CZ286766B6 - Attenuated virus strain, process of its preparation, vaccine, process of its preparation, cellular clone and use of the attenuated strain - Google Patents

Attenuated virus strain, process of its preparation, vaccine, process of its preparation, cellular clone and use of the attenuated strain Download PDF

Info

Publication number
CZ286766B6
CZ286766B6 CZ19973377A CZ337797A CZ286766B6 CZ 286766 B6 CZ286766 B6 CZ 286766B6 CZ 19973377 A CZ19973377 A CZ 19973377A CZ 337797 A CZ337797 A CZ 337797A CZ 286766 B6 CZ286766 B6 CZ 286766B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
strain
virus
attenuated
vaccine
prrs
Prior art date
Application number
CZ19973377A
Other languages
Czech (cs)
Other versions
CZ337797A3 (en
Inventor
Burch Reina Alemany
Maso Enric Espuea
Pujadas Pere Riera
Roca Narcis Saubi
Original Assignee
Hipra Lab Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hipra Lab Sa filed Critical Hipra Lab Sa
Publication of CZ337797A3 publication Critical patent/CZ337797A3/en
Publication of CZ286766B6 publication Critical patent/CZ286766B6/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983Viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525Virus
    • A61K2039/5254Virus avirulent or attenuated
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552Veterinary vaccine
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/10011Arteriviridae
    • C12N2770/10021Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/10011Arteriviridae
    • C12N2770/10034Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/10011Arteriviridae
    • C12N2770/10061Methods of inactivation or attenuation
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/815Viral vaccine for porcine species, e.g. swine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

In the present invention there is disclosed an attenuated virus strain causing pig disease known as pig reproduction and respiration syndrome (PRRS) that completely corresponds to a deposit with number I-1642 in CNCM Institut Pasteur deposited on November 23, 1995. In the present invention there is also indicated a cellular clone C8 CNCMI-1643 in which the PRRS virus is capable of replication up to high titer 10e5 to 10e7 TCIDi50/ml. In the present invention there are further claimed a process for preparing such virus, a vaccine containing thereof and its preparation process as well as the use of the attenuated virus strain for preparing the vaccine.

Description

Atenuovaný kmen viru, způsob jeho přípravy, vakcína, způsob její přípravy, buněčný klon a použití atenuovaného virového kmeneAttenuated virus strain, method of its preparation, vaccine, method of its preparation, cell clone and use of attenuated virus strain

Oblast technikyTechnical field

Tento vynález se týká nového atenuovaného kmenu viru způsobujícího chorobu prasat známou jako reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS). Atenuační a replikační postupy virulentního kmene za použití nového klonu buněk získaného z opičích ledvin umožňují přípravu vakcín a diagnostických kitů, které dovolují časnou diagnosu PRRS a účinnou preventivní léčbu tohoto onemocnění.The present invention relates to a novel attenuated strain of a virus causing pig disease known as porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS). The attenuation and replication procedures of a virulent strain using a new monkey kidney cell clone allow the preparation of vaccines and diagnostic kits that allow early diagnosis of PRRS and effective preventive treatment of the disease.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

V roce 1987 byla prvně detekována v Severní Americe choroba prasat, která byla vtom okamžiku definována jako „Zásadní choroba prasat“ nebo MSD, a později byla známá jako „syndrom prasečí neplodnosti a poruch respirace“, neboli SIRS. Velmi podobný syndrom byl poprvé detekován ve střední Evropě v roce 1990 a později se šířil do jiných evropských zemí, včetně Španělska. Na začátku bylo onemocnění v Evropě pojmenováno jako „Epidemické potraty a respirační syndrom u vepřů“ neboli PEARS a nakonec jako „Reprodukční a respirační syndrom prasat“ neboli PRRS. Toto pojmenování bylo ve světě akceptováno pro toto onemocnění.In 1987, pig disease was first detected in North America, which at that time was defined as 'Major Swine Disease' or MSD, and later known as 'Pig Infertility and Respiratory Disorder Syndrome', or SIRS. A very similar syndrome was first detected in Central Europe in 1990 and later spread to other European countries, including Spain. Initially, the disease was named in Europe as "Epidemic Abortion and Pig Respiratory Syndrome" or PEARS and finally as "Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome" or PRRS. This name has been accepted worldwide for this disease.

Je již známo, že etiologickým agens PRRS je malý enkapsulovaný RNA virus, poprvé izolovaný v Holandsku a pojmenovaný jako Lelystad virus. Bylo naznačeno, že virus patří ke skupině Arteviridae. Tento virus byl popsán v patentové přihlášce PCT WO-92/21357 a v Evropské patentové přihlášce EP-B-0587780 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut), kde druhá je odvozená od první. Pro účel této přihlášky byl izolát výše uvedeného viru deponován v Institut Pasteur of Paris, pod čísle 1-1102.It is already known that the etiological agent of PRRS is a small encapsulated RNA virus, first isolated in the Netherlands and named as Lelystad virus. It has been suggested that the virus belongs to the Arteviridae group. This virus has been described in PCT patent application WO-92/21357 and European patent application EP-B-0587780 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut), the latter being derived from the first. For the purpose of this application, an isolate of the above virus was deposited with the Institut Pasteur of Paris, number 1-1102.

Severoamerický typ viru byl izolován téměř simultánně s evropským typem viru, jak je popsáno v patentové přihlášce PCT WO 93/03760 (Collins et al.) a v evropské patentové přihlášce EP-A0529584 (Boehringer Ing.). Pro účely této přihlášky byl izolát výše uvedeného viru deponován v Američan Type Culture Collection (ATCC), č. VR-2332.The North American virus type was isolated almost simultaneously with the European virus type as described in PCT patent application WO 93/03760 (Collins et al.) And in European patent application EP-A0529584 (Boehringer Ing.). For the purposes of this application, the isolate of the above virus was deposited in American Type Culture Collection (ATCC), No. VR-2332.

Evropský a severoamerický typ viru jsou jasně odlišné, nejen s ohledem na serologickou reaktivitu, ale také s ohledem na stupeň homologie sekvence nukleotidů signifikantních RNA fragmentů. Na prvních dvou stranách evropské patentové přihlášky EP-A-0676467 (Akzo) je podrobný popis těchto rozdílů, s rozsáhlou citací literatury. Ve výše uvedené patentové přihlášce je usouzeno, že evropský typ a americký typ virů jasně divergovali před dlouhou dobou. V důsledku toho může být očekáváno, že eventuální účinná vakcína proti jednomu z těchto typů bude málo ne nebude vůbec účinná proti druhému typu.The European and North American virus types are clearly different, not only with regard to serological reactivity, but also with regard to the degree of homology of the nucleotide sequence of the significant RNA fragments. On the first two pages of European patent application EP-A-0676467 (Akzo) there is a detailed description of these differences, with extensive references to the literature. In the aforementioned patent application, it is considered that the European type and the American type of viruses clearly diverged a long time ago. As a result, it can be expected that an eventually effective vaccine against one of these types will be little or no effective at all against the other type.

Byly izolovány různé kmeny jak z evropského, tak z amerického typu viru. Každý kmen má svou vlastní specifickou charakteristiku, a několik kmenů bylo objektem patentové přihlášky. Například, patentová přihláška PCT WO-93/07898 (Akzo) popisuje evropský kmen, a vakcínu od něho odvozenou, deponovaný v CNCM (Institut Pasteru), č. 1-1140. Patentová přihláška PCT WO93/14196 a evropská patentová přihláška EP-A-541418 (Rhone-Merieux), obě odvozené od přihlášky stejné priority, popisují nový kmen izolovaný ve Francii, deponovaný v CNCM (Institut Pasteur), č. 1-1153. Evropská patentová přihláška EP-A-0595436 (Solvay) popisuje nový kmen amerického typu, více viruentní než dříve popsané, a jeho vakcínu. Tento kmen byl deponován v ATCC, ale přírůstkové číslo není v této přihlášce podrobně uvedeno. Konečně, španělská patentová přihláška ES-A-2074950 (Canamid Iberica) popisuje takzvaný „španělskýVarious strains were isolated from both European and American virus types. Each strain has its own specific characteristics, and several strains have been the subject of a patent application. For example, PCT patent application WO-93/07898 (Akzo) describes a European strain, and a vaccine derived therefrom, deposited at CNCM (Institut Paster), No. 1-1140. PCT patent application WO93 / 14196 and European patent application EP-A-541418 (Rhone-Merieux), both derived from the application of the same priority, describe a new strain isolated in France, deposited by CNCM (Institut Pasteur), No. 1-1153. European patent application EP-A-0595436 (Solvay) describes a new strain of the American type, more viruent than previously described, and a vaccine thereof. This strain has been deposited with the ATCC, but the accession number is not detailed in this application. Finally, Spanish patent application ES-A-2074950 (Canamid Iberica) describes a so-called "Spanish

-1 CZ 286766 B6 kmen“, který je odlišný od jiných evropských a amerických kmenů. Tento „španělský kmen“ byl deponován v European Animal Cell Culture Collection (EACCC), č. V93070108.Strain ', which is different from other European and American tribes. This "Spanish strain" was deposited at the European Animal Cell Culture Collection (EACCC), No. V93070108.

Závěrem, zdá se jasné, že etiologické agens PRRS ukazuje mnoho variet a pro účinný boj proti této chorobě, jsou potřeba vakcíny různých typů závisející na kmenu viru, který infikuje prasata.In conclusion, it seems clear that the etiological agent of PRRS shows many varieties and to effectively combat this disease, vaccines of various types are needed depending on the strain of virus that infects pigs.

