CN107326021A - 一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法，目的在于提供一种简单、经济、高效的制备固定化脂肪酶催化剂的方法，所采取的技术及方法为：以纤维素为原料，以固体碳酸钙颗粒为致孔剂，采用热熔胶转化法，结合反相悬浮技术，制备多孔再生纤维素微球，然后进行环氧化、氨基化接枝改性，以微孔为反应器进行共沉淀反应制备磁性纤维素微球，使用共价结合法将脂肪酶分子固定到磁性纤维素微球的表面和微孔中。该方法原料丰富易得，制备出的磁性纤维素载体尺寸较小、分布均匀、比表面积大，相比传统方法固酶量高、分散性好、固载牢固、且催化剂便于回收利用，能广泛应用于医药、环境、能源等领域。

Description

一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种以磁性纤维素微球为载体的固定化脂肪酶催化剂及其制备方法，属于固定化酶生物催化剂制备工艺技术领域。
背景技术
脂肪酶，又称三酰基甘油水解酶，是一种可以催化酯类水解产生脂肪酸和甘油的酶。脂肪酶是一种典型的可逆酶，不仅能在水相中催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成反应，而且这两种反应能以一种连续的方式组合在一起进而引发一系列反应，如交换反应、酸解反应、醇解反应和氨解反应等。在常温常压的温和条件下能高效地催化反应，且具有专一性，在医药、环境、能源等领域有着越来越广泛的应用。但是，脂肪酶易受环境的影响而失活、稳定性差、难以回收和分离提纯，这些缺点限制了脂肪酶在工业生产中的大规模应用。固定化酶技术的出现，不但可以提高酶的稳定性，实现酶的回收重复使用以及连续化操作，同时降低了成本，并且在环境保护、生产自动化等方面具有显著优势，为脂肪酶的应用开拓了更广阔的前景。
一直以来，固定化酶技术的研究热点集中在固定化方法及固定化载体两个方面。目前，酶的固定化方法主要有包埋法、吸附法、共价连结法、交联法及定向固定化法。其中，共价结合法固定化酶是利用酶分子表面的氨基酸残基与载体上的功能基团发生化学反应形成共价键。该方法中，一般要使用不同的多功能试剂对载体表面进行改性，然后将酶连接到载体上。其优点是酶和载体之间结合牢固，不易脱落，用于催化反应时不会对产物造成蛋白质污染。而且，由于酶和载体之间多个共价键的存在，减弱了酶分子链的柔性而增强了其热稳定性，从而阻止了酶蛋白的变性。
对于多数固定化方法而言，载体是必不可少的，而且载体对于固定化酶的性质影响非常大。对于酶而言，它的极性基团(如赖氨酸上的羟基、谷氨酸上的羧基)及非极性表面区域大小对于表面性质的影响较大。而载体的选择则应至少与酶的这些表面性质中的某一项相匹配。在众多的载体材料中，磁性纤维素复合材料受到了世界范围内研究者的广泛关注，由于它在生物医药领域具有广泛的应用性，例如把向释药、磁共振成像、生物大分子的固定化及分离、生物探针及生物传感器等。该类材料一方面具有磁性粒子的磁响应性，易于分离回收；另一方面，可以通过共聚或改性来调控载体的化学性能，可使其表面带上不同功能基。因此，这是一种具有广泛应用前景的固定化酶载体。
本发明是一种简单、高效制备固定化酶催化剂的方法，本发明制备出的磁性纤维素微球固定化酶催化剂酶负载量高、活性好，实现了脂肪酶的快速回收、重复利用的目。
发明内容
本发明以纤维素为原材料，以固体碳酸钙为致孔剂，采用热熔胶转化法，结合反相悬浮技术，制备多孔再生纤维素微球，对其进行官能团活化，以微孔为反应器进行共沉淀反应制备磁性纤维素微球，运用共价结合法在磁性纤维素微球表面、微孔中固定脂肪酶分子，制备出磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂。
本发明目的是通过以下方案实现的：
热熔胶转化法制备再生纤维素微球：脱脂棉、棉麻纤维、微晶纤维素、玻璃纤维等纤维素材料中的一种或几种，经碱化破除氢键，再进行老化降低分子聚合度，然后磺化成可溶性的纤维素粘胶液，再加入制孔剂碳酸钙搅拌均匀；将纤维素胶粘液加入分散相中，利用反相悬浮技术分散成液滴，同时升温固化成球形，并利用碳酸钙和盐酸发生的复分解反应对纤维素微球制孔。
化学改性：用环氧氯丙烷对制孔后的纤维素微球改性，使纤维素分子结构中引入环氧基团，再用乙二胺、己二胺、癸二胺等二胺中的一种或几种接枝引入氨基，得到氨基改性的纤维素微球。
共沉淀制备磁性纤维素微球：将改性后的纤维素微球加入到Fe3+和Fe2+的混合液中，在强碱性条件下进行热共沉淀反应，制得磁性纤维素微球。
共价结合法固定化酶：以戊二醛为交联剂，对纤维素微球载体上的氨基进行活化，将活化后的磁性纤维素载体与酶液混合，使载体上的氨基与脂肪酶分子表面的氨基酸残基发生化学反应形成共价键，制得磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂。
本发明的技术效果
1.本发明以多孔磁性纤维素微球为基质，对其进行氨基化改性，利用脂肪酶分子表面的氨基酸残基与载体上的功能基团发生化学反应形成共价键，使脂肪酶均匀固定于磁性纤维素小球的表面和空隙中，固载率高，固载稳定，高磁响应的基质使催化剂易于分离，有利于脂肪酶回收重复利用。
2.本发明催化剂的磁性纤维素基质能降低有机试剂对脂肪酶酶活的不利影响，稳定酶活，使得本发明制备的催化剂不仅具有高催化效率、高选择性，且催化条件温和、无毒无害。
3.本发明催化剂基质的材料主要为纤维素，原料易得、价格低廉，充分降低了生产成本。
附图说明
图1为本发明制备出的磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的扫描电镜图：A.放大300倍；B.放大1000倍；C.放大3000倍；D.放大5000倍。从图中可以看出，制备出的磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂具有规律的形状，其表面和内部布满了微孔，充分增大了催化剂的比表面积。
图2为本发明制备出的磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂磁性分离效果图。从中可以看出，制备出的磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂具有很好的磁性，在磁性的环境下易于被分离。
具体实施方式
实施例1
热熔胶转化法制备再生纤维素微球：用一定量的碱液浸泡脱脂棉中浸泡2～5h，然后抽干溶液，放置老化40～50h，加入适量CS2于25～40℃下磺化6～10h，加适量碱液和CaCO3搅拌均匀，倒入400～600mL含有0.05～0.1g油酸钾、0.2～0.4g司班60的变压器油中，室温搅拌0.5～2h，然后缓慢升温至70～90℃，固化1.5～3.5h，将油倒出，大量热水洗固体至无油，得到纤维素微球；纤维素微球加入到适量稀盐酸溶液中，摇晃至无气泡，将液体倒出，加入新的稀盐酸，反复多次，至液体显酸性，制得多孔纤维素微球。
实施例2
化学改性：将多孔纤维素微球加入到环氧氯丙烷中，加适量碱液进行反应，制得环氧化纤维素微球；适量环氧化后的纤维素球加入到8～12mL二胺类改性试剂中，40～60℃反应8～12h，得到氨基改性的纤维素微球。
实施例3
共沉淀制备磁性纤维素微球：将氨基改性的纤维素微球加入到100～200mL Fe3+和Fe2+混合液中，0～25℃下真空抽滤1h，加入氨水调节液体pH＝9～11，50～60℃共沉淀反应1～3h，制得磁性纤维素微球基体。
实施例4
共价结合法固定化酶：将磁性纤维素基质加入到80mL含有3～10％戊二醛溶液的磷酸缓冲溶液中，搅拌1.5～2h，加入稀释后的酶液，放入25～35℃摇床固酶5～8h，制得磁性纤维素微球为载体的固定化脂肪酶催化剂。

