CN115044513B - 一株丝状支原体山羊亚种sxtg01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法 - Google Patents

一株丝状支原体山羊亚种sxtg01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115044513B
CN115044513B CN202210772151.3A CN202210772151A CN115044513B CN 115044513 B CN115044513 B CN 115044513B CN 202210772151 A CN202210772151 A CN 202210772151A CN 115044513 B CN115044513 B CN 115044513B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma
subspecies
sxtg01
vaccine
caprae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210772151.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115044513A (zh
Inventor
贺俊平
白涛
岳伟东
李东晓
王巾
赵子惠
李佳容
常倩文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi Agricultural University
Original Assignee
Shanxi Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi Agricultural University filed Critical Shanxi Agricultural University
Priority to CN202210772151.3A priority Critical patent/CN115044513B/zh
Publication of CN115044513A publication Critical patent/CN115044513A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115044513B publication Critical patent/CN115044513B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/35—Mycoplasma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明属于属于畜牧业动物疫苗技术领域，具体涉及一株丝状支原体山羊亚种SXTG01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法。本发明提供了一株丝状支原体山羊亚种SXTG01，已进行生物保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45166。本发明从山西省晋中地区出现典型羊支原体肺炎症状的多只病羊体内，取鼻拭子或病肺，使用盲传的方式从中分离到一株丝状支原体山羊亚种SXTG01，该毒株生长滴度高，将其灭活后制备得到的疫苗，产抗体效价高、持续时间长，能够有效防控丝状支原体山羊亚种感染，具有广泛的市场应用前景。

Description

一株丝状支原体山羊亚种SXTG01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于畜牧业动物疫苗技术领域，具体涉及一株丝状支原体山羊亚种SXTG01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法。
背景技术
丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subspecies capri，Mmc)是一种系统性感染病原，可导致羊发生乳腺炎、关节炎、角膜炎肺炎和败血症等综合征，引起羊支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPSG)。1951年Longley首次分离到丝状支原体山羊亚种，Mmc的广泛流行对全世界的养羊业均造成了严重的经济损失。
针对丝状支原体山羊亚种感染，使用抗生素治疗易产生耐药性，且存在肉品药物残留问题，因此研制安全有效的疫苗是当前防控该病工作的最优选项。在疫苗研制方面，灭活疫苗通过适宜的化学方法将病原灭活，不可逆转地破坏其基因组，既使病原微生物丧失感染和增殖的能力，又不破坏其免疫原性蛋白，使其仍具有刺激机体产生体液免疫和细胞免疫的能力，再通过混合佐剂的方式刺激机体对灭活抗原产生更强的免疫反应、延长其在机体内的作用时间。然而现有的丝状支原体山羊亚种灭活疫苗存在诸多不足，不能有效防控丝状支原体山羊亚种感染，对羊支原体肺炎都起到很高的保护效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一株丝状支原体山羊亚种SXTG01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法，丝状支原体山羊亚种SXTG01生长滴度高，产生效价高、持续时间长的抗体，有效防控丝状支原体山羊亚种感染。
本发明提供了一株丝状支原体山羊亚种SXTG01，所述丝状支原体山羊亚种SXTG01丝状支原体山羊亚种SXTG01中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45166。
本发明还提供了上述技术方案所述的丝状支原体山羊亚种SXTG01在制备丝状支原体山羊亚种疫苗中的应用。
本发明还提供了一种丝状支原体山羊亚种疫苗的制备方法，包括如下步骤：
将上述技术方案所述的丝状支原体山羊亚种SXTG01灭活后与佐剂混合。
优选的，所述灭活的方式包括：将上述技术方案所述的丝状支原体山羊亚种SXTG01与灭活剂混合。
优选的，所述灭活的时间为4～24h；所述灭活剂包括β-丙内酯和/或二乙烯亚胺。
优选的，所述二乙烯亚胺的工作浓度为0.2wt.％～0.6wt.％；所述β-丙内酯的工作浓度为0.05wt.％～0.2wt.％。
优选的，所述佐剂包括MontanideTMISA 78、ISA 201和IMS 1313中的一种或多种。