U sviní je onemocnění charakterizováno ztrátou apetitu, anorexií, poruchami reprodukce (potraty, předčasnými porody, porody mrtvých nebo slabých selat a smrtí plodu, s nebo bez mumifikace). Některá infikovaná prasata mohou zemřít. Méně obvyklými příznaky je transientní mokré zbarvení uší, břicha nebo vulvy; podle tohoto byla choroba prvně známa jako „modiý potrat“ v Holandsku a „modré uši“ ve Velké Britanii. U novorozených selat může být pozorována dušnost nebo třes, zatímco u starších selat je častější posteriomí paresa a ataxie. Při vrcholu vypuknutí onemocnění je mortalita během prvních dní omezena, ale může dosáhnout až 80 % u desetidenních selat. Infikovaná krmená selata pijí méně a vykazují více respiračních problémů.In swine, the disease is characterized by loss of appetite, anorexia, reproductive disorders (abortion, premature birth, birth of dead or weak piglets and fetal death, with or without mummification). Some infected pigs may die. Less common symptoms are transient wet discoloration of the ears, abdomen or vulva; according to this, the disease was first known as 'blue abortion' in the Netherlands and 'blue ears' in Great Britain. Dyspnoea or tremor may be observed in newborn piglets, whereas posterior paresis and ataxia are more common in older piglets. At the peak of the outbreak, mortality during the first days is limited, but may reach as much as 80% in ten-day piglets. Infected feeding piglets drink less and exhibit more respiratory problems.

Inkubační doba onemocnění je velmi variabilní, v rozmezí od 5 do 37 dní (I.B. Robertson Europ. Comm. Comm. Seminář on PRRS, 11:4 - 5, Brussels, 1991). Někdy se onemocnění šíří velmi pomalu, ale pokud je postižena farma, pak může onemocnění přetrvávat několik měsíců (B. Thacker, Int. Symp. on SIRS, St. Paul/Minnesota, 1992).The incubation period of the disease is very variable, ranging from 5 to 37 days (I.B. Robertson Europ. Comm. Comm. Seminar on PRRS, 11: 4-5, Brussels, 1991). Sometimes the disease spreads very slowly, but if the farm is affected, the disease may persist for several months (B. Thacker, Int. Symp. On SIRS, St. Paul / Minnesota, 1992).

Protilátky proti viru byly detekovány imunoperoxidasovou technikou (imunoperoxidasový monovrstevný test, zde IPMA) v den 6 po-infekci, jak je popsáno Wensvoortem, G., et al. (The Vet. Quart. 13: 121-130, 1991). Titry protilátek mohou dosáhnout 1/20 000 o pět dní později, a obyčejně persistují více než 12 měsíců. Nicméně, některá prasata se stanou seronegativními o 4 - 5 měsíců později, jak to popsal V. Ohlinger et al., Meredith, M. De. Pig Dis. Info. Center Cambridge, 12/1992. Tito autoři byli schopni izolovat virus po infekci z různých orgánů, s titrem viru dosahujícím 104 TCID50 (infekční dávka pro tkáňovou kulturu 50 %) 6 dní po infekci v homogenátech plic, séra, plazma a krevních buněk. Toto ukazuje, že virus a protilátky spolu mohou persistovat několik týdnů, kromě toho, je dobře známo, že zvířata, která přežívají vypuknutí onemocnění mohou být zdrojem infekce pro citlivá zvířata. Viremie může být detekována od dnu 1 po infekci a může trvat do 56 dní, ačkoliv je obvykle kratší.Anti-virus antibodies were detected by the immunoperoxidase technique (immunoperoxidase monolayer assay, herein IPMA) on day 6 post-infection, as described by Wensvoort, G., et al. (The Vet. Quart. 13: 121-130, 1991). Antibody titers can reach 1/20,000 five days later, and usually persist for more than 12 months. However, some pigs become seronegative 4-5 months later, as described by V. Ohlinger et al., Meredith, M. De. Pig Dis. Info. Center Cambridge, 12/1992. These authors were able to isolate virus after infection from various organs, with a virus titer reaching 10 4 TCID 50 (tissue culture infectious dose 50%) 6 days after infection in lung, serum, plasma and blood cell homogenates. This shows that the virus and antibodies can persist for several weeks, moreover, it is well known that animals that survive the outbreak of disease can be a source of infection for susceptible animals. Viremia can be detected from day 1 after infection and can last up to 56 days, although it is usually shorter.

Při hematogenním šíření viru může virus dosáhnout placenty pregnantních sviní. Bylo ukázáno, že virus může procházet placentou a způsobovat smrt plodu. Maximální citlivost plodu se vyskytuje během třetí třetiny gestace. Kromě toho, virus je schopen replikace v plodu bez toho, že by způsobil jeho smrt. Nicméně, virus nebyl nikdy izolován z mumifíkovaných nebo autolysovaných plodů.In the hematogenous spread of the virus, the virus can reach the placenta of pregnant sows. It has been shown that the virus can cross the placenta and cause fetal death. Maximum fetal sensitivity occurs during the third third of gestation. In addition, the virus is capable of replicating in the fetus without causing death. However, the virus has never been isolated from mummified or autolysed fetuses.

U selat se nástup onemocnění projevuje tehdy, když je hladina kolostrálních mateřských protilátek snížena. U živě narozených selat od sviní infikovaných v poslední třetině březosti byly pozorovány některé případy selat s protilátkami proti viru před tím, než byla pozorována sekrece kolostra. Obvykle tato zvířata vykazují viremii při narození (C. Terpstra et al, Vet. Q. 13: 131 136, 1991).In piglets, the onset of the disease occurs when the level of colostral maternal antibodies is reduced. In live-born piglets from sows infected in the last third of pregnancy, some cases of piglets with anti-virus antibodies were observed before colostrum secretion was observed. Usually, these animals show viremia at birth (C. Terpstra et al, Vet. Q. 13: 131 136, 1991).

I přes destrukci velkého počtu makrofágů nebyla imunosupresorická aktivita PRRS - způsobujícího viru jasně prokázána. Nicméně, asociované sekundární infekce jsou časté, a způsobují vážné ekonomické ztráty na prasečích farmách.Despite the destruction of a large number of macrophages, the immunosuppressor activity of PRRS-causing virus has not been clearly established. However, associated secondary infections are common and cause serious economic losses on pig farms.

V současnosti byl PRRS virus nalezen ve většině zemí s významnou populací prasat.Currently, the PRRS virus has been found in most countries with a significant pig population.

V současnosti je PRRS jednou z nejvýznamnějších onemocnění postihujících prasata díky sekundárním ztrátám, jak přímým, tak nepřímým, způsobeným sekundárními agens po infekci PRRS virem.Currently, PRRS is one of the most important diseases affecting pigs due to secondary losses, both direct and indirect, caused by secondary agents after infection with PRRS virus.

-2CZ 286766 B6-2GB 286766 B6

Použití inaktivovaných vakcín redukovaných v prasečích kulturách alvoelámích makrofágů (PAM) dává akceptovatelné výsledky na laboratorní úrovní, ale účinnost v polních podmínkách závisí, částečně, na podmínkách prostředí a na chovu vakcinovaných zvířat.The use of inactivated vaccines reduced in porcine alvolar macrophage (PAM) cultures gives acceptable results at laboratory level, but efficacy in field conditions depends, in part, on environmental conditions and the breeding of vaccinated animals.

Jedním z problémů, které brání získání imunologických produktů proti PRRS viru je omezená dostupnost stabilních substrátů pro replikaci viru.One of the problems that hinders the acquisition of immunological products against PRRS virus is the limited availability of stable substrates for virus replication.

Dosud mohl být PRRS virus aplifikován pouze v kulturách prasečích alveolámích makrofágů (PAM) (Wensvoort G., et al., vThe Vet. Quart. 13 : 121-130, 1991). Potřeba použití zdravých prasat jistého věku pro získání těchto makrofágů implikovala vážné překážky. Kromě toho, citlivost na virovou infekci nebyla garantována v získaných PAM, protože buněčné substráty odvozené od různých zvířat jsou již různé. Toto určovalo hlavní překážku při produkci antigenních vsádek konstantní a homogenní kvality a každá vsádka musela být hodnocena pro určení její citlivosti.So far, the PRRS virus could only be applied in porcine alveolar macrophage (PAM) cultures (Wensvoort G., et al., In The Vet. Quart. 13: 121-130, 1991). The need to use healthy pigs of a certain age to obtain these macrophages implied serious obstacles. In addition, susceptibility to viral infection was not guaranteed in the obtained PAM since cell substrates derived from different animals are already different. This identified a major obstacle to the production of antigen batches of constant and homogeneous quality and each batch had to be evaluated to determine its sensitivity.

Ze všech těchto důvodů, redukovaná dostupnost stabilního kontinuálního buněčného hostitele vážně bránila studiu strategií pro získání mutantů na základě replikace PRRS viru v buněčných substrátech a selekci atenuovaných variet.For all these reasons, the reduced availability of a stable continuous cell host seriously hindered the study of strategies for obtaining mutants based on PRRS virus replication in cell substrates and the selection of attenuated varieties.

Jedním z hlavních problémů, který má být vyřešen, je potřeba neutralizace virulentního viru vyhýbající se jeho replikaci v PAM, protože replikace viru způsobuje jejich destrukci.One of the main problems to be solved is the need to neutralize the virulent virus avoiding its replication in PAM, since the replication of the virus causes their destruction.