Claims (6)

1.本发明涉及一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)热熔胶转化法制备再生纤维素微球：脱脂棉、棉麻纤维、微晶纤维素、玻璃纤维等纤维素材料中的一种或几种，经碱化破除氢键，再进行老化降低分子聚合度，然后磺化成可溶性的纤维素粘胶液，再加入制孔剂碳酸钙搅拌均匀；将纤维素胶粘液加入分散相中，利用反相悬浮技术分散成液滴，同时升温固化成球形，并利用碳酸钙和盐酸发生的复分解反应对纤维素微球制孔；
(2)化学改性：用环氧氯丙烷对制孔后的纤维素微球改性，使纤维素分子结构中引入环氧基团，再用乙二胺、己二胺、癸二胺等二胺中的一种或几种接枝引入氨基；
(3)共沉淀制备磁性纤维素微球：将改性后的纤维素微球加入到Fe3+和Fe2+的混合液中，在强碱性条件下进行热共沉淀制得磁性纤维素微球；
(4)共价结合法固定化酶：以戊二醛为交联剂，对纤维素微球载体上的氨基进行活化，将活化后的磁性纤维素载体与酶液混合，使载体上的氨基与脂肪酶分子表面的氨基酸残基发生化学反应形成共价键，制得磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂。
2.按照权利要求1所述的一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的热熔胶转化法，其磺化温度为25～40℃，磺化时间6～10h。
3.按照权利要求1所述的一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的反相悬浮技术，其分散相为变压器油400～600mL，分散剂为0.2～0.4g司班60和油酸钾0.05～0.1g，固化温度70～90℃，固化时间1.5～3.5h。
4.按照权利要求1所述的一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的化学改性活化载体，环氧氯丙烷的用量为0.5～2mL/g，乙二胺的用量为1～3mL/g。
5.按照权利要求1所述的一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的共沉淀，其所用Fe3+和Fe2+摩尔量比为2:1，共沉淀温度为50～60℃，加碱液调pH＝9～11。
6.按照权利要求1所述的一种磁性纤维素微球固定化脂肪酶催化剂的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的共价结合法固定化酶，戊二醛的用量为3～10％，酶液浓度为10～20％，pH值为6.5～8.0，固定化时间5～8h。
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