优选的，所述佐剂与灭活所得抗原的体积比为(1～2):1。
优选的，所述灭活前，还包括：将所述丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌液按照1:10的体积比接种到液体培养基中培养，分离，得到支原体浓缩菌液；
所述液体培养基以1L计包括：PPLO肉汤粉21g、葡萄糖5g、10％精氨酸溶液10mL、1％醋酸铊溶液10mL、25％酵母浸出液100mL、10倍MEM 10mL、8万单位/mL青霉素溶液10mL、马血清100mL、1％酚红溶液1.0mL和余量的双蒸水。
优选的，所述培养的温度为35～37℃，时间为2～3d；所述菌液中丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌量为1×1015CCU/mL。
本发明提供了一株丝状支原体山羊亚种SXTG01，已进行生物保藏，丝状支原体山羊亚种SXTG01中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.45166。本发明从山西省晋中地区出现典型羊支原体肺炎症状的多只病羊体内，取鼻拭子或病肺，使用盲传的方式从中分离到一株丝状支原体山羊亚种SXTG01，该毒株生长滴度高，将其灭活后制备得到的疫苗，产抗体效价高、持续时间长，能够有效防控丝状支原体山羊亚种感染，具有广泛的市场应用前景。
生物保藏信息
丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subspecies capri，Mmc)SXTG01，于2022年5月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.45166。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1-1为实施例1丝状支原体山羊亚种SXTG01形态学鉴定结果；
图1-2为实施例1丝状支原体山羊亚种SXTG01琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2为实施例1丝状支原体山羊亚种SXTG01病毒滴度检测结果；
图3为不同浓度的β-丙内酯对丝状支原体山羊亚种SXTG01的灭活效果；
图4为不同浓度的二乙烯亚胺对丝状支原体山羊亚种SXTG01的灭活效果；
图5为不同灭活剂处理丝状支原体山羊亚种SXTG01后得到的疫苗免疫小鼠后血清特异性IgG抗体水平检测结果；如各组数据之间差异显著则标注不同字母(P＜0.05)，差异不显著则标注相同字母(P＞0.05)；
图6为不同灭活剂处理丝状支原体山羊亚种SXTG01后得到的疫苗刺激特异性淋巴细胞增殖的情况；如各组数据之间差异显著则标注不同字母(P＜0.05)，差异不显著则标注相同字母(P＞0.05)；
图7-1和7-2为稳定性检测结果；
图8为不同佐剂制备丝状支原体山羊亚种SXTG01疫苗免疫小鼠后血清特异性IgG抗体水平检测结果；各组数据之间如差异显著则标注不同字母(P＜0.05)，差异不显著则标注相同字母(P＞0.05)；
图9为不同佐剂制备丝状支原体山羊亚种SXTG01疫苗刺激抗原特异性淋巴细胞增殖的情况；各组数据之间如差异显著则标注不同字母(P＜0.05)，差异不显著则标注相同字母(P＞0.05)。
具体实施方式
本发明提供了一株丝状支原体山羊亚种SXTG01，所述丝状支原体山羊亚种SXTG01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.45166。
本发明所述丝状支原体山羊亚种SXTG01是从山西省晋中地区出现典型羊支原体肺炎症状的多只病羊体内，取鼻拭子或病肺，使用盲传的方式分离得到，所述丝状支原体山羊亚种SXTG01的LppA基因序列优选如SEQ ID NO.1所示。本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为5’-ATCAGTGAACAAGACCCATCTGAACCTGAAGAAAAGCAGCCAGATATAAAACCTCAAGGTGATAATCCTAATAATGTTCAACCACATAACGATCAACCTGAAATTAATAATGTAGACCTTTCTGACTTAGATAAAATAAAAAAGGAATTGTCATTTGACAATTATTTAATATATAAACAAAAAGACCCTATATCAGCTTGATCTATGTTAAAAAATGATTTATCTACAATAACAACTGTTTTCTACAACACTAACAAAAATGTTAAAAGGGAATATAAATTAAGTTTAGAAAGTCCAAATAAAGATCCTGACTTTATTTCTAAAAAAGGAGTAATTGATAAAGTAAAAATTAAGTTTACAAAAGAGAATAATTTTAGAATTCTTGAATTTAGTTTCACAGGATTTAAAGTAACAGAAATAGACAAAAATAAAAATAAAAAATATGATTATATTAAACCAAAAGAAACAGTAGATTCAAGATTAAGTGGTTTATATCCTTCTATTTTAGCATATATGTTGTTATATGCAGAAAATACTAATAACTATAAAAGTTTGCAAGAAACAGACAAAGATGCAATTAATTTTGAAGGATTAATAAATAAACCAACTAACTTATTTAATGATAAATTTGTAGGTTTTAGTGTTGGTACTAAAGAATTGCTATTTGATTTTAACGAAAATTACAGAAAACTATATGTTTATAAGTTAGTTGGTGCTGGATTTGATGATATCAATGGAACATTAACTTTAAAAGTGGAAATCAATAATAGTGAAGATAATAAAGAAAAAGAGCCTGGAATTTCTAAAGAATTTAGCTTTAAAGAATTTAGAAAAGTAAATACTGATGATCCTAGCAAAAATCCTTTTTATGTTTCATTAACACCAGCTGATCTAAAGAAAATAATAACTGACAAAAGGATTAAAAAAATTTAGAAAACTACTTTGGAATACAAAGAAATATCTTAATTGTGGGGGGGGGGAAAAGAAGATAAGAAGGGGTT-3’。
本发明所述丝状支原体山羊亚种SXTG01在固体培养基上菌落呈现典型的圆形，菌落中心稍暗，边缘光滑，瑞氏染色染色良好，呈现淡紫色，该菌株为0.2μm左右大小，具有点状、两极状等多种形态；葡萄糖水解试验、尿素酶活性测定和精氨酸水解试验结果依次为阳性、阴性和阴性；与Mmc标准株PG3同源性最高、遗传距离最近，相似度98.86％，覆盖率95％，属于为丝状支原体山羊亚种。