Z toho plyne, že adaptace viru na stabilní substrát odvozený od transformované buněčné linie poskytne vhodný nástroj jak pro získání atenuovaných mutantů, tak pro přípravu inaktivních vakcín, což eliminuje závislost a variabilitu PAM.Accordingly, adaptation of the virus to a stable substrate derived from a transformed cell line will provide a suitable tool both for obtaining attenuated mutants and for preparing inactive vaccines, eliminating PAM dependence and variability.

Patentová přihláška PCT WO-94/18311 (Miles) navrhuje propagaci jistých kmenů PRRS viru vjedinečném klonu, označeném jako klon 9009B, odvozeném od ledvinné buněčné linie afrických zelených opic, označené jako linie MA-104 (M) patentovou přihláškou, odvozené od komerční buněčné linie známé jako MA-104. V patentové přihlášce není uvedeno přírůstkové číslo uvedeného jedinečného klonu a proto je hodnocení přihlášky a reprodukování obtížné.PCT patent application WO-94/18311 (Miles) proposes the propagation of certain PRRS virus strains in a unique clone, designated as clone 9009B, derived from the African green monkey kidney cell line, designated MA-104 (M) by a patent application, derived from a commercial cell line. known as MA-104. In the patent application the accession number of said unique clone is not given and therefore the evaluation of the application and the reproduction are difficult.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podstatu vynálezu tvoří atenuovaný kmen viru, způsobujícího chorobu prasat známou jako reprodukční a respirační syndrom prasat, PRRS, který zcela koresponduje depozitu s přírůstkovým číslem 1-1642 v CNCM Institut Pasteur, uloženému 23. 11. 1995.The present invention is based on an attenuated strain of swine disease virus known as porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS, which fully corresponds to deposit number 1-1642 of the CNCM Institut Pasteur, deposited on November 23, 1995.

Součást podstaty vynálezu tvoří také vakcína pro ochranu prasat proti onemocnění známému jako reprodukční a respirační syndrom prasat, PRRS, která obsahuje svrchu popsaný virový kmen a/nebo alespoň jeden virový antigen, který je možno získat od tohoto kmenu.The present invention also provides a vaccine for the protection of pigs against a disease known as porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS, comprising a viral strain as described above and / or at least one viral antigen obtainable from said strain.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž buněčný klon C8 odvozený od stabilní buněčné linie opičích ledvin MA-104, v němž je 105 až 107 TCID5o/ml a který je uložen v CNCM Institut Pasteur pod depozitním číslem 1-1643.The present invention also provides a C8 cell clone derived from the MA-104 monkey kidney cell line, which has 10 5 to 10 7 TCID 5 o / ml and deposited with the CNCM Institut Pasteur under deposit number 1-1643.

Součást řešení tvoří rovněž použití svrchu popsaného atenuovaného kmenu viru pro výrobu vakcíny proti onemocnění prasat, známému jako PRRS.The invention also provides the use of the attenuated virus strain described above for the production of a vaccine against swine disease, known as PRRS.

Atenuovaný kmen PRRS viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, byl odvozen atenuováním virulentního kmene izolovaného od infikovaných prasat ze španělské farmy. Pro splnění podmínek popisu byl tento atenuovaný kmen deponován v Collection Nationale deThe attenuated strain of PRRS virus object of the present invention was derived by attenuating a virulent strain isolated from infected pigs from a Spanish farm. In order to fulfill the conditions of the description, this attenuated strain was deposited in the Collection Nationale de

-3 CZ 286766 B6-3 CZ 286766 B6

Cultures de Microorganismes (CNCM) z Institute Pasteur, s přírůstkovým číslem 1-1642. Datum uložení je 23. 11. 1995.Cultures de Microorganismes (CNCM) of the Institute Pasteur, with accession number 1-1642. Date of deposit is 23.11.1995.

Atenuování virulentního kmene a replikace atenuovaného kmene byly provedeny sériovým pasážováním v buněčném klonu, který je také předmětem předkládaného vynálezu, a který byl autory označen jako Klon-8. Tento klon je odvozen od komerční opičí ledvinné buněčné linie známé jako MA-104. Také pro splnění podmínek popisu bylo provedeno uložení klonu-8, ve stejný den jako je uvedeno výše, v CNCM z institut Pasteur, s přírůstkovým číslem 1-1643.Attenuation of the virulent strain and replication of the attenuated strain were performed by serial passage in a cell clone, which is also an object of the present invention, which was designated by the authors as Clone-8. This clone is derived from a commercial monkey kidney cell line known as MA-104. Also to meet the conditions of the description, clone-8 was deposited, on the same day as above, in the CNCM of the Pasteur Institute, with accession number 1-1643.

Nejprve, komerční buněčná linie MA-104 byla klonována pro selekci a při izolaci klonu 8. Toto klonování bylo provedeno suspendováním buněk ve vhodném kultivačním mediu (např. Earlovu minimálním esenciálním médiu (Earle's MEM) s fetálním hovězím sérem (FBS)), umístěním suspenze při různých koncentracích, selekcí a trypsinizováním klonů a jejich expandováním v kultivačních nádobách. Klony získané tímto způsobem byly postupně klonovány za použití popsaných technik, dokud nebyly získány dobře diferencované klony.First, the commercial cell line MA-104 was cloned for selection and isolation of clone 8. This cloning was performed by suspending cells in a suitable culture medium (e.g., Earl's Minimum Essential Medium (Earle's MEM) with Fetal Bovine Serum (FBS)), placing the suspension at various concentrations, selection and trypsinization of the clones and their expansion in culture vessels. Clones obtained in this way were sequentially cloned using the techniques described until well differentiated clones were obtained.

Po odstranění klonů, které vykazovaly nepravidelné chování nebo které bylo obtížné amplifíkovat, byly selektované klony testovány s ohledem na citlivost k infekci k počátečnímu virulentnímu kmenu PRRS viru. Klon 8 byl selektován díky své vysoké citlivosti pro replikaci virového kmene (vysoké TCID5o) a reprodukovatelnosti a konzistenci získaného výnosu viru.After removal of clones that showed irregular behavior or which were difficult to amplify, the selected clones were tested for susceptibility to infection to the initial virulent PRRS virus strain. Clone 8 was selected because of its high sensitivity to viral strain replication (high TCID 50 ) and the reproducibility and consistency of the virus yield obtained.

Virulentní kmen byl atenuován sekvenční replikací v kulturách klon-8, preferenčně při 34 °C. Obsah infekčních virových částic byl určen pro hodnocení relikační životaschopnosti a cytopatický účinek (CPE) byl vyšetřován s cílem určit stupeň adaptace. Podle získaných výsledků je virus schopen replikace v klonu-8 bez ztráty životaschopnosti, alespoň po dobu 20 pasáží, a atenuací vzniká prakticky neškodný virus, který si zachovává svou antigenní aktivitu.The virulent strain was attenuated by sequential replication in clone-8 cultures, preferably at 34 ° C. The content of infectious virus particles was determined to assess relicative viability and the cytopathic effect (CPE) was examined to determine the degree of adaptation. According to the results obtained, the virus is capable of replicating in clone-8 without loss of viability for at least 20 passages, and attenuation produces a virtually harmless virus that retains its antigenic activity.

V důsledku toho je získán atenuovaný kmen PRRS viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, stabilním a průmyslově reprodukovatelným způsobem, což usnadňuje jeho použití pro získání PRS vakcín a PRRS diagnostických kitů.As a result, the attenuated PRRS virus strain of the present invention is obtained in a stable and industrially reproducible manner, which facilitates its use for obtaining PRS vaccines and PRRS diagnostic kits.

Srovnávací testy mezi skupinami prasat infikovanými buď virulentním kmenem, nebo atenuovaným kmenem jasně ukázaly, že atenuovaný kmen je neškodný pro zvířata, která jsou jím infikována. Na druhou stranu, atenuovaný kmen, který je předmětem předkládaného vynálezu, vykazuje vysokou replikační účinnost u seronegativních prasat a je schopen vyvolat serokonverzi u zvířat inokulovaných dávkou 200 TCID50 intramuskulámě. Protilátky vyvolané tímto způsobem persistují alespoň 80 dní.Comparative tests between groups of pigs infected with either a virulent strain or an attenuated strain have clearly shown that the attenuated strain is harmless to the animals infected with it. On the other hand, the attenuated strain object of the present invention exhibits high replication efficacy in seronegative pigs and is able to induce seroconversion in animals inoculated with a dose of 200 TCID 50 by intramuscular. Antibodies elicited in this manner persist for at least 80 days.

Dále, atenuovaný kmen, který je předmětem předkládaného vynálezu, je výborným základem pro přípravu vakcín pro preventivní léčbu prasat proti PRRS. Takové vakcíny mohou být připraveny za použití dobře známých metod odborníky v oboru a v různých běžných formách, jako jsou vodné disperze, olejové emulse, liposomové kompozice, lyofilizované formy atd. Vakcinové kompozice mohou být doplněny různými adjuvans, jako jsou imunostimulans, emulsifikátory, stabilizátory, atd. Vakcíny mohou být podány intramuskulámě nebo subkutálně, intranasálně, intratracheálně, kutálně, perkutálně nebi intrekutálně.Furthermore, the attenuated strain object of the present invention is an excellent basis for the preparation of vaccines for preventive treatment of pigs against PRRS. Such vaccines may be prepared using well known methods by those skilled in the art and in various conventional forms such as aqueous dispersions, oil emulsions, liposome compositions, lyophilized forms, etc. The vaccine compositions may be supplemented with various adjuvants such as immunostimulants, emulsifiers, stabilizers, etc. The vaccines may be administered intramuscularly or subcutaneously, intranasally, intratracheally, cutaneously, percutaneously or intecutally.

