CN105624059A - 一种鹅支原体体外液体培养基及其制备方法 - Google Patents

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CN105624059A CN201510922580.4A CN201510922580A CN105624059A CN 105624059 A CN105624059 A CN 105624059A CN 201510922580 A CN201510922580 A CN 201510922580A CN 105624059 A CN105624059 A CN 105624059A
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刘永生
郑福英
陈启伟
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Abstract

本发明提供一种鹅支原体体外液体培养基，由培养基A和培养基B组成，培养基A为分解葡萄糖的支原体培养基，培养基B为分解精氨酸的支原体培养基，培养基A的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，葡萄糖，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐水溶液，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液；培养基B的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-精氨酸盐酸盐水溶液。采用本发明的培养基培养鹅支原体仅24小时即可生长，生长48小时的滴度可达103？CCU/mL；适用于鹅支原体的分离培养和诊断。

Description

一种鹅支原体体外液体培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于培养基技术领域，具体涉及一种鹅支原体体外液体培养基。
背景技术
鹅支原体（Mycoplasmaanseris）是造成鹅呼吸道疾病、阴茎和泄殖腔炎症、产蛋下降、无精蛋及死胚增加的病原体。最早由Kosovac和Djurisic从患有输卵管炎的鹅中检测到，随后由Palya于1971年从匈牙利的一只公鹅的生殖器中分离获得，并在之后命名为sp.1220株（Stipkovits，1978、1984、1986、2012）。流行病学调查显示德国、波兰、捷克斯洛伐克、苏联、英国等国家相继从发炎的公鹅生殖器及泄殖腔中分离到鹅支原体。我国是世界上主要的鹅养殖基地，鹅肉产量占全球总量的93%。珠江三角洲地区和扬州等地流行病学调查证实支原体在鹅群中的广泛感染（彭万强，1988；陈志华，2006），通过剖检病鹅，临床病变主要为肝周炎、气囊炎、腹膜炎、泄殖腔炎和阴茎炎，并可见肠壁变薄出血及输卵管积液，本病流行范围广，一年四季均有发生，以产蛋季节最为严重，可在无精蛋、死胚及孵化的雏鹅中分离到支原体，表明鹅支原体不仅可以经蛋垂直传播，也可以通过交配水平传播。
鹅支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁，由于其基因组较小，造成基因组中编码氨基酸和辅助因子生物合成的基因就少，从而导致能量代谢能力有限；支原体属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化做出调整，需要从外界摄取多种营养物质促进繁殖，因此对体外培养基的要求相当苛刻；由于不同菌株对葡萄糖、精氨酸两种物质利用的情况不同，支原体对培养基的要求也存在差异；其中利用葡萄糖的鹅支原体在含葡萄糖的培养基中生长并产酸，使酚红试剂变黄；利用精氨酸的支原体可分解培养基中的精氨酸产生氨（NH3），使酚红试剂变红。目前，鹅支原体病与鹅的鸭瘟病、鹅出败病列为我国鹅群感染的三大疫病，相对于鸡毒支原体（Mycoplasmagallispeticum）和滑液支原体（Mycoplasmasymoviae）的研究，我国在鹅支原体分离诊断及防控措施方面的研究仍处于起步阶段，目前分离鹅支原体使用的人工培养基一般均由Frey或PPLO培养基改良而来，但仍存在活菌滴度低，繁殖能力差等问题，再加上鹅群中存在两种生化性质不同的支原体（一种分解葡萄糖，一种分解精氨酸），容易产生假阴性，因此，本领域亟需高效稳定、且能达到快速分离诊断鹅支原体的培养基，进而开展鹅支原体感染的治疗与防控研究。
发明内容
本发明提供一种生长周期短、活菌滴度高、适用于两种生化特性的鹅支原体体外的分离及传代培养的高效液体培养基，同时提供这种培养基的制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种鹅支原体体外液体培养基，由培养基A和培养基B组成，所述培养基A为分解葡萄糖的支原体体外培养基，所述培养基B为分解精氨酸的支原体体外培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，葡萄糖，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-精氨酸盐酸盐。
作为优选，所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水680-720mL/L，葡萄糖4-6g/L，丙酮酸钠1.5-3g/L，1%的酚红3-4mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L。
