CN115155541A - 一种两段式可控制备双配基层析介质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种两段式可控制备双配基层析介质的方法，属于层析分离技术领域。所述两段式可控制备双配基层析介质的方法步骤包括：先将层析基质活化，再溴化，然后偶联第一种疏水性电荷诱导配基，制得单配基层析介质；所述单配基层析介质偶联第二种疏水性电荷诱导配基，制得双配基层析介质。本发明选用两种疏水性电荷诱导层析配基作为对象，进行配基组合，该类型配基包含离子交换、疏水作用、氢键等多种结合方式，拥有独特的吸附选择性、高容量、耐盐性和相对较低的成本，形成的双配基介质将具有天然的竞争优势。

Description

一种两段式可控制备双配基层析介质的方法
技术领域
本发明涉及层析分离技术领域，特别涉及一种两段式可控制备双配基层析介质的方法。
背景技术
根据配基作用模式，层析可以分成许多种类，包括传统的离子交换，疏水作用，亲和作用以及新型的混合模式等。因而，配基的种类与作用方式极大地影响了层析的性能。对于配基的开发与优化一直是新型层析开发的重要方向。目前新配基的发现速率已渐渐放缓，而配基运用方式上的优化研究则取得了不错的成果。比如通过接枝，使配基呈现立体分布，可以有效提升层析吸附能力，但是接枝法存在接枝链缠结的风险，同时其中的蛋白质吸附和转移行为的机制也还未清晰。利用现有配基体系，构建配基组合是另一种方式。可将此类多种配基制备的层析称为多配基层析。多配基模式相对于单配基模式，除了可以在配基种类，配基密度方面进行优化，还可以在组合方式，配基比例等方面进行优化，因而拥有更多的选择性，可以有效地发掘现有配基潜力，获得性能更优的新型介质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种两段式可控制备双配基层析介质的方法，从而形成一种简单有效的多配基介质制备方法。选用两种疏水性电荷诱导层析配基作为对象，进行配基组合，大量研究表明该类型配基包含离子交换、疏水作用、氢键等多种结合方式，拥有独特的吸附选择性、高容量、耐盐性和相对较低的成本，形成的双配基介质将具有天然的竞争优势。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明技术方案之一：提供一种两段式可控制备双配基层析介质的方法，包括以下步骤：
先将层析基质活化，再溴化，然后偶联第一种疏水性电荷诱导配基，制得单配基层析介质；所述单配基层析介质偶联第二种疏水性电荷诱导配基，制得双配基层析介质。
优选地，所述层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球；所述带有羟基的亲水性多孔微球的平均粒径为65μm。
优选地，所述带有羟基的亲水性多孔微球为4％交联琼脂糖微球。
优选地，所述活化为利用溴丙烯进行活化反应；所述溴化为利用N-溴代琥珀酰亚胺进行溴化反应。
优选地，所述活化反应的具体步骤为：取4％交联琼脂糖微球，加入溴丙烯、NaOH和体积分数为20％二甲基亚砜，30℃、150rpm振荡12h，其中4％交联琼脂糖微球、溴丙烯、NaOH和20％二甲基亚砜的质量与体积比为1g:0.7mL:0.4g:1mL；
所述溴化反应的具体步骤为：取活化后的4％交联琼脂糖微球，加入N-溴代琥珀酰亚胺、水和丙酮，30℃、150rpm振荡2h；其中4％交联琼脂糖微球、N-溴代琥珀酰亚胺、水和丙酮的质量与体积比为1g:0.16g:1mL:1mL。
优选地，所述疏水性电荷诱导配基为含有氨基的疏水性电荷诱导配基；例如色胺和色氨酸。
优选地，偶联色胺的条件为30℃、150rpm振荡24h；偶联色氨酸的条件为pH9～11，25℃、150rpm振荡12h。
优选的，偶联色胺和偶联色氨酸均在碳酸盐缓冲液中进行。
优选地，在偶联第二种疏水性电荷诱导配基前，还包括清洗步骤，具体为清洗所述单配基层析介质中未反应的第一种疏水性电荷诱导配基并使所述单配基层析介质处于溴化状态。
优选地，清洗液为碳酸盐缓冲液。
更优选地，所述碳酸盐缓冲液的浓度为1mol/L。
本发明技术方案之二：提供一种根据上述两段式可控制备双配基层析介质的方法制得的双配基层析介质。
本发明的有益技术效果如下：
本发明提供的一种两段式可控制备双配基层析介质的方法是一种简单有效的双配基介质制备方法，并可调整配基加入量进行配基比例控制，通过滴定法测定配基比例，从而发掘现有配基潜力，获得性能更优的新型介质。
附图说明
图1为本发明实施例1两段式可控制备双配基层析介质的方法流程示意图。
图2为本发明实施例1制备的双配基层析介质的红外图谱。
图3为本发明实施例1-5制备的双配基层析介质静态吸附牛血清白蛋白的Langmuir方程拟合图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中所用20％二甲基亚砜中的百分数指体积分数。
本发明实施例中所用4FF指琼脂糖交联度为4％的微球，其平均粒径为65μm。
本发明实施例中所用1mol/L碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液由1mol/L的碳酸钠溶液和1mol/L的碳酸氢钠溶液混合后调整pH至10配制得到。本发明所用碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液可选pH值范围为9～11，当pH值为10时，效果最佳。
图1为本发明实施例1两段式可控制备双配基层析介质的方法流程示意图。
实施例1