Účinné dávky vakcíny se budou velmi lišit, v preferované formě rozmezí od 102 do 106 TCID50 atenuovaného kmenu, který je předmětem předkládaného vynálezu.Effective doses of the vaccine will vary widely, in a preferred form ranging from 10 2 to 10 6 TCID 50 of the attenuated strain object of the present invention.

Získané vakcíny, také předmět předkládaného vynálezu, mohou být také formulovány jako polyvalentní vakcíny, spolu s jiným živým nebo inaktivovaným virem prasat, nebo spolu s živou nebo inaktivovanou bakterií.The obtained vaccines, also an object of the present invention, can also be formulated as polyvalent vaccines, together with another live or inactivated swine virus, or together with a live or inactivated bacterium.

-4CZ 286766 B6-4GB 286766 B6

Jak je odborníkům v oboru zřejmé, mohou být také připraveny vakcíny obsahující virové antigeny odvozené od virového kmene, který je předmětem předkládaného vynálezu, například vakcíny obsahující uvedený kmen ve zcela inaktivované formě za použití jakékoliv běžné metody, například tepelné nebo chemické metody, vakcíny obsahující obaly nebo RNA fragmenty uvedeného kmenu a podobně.As will be appreciated by those skilled in the art, vaccines comprising the viral antigens derived from the viral strain of the present invention, for example, vaccines comprising said strain in completely inactivated form, can also be prepared using any conventional method, e.g. or RNA fragments of said strain and the like.

Atenuovaný kmen, který je předmětem předkládaného vynálezu, může být také použit pro přípravu vhodných diagnostických kitů - za použití běžných technik - obsahujících antigenní elementy schopné detekovat protilátky u séropozitivních zvířat. Například, IPMA postupy pro detekci PRRS protilátek mohou obsahovat následující kroky:The attenuated strain object of the present invention can also be used to prepare suitable diagnostic kits - using conventional techniques - containing antigenic elements capable of detecting antibodies in seropositive animals. For example, IPMA procedures for detecting PRRS antibodies may include the following steps:

a) Adaptaci atenuovaného kmenu, který je předmětem předkládaného vynálezu, na stabilní buněčnou kulturu, preferovaně klon-8, na kultivační mikroplotně, tak, že každá jamka je infikována asi okolo 20 - 40 infekčními částicemi.a) Adaptation of the attenuated strain of the present invention to a stable cell culture, preferably clone-8, on a culture microplate such that each well is infected with about 20-40 infectious particles.

b) Fixaci infikovaných buněk na pevnou fázi za použití známých fixačních látek.b) Fixing the infected cells to the solid phase using known fixants.

c) Detekci sérových protilátek prasat jejich inkubací na mikroplotně, a potom barvením uvedených protilátek na mikroplotně IMPA technikami.c) Detecting porcine serum antibodies by incubating them in the microplate and then staining said antibodies on the microplate with IMPA techniques.

Přehled obrázků na výkresechOverview of the drawings

Dvě strany se čtyřmi obrázky jsou připojeny k předkládanému popisu a jsou jeho součástí. Obrázky jsou ilustrativní a nijak neomezují předkládaný popis.Two pages with four figures are attached to and included in the present description. The figures are illustrative and do not limit the present description.

Obrázek 1 ukazuje dvourozměrný obrázek reprezentující vývoj rektální teploty u březích prasnic inokulovaných intranasálním způsobem atenuovaným kmenem, který je předmětem předkládaného vynálezu.Figure 1 shows a two-dimensional figure representing the development of rectal temperature in pregnant sows inoculated in an intranasal manner with an attenuated strain object of the present invention.

Obrázek 2 je dvourozměrný obrázek reprezentující vývoj hmotnosti selat, která se narodila prasnicím inokulovaným atenuovaným kmenem, který je předmětem předkládaného vynálezu.Figure 2 is a two-dimensional figure representing the development in weight of piglets born to a sow inoculated with an attenuated strain object of the present invention.

Obrázek 3 je dvourozměrný obrázek reprezentující kinetiku kolostrálních protilátek jak byla určena IPMA, v potomstvu prasnic vakcinových atenuovaným kmenem, který je předmětem předkládaného vynálezu. Nízké titry u potomstva prasnic 1 a 10 při narození jsou způsobeny skutečností, že některá selata ještě nesála kolostrum v době odběru krve.Figure 3 is a two-dimensional figure representing the kinetics of colostral antibodies as determined by IPMA, in the offspring of sows vaccinated with the attenuated strain object of the present invention. Low titers in the offspring of sows 1 and 10 at birth are due to the fact that some piglets have not yet sowed colostrum at the time of blood collection.

Obrázek 4 ukazuje trojrozměrný obrázek reprezentující vývoj protilátkové odpovědi u selat inokulovaných intramuskulámí cestou 200, 2000, a 20 000 TCID50 atenuovaného kmenu, který je předmětem předkládaného vynálezu.Figure 4 shows a three-dimensional image representing the development of antibody response in piglets inoculated by intramuscular route 200, 2000, and 20,000 TCID 50 of the attenuated strain object of the present invention.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Je ukázáno několik příkladů postupů s cílem podrobněji ilustrovat popis předkládaného vynálezu. Takové příklady neomezují rozsah vynálezu.Several examples of procedures are shown to illustrate the present invention in more detail. Such examples do not limit the scope of the invention.

Příklad 1: Získání buněčných klonů ze stabilní buněčné linie opicích ledvin MA-104.Example 1: Obtaining cell clones from a stable monkey kidney cell line MA-104.

Šest pasáží selektovaného PRRS virulentního kmene bylo provedeno za použití stabilní buněčné linie opičích ledvin MA-104 dodané od European Animal Cell Culture Colection (EACCC), přírůstkové číslo 85102918, ve statické kultivační buněčné monovrstvě kultivované v plastovýchSix passages of the selected PRRS virulent strain were performed using the MA-104 monkey kidney cell line provided by the European Animal Cell Culture Collection (EACCC) accession number 85102918, in a static cell culture monolayer cultured in plastic.

-5 CZ 286766 B6 kultivačních nádobách v Earle's MEM médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS), při 37 °C a bez doplňování CO2. Sklizeň viru byla provedena 6-7 dní po inokulaci v každé pasáži.Culture vessels in Earle's MEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), at 37 ° C and without CO 2 replenishment. Virus harvest was performed 6-7 days after inoculation at each passage.

Pro studium zisku virové sklizně byla buněčná linie inokulována virulentním kmenem při různých silách infekce (zde MOI). Výtěžky sklizně viru byly nízké (mezi 103 a 104 TCID50/ml) a nedostatečné pro použití v produkci vakcíny, i po čtyřech adaptačních pasážích.To study viral harvest gains, the cell line was inoculated with a virulent strain at various strengths of infection (here MOI). Virus harvest yields were low (between 10 3 and 10 4 TCID 50 / ml) and insufficient for use in vaccine production, even after four adaptation passages.

V těchto pokusech bylo pozorováno, že pouze část infikovaných buněk byla citlivá na virulentní virus, zatímco zbytek buněk zůstával refraktemí na infekci. Z tohoto důvodu byla buněčná linie klonována s cílem selektovat tu populaci buněk, která je zcela citlivá na virulentní kmen.In these experiments, it was observed that only a portion of the infected cells were susceptible to the virulent virus, while the remainder of the cells remained refractory to the infection. For this reason, the cell line was cloned in order to select that cell population that is completely sensitive to the virulent strain.

Klonování selekce byla provedena následovně:The cloning of the selection was performed as follows:

Suspenze buněčné linie byla ředěna v Earle MEM s 20% FBS a různá ředění byla umístěna do 96 jamkové mikroplotny (NUNCR). Plotny byly inkubovány po 8 dní při 37 °C v 5% CO2. V den 3 byly jamky obsahující pouze jednu buňku identifikovány mikroskopicky a byly trypsinizovány v den 8. Tímto způsobem bylo získáno 44 klonů. Potom byly získány klony expandovány v kultivačních nádobách, dokud nebyla získána suspenze 5 x 107 buněk/ml. Tyto buňky byly potom klonovány podruhé a potřebí za použití stejného postupu.The cell line suspension was diluted in Earle MEM with 20% FBS and various dilutions were placed in a 96 well microplate (NUNC R ). The plates were incubated for 8 days at 37 ° C in 5% CO 2 . On day 3, wells containing only one cell were identified microscopically and were trypsinized on day 8. In this way, 44 clones were obtained. Then, the obtained clones were expanded in culture flasks until a suspension of 5 x 10 7 cells / ml was obtained. These cells were then cloned a second time and needed using the same procedure.

Po třetím klonování bylo 44 získaných klonů expandováno, dokud nebylo získáno 25 ml buněčné suspenze každého klonu obsahujícího 6 x 106 buněk/ml. Médium použité v tomto procesu obsahovalo 20% FBS.After the third cloning, 44 obtained clones were expanded until 25 ml of cell suspension of each clone containing 6 x 10 6 cells / ml was obtained. The medium used in this process contained 20% FBS.

Tyto klony byly dále selektovány podle jejich růstových charakteristik a podle jejich životaschopnosti.These clones were further selected according to their growth characteristics and their viability.

