CN109762805A - 一种固定化胰蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种固定化胰蛋白酶的方法，包括将固定材料加入醋酸水溶液中；加入20‑30二氧化硅球；将第二溶液滴入氢氧化钠、乙醇的水溶液中；氢氧化钠溶液加热促进小球A中的二氧化硅溶解；取出小球B清洗；小球C放入甘油溶液中浸泡；小球D，置于烤箱中烘干；取小球E加入戊二醛溶液修饰表面基团，洗涤；将小球F固定、冲洗得到固定化胰蛋白酶。该固定化胰蛋白酶的方法选用的壳聚糖表面有大量的氨基，可在戊二醛的修饰下与酶分子交联；二氧化硅与热碱在壳聚糖小球内部产生孔道，增大了载体的比表面积，提高了单位质量载体的载酶量；使用的壳聚糖，二氧化硅，戊二醛，氢氧化钠，醋酸均为化学大宗商品，价廉易得。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种固定化胰蛋白酶的方法。
背景技术
胰蛋白酶为蛋白酶的一种，EC 3.4.4.4，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，在脊椎动物中，作为消化酶而起作用，在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具；随着生物技术应用领域的不断扩大，作为催化剂的胰蛋白酶在工业上的应用越来越广泛，胰蛋白酶属于水溶性蛋白质，在溶解状态下与底物溶液形成的均相反应体系中表现出高的催化活性，但是该酶在溶液中稳定性差，容易发生自消化反应，且以溶液状态使用智能是一次性的，导致生产成本的增加，因而受到了一定限制，为了解决胰蛋白酶在工业上的应用难题，可以将其制备成固化酶使用，现有的固定化胰蛋白酶的技术主要有以下几类：1、吸附（利用物理吸附作用将酶分子吸附于载体表面）；2、包埋（胰蛋白酶分子被包埋在载体内部）3、交联（将胰蛋白酶分子通过共价键连接到载体表面），但是现有的技术的缺点也同样很明显：吸附-理吸附作用力弱，酶分子固定后容易脱落；包埋-胰蛋白酶的作用底物也是各类蛋白大分子，被包埋的胰蛋白酶难以与底物接触反应；交联-要求载体表面有可交联的基团，且有大的比表面积，所以现在发明一种既可以实现成本低廉同时又可以获得高酶载量、酶固定牢固的固定化胰蛋白酶方法来解决以上问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化胰蛋白酶的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种固定化胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：选择固定化胰蛋白酶的材料40-50份，醋酸水溶液50-100份，将固定材料加入醋酸水溶液中，调至到所需浓度，用高速搅拌机高速搅拌混匀至形成透明粘稠的均一体系溶液，得到第一溶液，静置20-30min除去气泡；
步骤二：在获得的第一溶液中加入20-30份粒径为10μm的二氧化硅球，调制浓度是5%，用搅拌棒慢慢搅拌至小球分散均匀，得到第二溶液，减少气泡的形成；
步骤三：将第二溶液通过内径1mm的管道逐滴滴入含12%氢氧化钠、20%乙醇的水溶液中，滴入的液滴在水溶液中会逐渐形成白色的小球，刚滴入时浮在液面处，后逐渐沉入底部，得到小球A；
步骤四：取50-100份的5%氢氧化钠溶液置于量杯中，并将氢氧化钠溶液加热至80℃，用仪器取出小球A置于量杯中，恒温反应2h-4h，促进小球A中的二氧化硅溶解，形成孔道，得到小球B；
步骤五：取出小球B将其放入清水中清洗至洗涤液为中性为止，得到小球C；
步骤六：取出小球C放入30%甘油溶液中充分浸泡1h-2h，得到小球D；
步骤七：取一个烤箱调节温度至40℃，取出小球D，置于烤箱中烘干10h-20h，得到小球E；