进一步优选地，所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础21g/L，去离子水700-720mL/L，葡萄糖5g/L，丙酮酸钠2g/L，1%的酚红3mL/L，10%的醋酸铊溶液2.6mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L；
作为优选，所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水700-740mL/L，丙酮酸钠1-2g/L，1%的酚红1-1.5mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-精氨酸盐酸盐10-12g/L。
进一步优选地，所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础21g/L，去离子水720-740mL/L，丙酮酸钠1g/L，1%的酚红1mL/L，10%的醋酸铊溶液2.6mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80万单位/L，L-精氨酸盐酸盐10g/L。
作为优选，所述酵母提取液的制备方法为：将酵母溶于4-6倍重量的去离子水中，在28-32℃下磁力搅拌1-1.5小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40℃；之后每分钟增加5℃至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，过滤收集滤液即得。
本发明的第二个目的是提供上述培养基的制备方法，所述培养基A的制备方法为：将配方量的支原体肉汤基础、去离子水、葡萄糖、丙酮酸钠、1%的酚红、10%的醋酸铊溶液充分混匀，调pH至7.8，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50-55℃，加入配方量的灭活的马血清、酵母提取液、灭菌的青霉素水溶液、灭菌的L-半胱氨酸盐酸盐的水溶液、灭菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水溶液，混匀后无菌条件下调整pH至7.7-7.8。
作为优选，所述培养基B的制备方法为：将配方量的支原体肉汤基础、去离子水、丙酮酸钠、1%的酚红、10%的醋酸铊溶液充分混匀，调pH至7.8，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50-55℃，加入配方量的灭活的马血清、酵母提取液、灭菌的青霉素水溶液、灭菌的L-精氨酸盐酸盐的水溶液，混匀后无菌条件下调整pH至7.2-7.3。
本发明的第三个目的是提供应用上述培养基培养鹅支原体的方法，将鹅支原体接种到培养基中，在37℃恒温下静置培养，得到扩大培养的鹅支原体。
本发明对上述培养基的PH值和营养成分等进行了筛选和分析，通过PH值的升高或下降，观察培养基颜色的变化，可快速鉴别支原体的生长（其中A培养基随pH值降低变为橘黄色，B培养基随pH值升高变为深粉色）；通过添加醋酸铊、提高青霉素的浓度，可阻止环境中其他杂菌的生长，使培养基在2-8℃存储时间从1-2月延长为4-5月；通过添加新鲜酵母提取液和生长所需的氨基酸，能明显缩短鹅支原体生长时间，提高活菌滴度；经反复实验证实该培养基培养鹅支原体24小时即可生长，生长48小时的滴度可达103CCU/mL；而未添加之前36-48小时才能生长，生长72-80小时才能达到103CCU。本发明的培养基具有生长快速、含菌量高的特点，适用于鹅支原体的分离培养。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为鹅支原体培养基A；
图2为鹅支原体培养基B；
图3为鹅支原体培养基A的活菌滴度测定结果；
图4为鹅支原体培养基B的活菌滴度测定结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。如无特殊说明，文中的“%”为质量百分比。
实验材料：
支原体肉汤基础（Frey）为BD公司生产，货号为211458；
马血清为Hyclone公司生产，货号为SH30074.03；
青霉素为sigma公司成产，货号为P7794-10MU；
L-半胱氨酸盐酸盐为sigma公司成产，货号为G1276-10G；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为sigma公司成产，货号为N3014-1G；
L-精氨酸盐酸盐为sigma公司成产，货号为A5131-100G；
酚红为Sigma公司生产，货号为P3532；
丙酮酸钠为MECK公司产品，货号为1.06619.0050；
干酵母粉为安琪公司生产。
本发明的鹅支原体体外培养基由分解葡萄糖的培养基（培养基A）和分解精氨酸的培养基（培养基B）组成，具体配方如下：
培养基A的配方：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水680-720mL/L，葡萄糖4-6g/L，丙酮酸钠1.5-3g/L，1%的酚红3-4mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L。
培养基B的配方：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水700-740mL/L，丙酮酸钠1-2g/L，1%的酚红1-1.5mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-精氨酸盐酸盐10-12g/L。