Příklad 2: Selekce buněčného klonu klon-8Example 2: Selection of a clone-8 cell clone

Klony získané v předchozím příkladu byly hodnoceny podle jejich růstové účinnosti, a ty, které vykazovaly amplifikační problémy, nepravidelnou morfologii neboje bylo obtížné udržovat při 37 °C, byly odstraněny. 35 klonů bylo odstraněno po této předchozí selekci a zbylých 9 klonů bylo selektováno.The clones obtained in the previous example were evaluated for their growth efficiency, and those that showed amplification problems, irregular morphology or were difficult to maintain at 37 ° C were removed. 35 clones were removed after this previous selection and the remaining 9 clones were selected.

Selektované buněčné klony byly infikovány PRRS virem virulentního kmene při osmi pasážích viru (P-8) a PAM kulturách (jak popsal Bloemberg, M. et al., Vet Microb. 42 : 361 - 371, 1994). Adaptační proces pro buněčné klony byl proveden před tím: virus byl replikován při 37 °C během 3 pasáží udržováním 80 - 90% konfluentní monovrstvy v kontaktu s virovou suspenzí během 6 dnů a potom zmražen při -80 °C a rozmražen o 24 hodin později.The selected cell clones were infected with the virulent strain PRRS virus in eight virus passages (P-8) and PAM cultures (as described by Bloemberg, M. et al., Vet Microb. 42: 361-371, 1994). The adaptation process for cell clones was performed before: the virus was replicated at 37 ° C for 3 passages by keeping an 80-90% confluent monolayer in contact with the virus suspension for 6 days and then frozen at -80 ° C and thawed 24 hours later.

Earle MEM doplněné 10% FBA a gentamycinem (0,4 mg/ml) bylo použito jako infekční médium. Nebyly použity ani sloučeniny proti houbám, ani sloučeniny proti kvasinkám. Každá sklizeň viru získaná tímto způsobem byla titrována v korespondujícím buněčném klonu. Po analýze výsledků bylo uzavřeno, že 9 klonů bylo citlivých na virovou infekci, s titrem rovným nebo větším než 104 2 TCID5o/ml. Výsledky jsou ukázány v tabulce 1.Earle MEM supplemented with 10% FBA and gentamycin (0.4 mg / ml) was used as an infectious medium. Neither fungal compounds nor yeast compounds were used. Each virus harvest obtained in this way was titrated in the corresponding cell clone. After analysis of the results, it was concluded that 9 clones were susceptible to viral infection, with a titer equal to or greater than 10 4 2 TCID 5 o / ml. The results are shown in Table 1.

-6CZ 286766 B6-6GB 286766 B6

Tabulka 1: Sensitivita získaných buněčných klonů k selektovanému virulentnímu kmenuTable 1: Sensitivity of the obtained cell clones to the selected virulent strain

Klon nebo buněčná linie Clone or cell line Titr jako TCID5o/mlTiter as TCID 5 o / ml neklonovaná buněčná linie uncloned cell line 103 10 3 klon 1 clone 1 10575 10 575 klon 2 clone 2 1045 10 45 klon 3 clone 3 1052 10 52 klon 4 clone 4 1053 10 53 klon 8 clone 8 106 10 6 klon 29 clone 29 10575 10 575 klon 30 clone 30 10538 10 538 klon 41 clone 41 10538 10 538 klon 44 clone 44 1042 10 42

Jak je vidět v tabulce 1, neklonovaná buněčná linie vykazuje velmi nízkou sensitivitu pro virus a proto se její použití jako antigenu pro získání účinné vakcíny nezdá možné. Tabulka 1 také ukazuje, že některé klony, zejména klon 8, jsou více sensitivní k viru než neklonovaná buněčná linie. Klon-8 je zejména zaznamenání hodný. Titry vyšší než 106 TCID5o/ml mohou být získány při sklizni viru z klonu-8.As can be seen in Table 1, an uncloned cell line exhibits a very low sensitivity to the virus and therefore its use as an antigen to obtain an effective vaccine does not seem possible. Table 1 also shows that some clones, especially clone 8, are more sensitive to the virus than an uncloned cell line. Clone-8 is particularly worthy of recording. Titers greater than 10 6 TCID 5 o / ml can be obtained when harvesting the virus from clone-8.

V souladu s výsledky popsanými výše byl selektován klon-8. Bylo provedeno několik testů pro stadium spolehlivosti tohoto klonu. V různých testech byly titry virové sklizně vysoce reprodukovatelné, s hodnotami mezi 105 a 107 TCID5o/ml.In accordance with the results described above, clone-8 was selected. Several tests were performed for the reliability stage of this clone. In various tests, viral harvest titers were highly reproducible, with values between 10 5 and 10 7 TCID 5 o / ml.

Příklad 3: Získání atenuovaného kmene viruExample 3: Obtaining an attenuated virus strain

Atenuovaný kmen viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, byl získán replikací selektovaného virulentního kmenu při 34 °C v klon-8 buněčných kulturách.The attenuated virus strain of the present invention was obtained by replicating the selected virulent strain at 34 ° C in clone-8 cell cultures.

Virem infikované monovrstvy buněk klonu 8 byly udržovány při 34 °C dokud nebylo vyvinuto CPE. CPE bylo detekováno 24 a 48 hodin později než v kulturách udržovaných při 37 °C. Nicméně, nebyly nalezeny žádné signifikantní rozdíly ve vlastnostech CPE vyvinutých při obou teplotách.Virus-infected monolayers of clone 8 cells were maintained at 34 ° C until CPE was developed. CPE was detected 24 and 48 hours later than in cultures maintained at 37 ° C. However, no significant differences were found in the CPE properties developed at both temperatures.

Vzniklé virové sklizně byly titrovány za použití buněčných mono vrstev klonu-8. Dále byla identita viru ověřena IMPA.The resulting viral harvests were titrated using clone-8 cell mono layers. Furthermore, the identity of the virus was verified by IMPA.

Virus byl inokulován do 75 cm2 buněčné monovrstvy klonu-8 okolo konfluence a byla umožněna adsorpce při 34 °C po 2 hodiny. Potom bylo infekční médium přidáno k monovrstvě. Infekčním médiem bylo Earle modifikované minimální esenciální médium doplněné 10% FBS a předem ohřáté na 34 °C.The virus was inoculated into a 75 cm 2 clone-8 cell monolayer around confluence and allowed to adsorb at 34 ° C for 2 hours. Then, the infectious medium was added to the monolayer. The infectious medium was Earle modified minimal essential medium supplemented with 10% FBS and pre-heated to 34 ° C.

cm2 nádoby byly umístěny při 34 °C v inkubátoru a denně kontrolovány, dokud nebylo pozorováno CPE. Když 80 - 95 % buněčné monovrstvy vykazovalo CPE, obvykle mezi 5 a 7 dnem po infekci, byla provedena virová sklizeň. Virová sklizeň byla potom centrifugována při 2000 rpm a supematant byl titrován pro určení titru viru (TCID5o/ml).cm 2 flasks were placed at 34 ° C in an incubator and checked daily until CPE was observed. When 80-95% of the cell monolayer showed CPE, usually between 5 and 7 days after infection, viral harvesting was performed. The viral harvest was then centrifuged at 2000 rpm and the supernatant was titrated to determine the virus titer (TCID 50 o / ml).

Za použití výše popsané metody bylo provedeno 20 pasáží. Obsah viru byl hodnocen při pasáži P.l, P.5, P.10 a P.20. Výsledky ukazují, že virus může být replikován v buněčné monovrstvě klonu-8 při 34 °C, bez jakékoliv ztráty životaschopnosti, alespoň do pasáže P.20 (tabulka 2).Using the method described above, 20 passages were performed. Virus content was evaluated at passages P.1, P.5, P.10 and P.20. The results show that the virus can be replicated in the cell monolayer of clone-8 at 34 ° C, without any loss of viability, at least until passage P.20 (Table 2).

-7CZ 286766 B6-7EN 286766 B6

Tabulka 2: Vývoj viru propagovaného v klonu-8 při 34 °C od pasáže P.l do pasáže P.20.Table 2: Development of virus propagated in clone-8 at 34 ° C from passage P.l to passage P.20.

Pasáž v klonu-8 Arcade in clone-8 Obsah viru v TCID5o/mlVirus content in TCID 5 o / ml P.l P.l 1055 10 55 P.5 P.5 1057 10 57 P.10 P.10 1055 10 55 P.15 P.15 1056 10 56 P.20 P.20 1062 10 62

Další výsledky potvrdily, že klon-8 buněčná monovrstva může být infikována při MOI 0,001.Further results confirmed that clone-8 cell monolayer can be infected at an MOI of 0.001.

Pokusy provedené podle následujícího příkladu ukázaly, že od P.20 odvozený kmen viru byl neškodný pro prasata.Experiments carried out according to the following example showed that the P.20-derived virus strain was harmless to pigs.

Příklad 4: Biologická charakteristizace atenuovaného virového kmene a účinky vakcinace tímto kmenemExample 4: Biological characterization of the attenuated viral strain and the effects of vaccination with this strain

Počátečním virovým kmenem použitým pro získání atenuovaného kmene viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, je virulentní kmen. Hlavní účinky na březí svině jsou předčasné porody a slabá, mrtvá a/nebo mumifikovovaná novorozená selata. Infikované svině také ukazují depresi a 3 - 5 denní periodu mírné anorexie v den 4 - 5 po infekci.The initial viral strain used to obtain the attenuated virus strain of the present invention is a virulent strain. The main effects on pregnant sows are premature births and weak, dead and / or mummified newborn piglets. Infected sows also show depression and a 3-5 day period of mild anorexia on day 4-5 after infection.