本发明实施例中，所述丝状支原体山羊亚种SXTG01生长滴度高，为1×1015CCU/mL，本发明丝状支原体山羊亚种SXTG01更有利于疫苗的生产；将其灭活后可制备疫苗，免疫丝状支原体山羊亚种，并且产生的抗体效价高、持续长，能够有效防控丝状支原体山羊亚种感染，具有广泛的市场应用前景。
根据本发明所述丝状支原体山羊亚种SXTG01的生理生化特性，所述的丝状支原体山羊亚种SXTG01在制备丝状支原体山羊亚种疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种丝状支原体山羊亚种疫苗的制备方法，包括如下步骤：将所述丝状支原体山羊亚种SXTG01灭活后与佐剂混合。
本发明将所述丝状支原体山羊亚种SXTG01灭活前，优选将所述丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌液按照1:10的体积比接种到液体培养基中培养，得丝状支原体山羊亚种SXTG01培养液。本发明所述液体培养基以1L计，优选包括：PPLO肉汤粉21g、葡萄糖5g、10％精氨酸溶液10mL、1％醋酸铊溶液10mL、25％酵母浸出液100mL、10×MEM 10mL、8万单位/mL青霉素溶液10mL、马血清100mL、1％酚红溶液1.0mL和余量的双蒸水。本发明所述菌液中丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌量优选为1×1015CCU/mL。本发明对所述丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌液的制备方法没有严格要求，常规操作即可。本发明所述培养的温度优选为35～37℃，进一步优选为36℃；所述培养的时间优选为2～3d，进一步优选为2d。
得所述丝状支原体山羊亚种SXTG01培养液后，本发明优选对所述丝状支原体山羊亚种SXTG01培养液进行分离，得到支原体浓缩菌液。本发明所述分离优选包括第一分离、第二分离和第三分离。本发明所述第一分离的转速优选为2000～2500rpm，进一步优选为2100～2400rpm，更优选为2200～2300rpm，最优选为2250rpm；所述第一分离的时间优选为10min。本发明优选对所述第一分离所得上清液进行第二分离，所述第二分离的转速优选为12000rpm；所述第二分离的时间优选为30min；所述第二分离的温度优选为4℃。本发明优选利用0.1M的PBS溶液重悬所述第二分离所得沉淀后进行第三分离，所述第三分离的转速优选为12000rpm；所述第三分离的时间优选为10min；所述第三分离的温度优选为4℃。本发明优选利用0.1M的PBS溶液重悬所述第三分离所得沉淀，得到所述支原体浓缩菌液。本发明对所述丝状支原体山羊亚种SXTG01培养液进行分离时，所述丝状支原体山羊亚种SXTG01培养液的体积与所述第三分离使用的0.1M的PBS溶液的体积比优选为5:1，所述支原体浓缩菌液中的菌量优选为5×1015CCU/mL。
得所述支原体浓缩菌液后，本发明优选对所述支原体浓缩菌液进行灭活，得到支原体灭活抗原。本发明所述灭活的时间优选为4～24h，进一步优选5～20h，更优选为8～16h，最优选为12h；所述灭活的温度优选为25℃。本发明所述灭活的方式优选包括：将所述支原体浓缩菌液与灭活剂混合。本发明所述灭活剂优选包括β-丙内酯和/或二乙烯亚胺，进一步优选为β-丙内酯。本发明所述二乙烯亚胺的工作浓度优选为0.2wt.％～0.6wt.％，进一步优选为0.3wt.％～0.5wt.％，更优选为0.5wt.％；所述β-丙内酯的工作浓度优选为0.05wt.％～0.2wt.％，进一步优选为0.08wt.％～0.18wt.％，更优选为0.1wt.％～0.15wt.％，最优选为0.12wt.％。
得所述支原体灭活抗原后，本发明优选将所述支原体灭活抗原与佐剂混合，得到所述丝状支原体山羊亚种疫苗。本发明所述佐剂优选包括MontanideTMISA 78、ISA 201和IMS 1313中的一种或多种，进一步优选为IMS 1313和/或ISA 201，更优选为IMS1313。本发明所述支原体灭活抗原与佐剂的体积比优选为(1～2):1，进一步优选为1:1。本发明所述丝状支原体山羊亚种疫苗可免疫丝状支原体山羊亚种，免疫实验动物Balb/c小鼠结果表明，本发明制备得到的疫苗产生的抗体效价高，持续时间长，能够有效防控丝状支原体山羊亚种感染，尤其能够防控山西省内流行的丝状支原体山羊亚种菌株的感染。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株丝状支原体山羊亚种SXTG01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例中使用的培养基：
液体培养基：PPLO肉汤粉21g、葡萄糖5g、10％精氨酸溶液10mL、1％醋酸铊溶液10mL、25％酵母浸出液100mL、10倍MEM 10mL、8万单位/mL青霉素溶液10mL、马血清100mL、1％酚红溶液1.0mL、双蒸水加至1000mL；
固体培养基：PPLO肉汤粉21g、葡萄糖5g、10％精氨酸溶液10mL、1％醋酸铊溶液10mL、25％酵母浸出液100mL、10倍MEM 10mL、8万单位/mL青霉素溶液10mL、马血清100mL、1％酚红溶液1.0mL、琼脂15g、双蒸水加至1000mL；
不含青霉素的液体培养基：PPLO肉汤粉21g、葡萄糖5g、10％精氨酸溶液10mL、1％醋酸铊溶液10mL、25％酵母浸出液100mL、10倍MEM 10mL、马血清100mL、1％酚红溶液1.0mL、双蒸水加至1000mL；
不含青霉素的固体培养基：PPLO肉汤粉21g、葡萄糖5g、10％精氨酸溶液10mL、1％醋酸铊溶液10mL、25％酵母浸出液100mL、10倍MEM 10mL、马血清100mL、1％酚红溶液1.0mL、琼脂15g、双蒸水加至1000mL。
实施例1-1
1.1毒株分离
从山西省晋中地区出现典型羊支原体肺炎症状的39只病羊体内，取鼻拭子或病肺，使用盲传的方式从中分离培养3代病原菌，再用固液交替纯化3次，得到菌液(固液交替纯化1次的操作：在液体培养基中37℃培养2～3d后，然后接种至不含青霉素的固体培养基上37℃培养3～5d，再挑取典型形态单菌落至液体培养中37℃培养2～3d，如此循环，直至分别在液体培养基和固体培养基上分别培养3次后结束)，从其中5只体内肺脏分离到了支原体，依次标记为1～5，依次对1～5号支原体进行形态学鉴定、生化特征鉴定和特异性基因PCR鉴定。