(1)取适量4％交联琼脂糖微球(4FF)于砂芯漏斗中水洗三次，抽干。精确称取1.0g，置于25mL锥形瓶中，加入0.7mL的溴丙烯(Allyl bromide，AB)、0.4g NaOH、1mL 20％二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，30℃、150rpm的恒温水浴摇床中，进行12小时的活化反应。
(2)去离子水冲洗活化4FF，抽干。加入0.16g N-溴代琥珀酰亚胺(N-bromosuccinimide，NBS)、1mL去离子水和1mL丙酮，30℃、150rpm水浴恒温振荡2h，进行溴化反应。
(3)水洗溴化介质，抽干。加入1mL 1mol/L碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及3mg色胺，以30℃、150rpm水浴恒温振荡24h，进行偶联反应。获得单配基介质。
(4)以1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液充分清洗阶段I制备的单配基介质，抽干。加入10mg色氨酸配基，于1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中与介质进行偶联反应，pH为10，温度25℃，120rpm摇床，12小时。
(5)依次使用0.1M的盐酸溶液，0.1M的氢氧化钠溶液和去离子水清洗介质，洗脱未反应配基，获得双配基层析介质。通过滴定法测得色胺/色氨酸密度比为18-17。
本发明实施例1制备的双配基层析介质的红外图谱见图2。
从图2中可以看出，4FF耦合色胺后(4FF-Tryptamine)在740cm-1处出现邻二取代苯的特征峰，表明色胺成功固定在基质4FF上；耦合色胺和色氨酸后(4FF-Tryptamine+Tryptophan)在1730cm-1的羰基特征峰表明色氨酸也成功偶联于色胺介质上，形成双配基介质。
实施例2
(1)取适量4％交联琼脂糖微球(4FF)于砂芯漏斗中水洗三次，抽干。精确称取1.0g，置于25mL锥形瓶中，加入0.7mL的溴丙烯(Allyl bromide，AB)、0.4g NaOH、1mL 20％二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，30℃、150rpm的恒温水浴摇床中，进行12小时的活化反应。
(2)去离子水冲洗活化4FF，抽干。加入0.16g N-溴代琥珀酰亚胺(N-bromosuccinimide，NBS)、1mL去离子水和1mL丙酮，30℃、150rpm水浴恒温振荡2h，进行溴化反应。
(3)水洗溴化介质，抽干。加入1mL 1mol/L碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及4mg色胺，以30℃、150rpm水浴恒温振荡24h，进行偶联反应。获得单配基介质。
(4)以1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液充分清洗阶段I制备的单配基介质，抽干。加入14mg色氨酸配基，于1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中与介质进行偶联反应，pH为10，温度25℃，120rpm摇床，12小时。
(5)依次使用0.1M的盐酸溶液，0.1M的氢氧化钠溶液和去离子水清洗介质，洗脱未反应配基，获得双配基层析介质。通过滴定法测得色胺/色氨酸密度比为21-22。
实施例3
(1)取适量4％交联琼脂糖微球(4FF)于砂芯漏斗中水洗三次，抽干。精确称取1.0g，置于25mL锥形瓶中，加入0.7mL的溴丙烯(Allyl bromide，AB)、0.4g NaOH、1mL 20％二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，30℃、150rpm的恒温水浴摇床中，进行12小时的活化反应。
(2)去离子水冲洗活化4FF，抽干。加入0.16g N-溴代琥珀酰亚胺(N-bromosuccinimide，NBS)、1mL去离子水和1mL丙酮，30℃、150rpm水浴恒温振荡2h，进行溴化反应。
(3)水洗溴化介质，抽干。加入1mL 1mol/L碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及6mg色胺，以30℃、150rpm水浴恒温振荡24h，进行偶联反应。获得单配基介质。
(4)以1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液充分清洗阶段I制备的单配基介质，抽干。加入20mg色氨酸配基，于1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中与介质进行偶联反应，pH为10，温度25℃，120rpm摇床，12小时。
(5)依次使用0.1M的盐酸溶液，0.1M的氢氧化钠溶液和去离子水清洗介质，洗脱未反应配基，获得双配基层析介质。通过滴定法测得色胺/色氨酸密度比为27-28。
实施例4
(1)取适量4％交联琼脂糖微球(4FF)于砂芯漏斗中水洗三次，抽干。精确称取1.0g，置于25mL锥形瓶中，加入0.7mL的溴丙烯(Allyl bromide，AB)、0.4g NaOH、1mL 20％二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，30℃、150rpm的恒温水浴摇床中，进行12小时的活化反应。
(2)去离子水冲洗活化4FF，抽干。加入0.16g N-溴代琥珀酰亚胺(N-bromosuccinimide，NBS)、1mL去离子水和1mL丙酮，30℃、150rpm水浴恒温振荡2h，进行溴化反应。