其中，酵母提取液的制备方法为：称取酵母粉200g，加入800-1200mL去离子水，在28-32℃下磁力搅拌1-1.5小时，使细粉充分分散、混匀、发酵；然后逐渐增加温度到40℃，此过程需要10-15分钟；之后每分钟增加5℃，不断搅拌，防止酵母烧糊致使营养成分破坏；加热至沸点维持5分钟，总时间控制在2小时左右，减少了污染杂菌的概率；冷却至室温，3500rpm离心20分钟，取上清，先用滤纸过滤，然后依次经0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤器过滤，将滤液每50mL分装后放入-20℃备用。
培养基A的制备方法为：
先将能够高压灭菌的组分：即支原体肉汤基础（Frey）18-23g/L、680-720mL去离子水、葡萄糖4-6g/L、丙酮酸钠1.5-3g/L、1%的酚红3-4mL/L、10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L充分混匀，用20%的NaOH调PH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟；待冷却至50-55℃，加入不能高压灭菌的组分：即灭活的马血清150-180mL/L、酵母提取液40-55mL/L、灭菌的青霉素80-100万单位/L、灭菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液0.1-0.2g/L、灭菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液0.1-0.2g/L；最后无菌条件下微调PH值至7.7-7.8。
培养基B的制备方法为：
先将能够高压灭菌的组分：即支原体肉汤基础（Frey）18-23g/L，700-740mL去离子水，丙酮酸钠1-2g/L，1%的酚红1-1.5mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L充分混匀，用20%的NaOH调PH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟；待冷却至50-55℃，加入不能高压灭菌的组分：即灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，灭菌的青霉素80-100万单位/L，灭菌的L-精氨酸盐酸盐水溶液10-12g/L；最后无菌条件下微调PH值至7.2-7.3。
将上述培养基用于鹅支原体的培养：将鹅支原体接种到培养基中，在37℃恒温箱中静置培养，24小时即可生长，生长48小时的滴度可达103CCU/mL。
实施例1
本发明的鹅支原体体外培养基由分解葡萄糖的培养基（培养基A）和分解精氨酸的培养基（培养基B）组成，具体配方如下：
本发明的培养基A的配方（500mL）为：支原体肉汤基础（Frey）10.5g，去离子水355mL，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠1g，1%的酚红1.5mL，10%的醋酸铊溶液1.3mL，灭活的马血清75mL，酵母提取液22.5mL，青霉素40万单位，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1g。
本发明的培养基B的配方（500mL）为：支原体肉汤基础（Frey）10.5g，去离子水365mL，丙酮酸钠0.5g，1%的酚红0.5mL，10%的醋酸铊溶液1.3mL，灭活的马血清75mL，酵母提取液22.5mL，青霉素40万单位，L-精氨酸盐酸盐5g。
500mL本发明的培养基A的制备方法为：
将1L的三角瓶置于磁力搅拌机上，先量取355mL的去离子水，缓慢滴加10%的醋酸铊溶液1.3mL，然后依次加入支原体肉汤基础（Frey）10.5g，葡萄糖2.5g，丙酮酸钠1g，1%的酚红1.5mL，充分混匀后用20%的NaOH调PH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟；冷却至50-55℃，加入灭活的马血清75mL，酵母提取液22.5mL，灭菌的青霉素40万单位（溶于10mL去离子水），灭菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液（0.1g溶于10mL去离子水），灭菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液（0.1g溶于10mL去离子水）；最终无菌条件下微调PH值至7.8，置4℃冰箱备用。
500mL本发明的培养基B的制备方法为：
将1L的三角瓶置于磁力搅拌机上，先量取365mL的去离子水，缓慢滴加10%的醋酸铊溶液1.3mL，然后依次称取支原体肉汤基础（Frey）10.5g，丙酮酸钠0.5g，1%的酚红0.5mL，充分混匀后用20%的NaOH调PH值为7.8，121℃高压灭菌15分钟；冷却至50-55℃，加入灭活的马血清75mL，酵母提取液22.5mL，灭菌的青霉素40万单位（溶于10mL去离子水），灭菌的L-精氨酸盐酸盐水溶液（5g溶于10mL去离子水），最终PH值调整至7.3，置4℃冰箱备用。
活菌滴度(CCU)测定：
取2组无菌试管分别用于A、B液体培养基，每组11支试管(图1、图2)，加对应的培养基4.5mL/管，分别在第1管中加入0.5mL生长良好的培养液(在A液体培养基中加入鹅支原体分离株M.anseris-novel：由美国乔治亚大学Dr.Ferguson馈赠；B液体培养基-鹅支原体模式菌株1219株：购自美国菌种保藏中心ATCC)，振荡器混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5mL加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第10管，最后一管中的0.5mL弃去；第11管为阴性对照。将试管放置37℃恒温箱中静置培养，每日观察颜色变化，连续观察10-12天，最后发生颜色变化的那管稀释度就是该培养物的CCU滴度。第12天读值，结果显示培养基A的含菌量为1×108CCU/mL，培养基B的含菌量为1×109CCU/mL(图3、图4)。