(1)形态学鉴定
向液体培养基中添加苯酚红(支原体代谢反应会使培养基变色)，分别接种1～5号支原体，取变黄的液体培养基制作涂片，进行瑞氏染色，在油镜下观察，结果如图1-1所示；取变黄的液体培养基接种到不含青霉素的固体培养基培养3～5d后，使用体视显微镜观察菌落形态，发现1～5号支原体菌落形态一致，结果如图1-2所示。
根据图1-1和图1-2可以看出，不含青霉素的固体培养基上菌落呈现典型的圆形，菌落中心稍暗，边缘光滑，瑞氏染色染色良好，呈现淡紫色，该菌株为0.2μm左右大小，具有点状、两极状等多种形态。符合丝状支原体山羊亚种形态学特征。
(2)生化特性鉴定
根据毕丁仁等人(毕丁仁,王桂枝.动物霉形体及研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998.)所述方法，对分离到的1～5号支原体进行葡萄糖水解试验(Glucosehydrolysis)、尿素酶活性测定(Determination activity of urease)、精氨酸水解试验(Arginine hydrolysis test)，根据培养基颜色变化判定其生化特性。发现1～5号支原体生化特性一致，鉴定结果为：葡萄糖水解试验阳性，尿素酶活性测定阴性，精氨酸水解试验阴性，符合丝状支原体山羊亚种生化特性。
(3)PCR鉴定
根据SEQ ID NO.2所示的丝状支原体山羊亚种标准株PG3的LppA基因序列设计如SEQ ID NO3所示的上游引物LF和序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物LR(SEQ ID NO.2：5’-AACAAAGACCCATCTGAACCTGAAGAAAAGCAGCCAGATATAAAACCTCAAGGTGATAATCCTAATAATGTTCAACCACATAACGATCAACCTGAAATTAATAATGTAGACCTTTCTGACTTAGATAAAATAAAAAAGGAATTGTCATTTGACAATTATTTAATATATAAACAAAAAGACCCTATATCAGCTTGATCTATGTTAAAAAATGATTTATCTACAATAACAACTGTTTTCTACAACACTAACAAAAATGTTAAAAGGGAATATAAATTAAGTTTAGAAAGTCCAAATAAAGATCCTGACTTTATTTCTAAAAAAGGAGTAATTGATAAAGTAAAAATTAAGTTTACAAAAGAGAATAATTTTAGAATTCTTGAATTTAGTTTCACAGGATTTAAAGTAACAGAAATAGACAAAAATAAAAATAAAAAATATGATTATATTAAACCAAAAGAAACAGTAGATTCAAGATTAAGTGGTTTATATCCTTCTATTTTAGCATATATGTTGTTATATGCAGAAAATACTAATAACTATAAAAGTTTGCAAGAAACAGACAAAGATGCAATTAATTTTGAAGGATTAATAAATAAACCAACTAACTTATTTAATGATAAATTTGTAGGTTTTAGTGTTGGTACTAAAGAATTGCTATTTGATTTTAACGAAAATTACAGAAAACTATATGTTTATAAGTTAGTTGGTGCTGGATTTGATGATATCAATGGAACATTAACTTTAAAAGTGGAAATCAATAATAGTGAAGATAATAAAGAAAAAGAGCCTGGAATTTCTAAAGAATTTAGCTTTAAAGAATTTAGAAAAGTAAATACTGATGATCCTAGCAAAAATCCTTTTTATGTTTCATTAACACCAGCTGATCTAAAGAAAATAATAACTGACAAAAGTATTAAAAAAAATTTAGAAGATCTACATTTGGATATAACAAAAGAAAATAATCTT-3’)，使用序列如SEQ IDNO.3所示的上游引物LF和序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物LR分别对分离到的1～5号支原体的LppA基因进行PCR扩增(LF：5’-CAATCCAGATCATAAAAAACCT-3’，LR：5’-CTCCTCATATTCCCCTAGAA-3’)，预期扩增产物大小为1049bp。PCR扩增反应体系为：2×TaqPCR Ma ster Mix12.5μL，引物LF(10μmol/L)0.5μL，引物LR(10μmol/L)0.5μL，DNA模板1.5μL，ddH2O 10μL，总体系25μL。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸8min，4℃保存。产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，将符合预期扩增条带大小(1049bp)的电泳产物送至北京擎科生物科技有限公司测序并同GenBank已登录的其他菌种进行序列比对、同源性遗传距离分析，测序结果如SEQ ID NO.1所示，将LppA测序结果在NCBI上Blast比对结果表示，分离得到的1～5号支原体LppA基因序列一致，并且分别与Mmc标准株PG3同源性最高、遗传距离最近，相似度均为98.86％，覆盖率均为95％，从分子水平上证明了分离株为丝状支原体山羊亚种，本发明1～5号支原体为同一株，将本发明分离得到的支原体鉴定为丝状支原体山羊亚种，命名为丝状支原体山羊亚种SXTG01，并于2022年5月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.45166。
实施例1-2
支原体生长滴度检测
测定操作如下：准备16支1.5mL的离心管，每管打入900μL液体培养基，取100μL实施例1-1经过固液交替纯化3次后得到的菌液，加入第1支管中，吸打混匀后，从第1支管中吸取100μL至第2支管，混匀后从第2支管吸取100μL至第3支管，重复上述操作步骤直到第15管混匀后弃掉100μL，相当于每次将前一管的菌液进行10倍稀释，第1支管作为对照管，将离心管置于37℃恒温培养箱中静置培养，以管中颜色不再变化时停止，每组中发生颜色变化的最大稀释倍数即为菌株的CCU生长滴度，16支试管颜色变化结果如图2，从左到右每管依次10倍稀释，16号管为阴性对照，从左到右变黄的最后一管对应的稀释倍数即为分离株的生长滴度，根据图2可以看出，本发明丝状支原体山羊亚种SXTG01滴度高，为1×1015CCU/mL。