(3)水洗溴化介质，抽干。加入1mL 1mol/L碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及13mg色胺，以30℃、150rpm水浴恒温振荡24h，进行偶联反应。获得单配基介质。
(4)以1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液充分清洗阶段I制备的单配基介质，抽干。加入40mg色氨酸配基，于1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中与介质进行偶联反应，pH为10，温度25℃，120rpm摇床，12小时。
(5)依次使用0.1M的盐酸溶液，0.1M的氢氧化钠溶液和去离子水清洗介质，洗脱未反应配基，获得双配基层析介质。通过滴定法测得色胺/色氨酸密度比为30-32。
实施例5
(1)取适量4％交联琼脂糖微球(4FF)于砂芯漏斗中水洗三次，抽干。精确称取1.0g，置于25mL锥形瓶中，加入0.7mL的溴丙烯(Allyl bromide，AB)、0.4g NaOH、1mL 20％二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，30℃、150rpm的恒温水浴摇床中，进行12小时的活化反应。
(2)去离子水冲洗活化4FF，抽干。加入0.16g N-溴代琥珀酰亚胺(N-bromosuccinimide，NBS)、1mL去离子水和1mL丙酮，30℃、150rpm水浴恒温振荡2h，进行溴化反应。
(3)水洗溴化介质，抽干。加入1mL 1mol/L碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液及15mg色胺，以30℃、150rpm水浴恒温振荡24h，进行偶联反应。获得单配基介质。
(4)以1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液充分清洗阶段I制备的单配基介质，抽干。加入55mg色氨酸配基，于1M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中与介质进行偶联反应，pH为10，温度25℃，120rpm摇床，12小时。
(5)依次使用0.1M的盐酸溶液，0.1M的氢氧化钠溶液和去离子水清洗介质，洗脱未反应配基，获得双配基层析介质。通过滴定法测得色胺/色氨酸密度比为40-40。
本发明实施例1-5制备的双配基层析介质静态吸附牛血清白蛋白的Langmuir方程拟合图见图3。
从图3中可以看出，通过二段式制备法可以精确控制两种配基的密度，形成吸附性能不同的双配基介质。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
先将层析基质活化，再溴化，然后偶联第一种疏水性电荷诱导配基，制得单配基层析介质；所述单配基层析介质偶联第二种疏水性电荷诱导配基，制得双配基层析介质。
2.根据权利要求1所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，所述层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球。
3.根据权利要求2所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，所述带有羟基的亲水性多孔微球为4％交联琼脂糖微球。
4.根据权利要求3所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，所述活化为利用溴丙烯进行活化反应；所述溴化为利用N-溴代琥珀酰亚胺进行溴化反应。
5.根据权利要求4所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，所述活化反应的具体步骤为：取4％交联琼脂糖微球，加入溴丙烯、NaOH和体积分数为20％二甲基亚砜，30℃、150rpm振荡12h，其中4％交联琼脂糖微球、溴丙烯、NaOH和20％二甲基亚砜的质量与体积比为1g:0.7mL:0.4g:1mL；
所述溴化反应的具体步骤为：取活化后的4％交联琼脂糖微球，加入N-溴代琥珀酰亚胺、水和丙酮，30℃、150rpm振荡2h；其中4％交联琼脂糖微球、N-溴代琥珀酰亚胺、水和丙酮的质量与体积比为1g:0.16g:1mL:1mL。
6.根据权利要求1所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，所述疏水性电荷诱导配基为含有氨基的疏水性电荷诱导配基。
7.根据权利要求6所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，偶联色胺的条件为30℃、150rpm振荡24h；偶联色氨酸的条件为pH9～11，25℃、150rpm振荡12h。
8.根据权利要求7所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，在偶联第二种疏水性电荷诱导配基前，还包括清洗步骤，具体为清洗所述单配基层析介质中未反应的第一种疏水性电荷诱导配基并使所述单配基层析介质处于溴化状态。
9.根据权利要求8所述的两段式可控制备双配基层析介质的方法，其特征在于，清洗液为碳酸盐缓冲液。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述两段式可控制备双配基层析介质的方法制得的双配基层析介质。
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