实施例2
本发明的鹅支原体体外培养基由分解葡萄糖的培养基（培养基A）和分解精氨酸的培养基（培养基B）组成，具体配方如下：
本发明的培养基A的配方（1000ml）为：支原体肉汤基础18g，葡萄糖4g，丙酮酸钠3g，1%的酚红3mL，10%的醋酸铊溶液3.2mL，灭活的马血清180mL，酵母提取液40mL，青霉素100万单位，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g，其余为去离子水。
本发明的培养基B的配方（1000ml）为：支原体肉汤基础18g，丙酮酸钠1g，1%的酚红1.5mL，10%的醋酸铊溶液3.2mL，灭活的马血清180mL，酵母提取液40mL，青霉素100万单位，L-精氨酸盐酸盐12g，其余为去离子水。
本实施例的其余部分与实施例1相同。
实施例3
本发明的鹅支原体体外培养基由分解葡萄糖的培养基（培养基A）和分解精氨酸的培养基（培养基B）组成，具体配方如下：
本发明的培养基A的配方（1000ml）为：支原体肉汤基础23g，葡萄糖6g，丙酮酸钠1.5g，1%的酚红4mL，10%的醋酸铊溶液2mL，灭活的马血清160mL，酵母提取液50mL，青霉素90万单位，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1g，其余为去离子水。
本发明的培养基B的配方（1000ml）为：支原体肉汤基础23g，丙酮酸钠1g，1%的酚红1.2mL，10%的醋酸铊溶液2mL，灭活的马血清160mL，酵母提取液50mL，青霉素90万单位，L-精氨酸盐酸盐11g，其余为去离子水。
本实施例的其余部分与实施例1相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种鹅支原体体外液体培养基，由培养基A和培养基B组成，所述培养基A为分解葡萄糖的支原体体外培养基，所述培养基B为分解精氨酸的支原体体外培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，葡萄糖，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础，去离子水，丙酮酸钠，1%的酚红，10%的醋酸铊溶液，灭活的马血清，酵母提取液，青霉素，L-精氨酸盐酸盐。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水680-720mL/L，葡萄糖4-6g/L，丙酮酸钠1.5-3g/L，1%的酚红3-4mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述培养基A的配方为：支原体肉汤基础21g/L，去离子水700-720mL/L，葡萄糖5g/L，丙酮酸钠2g/L，1%的酚红3mL/L，10%的醋酸铊溶液2.6mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础18-23g/L，去离子水700-740mL/L，丙酮酸钠1-2g/L，1%的酚红1-1.5mL/L，10%的醋酸铊溶液2-3.2mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母提取液40-55mL/L，青霉素80-100万单位/L，L-精氨酸盐酸盐10-12g/L。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述培养基B的配方为：支原体肉汤基础21g/L，去离子水720-740mL/L，丙酮酸钠2g/L，1%的酚红1mL/L，10%的醋酸铊溶液2.6mL/L，灭活的马血清150mL/L，酵母提取液45mL/L，青霉素80万单位/L，L-精氨酸盐酸盐10g/L。
6.根据权利要求1-5任一所述的培养基，其特征在于：所述酵母提取液的制备方法为：将酵母溶于4-6倍重量的去离子水中，在28-32℃下磁力搅拌1-1.5小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40℃；之后每分钟增加5℃至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，过滤收集滤液即得。
7.权利要求1-6任一所述的培养基的制备方法，其特征在于：所述培养基A的制备方法为：将配方量的支原体肉汤基础、去离子水、葡萄糖、丙酮酸钠、1%的酚红、10%的醋酸铊溶液充分混匀，调pH至7.8并高压灭菌，冷却至50-55℃，加入配方量的灭活的马血清、酵母提取液、灭菌的青霉素水溶液、灭菌的L-半胱氨酸盐酸盐的水溶液、灭菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水溶液，混匀后无菌条件下调整pH至7.7-7.8。
8.权利要求1-6任一所述的培养基的制备方法，其特征在于：所述培养基B的制备方法为：将配方量的支原体肉汤基础、去离子水、丙酮酸钠、1%的酚红、10%的醋酸铊溶液充分混匀，调pH至7.8并高压灭菌，冷却至50-55℃，加入配方量的灭活的马血清、酵母提取液、灭菌的青霉素水溶液、灭菌的L-精氨酸盐酸盐的水溶液，混匀后无菌条件下调整pH至7.2-7.3。
9.应用权利要求1-6任一所述的培养基培养鹅支原体的方法，其特征在于：将鹅支原体接种到培养基中，在37℃恒温下静置培养，得到扩大培养的鹅支原体。
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