实施例2-1
将β-丙内酯(Beta-propiolactone，BPL)加入到3管实施例2-1步骤(1)丝状支原体山羊亚种浓缩菌液中，使3管中BPL终浓度依次为0.05％、0.1％和0.2％，充分震荡混匀后，室温(25℃)条件下灭活反应并开始计时，分别于灭活4h、8h、12h、16h、24h时取样，每次取样均于37℃水浴静置2h终止灭活，接种于液体培养基，在36～37℃条件下培养3～7d观察是否变色，培养5d后的结果如图3所示，根据图3可以看出，BPL的工作浓度为0.05％时，灭活4h液体培养基开始变色；BPL的工作浓度为0.1％时，灭活4h液体培养基开始变色；BPL的工作浓度为0.2％时，灭活4h液体培养基开始变色，并且培养6～7d的结果与第5d一致，未发生变化；
将步骤(2)利用终浓度为0.05％的BPL灭活4h后得到的灭活抗原与IMS1313按照1:1的体积比混合，得到疫苗。
实施例2-2
同实施例2-1，区别在于将步骤(2)利用终浓度为0.05％的BPL灭活4h后得到的灭活抗原与ISA 78按照1:1的体积比混合，得到疫苗。
实施例2-3
同实施例2-1，区别在于将步骤(2)利用终浓度为0.05％的BPL灭活4h后得到的灭活抗原与ISA 201按照1:1的体积比混合，得到疫苗。
实施例3-1
丝状支原体山羊亚种疫苗的制备，由如下步骤组成：
1.制备抗原
(1)丝状支原体山羊亚种支原体浓缩菌液
取冻存的丝状支原体山羊亚种SXTG01接种液体培养基复苏培养，将约处于对数生长期的菌液接种到固体培养基上，用玻璃涂布棒将其涂抹均匀以进行杂菌检验，经过检验确定菌液中无杂菌生长后将此菌液(菌量约为1×1015CCU/mL)按照1:10的比例加到液体培养基中进行扩大培养，2～3d后收取。将25mL菌液于4℃下2000rpm离心10min，吸取上清，弃沉淀；将上清液于4℃12000rpm状态下离心30min，弃上清，加0.01M的PBS(pH7.4)重悬后再次以4℃12000rpm离心10min取沉淀，三次后得到的沉淀用5mL 0.01M的PBS(pH 7.4)重悬，即为丝状支原体山羊亚种浓缩菌液(菌量约为5×1015CCU/mL)。
(2)灭活
将浓度为1mol/L的2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)溶液和1mol/L的NaOH溶液在37℃下等体积混合1h，每隔10min摇匀一次，环化得到浓度为0.5mol/L二乙烯亚胺(Binaryethylenimine，BEI)，加入到3管步骤(1)丝状支原体山羊亚种浓缩菌液中，使3管中BEI终浓度依次为0.2％、0.4％和0.6％，震荡混匀，置于37℃培养箱内灭活并开始计时，在灭活4h、8h、12h、16h、20h时取样，加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与对应样本中BEI的终浓度相等，中和BEI进而终止灭活，3500rpm离心10min，取上清液，向其中加入相当于取样菌液十分之一体积的5％AgNO3溶液，观察是否黑色沉淀产生，如有则说明硫代硫酸钠过量，BEI已被完全中和，然后接种于液体培养基，在36～37℃条件下培养3～7d观察是否变色，培养5d后的结果如图4所示，根据图4可以看出，BEI的工作浓度为0.2％时，灭活16h液体培养基开始变色；BEI的工作浓度为0.4％时，灭活16h液体培养基开始变色；BEI的工作浓度为0.6％时，灭活12h液体培养基开始变色，并且培养6～7d的结果与第5d一致，未发生变化。
(3)疫苗制备
将步骤(2)利用终浓度为0.6％的BEI灭活12h后得到的灭活抗原与IMS 1313按照1:1的体积比混合，得到疫苗。
实施例3-2
同实施例3-1，区别在于步骤(3)将步骤(2)利用终浓度为0.6％的BEI灭活12h后得到的灭活抗原与ISA 78按照1:1的体积比混合，得到疫苗。
实施例3-3
同实施例3-1，区别在于步骤(3)将步骤(2)利用终浓度为0.6％的BEI灭活12h后得到的灭活抗原与ISA 201按照1:1的体积比混合，得到疫苗。
测试例1
1.小鼠分组
选取5～7周龄体重范围在17-23g的Balb/c小鼠，平均分为7组，具体为A～G组别，每组4只小鼠，其中A组免疫PBS，B～G组依次免疫实施例2-1～实施例3-3得到的疫苗。
2.免疫方法
后肢肌肉注射免疫，分别于首次免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d眼眶后采血分离血清测定血清抗体效价以评价体液免疫水平(如图5和表2)，首免后42d取小鼠脾脏进行淋巴细胞增殖试验以评价细胞免疫水平(如图6和表3)；各组均在首次免疫后14d进行第二次免疫，首次免疫和第二次免疫的剂量为100μL/只，具体如下表1。
表1小鼠免疫分组及免疫情况
Figure BDA0003724603890000111
表2血清抗体效价(OD450-OD630)
Figure BDA0003724603890000112
Figure BDA0003724603890000121
表3淋巴细胞增殖结果
Figure BDA0003724603890000122
注：表3中数值为刺激指数(SI)，表示细胞增殖水平。
根据图5～图6和表2～3可以看出，二乙烯亚胺和β-丙内酯灭活丝状支原体山羊亚种SXTG01制备的疫苗免疫小鼠产生的体液免疫水平和细胞免疫水平在7～42d内持续不断升高；结合上述实施例，β-丙内酯的工作浓度为0.05wt.％～0.2wt.％，作用4h即可使分离到的丝状支原体山羊亚种SXTG01灭活；二乙烯亚胺的工作浓度为0.2wt.％～0.6wt.％，作用12～16h可使分离到的丝状支原体山羊亚种SXTG01灭活，β-丙内酯的灭活效果优于二乙烯亚胺，β-丙内酯是以丝状支原体山羊亚种SXTG01制备疫苗时更为理想的灭活剂。
实施例4-1
ISA78高压灭菌后放入水浴锅内31℃水浴保温，与同样在31℃的0.05％的BPL灭活4h得到的灭活抗原以1:1的体积比混合，并迅速用震荡机剧烈震荡乳化，得到疫苗。
实施例4-2
同实施例4-1，区别在于将ISA78替换为ISA201，得到疫苗。
实施例4-3
IMS1313无菌保存，在室温下与0.05％的BPL灭活4h得到的灭活抗原以1:1的体积比混合并震荡混匀，得到疫苗。
测试例2
对实施例4-1～4-3得到的疫苗进行常规检测
(1)稳定性检测
