CN115058052B - 一种多孔型壳聚糖微球及在固定碱性蛋白酶中的应用 - Google Patents

一种多孔型壳聚糖微球及在固定碱性蛋白酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多孔型壳聚糖微球及在固定碱性蛋白酶中的应用，由如下步骤制成：（1）制备壳聚糖‑二氧化硅复合凝胶；（2）利用碱性成型剂处理步骤（1）所得壳聚糖‑二氧化硅复合凝胶，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球。本发明在众多酸性试剂中筛选了质量分数为1.5%‑5%的乙酸水溶液，并经过大量实验，限定了最佳的pH值和物质添加比例，使得制备的多孔型壳聚糖微球能够提供更多和更稳定的结合位点，从而大幅度提升碱性蛋白酶的稳定性和负载率。

Description

一种多孔型壳聚糖微球及在固定碱性蛋白酶中的应用
技术领域
本发明涉及酶的固定化技术，具体地说，涉及多孔型壳聚糖材料的制备和碱性蛋白酶的固定化技术。
背景技术
蛋白酶是一种温和的高效催化剂，而碱性蛋白酶是蛋白酶家族中最重要的一类蛋白酶，它能够在极端的碱性环境下发挥作用，被广泛应用于食品、纺织、医药、洗涤等行业。碱性蛋白酶在工业生产中的应用环境较为苛刻，与合成碱性蛋白酶的天然生物细胞环境有着较大的差异，其在体外环境的性能发挥受到不同程度的抑制。如何有效地在体外或是在特定蛋白酶所处的应用环境中稳定蛋白酶的性能是该领域亟待解决的难题之一。
酶的固定化是一种有效的稳定酶的策略，它不仅能够使酶的稳定性得到提高，还能将酶循环利用。可溶性的酶通常可以通过与不溶性载体的表面发生如吸附、交联等相互作用来实现酶的固定化。酶的固定化效果与载体材料的性能直接相关。壳聚糖具有廉价易得、易改性、天然无毒等优良性能，且壳聚糖表面还有着丰富的活泼基团如-NH2、-OH等，利于酶的固定和进一步改性，目前已成功用于多种酶的固定化。钟方旭等直接采用商业壳聚糖固载碱性蛋白酶，获得了一定固定化效果（食品科技，2008，3，49）。梁玉杰等制备了Fe3O4磁性壳聚糖微球，并将其用于蛋白酶的固定化和回收利用(食品与发酵工业，2014，40(8)，66)。然而，目前所采用的壳聚糖微球普遍存在酶的固定效率不高的问题，限制了其推广应用。
发明内容
本发明的目的在于克服目前壳聚糖微球普遍存在酶的固定效率不高的问题，提供一种负载率高、稳定性好的用于碱性蛋白酶固定的多孔型壳聚糖微球及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种多孔型壳聚糖微球，由如下步骤制成：
（1）制备壳聚糖-二氧化硅复合凝胶；（2）利用碱性成型剂处理步骤（1）所得壳聚糖-二氧化硅复合凝胶，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球。
作为优选的，在上述的多孔型壳聚糖微球中，步骤（1）所述壳聚糖-二氧化硅复合凝胶的制备方法为：先将壳聚糖粉末溶于质量分数为1.5%-5%的乙酸水溶液中制备壳聚糖凝胶，再向其加入与壳聚糖质量比为1:1~1:5的纳米二氧化硅粉末，搅拌制得壳聚糖-二氧化硅凝胶。
作为优选的，在上述的多孔型壳聚糖微球中，步骤（2）所述碱性成型剂由强碱溶液与乙醇溶液混合而成，强碱溶液的浓度为0.5 - 5 M，强碱溶液与无水乙醇的体积比为5:1- 2:1，所述强碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾。
一种碱性蛋白酶的固定方法，包括以下步骤：
(1) 将上述的多孔型壳聚糖微球作为载体加入到磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后加入碱性蛋白酶溶液振荡混合；
(2) 向步骤（1）中加入交联剂，使碱性蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，用磷酸盐缓冲液洗涤后，得到以多孔型壳聚糖微球为载体的固定化酶。
作为优选的，在上述的碱性蛋白酶的固定方法中，所述多孔型壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为100:1~20:1，所述交联剂在混合溶液中的体积比浓度为1% - 5%。
作为优选的，在上述的碱性蛋白酶的固定方法中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0 -9.5。
作为优选的，在上述的碱性蛋白酶的固定方法中，所述交联剂为京尼平或戊二醛或EDC/NHS。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：壳聚糖可利用的物理形态具有多样化，通常需要制备得到壳聚糖凝胶以实现利用形式的转变。壳聚糖只有在合适的酸性环境中才能溶解，而酸性过强的试剂会对壳聚糖的分子结构与官能团造成破坏，不同工艺条件制备的壳聚糖微球具有不同的酶固定效果。本发明在众多酸性试剂中筛选了质量分数为1.5%-5%的乙酸水溶液，并经过大量实验，限定了最佳的pH值和物质添加比例，使得制备的多孔型壳聚糖微球能够提供更多和更稳定的结合位点，从而大幅度提升碱性蛋白酶的稳定性和负载率。
附图说明
图1为固定酶与游离酶温度稳定性对比图。
具体实施方式
实施例1
（1）多孔型壳聚糖微球的制备
将壳聚糖粉末（脱乙酰度>95%）加入到2%的乙酸溶液中，搅拌制得壳聚糖的凝胶溶液。以二氧化硅与壳聚糖质量比为1:5的量向上述制得的凝胶中加入纳米二氧化硅，充分搅拌，制备得到壳聚糖-二氧化硅凝胶。将0.5 M的氢氧化钠溶液与无水乙醇以3:1的比例混合，制得成型剂。将所制得壳聚糖-二氧化硅凝胶复合物，缓慢加入到成型剂中，搅拌成型、静置硬化后用纯净水洗至中性，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球。
（2）碱性蛋白酶的固定
将壳聚糖微球加入到pH =7.5为磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后，以多孔型壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为20:1，加入碱性蛋白酶溶液，在1~10℃下振荡混合。向载体与蛋白酶的混合液中加入交联剂戊二醛溶液，使得戊二醛在混合液中的浓度为1%，使蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，交联一段时间后，使用pH =7.5为磷酸盐缓冲液充分洗涤，除去多余的交联剂，得到以多孔型壳聚糖微球为载体的固定化酶。
实施例2
（1）多孔型壳聚糖微球的制备
将壳聚糖粉末（脱乙酰度>95%）加入到3%的乙酸溶液中，搅拌制得壳聚糖凝胶溶液。以二氧化硅与壳聚糖质量比为1:4的量向上述制得的凝胶中加入纳米二氧化硅，充分搅拌，制备得到壳聚糖-二氧化硅凝胶。将1 M的氢氧化钾溶液与无水乙醇以4:1的比例混合，制得成型剂。将所制得壳聚糖-二氧化硅凝胶复合物，缓慢加入到成型剂中，搅拌成型、静置硬化后用纯净水洗至中性，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球。
（2）碱性蛋白酶的固定
将壳聚糖微球加入到pH =8.0为磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后，以多孔型壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为100:1，加入碱性蛋白酶溶液，在1~10℃下振荡混合。向载体与蛋白酶的混合液中加入交联剂戊二醛溶液，使得戊二醛在混合液中的浓度为2%，使蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，交联一段时间后，使用pH =8.0为磷酸盐缓冲液充分洗涤，除去多余的交联剂，得到以多孔型壳聚糖微球为载体的固定化酶。
实施例3
（1）多孔型壳聚糖微球的制备
将壳聚糖粉末（脱乙酰度>95%）加入到2.5%的乙酸溶液中，搅拌制得壳聚糖凝胶溶液。以二氧化硅与壳聚糖质量比为1:3的量向上述制得的凝胶中加入纳米二氧化硅，充分搅拌，制备得到壳聚糖-二氧化硅凝胶。将1.5 M的氢氧化钠溶液与无水乙醇以3:1的比例混合，制得成型剂。将所制得壳聚糖-二氧化硅凝胶复合物，缓慢加入到成型剂中，搅拌成型、静置硬化后用纯净水洗至中性，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球。
（2）碱性蛋白酶的固定
将壳聚糖微球加入到pH =7.0为磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后，以多孔型壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为50 : 1，加入碱性蛋白酶溶液，在1~10℃下振荡混合。向载体与蛋白酶的混合液中加入交联剂戊二醛溶液，使得戊二醛在混合液中的浓度为3.5%，使蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，交联一段时间后，使用pH =7.0为磷酸盐缓冲液充分洗涤，除去多余的交联剂，得到以多孔型壳聚糖微球为载体的固定化酶。
实施例4
（1）多孔型壳聚糖微球的制备
将壳聚糖粉末（脱乙酰度>95%）加入到1.5%的乙酸溶液中，搅拌制得壳聚糖凝胶溶液。以二氧化硅与壳聚糖质量比为1:2的量向上述制得的凝胶中加入纳米二氧化硅，充分搅拌，制备得到壳聚糖-二氧化硅凝胶。将2 M的氢氧化钾溶液与无水乙醇以4:1的比例混合，制得成型剂。将所制得壳聚糖-二氧化硅凝胶复合物，缓慢加入到成型剂中，搅拌成型、静置硬化后用纯净水洗至中性，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球。
（2）碱性蛋白酶的固定
将壳聚糖微球加入到pH =8.5为磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后，以多孔型壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为40 : 1，加入碱性蛋白酶溶液，在1~10℃下振荡混合。向载体与蛋白酶的混合液中加入交联剂戊二醛溶液，使得戊二醛在混合液中的浓度为1.5%，使蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，交联一段时间后，使用pH =8.5为磷酸盐缓冲液充分洗涤，除去多余的交联剂，得到以多孔型壳聚糖微球为载体的固定化酶。
对比例1
（1）传统壳聚糖微球的制备
将壳聚糖粉末（脱乙酰度>95%）加入到2%的乙酸溶液中，搅拌制得壳聚糖的凝胶溶液。将0.5 M的氢氧化钠溶液与无水乙醇以3:1的比例混合，制得成型剂。将壳聚糖凝胶缓慢加入到成型剂中，搅拌成型、静置硬化后用纯净水洗至中性，冷冻干燥后制得传统壳聚糖微球。
（2）碱性蛋白酶的固定
将壳聚糖微球加入到pH =7.5为磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后，以壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为20:1，加入碱性蛋白酶溶液，在1~10℃下振荡混合。向载体与蛋白酶的混合液中加入交联剂戊二醛溶液，使得戊二醛在混合液中的浓度为1%，使蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，交联一段时间后，使用pH =7.5为磷酸盐缓冲液充分洗涤，除去多余的交联剂，得到以传统壳聚糖微球为载体的固定化酶。
对比例2
（1）多孔型壳聚糖微球的制备
将壳聚糖粉末（脱乙酰度>95%）加入到3%的苹果酸溶液中，搅拌制得壳聚糖凝胶溶液。以二氧化硅与壳聚糖质量比为1:2的量向上述制得的凝胶中加入纳米二氧化硅，充分搅拌，制备得到壳聚糖-二氧化硅凝胶。将2 M的氢氧化钾溶液与无水乙醇以4:1的比例混合，制得成型剂。将所制得壳聚糖-二氧化硅凝胶复合物，缓慢加入到成型剂中，搅拌成型、静置硬化后用纯净水洗至中性，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球。
（2）碱性蛋白酶的固定