步骤八：称取1g的小球E，按每克小球E，每5ml的戊二醛溶液的量加入戊二醛溶液修饰表面基团，反应避光进行 2h-4h，避免戊二醛的自我交联，修饰结束后将小球取出，用清水洗涤5-10遍，去除多余的戊二醛，获得的小球称为小球F；
步骤九：将小球F加入胰蛋白酶液中，在4℃条件下固定2h-5h，固定完成后用pH=8.0的缓冲液冲洗3-5次，得到固定化胰蛋白酶。
优选的，所述步骤一中固定化胰蛋白酶的材料是壳聚糖，脱乙酰程度大于90%。
优选的，所述步骤一中将固定材料加入醋酸水溶液中，调节到所需的浓度为5%。
优选的，所述步骤六中30%甘油溶液的作用为使小球C 充分吸收甘油，在烘干的过程中不会发生塌缩的现象。
优选的，所述步骤八中戊二醛溶液的浓度为1%。
本发明提出的一种固定化胰蛋白酶的方法，有益效果在于：
1、本发明所选取的壳聚糖表面有大量的氨基，具有较强的吸附性，容易进行化学修饰，可在戊二醛的修饰下与酶分子交联，形成网状聚合物，从而降低氨基被质子化的几率，放置壳聚糖使用时的损耗及流失，提高了其应用特性；
2、本发明步骤四中二氧化硅与热碱在壳聚糖小球内部产生孔道，增大了载体的比表面积，提高了单位质量载体的载酶量；
3、本发明中使用的壳聚糖，二氧化硅，戊二醛，氢氧化钠，醋酸均为化学大宗商品，成本低廉同时容易获得。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施 例，而不是全部的实施例。
实施例一：一种固定化胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：选择固定化胰蛋白酶的材料40份，固定化胰蛋白酶的材料是壳聚糖，脱乙酰程度大于90%，醋酸水溶液50份，将固定材料加入醋酸水溶液中，调至到所需浓度为5%，用高速搅拌机高速搅拌混匀至形成透明粘稠的均一体系溶液，得到第一溶液，静置20min除去气泡；
步骤二：在获得的第一溶液中加入20份粒径为10μm的二氧化硅球，调制浓度是5%，用搅拌棒慢慢搅拌至小球分散均匀，得到第二溶液，减少气泡的形成；
步骤三：将第二溶液通过内径1mm的管道逐滴滴入含12%氢氧化钠、20%乙醇的水溶液中，滴入的液滴在水溶液中会逐渐形成白色的小球，刚滴入时浮在液面处，后逐渐沉入底部，得到小球A；
步骤四：取50份的5%氢氧化钠溶液置于量杯中，并将氢氧化钠溶液加热至80℃，用仪器取出小球A置于量杯中，恒温反应2h，促进小球A中的二氧化硅溶解，形成孔道，得到小球B；
步骤五：取出小球B将其放入清水中清洗至洗涤液为中性为止，得到小球C；
步骤六：取出小球C放入30%甘油溶液中充分浸泡1h，30%甘油溶液的作用为使小球C 充分吸收甘油，在烘干的过程中不会发生塌缩的现象，得到小球D；
步骤七：取一个烤箱调节温度至40℃，取出小球D，置于烤箱中烘干10h，得到小球E；
步骤八：称取1g的小球E，按每克小球E，每5ml的戊二醛溶液的量加入戊二醛溶液修饰表面基团，戊二醛溶液的浓度为1%，反应避光进行 2h，避免戊二醛的自我交联，修饰结束后将小球取出，用清水洗涤5遍，去除多余的戊二醛，获得的小球称为小球F；
步骤九：将小球F加入胰蛋白酶液中，在4℃条件下固定2h，固定完成后用pH=8.0的缓冲液冲洗3次，得到固定化胰蛋白酶。
实施例二：一种固定化胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：选择固定化胰蛋白酶的材料45份，固定化胰蛋白酶的材料是壳聚糖，脱乙酰程度大于90%，醋酸水溶液80份，将固定材料加入醋酸水溶液中，调至到所需浓度为5%，用高速搅拌机高速搅拌混匀至形成透明粘稠的均一体系溶液，得到第一溶液，静置30min除去气泡；
步骤二：在获得的第一溶液中加入28份粒径为10μm的二氧化硅球，调制浓度是5%，用搅拌棒慢慢搅拌至小球分散均匀，得到第二溶液，减少气泡的形成；
步骤三：将第二溶液通过内径1mm的管道逐滴滴入含12%氢氧化钠、20%乙醇的水溶液中，滴入的液滴在水溶液中会逐渐形成白色的小球，刚滴入时浮在液面处，后逐渐沉入底部，得到小球A；
步骤四：取75份的5%氢氧化钠溶液置于量杯中，并将氢氧化钠溶液加热至80℃，用仪器取出小球A置于量杯中，恒温反应3h，促进小球A中的二氧化硅溶解，形成孔道，得到小球B；
步骤五：取出小球B将其放入清水中清洗至洗涤液为中性为止，得到小球C；
步骤六：取出小球C放入30%甘油溶液中充分浸泡2h，30%甘油溶液的作用为使小球C 充分吸收甘油，在烘干的过程中不会发生塌缩的现象，得到小球D；
步骤七：取一个烤箱调节温度至40℃，取出小球D，置于烤箱中烘干15h，得到小球E；
步骤八：称取1g的小球E，按每克小球E，每5ml的戊二醛溶液的量加入戊二醛溶液修饰表面基团，戊二醛溶液的浓度为1%，反应避光进行4h，避免戊二醛的自我交联，修饰结束后将小球取出，用清水洗涤10遍，去除多余的戊二醛，获得的小球称为小球F；
步骤九：将小球F加入胰蛋白酶液中，在4℃条件下固定4h，固定完成后用pH=8.0的缓冲液冲洗5次，得到固定化胰蛋白酶。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种固定化胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
步骤一：选择固定化胰蛋白酶的材料40-50份，醋酸水溶液50-100份，将固定材料加入醋酸水溶液中，调至到所需浓度，用高速搅拌机高速搅拌混匀至形成透明粘稠的均一体系溶液，得到第一溶液，静置20-30min除去气泡；
步骤二：在获得的第一溶液中加入20-30份粒径为10μm的二氧化硅球，调制浓度是5%，用搅拌棒慢慢搅拌至小球分散均匀，得到第二溶液，减少气泡的形成；
步骤三：将第二溶液通过内径1mm的管道逐滴滴入含12%氢氧化钠、20%乙醇的水溶液中，滴入的液滴在水溶液中会逐渐形成白色的小球，刚滴入时浮在液面处，后逐渐沉入底部，得到小球A；
步骤四：取50-100份的5%氢氧化钠溶液置于量杯中，并将氢氧化钠溶液加热至80℃，用仪器取出小球A置于量杯中，恒温反应2h-4h，促进小球A中的二氧化硅溶解，形成孔道，得到小球B；
步骤五：取出小球B将其放入清水中清洗至洗涤液为中性为止，得到小球C；
步骤六：取出小球C放入30%甘油溶液中充分浸泡1h-2h，得到小球D；
步骤七：取一个烤箱调节温度至40℃，取出小球D，置于烤箱中烘干10h-20h，得到小球E；
步骤八：称取1g的小球E，按每克小球E，每5ml的戊二醛溶液的量加入戊二醛溶液修饰表面基团，反应避光进行 2h-4h，避免戊二醛的自我交联，修饰结束后将小球取出，用清水洗涤5-10遍，去除多余的戊二醛，获得的小球称为小球F；
步骤九：将小球F加入胰蛋白酶液中，在4℃条件下固定2h-5h，固定完成后用pH=8.0的缓冲液冲洗3-5次，得到固定化胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种固定化胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤一中固定化胰蛋白酶的材料是壳聚糖，脱乙酰程度大于90%。
3.根据权利要求1所述的一种固定化胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤一中将固定材料加入醋酸水溶液中，调节到所需的浓度为5%。
4.根据权利要求1所述的一种固定化胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤六中30%甘油溶液的作用为使小球C 充分吸收甘油，在烘干的过程中不会发生塌缩的现象。
5.根据权利要求1所述的一种固定化胰蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤八中戊二醛溶液的浓度为1%。
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