实施例4-1～4-3得到的疫苗存放前外观结果如图7-1所示，其中图7-1从左到右依次为实施例4-3、实施例4-2和实施例4-1得到的疫苗；4℃冰箱存放80天后外观结果如图7-2所示，其中图7-2从左到右依次为实施例4-3、实施例4-2和实施例4-1得到的疫苗；根据图7-1和7-1可以看出，实施例4-1得到的疫苗存放后分层明显，实施例4-2得到的疫苗存放后轻微分层，实施例4-3得到的疫苗存放后未发生分层现象，说明实施例4-3得到的疫苗稳定性最好。
(2)物理性状检测
从外观、黏度、剂型三方面检测实施例4-1～4-3得到的疫苗，IMS 1313为水溶性免疫刺激复合物微米佐剂，稳定且黏度极低近似于水，因此只需检测ISA 78和ISA 201油乳剂物理性状，结果如表4。
表4物理性状检测结果
Figure BDA0003724603890000131
根据表4可以看出，以ISA 78为佐剂得到的疫苗黏度高于以ISA 201为佐剂得到的疫苗。
(3)无菌检测
将实施例4-1～4-3得到的疫苗分别接种至不含抗生素的液体培养基和不含抗生素的固体培养基中，置于37℃培养箱，培养7天后6个培养基均无变色、无浑浊以及无菌落生长，表明疫苗为无菌状态。
(4)安全性分析
取小鼠，分别肌肉注射实施例4-1～4-3得到的疫苗，设PBS阴性对照，注射当天开始观察小鼠的临床症状(神经症状、注射过敏反应和局部反应)，结果表明MS 1313佐剂、ISA78佐剂和ISA 201佐剂制备的疫苗注射小鼠无神经症状和过敏反应，生长良好，仅ISA 78和ISA 201制备的疫苗在注射当天注射部位轻微红肿，第二天即消退，不存在安全性问题，且三者中IMS 1313最稳定。
测试例3
疫苗免疫小鼠后免疫效果的评价
1.小鼠分组
选取5～7周龄体重范围在17-23g的Balb/c小鼠，平均分为10组，具体为A～J组别，其中A组4只小鼠，B～J组8只小鼠，A组免疫PBS，免疫次数为2次；B～D组免疫实施例4-3得到的疫苗，B组免疫次数为2次，每次免疫100μL/只，C组免疫次数为3次，每次免疫100μL/只，D组免疫次数为2次，每次免疫200μL/只；E～G组免疫实施例4-1得到的疫苗，E组免疫次数为2次，每次免疫100μL/只，F组免疫次数为3次，每次免疫100μL/只，G组免疫次数为2次，每次免疫200μL/只；H～J组免疫实施例4-2得到的疫苗，H组免疫次数为2次，每次免疫100μL/只，I组免疫次数为3次，每次免疫100μL/只，J组免疫次数为2次，每次免疫200μL/只。
2.免疫和检测方法
后肢肌肉注射免疫，分别于首次免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d眼眶后采血分离血清，使用间接ELISA法测定血清抗体效价以评价体液免疫水平(如图8和表6)；于首次免疫后42d取小鼠脾脏进行淋巴细胞增殖试验以评价细胞免疫水平(如图9和表7)；各组均在首次免疫后14d进行第二次免疫，增加免疫剂次组在二免后14d(即首免后28d)进行第三次免疫，具体如下表5
表5小鼠免疫分组及免疫情况
Figure BDA0003724603890000141
Figure BDA0003724603890000151
表6血清抗体效价(OD450-OD630)
Figure BDA0003724603890000152
表7淋巴细胞增殖结果
Figure BDA0003724603890000153
Figure BDA0003724603890000161
注：表3中数值为刺激指数(SI)，表示细胞增殖水平。
根据图7～8和表6～7可以看出，IMS1313佐剂起效较慢，但能引起体液免疫水平在7～42d内持续不断升高。IMS1313可使小鼠产生较强的细胞免疫应答，增加免疫剂量和三次加强免疫都可以增强疫苗引起的淋巴细胞增殖能力，且增加免疫剂量比三次加强免疫要引起更强的细胞免疫应答。IMS1313为以丝状支原体山羊亚种SXTG01制备疫苗较为理想的免疫佐剂。
本发明分离到的丝状支原体山羊亚种SXTG01生长滴度高，将其灭活后制备得到的疫苗，产抗体效价高、持续时间长，能够有效防控丝状支原体山羊亚种感染，具有广泛的市场应用前景。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一株丝状支原体山羊亚种SXTG01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcagtgaac aagacccatc tgaacctgaa gaaaagcagc cagatataaa acctcaaggt 60
gataatccta ataatgttca accacataac gatcaacctg aaattaataa tgtagacctt 120
tctgacttag ataaaataaa aaaggaattg tcatttgaca attatttaat atataaacaa 180
aaagacccta tatcagcttg atctatgtta aaaaatgatt tatctacaat aacaactgtt 240
ttctacaaca ctaacaaaaa tgttaaaagg gaatataaat taagtttaga aagtccaaat 300
aaagatcctg actttatttc taaaaaagga gtaattgata aagtaaaaat taagtttaca 360
aaagagaata attttagaat tcttgaattt agtttcacag gatttaaagt aacagaaata 420
gacaaaaata aaaataaaaa atatgattat attaaaccaa aagaaacagt agattcaaga 480
ttaagtggtt tatatccttc tattttagca tatatgttgt tatatgcaga aaatactaat 540
aactataaaa gtttgcaaga aacagacaaa gatgcaatta attttgaagg attaataaat 600
aaaccaacta acttatttaa tgataaattt gtaggtttta gtgttggtac taaagaattg 660
ctatttgatt ttaacgaaaa ttacagaaaa ctatatgttt ataagttagt tggtgctgga 720
tttgatgata tcaatggaac attaacttta aaagtggaaa tcaataatag tgaagataat 780