将壳聚糖微球加入到pH =8.5为磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后，以多孔型壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为40 : 1，加入碱性蛋白酶溶液，在1~10℃下振荡混合。向载体与蛋白酶的混合液中加入交联剂戊二醛溶液，使得戊二醛在混合液中的浓度为1.5%，使蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，交联一段时间后，使用pH =8.5为磷酸盐缓冲液充分洗涤，除去多余的交联剂，得到以多孔型壳聚糖微球为载体的固定化酶。
采用考马斯亮蓝法对碱性蛋白酶的固载量进行测试，首先配制考马斯亮蓝染液，后以牛血清蛋白为标准蛋白质配置梯度浓度标准液并根据蛋白质显色原理绘制浓度标准曲线。
接着对样品溶液中蛋白质浓度进行测定，取待测酶溶液1 mL或取适量待测酶样品溶液稀释到1 mL，加入5 mL的考马斯亮蓝染液，摇匀后静置5-10 min，在595 nm处测其吸光度，与标准曲线进行对照，求得酶的浓度。由此可测得固定前碱性蛋白酶溶液与固定化后上层清液中的蛋白质浓度，计算得到固定化酶负载量。实施例1-4与对比例1和2的测试结果如表1所示。
采用国标法对碱性蛋白酶的活力进行测试，即取1 mL的蛋白酶溶液或等量的固定化酶于40 ℃预热5 min，加入1 mL提前预热的pH 7.5 的1%酪蛋白溶液，混匀后于40 ℃下反应10 min，加入2 mL的10% TCA溶液终止反应，过滤或离心，取1 mL上清液依次加入5 mL0.4 M碳酸钠溶液与1 mL福林酚显色剂，40℃下显色20 min，使用分光光度计于680 nm处测试吸光度，以灭活的酶液为空白对照，平行测定三次。酶活单位定义为在一定条件下（本实验为25 ℃，pH 7.5），每分钟催化酪蛋白水解产生1μg酪氨酸所需的碱性蛋白酶量。实施例1-4与对比例1和2的测试结果如表1所示。
表1多孔型壳聚糖微球对碱性蛋白酶的负载率
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2
负载率（%） 65.24 68.94 62.34 60.25 42.73 51.75
酶活性（U/mg） 306.32 276.48 242.61 258.57 120.14 210.54

Claims (2)

1.一种碱性蛋白酶的固定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 将多孔型壳聚糖微球作为载体加入到磷酸盐缓冲液中浸润，充分润湿溶胀后加入碱性蛋白酶溶液振荡混合；
(2) 向步骤（1）中加入交联剂，使碱性蛋白酶负载于多孔型壳聚糖微球上，用磷酸盐缓冲液洗涤后，得到以多孔型壳聚糖微球为载体的固定化酶；
所述多孔型壳聚糖微球由如下步骤制成：
（1）制备壳聚糖-二氧化硅复合凝胶；（2）利用碱性成型剂处理步骤（1）所得壳聚糖-二氧化硅复合凝胶，冷冻干燥后制得多孔型壳聚糖微球；步骤（1）所述壳聚糖-二氧化硅复合凝胶的制备方法为：先将壳聚糖粉末溶于质量分数为1.5%-5%的乙酸水溶液中制备壳聚糖凝胶，再向其加入与壳聚糖质量比为1:1~1:5的纳米二氧化硅粉末，搅拌制得壳聚糖-二氧化硅凝胶；步骤（2）所述碱性成型剂由强碱溶液与乙醇溶液混合而成，强碱溶液的浓度为0.5 - 5 M，强碱溶液与无水乙醇的体积比为5:1 - 2:1，所述强碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾；
所述多孔型壳聚糖微球与碱性蛋白酶的质量比为100:1~20:1，所述交联剂在混合溶液中的体积比浓度为1% - 5%；
所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0 - 9.5。
2.如权利要求1所述的碱性蛋白酶的固定方法，其特征在于所述交联剂为京尼平或戊二醛或EDC/NHS。
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