Čtyři těhotné svině (označené 01, 02, 03 a 06) byly infikovány intranasálně 1066 TCID50 počátečního virulentního kmene. Dvě neinfikované svině (označené 73 a 74) byly použity jako kontroly. Výsledky jsou ukázány v tabulce 3.Four pregnant sows (designated 01, 02, 03 and 06) were infected intranasally with 10 66 TCID 50 of the initial virulent strain. Two uninfected swine (labeled 73 and 74) were used as controls. The results are shown in Table 3.

Tabulka 3: Účinky na potomstvo březích sviní inokulovaných virulentním viremTable 3: Effects on offspring of pregnant sows inoculated with virulent virus

Svině č. Svině č. Inokulace virulentním virem Inoculation with virulent virus Počet narozených selat Number of piglets born Počet mrtvých selat do odstavení Number of dead piglets until weaning živá live mrtvá dead mumifikovaná mummified 01 01 + + 10 10 2 2 0 0 2 2 02 02 / + + 15 15 Dec 0 0 0 0 4 4 03 03 / + + 6 6 5 5 0 0 2 2 06 06 / + + 6 6 6 6 0 0 1 1 73 73 - 13 13 0 0 0 0 0 0 74 74 - - 10 10 0 0 0 0 0 0

Pouze infikované svině porodily v očekávaném datu. Infikované svině měly 2, 0 5 a 6 mrtvě narozených selat a 2, 4, 2 a 1 slabých selat, v příslušném pořadí. Slabá selata zemřela několik dní po narození. Při odstavení bylo průměrně 11 selat od každé kontroly naživu. Pouze průměrně 6,5 selat od každé infikované svině bylo naživu při odstavení. Při odstavení byla průměrná hmotnost selat 4,621 g (selata od infikovaných sviní) a 5,365 g (selata od kontrolních sviní). Virulentní PRRS virus byl izolován z homogenizovaných plic slabých selat. Po vystavení infekci jak infikované svině, tak jejich potomstvo sérokonvertovalo.Only infected swine gave birth at the expected date. The infected sows had 2, 0 5 and 6 stillborn piglets and 2, 4, 2 and 1 weak piglets, respectively. Weak piglets died a few days after birth. At weaning, an average of 11 piglets from each control were alive. Only an average of 6.5 piglets from each infected swine were alive at weaning. At weaning, the average weight of piglets was 4.621 g (piglets from infected sows) and 5.365 g (piglets from control sows). Virulent PRRS virus was isolated from homogenized lungs of weak piglets. After challenge, both the infected swine and their offspring seroconverted.

Byla provedena biologická charakterizace atenuovaného kmenu viru, který je předmětem předkládaného vynálezu, podle specifických testů, za použití prasat obou pohlaví. Test neškodnosti byl proveden u 3 PRRS séronegativních březích sviní z malé farmy, kde PRRS infekce nebyla nikdy detekována. Svině byly inokulovány v poslední třetině těhotenství, kdy je sensitivita na virus maximální. Dávka 106 TCED5o/svini atenuovaného viru byla podána intranasálnímBiological characterization of the attenuated virus strain of the present invention, according to specific tests, was performed using pigs of both sexes. A harmless test was performed on 3 PRRS seronegative pigs from a small farm where PRRS infection was never detected. The sows were inoculated in the last third of pregnancy when the virus sensitivity was maximal. A dose of 10 6 TCED 5 o / swine of the attenuated virus was administered intranasally

-8CZ 286766 B6 způsobem mezi dnem 78 a 93 březosti. Po inokulaci viru zůstaly fyziologické konstanty třech sviní nezměněny a rektální teplota byla v mezích normálu (viz obr. 1). Tři svině také vykazovaly očekávaná data. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.-8GB 286766 B6 in a manner between day 78 and 93 of pregnancy. After virus inoculation, the physiological constants of the three sows remained unchanged and the rectal temperature was within normal (see Figure 1). The three pigs also showed the expected data. The results obtained are summarized in Table 4.

Tabulka 4: Účinky na potomstvo březích sviní inokulovaných atenovaným viremTable 4: Effects on offspring of pregnant sows inoculated with attenuated virus

Svině č. Inokulace ate- Počet narozených selat Počet úmrtí způsobených nuovaným virem živá mrtvá mumifikovaná PRRS do odstaveníSwine No. Atte inoculation - Number of piglets born Number of deaths due to nuanced virus live dead mummified PRRS until weaning

1 1 + + 13 13 0 0 3 3 0 0 2 2 + + 4 4 1 1 0 0 0 0 10 10 + + 16 16 0 0 1 1 0 0

Tři svině porodily 13, 4 a 1 selat, v příslušném pořadí. Vitalita novorozených selat byla považována za normální. Nicméně, několik mumifikovaných selat bylo nalezeno v potomstvu dvou sviní. Toto může být považováno za normální vzhledem k velkým vrhům těchto sviní. Vývoj hmotnosti selat byl ve všech případech považován za normální (viz obr. 2) a byl do konce pozorování v normálních mezích (45 dní). Symptomy slabosti a onemocnění, které mohou souviset s infekcí PRRS virem, nebyly pozorovány u jakéhokoliv selete. Dále, PRRS virus nebyl detekován ani v krvi, ani ve vzorcích séra od novorozených selat.The three sows gave birth to 13, 4 and 1 piglets, respectively. Vitality of newborn piglets was considered normal. However, several mummified piglets were found in the offspring of two sows. This can be considered normal due to the large litters of these pigs. Piglet weight development was in all cases considered normal (see Fig. 2) and was within normal limits (45 days) until the end of observation. Symptoms of weakness and disease that may be related to PRRS virus infection were not observed in any piglet. Furthermore, PRRS virus was not detected in blood or serum samples from newborn piglets.

Stejně tak nebyl PRRS virus detekován ve vzorcích krve a séra od březích sviní 21-36 dní po inokulaci viru. Všechny tyto skutečnosti potvrzují neškodnost atenuovaného kmene PRRS u březích sviní, které jsou nejcitlivější kategorií pro infekci přirozeným typem viru. Všechny vzorky séra od novorozených selat od inokulovaných březích sviní byly negativní, když byly vyšetřovány na přítomnost PRRS viru a PAM kulturách za použití běžných technik. Tři svině inokulované atenuovaným virem měly humorální protilátky stitry IPMA 1/480 v den 45 po porodu, s tím, že byly stabilní s malými odchylkami od tohoto dne. Svině byly séropozitivní již 21 den po inokulaci. Jak je vidět na obrázku 3, selata od inokulovaných sviní byly séropozitivní po sání kolostra a zůstávaly séropozitivní alespoň po 75 dní věku.Similarly, PRRS virus was not detected in blood and serum samples from pregnant sows 21-36 days after virus inoculation. All these facts confirm the harmlessness of the attenuated PRRS strain in pregnant sows, which are the most sensitive category for infection with wild-type virus. All serum samples from newborn piglets from inoculated pregnant sows were negative when examined for PRRS virus and PAM cultures using conventional techniques. The three pigs inoculated with the attenuated virus had humoral antibodies of IPMA 1/480 titers at day 45 postpartum, with stable stability with slight deviations from that day. The sows were seropositive as early as 21 days after inoculation. As seen in Figure 3, piglets from inoculated sows were seropositive after colostrum suction and remained seropositive for at least 75 days of age.

Další test neškodnosti byl proveden ve skupině 12 březích sviní v poslední třetině těhotenství. Osm sviní bylo vakcinováno intramuskulámě 39 dávkami vakcíny (105 TCID50) a zbylé čtyři svině byly použity jako kontroly pro hodnocení účinků atenuovaného kmene na parametry reprodukce. Žádné změny nebyly pozorovány ve fyziologických parametrech vakcinovaných sviní, které ukazovaly očekávaná data. Výsledky jsou kázány v tabulce 5. Jak je vidět z této tabulky, jak osm inokulovaných sviní, tak čtyři kontrolní svině vykazovaly normální počet selat. Selata také měla normální životaschopnost.Another harmless test was performed in a group of 12 pregnant sows in the last third of pregnancy. Eight sows were vaccinated intramuscularly with 39 doses of vaccine (10 5 TCID 50 ) and the remaining four sows were used as controls to assess the effects of the attenuated strain on reproduction parameters. No changes were observed in the physiological parameters of the vaccinated sows showing the expected data. The results are shown in Table 5. As can be seen from this table, both the eight inoculated sows and the four control sows showed a normal number of piglets. The piglets also had normal viability.

