滴度，包装的比例为目的质粒/psPAX2/pMD2.G＝X/3/1，X＝2/4/6/8/10(B)检测三组5mL慢病毒包装体系的病毒滴度，包装比例为目的质粒/psPAX2/pMD2.G＝X/3/1，X＝4/6/8。
图2小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)转染时间流程。
图3不同时间点侵染BMDM的EGFP表达，分别在m-csf诱导BMDM的第0、1、2、3、4天进行慢病毒侵袭，转染后每天检测。(A)荧光显微镜检测EGFP表达情况；(B)流式检测EGFP表达情况
具体实施方式：
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并未用于限定本发明的范围。
慢病毒的制备及包装体系的优化
1)293T细胞准备：转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，将细胞密度为2.5×106细胞/5ml，重新接种于60mm*15mm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养过夜。待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。
2)转染步骤：取2个PE管，其中各加入250μL Opti-MEM培养基；在A管中按照plvx-EGFP/psPAX2/pMD2.G的顺序，设置了5组不同的包装比例：2/3/1；4/3/1；6/3/1；8/3/1；10/3/1，；在B管中加入27μL lipo2000，混匀并室温放置5min；将A管、B管混合，室温放置20min。将上述DNA/lipo2000复合物逐滴加入到细胞培养皿中，轻轻摇匀，放回培养箱继续培养；6小时后换液，加入5mL预热的完全培养基。
3)病毒收获及浓缩：收集转染48小时后的293T细胞上清液，离心(1500rpm，10min)去除细胞碎片，上清用0.45μm滤器过滤；将病毒浓缩液与过滤后的病毒上清以1∶4加入，混匀后4℃孵育过夜(12小时以上)；将病毒混合液离心(2000g，30min)，离心管底部会出现白色沉淀，弃去上清，再离心(2000g，5min)，吸去所有残留液体，同时不要破坏已经沉淀的病毒颗粒；用1/10的体积DMEM培养基重悬病毒沉淀，立即使用或分装保存于-80℃。
96孔稀释法测定慢病毒滴度
1)测定前一天，293T细胞铺板，在96孔板中每个孔加4×104个细胞，体积为100μL。
2)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌EP管。在每个管中加入90μL的无血清培养基。将待测定的病毒原液10μL加入到第一个管中，混匀后，取10μL加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。
3)选取对应的细胞孔，吸90μL培养基，丢弃。加入90μL稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。
4)24小时后，加入完全培养基100μL。小心操作，避免吹起细胞。
5)24小时后，观察并记录荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
6)滴度计算：第一个EP管中加入10μL病毒原液，记为10-1μL；第二个EP管中进行了第二次十倍稀释，记为10-2μL；第三个EP管记为10-3μL，第四个EP管记为10-4μL，以此类推，根据荧光镜检中GFP表达情况，例如在加入1E-6μL病毒原液的孔中观察到2个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是2×106，单位为TU/μl，即2×109TU/ml。
结果显示慢病毒包装体系为plvx-EGFP/psPAX2/pMD2.G按照6/3/1的比例能够获得最大程度的获得高滴度的慢病毒。
小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的分离及培养
1)BALB/c 8周龄雌性小鼠处死后，在无菌环境下完整取出小鼠双侧股骨与胫骨，仔细分离肌肉等组织，转移至超净台。
2)用灭菌PBS冲洗多遍，将股骨和胫骨的两端剪开，用1mL注射器吸取PBS将骨髓吹出可见红色团块，重复多次至骨变白。
3)将骨髓细胞悬液过40μM滤网至50ml离心管，离心(1000rpm，5min)。
4)弃去上清，用3mL红细胞裂解液重悬，室温裂解5min。
5)用PBS补齐至30mL，离心(1000rpm，5min)，弃上清。
6)按照1.5×106个/mL重悬于含10％FBS的DMEM完全培养基。
7)加入鼠源的M-CSF(20ng/mL)诱导。
BMDM慢病毒转染及转染条件优化
分别在M-CSF诱导BMDM的第0、1、2、3、4天进行慢病毒侵袭，并在转染后每天跟踪流式检测EGFP表达情况。
结果显示，慢病毒侵染后，EGFP的表达随时间逐渐升高，在M-CSF诱导的第6天和第7天趋于稳定；在M-CSF诱导BMDM的第2天进行慢病毒侵染，第6天和第7天流式检测EGFP的表达最高，达到60％；而一般BMDM转染方式(M-CSF诱导第四天转染)其EGFP表达仅有10％左右。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种慢病毒介导的小鼠骨髓来源巨噬细胞的高效转染方法，所述方法包括以下步骤：
1)按照目的质粒/psPAX2/pMD2.G的顺序以6∶3∶1的比例在293T细胞中进行慢病毒的包装，获得高滴度慢病毒；
2)取小鼠骨髓细胞，加入鼠源M-CSF(10ng/mL)进行诱导，在诱导的第二天加入慢病毒，持续诱导培养7天，获得高转染巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于目的质粒/psPAX2/pMD2.G比例为6∶3∶1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于病毒滴度为2～3×107TU/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包装病毒所用的细胞是293T细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该转染方法所针对的细胞是小鼠骨髓来源的巨噬细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在小鼠骨髓细胞诱导成巨噬细胞的第二天加入慢病毒。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于加入病毒后，不进行换液，继续诱导培养至第7天，贴壁细胞为巨噬细胞。
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