aaagaaaaag agcctggaat ttctaaagaa tttagcttta aagaatttag aaaagtaaat 840
actgatgatc ctagcaaaaa tcctttttat gtttcattaa caccagctga tctaaagaaa 900
ataataactg acaaaaggat taaaaaaatt tagaaaacta ctttggaata caaagaaata 960
tcttaattgt gggggggggg aaaagaagat aagaaggggt t 1001
<210> 2
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacaaagacc catctgaacc tgaagaaaag cagccagata taaaacctca aggtgataat 60
cctaataatg ttcaaccaca taacgatcaa cctgaaatta ataatgtaga cctttctgac 120
ttagataaaa taaaaaagga attgtcattt gacaattatt taatatataa acaaaaagac 180
cctatatcag cttgatctat gttaaaaaat gatttatcta caataacaac tgttttctac 240
aacactaaca aaaatgttaa aagggaatat aaattaagtt tagaaagtcc aaataaagat 300
cctgacttta tttctaaaaa aggagtaatt gataaagtaa aaattaagtt tacaaaagag 360
aataatttta gaattcttga atttagtttc acaggattta aagtaacaga aatagacaaa 420
aataaaaata aaaaatatga ttatattaaa ccaaaagaaa cagtagattc aagattaagt 480
ggtttatatc cttctatttt agcatatatg ttgttatatg cagaaaatac taataactat 540
aaaagtttgc aagaaacaga caaagatgca attaattttg aaggattaat aaataaacca 600
actaacttat ttaatgataa atttgtaggt tttagtgttg gtactaaaga attgctattt 660
gattttaacg aaaattacag aaaactatat gtttataagt tagttggtgc tggatttgat 720
gatatcaatg gaacattaac tttaaaagtg gaaatcaata atagtgaaga taataaagaa 780
aaagagcctg gaatttctaa agaatttagc tttaaagaat ttagaaaagt aaatactgat 840
gatcctagca aaaatccttt ttatgtttca ttaacaccag ctgatctaaa gaaaataata 900
actgacaaaa gtattaaaaa aaatttagaa gatctacatt tggatataac aaaagaaaat 960
aatctt 966
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caatccagat cataaaaaac ct 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcctcatat tcccctagaa 20

Claims (10)

1.一株丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subspecies capri，Mmc)SXTG01，其特征在于，所述丝状支原体山羊亚种SXTG01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45166。
2.权利要求1所述的丝状支原体山羊亚种SXTG01在制备丝状支原体山羊亚种疫苗中的应用。
3.一种丝状支原体山羊亚种疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的丝状支原体山羊亚种SXTG01灭活后与佐剂混合。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述灭活的方式包括：将权利要求1所述的丝状支原体山羊亚种SXTG01与灭活剂混合。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述灭活的时间为4～24h；所述灭活剂包括β-丙内酯和/或二乙烯亚胺。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述二乙烯亚胺的工作浓度为0.2wt.％～0.6wt.％；所述β-丙内酯的工作浓度为0.05wt.％～0.2wt.％。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述佐剂包括MontanideTMISA 78、ISA201和IMS 1313中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述佐剂与灭活所得抗原的体积比为(1～2):1。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述灭活前，还包括：将所述丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌液按照1:10的体积比接种到液体培养基中培养，分离，得到支原体浓缩菌液；
所述液体培养基以1L计包括：PPLO肉汤粉21g、葡萄糖5g、10％精氨酸溶液10mL、1％醋酸铊溶液10mL、25％酵母浸出液100mL、10倍MEM10mL、8万单位/mL青霉素溶液10mL、马血清100mL、1％酚红溶液1.0mL和余量的双蒸水。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为35～37℃，时间为2～3d；所述丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌液中丝状支原体山羊亚种SXTG01的菌量为1×1015CCU/mL。