-9CZ 286766 B6-9EN 286766 B6

Tabulka 5: Účinek inokulace atenuovaného viru a parametry reprodukce u březích sviní v poslední třetině březostiTable 5: Effect of attenuated virus inoculation and reproduction parameters in pregnant sows in the last third of pregnancy

č. svině No swine vakcinovaná vaccinated Odchylka od očekávaného data porodu (ve dnech) Deviation from expected delivery date (in days) Počet živých selat (A) Number of live piglets (A) Počet selat vážících méně než skupina s průměrnou hmotností (B) Number of piglets weighing less than average weight group (B) Počet selat pfi narození slabých (C) Number of piglets at birth of the weak (C) Počet mrtvě narozených selat (D) Number of stillborn piglets (D) Počet mumifikovaných selat (E) Number of mummified piglets (E) Celkový počet selat (F) Total number of piglets (F) 86 86 ano Yes K+) K +) 11 11 1 1 0 0 1 1 0 0 12 12 94 94 ano Yes 0 0 9 9 0 0 0 0 0 0 1 1 10 10 96 96 ano Yes K+) K +) 13 13 2 2 1 1 0 0 0 0 13 13 102 102 ano Yes 2(+) 2 (+) 13 13 1 1 0 0 1 1 2 2 16 16 116 116 ano Yes 0 0 10 10 0 0 0 0 1 1 0 0 11 11 121 121 ano Yes K+) K +) 11 11 0 0 0 0 1 1 0 0 12 12 143 143 ano Yes i (-) i (-) 14 14 2 2 1 1 2 2 1 1 17 17 151 151 ano Yes 2(+) 2 (+) 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 8 8 76 76 ne No 2(+) 2 (+) 7 7 0 0 0 0 0 0 2 2 9 9 79 79 ne No 0 0 13 13 2 2 1 1 1 1 0 0 14 14 81 81 ne No I (-) I (-) 9 9 0 0 1 1 0 0 0 0 9 9 83 83 ne No LA) LA) 10 10 1 1 0 0 1 1 1 1 12 12

A zahrnuje BaC:F = A + D + EA includes BaC: F = A + D + E

Atenuovaný virus, kteiý je předmětem předkládaného vynálezu, se účinně replikuje v PRRS séronegativních selat. Toto je demonstrováno skutečností, tak malá dávka, jako je 200 TCID50 podaná intramuskulámě může replikovat a indukovat sérokonverzi u prasat. Jak je vidět z obrázku 4, indukované protilátky persistují po dobu alespoň 52 dní u inokulovaných zvířat.The attenuated virus object of the present invention replicates efficiently in PRRS seronegative piglets. This is demonstrated by the fact that a small dose such as 200 TCID 50 administered intramuscularly can replicate and induce seroconversion in pigs. As seen in Figure 4, induced antibodies persist for at least 52 days in inoculated animals.

Atenuovaný virus, který je předmětem předkládaného vynálezu, se nešířil na čtyři neinokulovaná sentinelová selata umístěná spolu se skupinou osmi intramuskulámě inokulovaných selat. Skutečnost, že virus není přenášen na nevakcinovaná zvířata ilustruje vhodnost atenuovaného kmenu pro vakcínu. Kromě toho, u vakcinovaných prasat nebyla pozorována žádná leukopenie ani jiné klinické příznaky, které by ukazovaly na to, že atenuovaný virus je také neškodný, pokud je podán intramuskulámě. Průměrně 86 % inokulovaných selat se stalo séropozitivními již 11 den po inokulaci.The attenuated virus of the present invention did not spread to four uninoculated sentinel piglets placed together with a group of eight intramuscularly inoculated piglets. The fact that the virus is not transmitted to unvaccinated animals illustrates the suitability of the attenuated strain for the vaccine. In addition, no leukopenia or other clinical symptoms were observed in vaccinated pigs to indicate that the attenuated virus is also harmless when administered intramuscularly. On average 86% of the inoculated piglets became seropositive as early as 11 days after inoculation.

Atenuovaný virus, který je předmětem předkládaného vynálezu, indukuje protektivní imunitní odpověď u vakcinovaných prasat, která brání klinickým účinkům infekce virulentním PRRS kmenem. Tak nebyly žádné klinické příznaky pozorovány u 75 % čtyři týdny starých vakcinovaných selat, pokud byly infikovány virulentním virem. Na druhou stranu, jak je vidět z tabulky 6, 80 % nevakcinováných kontrolních selat mělo signifikantní zvýšení rektální teploty po pokusné infekci. Dále, při nekropsii provedené 19 dnů po pokusné infekci vykazovala vakcinovaná selata signifikantně menší plicní lése než kontrolní nevakcinovaná selata. Podobně, po pokusné infekci byl virulentní virus nalezen pouze u 25 % vakcinovaných zvířat, zatímco u nevakcinovaných kontrolních zvířat mohl být virulentní virus nalezen alespoň 12 dní po infekci u 80 %.The attenuated virus of the present invention induces a protective immune response in vaccinated pigs which prevents the clinical effects of infection with a virulent PRRS strain. Thus, no clinical signs were observed in 75% of four week old vaccinated piglets when infected with a virulent virus. On the other hand, as shown in Table 6, 80% of unvaccinated control piglets had a significant increase in rectal temperature after challenge. Furthermore, at necropsy performed 19 days after challenge, the vaccinated piglets showed significantly less lung lesion than the control unvaccinated piglets. Similarly, after challenge, virulent virus was found in only 25% of vaccinated animals, whereas in unvaccinated control animals, virulent virus could be found in 80% at least 12 days after infection.

Tabulka 6: Hypertermie u vakcinovaných a kontrolních selat po infekciTable 6: Hyperthermia in vaccinated and control piglets after infection

Počet selat s hypertermií / celkový počet selat Number of piglets with hyperthermia / total number of piglets Počet dní s hypertermií Number of days with hyperthermia Vakcinovaná selata Vaccinated piglets 1/4 1/4 1 1 (intramuskulámě) (intramuscular) Nevakcinovaná selata Non-vaccinated piglets 4/5 4/5 8 8

-10CZ 286766 B6-10GB 286766 B6

Informace o deponování mikroorganismůInformation on depositing microorganisms

Podle Budapešťské smlouvy byly jak virový kmen, tak klon 8, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, deponovány v Intemational Authority of the Collection National de Cultures de Microoganismes (CNCM) Institut Pasteur, Paris, (France)Under the Budapest Treaty, both the viral strain and the clone 8 of the present invention were deposited with the Intemational Authority of the Collection of National Cultures of Microoganismes (CNCM) Institut Pasteur, Paris, (France)

Identifikace přehlašovateleIdentifier of the reporter

VP-046-BISVP-046-BIS

CNCM č.CNCM no.

Datum uloženíDate saved

1-16421-1642

23.11.199523.11.1995

Clon-8Aperture-8

1-16431-1643

23.11.199523.11.1995

Tato depozita jsou k dispozici veřejnosti za podmínek specifikovaných v Budapešťské smlouvě. Toto nemůže být interpretováno jako licence pro provádění předmětu předkládaného vynálezu, což by bylo porušení práv přihlašovatele předkládaného vynálezu.These deposits are available to the public under the conditions specified in the Budapest Treaty. This cannot be interpreted as a license for carrying out the subject matter of the present invention, which would be a violation of the rights of the applicant of the present invention.

Claims (15)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Atenuovaný kmen viru způsobujícího chorobu prasat známou jako reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS) CNCM 1-1642.An attenuated strain of swine disease virus known as porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) CNCM 1-1642. 2. Vakcína pro ochranu prasat proti onemocnění známému jako reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS), která obsahuje virový kmen nárokovaný v nároku 1 a/nebo alespoň jeden virový antigen, který je možné získat od tohoto kmenu.A vaccine for the protection of pigs against a disease known as porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), which comprises the viral strain claimed in claim 1 and / or at least one viral antigen obtainable from said strain. 3. Vakcína podle nároku 2, kde virový antigen je inaktivovaný virus.The vaccine of claim 2, wherein the viral antigen is an inactivated virus. 4. Vakcína podle nároku 2, která obsahuje mezi 102 a 106 TCID50 atenuovaného kmene viru.The vaccine of claim 2, comprising between 10 2 and 10 6 TCID 50 of the attenuated virus strain. 5. Vakcína podle nároku 2 nebo 3, kde dávka vakcíny obsahuje množství virového antigenu, které je ekvivalentní množství produkovanému mezi 102 a 106 TCID50 atenuovaného kmene viru.The vaccine of claim 2 or 3, wherein the vaccine dose comprises an amount of viral antigen that is equivalent to the amount produced between 10 2 and 10 6 TCID 50 of the attenuated virus strain. 6. Vakcína podle jakéhokoliv z nároků 2 až 5, která obsahuje další imunostimulační adjuvans a/nebo emulsifíkátory a/nebo stabilizátory.A vaccine according to any one of claims 2 to 5, which comprises further immunostimulatory adjuvants and / or emulsifiers and / or stabilizers. 7. Buněčný klon C8 CNCM 1-1643 odvozený od stabilní buněčné linie opičích ledvin MA104, v němž je virus podle nároku 1 schopen replikace až do vysokého titru 105 až 107 TCIDjo/ml.A C8 CNCM 1-1643 cell clone derived from the MA104 monkey kidney cell line, wherein the virus of claim 1 is capable of replicating up to a high titer of 10 5 to 10 7 TCID 50 / ml. 8. Způsob přípravy atenuovaného kmenu PRRS viru podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se tím, že se virulentní kmen modifikuje postupným pasážováním v buněčném klonu podle nároku 7.8. A method of preparing an attenuated PRRS virus strain according to claim 1, wherein the virulent strain is modified by sequential passage in a cell clone according to claim 7. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se při postupném pasážování udržuje teplota 34 °C.The method according to claim 8, characterized in that a temperature of 34 ° C is maintained during successive passages. 10. Způsob přípravy vakcíny proti PRRS podle nároku 2, vyznačující se tím, že se virový kmen podle nároku 1 propaguje v buněčném klonu podle nároku 7.The method of preparing a PRRS vaccine according to claim 2, wherein the viral strain of claim 1 propagates in the cell clone of claim 7. -11CZ 286766 B6-11EN 286766 B6 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se virový kmen propaguje při teplotě 34 °C.Method according to claim 10, characterized in that the virus strain propagates at a temperature of 34 ° C. 12. Způsob podle některého z nároků 10 nebo 11, vyznačující se tím, že se získaný atenuovaný kmen zpracuje na vodnou disperzi, olejovou emulzi, prostředek typu liposomů nebo na lyofilizovaný prostředek, popřípadě spolu s pomocným prostředkem a/nebo emulgátorem a/nebo stabilizátorem.Method according to either of claims 10 or 11, characterized in that the obtained attenuated strain is processed into an aqueous dispersion, an oil emulsion, a liposome-type composition or a lyophilized composition, optionally together with an auxiliary agent and / or emulsifier and / or stabilizer. 13. Způsob podle některého z nároků 10ažl2, vyznačující se tím, že se získaný kmen zpracovává působením tepla nebo chemickým způsobem až do úplné inaktivace.Process according to one of Claims 10 to 12, characterized in that the strain obtained is treated by heat treatment or by a chemical process until complete inactivation. 14. Použití atenuovaného virového kmenu podle nároku 1, pro výrobu vakcíny proti onemocnění prasat, známému jako PRRS.Use of the attenuated viral strain according to claim 1, for the manufacture of a vaccine against a disease of pigs known as PRRS. 15. Použití atenuovaného virového kmene podle nároku 1 pro výrobu kitů pro detekci onemocnění PRRS u prasat.Use of the attenuated viral strain according to claim 1 for the manufacture of kits for detecting PRRS disease in pigs.
CZ19973377A 1996-01-25 1996-12-04 Attenuated virus strain, process of its preparation, vaccine, process of its preparation, cellular clone and use of the attenuated strain CZ286766B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES09600168A ES2102971B1 (en) 1996-01-25 1996-01-25 NEW ATTENUATED STRAIN OF THE VIRUS CAUSING THE RESPIRATORY AND REPRODUCTIVE SYNDROME (PRRS), THE VACCINES AND DIAGNOSTIC MEDIA OBTAINABLE WITH THE SAME AND THE PROCEDURES FOR ITS OBTAINING.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ337797A3 CZ337797A3 (en) 1998-03-18
CZ286766B6 true CZ286766B6 (en) 2000-06-14

Family

ID=8293550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19973377A CZ286766B6 (en) 1996-01-25 1996-12-04 Attenuated virus strain, process of its preparation, vaccine, process of its preparation, cellular clone and use of the attenuated strain

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6001370A (en)
EP (1) EP0835929A1 (en)
JP (1) JP3068204B2 (en)
KR (1) KR19980703268A (en)
CN (1) CN1185806A (en)
BR (1) BR9604888A (en)
CA (1) CA2216436A1 (en)
CZ (1) CZ286766B6 (en)
ES (1) ES2102971B1 (en)
HU (1) HUP9801124A3 (en)
PL (1) PL185841B1 (en)
UA (1) UA68326C2 (en)
WO (1) WO1997027288A1 (en)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE118352T1 (en) * 1991-06-06 1995-03-15 Stichting Centr Diergeneeskund CAUSES OF MYSTERIOUS SWINE DISEASE, VACCINE COMPOSITIONS AND DIAGNOSTIC KITS.
US6380376B1 (en) * 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6773908B1 (en) * 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
EP0839912A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
AU767378B2 (en) 1999-02-10 2003-11-06 Genset Polymorphic markers of the LSR gene
JP3961222B2 (en) 1999-03-08 2007-08-22 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー PRRSV vaccine
DK1183332T3 (en) * 1999-04-22 2010-09-06 Us Agriculture Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vaccine based on isolate JA-142
SG83740A1 (en) * 1999-08-10 2001-10-16 Inst Of Molecular Agrobiology An attenuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain and methods of use
US7338787B2 (en) 2000-01-14 2008-03-04 Serono Genetics Institute S.A. Nucleic acids encoding OBG3 globular head and uses thereof
EP1156111A1 (en) * 2000-05-19 2001-11-21 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Chimeric arterivirus-like particles
EP1341903B1 (en) 2000-12-07 2012-12-26 Syngenta Limited Plant derived hydroxy phenyl pyruvate dioxygneases (hppd) resistant against triketone herbicides and transgenic plants containing these dioxygenases
PL214224B1 (en) * 2001-01-30 2013-07-31 Lauridsen Group Methods and compositions for modulating the immune system of animals
KR20050040172A (en) * 2003-10-27 2005-05-03 주식회사 중앙백신연구소 Method of porcine reproductive and respiratory syndrome inactivated oil vaccine
KR20070028547A (en) * 2004-06-18 2007-03-12 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 Identifying virally infected and vaccinated organisms
US7632636B2 (en) * 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
WO2006055331A2 (en) * 2004-11-19 2006-05-26 Intervet International B.V. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains and compositions
CA2611820C (en) 2005-06-24 2015-10-06 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
EP3868400A1 (en) 2005-12-29 2021-08-25 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
CN100523177C (en) * 2007-01-09 2009-08-05 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 Pig replication and respiration syndrome virus attenuated vaccine strain and uses thereof
CN102316895A (en) * 2008-08-25 2012-01-11 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 The vaccine of anti-high-pathogenicity porcine reproduction and respiration syndrome (HP PRRS)
AR078253A1 (en) 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed METHODS TO REDUCE ANTIVIRICAL ACTIVITY IN PCV-2 COMPOSITIONS AND PCV-2 COMPOSITIONS WITH BETTER IMMUNOGENICITY
WO2012110489A2 (en) 2011-02-17 2012-08-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novel european prrsv strain
SG192821A1 (en) 2011-02-17 2013-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Commercial scale process for production of prrsv
KR101281361B1 (en) * 2011-07-18 2013-07-02 서울대학교산학협력단 Vaccine composition for North American Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and mixed vaccine comprising thereof
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
US9315781B2 (en) 2011-07-29 2016-04-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious CDNA clone of european PRRS virus and uses thereof
MX2014013964A (en) * 2012-05-17 2015-03-04 Zoetis Llc Effective vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus prior to weaning.
CA2892948C (en) 2012-12-07 2022-09-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Porcine reproductive and respiratory syndrome virus compositions and uses thereof
US9579373B2 (en) 2013-03-15 2017-02-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
CA2930042C (en) 2013-12-20 2022-06-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prrs virus variant, european prrs virus cdna clone, and uses thereof
HUE061972T2 (en) 2016-11-03 2024-02-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE118352T1 (en) * 1991-06-06 1995-03-15 Stichting Centr Diergeneeskund CAUSES OF MYSTERIOUS SWINE DISEASE, VACCINE COMPOSITIONS AND DIAGNOSTIC KITS.
ATE144144T1 (en) * 1991-08-26 1996-11-15 James Edward Collins VACCINE AGAINST AND DIAGNOSTIC METHOD FOR SWINE INFERTILITY AND RESPIRATORY SYNDROME (SUAS)
MX9204885A (en) * 1991-08-26 1994-05-31 Boehringer Animal Health Inc VACCINE COMPOSITION INCLUDING VIRUSES OF INFERTILITY AND RESPIRATORY SYNDROME OF PIGS.
ATE131067T1 (en) * 1991-10-14 1995-12-15 Akzo Nobel Nv VACCINE AGAINST SWINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME (PRRS) AND DIAGNOSIS.
EP0683816B1 (en) * 1993-02-08 2000-11-02 Bayer Corporation Process for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in vaccines
EP0676467B1 (en) * 1994-04-11 2001-10-04 Akzo Nobel N.V. European vaccine strains of the porcine reproductive respiratory syndrome virus (PRRSV)

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997027288A1 (en) 1997-07-31
PL185841B1 (en) 2003-08-29
KR19980703268A (en) 1998-10-15
EP0835929A1 (en) 1998-04-15
JPH10507372A (en) 1998-07-21
HUP9801124A2 (en) 1998-08-28
MX9707302A (en) 1998-06-30
ES2102971A1 (en) 1997-08-01
CN1185806A (en) 1998-06-24
PL322455A1 (en) 1998-02-02
US6001370A (en) 1999-12-14
CA2216436A1 (en) 1997-07-31
HUP9801124A3 (en) 1999-09-28
CZ337797A3 (en) 1998-03-18
ES2102971B1 (en) 1998-03-01
BR9604888A (en) 1998-12-15
JP3068204B2 (en) 2000-07-24
UA68326C2 (en) 2004-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6001370A (en) Attenuated strain of the virus causing the porcine reproductive respiratory syndrome (PRRS), and vaccines
EP0683816B1 (en) Process for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in vaccines
EP0830142B1 (en) Prrs (porcine reproductive and respiratory syndrome) virus vaccine
CA2076744C (en) Viral agent associated with mystery swine disease
JPH07289250A (en) Europe vaccine strain for pig reproduction breath syndrome virus (prrsv)
JPH09509949A (en) Parainfluenza virus-containing vaccine for preventing reproductive and respiratory syndrome in pigs
SK119498A3 (en) Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
US7906311B2 (en) Cotton rat lung cells for virus culture
EP1543113B1 (en) Chicken astrovirus type 2
MXPA97007302A (en) New attenuated cepa of the virus causing the respiratory and reproductive swine syndrome (prrs), vaccines and diagnostic media obtained with the same and the procedures for your obtenc
ZA200408458B (en) Cotton rat lung cells for virus culture
JP2005520572A (en) Cotton rat lung cells for virus culture

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20041204