CN202210772151.3A 2022-06-30 2022-06-30 一株丝状支原体山羊亚种sxtg01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法 Active CN115044513B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210772151.3A CN115044513B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一株丝状支原体山羊亚种sxtg01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210772151.3A CN115044513B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一株丝状支原体山羊亚种sxtg01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115044513A CN115044513A (zh) 2022-09-13
CN115044513B true CN115044513B (zh) 2023-04-25

Family

ID=83165447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210772151.3A Active CN115044513B (zh) 2022-06-30 2022-06-30 一株丝状支原体山羊亚种sxtg01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115044513B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116832149A (zh) * 2023-07-26 2023-10-03 内蒙古自治区农牧业科学院 一种绵羊肺炎支原体、丝状支原体和d型多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗及制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106492210A (zh) * 2016-12-06 2017-03-15 中国兽医药品监察所 山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗及其生产方法
CN106511989A (zh) * 2016-12-15 2017-03-22 陕西玉航电子有限公司 一种山羊传染性胸膜肺炎自家苗的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115044513A (zh) 2022-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113337478B (zh) 一株猫细小病毒毒株及其应用
CN112779193B (zh) 一株滑液囊支原体强毒株及其应用
CN111789941B (zh) 一种山羊支原体肺炎、鹦鹉热衣原体病的二联灭活疫苗及其制备方法
CN115044513B (zh) 一株丝状支原体山羊亚种sxtg01及其应用、丝状支原体山羊亚种疫苗及其制备方法
CN114774372B (zh) 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用
CN112870341B (zh) 一种山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN111440815B (zh) 一种新型鸭呼肠孤病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法
CN110540579A (zh) 一种副鸡禽杆菌抗原蛋白、含有副鸡禽杆菌抗原的疫苗组合物、及其制备方法和应用
CN111057682B (zh) 一株禽源h9n2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用
CN112063596A (zh) 鸽副黏病毒1型ppmv-1/bj-c株及其应用
CN113957007B (zh) 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN115850404A (zh) 一种串联优势表位的重组猪丹毒杆菌表面保护抗原a及其应用
CN109735477B (zh) 单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用
CN109867713B (zh) 一种犬瘟热基因工程亚单位疫苗
CN108048364B (zh) 一种金黄色葡萄球菌及含该菌的海洋哺乳动物疫苗
CN111789942A (zh) 一种绵羊支原体肺炎、鹦鹉热衣原体病的二联灭活疫苗及其制备方法
CN112920976B (zh) 一株绵羊肺炎支原体强毒株及其应用
CN111944838B (zh) 革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗
CN116875563B (zh) 一株禽腺病毒、菌株、Fiber-2蛋白、疫苗、亚单位疫苗、用途
CN113476596B (zh) 杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌二联疫苗及其应用
CN108251341B (zh) 一种铜绿假单胞菌以及含该菌的海洋哺乳动物疫苗
CN108276499B (zh) 融合牛抗菌肽fbap重组酵母菌制剂的制备及应用
CN113289010A (zh) 一种鸡球虫三价重组酵母亚单位疫苗及制备方法
CN105861349B (zh) 一种生产b型禽偏肺病毒f蛋白的重组菌株
Farid et al. Molecular Confirmation and Immunological Cross Reactivity among Mycoplasma gallisepticum Isolates Recovered from Broiler Chicken in Khyber Pakhtunkhwa, Pakistan

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant