CN105969756A - 一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制备方法，包括以下两种方法中的任意一种：方法一：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔阴离子树脂为载体，在10～45℃，pH4.0～6.0条件下吸附并冷却后，以终浓度为0.1％～0.5％的戊二醛溶液为交联剂在2～25℃条件下交联后洗涤干燥得固定化酶；方法二：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸钠溶液中混匀制成混合溶液，将混合溶液滴入氯化钙溶液中，静置固定后，过滤并将滤饼洗涤干燥得固定化酶。本发明所述的技术方案制备的固定化酶酶回收利用率，操作稳定性和贮藏稳定性均显著提高，因而其制备的固定化酶在实际工业应用中具有较好的潜力。

Description

一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制备方法

技术领域

本发明属于酶固定化领域，具体涉及一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶及其制备方法。

背景技术

果聚糖水解酶是指能够催化果聚糖降解的一类酶。根据其水解底物方式和位点的不同大致可以分为两类：果聚糖外切水解酶(fructan exohydrolase)和果聚糖内切水解酶(endo-inulinlase)。研究认为，植物体中参与果聚糖降解的水解酶是果聚糖外切水解酶果聚糖外切水解酶是植物体中降解果聚糖的主要酶类，它主要是通过水解末端的果糖基生成1个果糖来实现降解的，最终形成产物是果糖和蔗糖，在转化酶催化作用下，蔗糖分子能够被进一步水解。目前为止，4种类型的FEH已经被发现并被报道：果聚糖6-外切水解酶，果聚糖1-外切水解酶，果聚糖6&1外切水解酶和6-蔗果三糖外切酶。它们的分类主要是通过糖苷键的不同来划分的。研究发现，果聚糖外切水解酶已经在菊芋黑麦草、燕麦、牛蒡、大蒜等植物中发现，并且其中一些植物的FEH基因已被克隆并得到了验证。

有关果聚糖水解酶的研究大概起始于九十年代，有关果聚糖水解酶的介绍国内外均有报道。1991年，Richard等从黑麦草叶片中提取出FEH，研究认为它具有水解果聚糖的能力，纯化后的FEH,E当蔗糖浓度为10mM时，其酶活会受到抑制。1993年，Richard等研究了草类植物中的果聚糖水解酶，研究认为，代谢浓度、蔗糖等体外抑制剂会对大麦草中的果聚糖水解酶的酶活具有影响。同时他还认为，外水解酶在低等植物体中是没有的，它只存在与高等植物体中。1999年，Joke De Roove从菊苣根中分离出果聚糖水解酶，通过纯化后，果聚糖水解酶分子量的大小为60kDa,最适温度35℃，最适pH范围在5.0-5.5之间。他认为，蔗糖、四乙酸二乙胺(EDTA)对果聚糖水解酶具有抑制作用。然而，Van等从小麦中分离纯化的6-FEH，蔗糖对其酶活并没有产生抑制作用。

近年来，我国也对果聚糖水解酶进行了研究。王静等通过对Aspergillus ficuum菊粉酶系进行了研究，通过分离纯化和鉴定获得了5个菊粉酶：3个外切菊粉酶(分别命名为Exo-Ⅰ、Exo-Ⅱ、Exo-Ⅲ)和2个内切菊粉酶(分别命名为Endo-Ⅰ、Endo-Ⅱ)，并对它们的酶学性质进行了研究。黄雪松等对大蒜果聚糖酶进行了研究，并对其酶学性质进行了分析，研究认为大蒜果聚糖酶属于外切酶。许欢欢等从菊芋中克隆得到了2个果聚糖外切水解酶基因，分别命名为Ht1-FEHⅠ和Ht1-FEHⅡ，然后转入酵母中进行异源表达，经诱导产生重组酶蛋白Ht1-FEHⅠ和Ht1-FEHⅡ。果聚糖外切水解酶(FEHt1-FEHⅡ)是从菊芋中克 隆分子量大小约为65.1kDa。它不仅在植物体中对果聚糖具有很强的水解能力，同时在植物的渗透调节过程中也有很重要的作用。

果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)在植物中主要负责果聚糖的降解，参与植物体内过果聚糖的动员和分配，果聚糖外切水解酶在菊苣、菊芋、小麦、大蒜等植物体中被发现并被报道，而关于果聚糖外切水解酶的应用目前还比较少。

果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)的酶学性质的分析发现，单纯的Ht1-FEHⅡ和大多数游离酶一样，稳定性差、易失活，不能够重复利用。因此研究果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)的固定化技术提高Ht1-FEHⅡ的酶学性能是被领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶。

本发明的另一种方法在于提供一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，它包括以下两种方法中的任意一种：

方法一：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔阴离子树脂为载体，在10～45℃，pH4.0～6.0条件下吸附并冷却后，以终浓度为0.1％～0.5％的戊二醛溶液为交联剂在2～25℃条件下交联后洗涤干燥得固定化酶；

方法二：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸钠溶液中混匀制成混合溶液，将混合溶液滴入氯化钙溶液中，静置固定后，过滤并将滤饼洗涤干燥得固定化酶。

上述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，优选为：

方法一的详细步骤为：称取预处理好的D201大孔阴离子树脂，加入pH4.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，在10～45℃条件下吸附并冷却后，加入终浓度为0.1％～0.5％的戊二醛溶液，2～25℃交联后洗涤并干燥得固定化酶；

方法二的详细步骤为：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到浓度为0.5％～3％的海藻酸钠溶液中混合均匀制成混合溶液，将混合溶液滴入浓度为1％～4％的氯化钙溶液中，静置固定0.5～2.5h后，过滤并将滤饼洗涤干燥得固定化酶。

上述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，进一步优选为：

方法一中所述吸附的温度为20～40℃，pH值为4.5～5.0，时间为0.5～6h；所述戊二醛溶液的终浓度为0.1％～0.25％，所述交联的温度为2～15℃，时间为0.5～8h；

方法二中所述海藻酸钠溶液的浓度为0.5％～2.5％，所述氯化钙溶液的浓度为1％～2％，所述静置固定的时间为0.5～2。

上述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，作为一种最优选技术方案：

所述的方法一为：称取预处理好的D201大孔阴离子树脂加入pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，40℃吸附3小时，迅速冷却后，加入戊二醛溶液，使其终浓度为0.125％,10℃交联2小时后，用蒸馏水洗涤干燥后放在4℃冰箱中备用；处理过程中，菊芋果聚糖外切水解酶酶液的添加量为每1g树脂中加入0.3～1ml部分纯化酶液；最佳为每1g树脂中加入0.5ml部分纯化酶液。

所述的方法二为：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到浓度为2％的海藻酸钠溶液中混合均匀制成混合溶液，将混合溶液滴入浓度为1.5％的氯化钙溶液中，静置固定2h后，过滤并将滤饼用蒸馏水洗涤干燥得固定化酶。

上述的方法所制备的固定化菊芋果聚糖外切水解酶。

本研究采用两种方法对菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)进行固定化：

一、以D201大孔阴离子树脂为载体，戊二醛溶液为交联剂，采用吸附交联法对菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)进行固定化：二、以海藻酸钠为载体，采用包埋法对Ht1-FEHⅡ进行固定化。确定了这两种方法制备固定化酶Ht1-FEHⅡ的最适制备条件，并对游离酶和固定化酶的酶学性质进行了分析。同时，通过对吸附交联法和包埋法制备的固定化酶进行了比较，确定了吸附交联法制备的固定化酶要比包埋法制备的固定化酶效果更为理想，在工业应用中更有使用价值。

主要研究结果如下：

1.采用D201大孔阴离子树脂为载体，戊二醛为交联剂对菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)进行固定化，对其固定化条件进行探索与优化，确定了固定化酶的最佳制备条件：称取已处理好的树脂0.2g，然后加入pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液和0.1ml的部分纯化酶液(3.40mg/ml)，放置在摇床上40℃吸附3小时，迅速冷却后，加入戊二醛溶液，使其终浓度为0.125％(v/v)，10℃交联2小时后，用蒸馏水洗涤后放在4℃冰箱中备用。通过此条件制备的固定化酶，酶活回收率能够达到73.53％。

按照固定化酶制备条件制备固定化酶，并对其进行了酶学性质分析：固定化酶的最适反应温度为40℃，比游离酶提高了5℃。最适pH为6.5，与游离酶相较，pH值向右移动了0.5个单位，固定化酶热稳定性与游离酶相比，并没有提高。

2.通过实验研究发现，采用海藻酸钠包埋法固定化重组酶Ht1-FEHⅡ的最适条件如下：海藻酸钠溶液为2％(质量体积比mg/ml，即每100ml溶液中含2mg的海藻酸钠)，氯 化钙溶液浓度为1.5％(质量体积比mg/ml)，加酶量为0.3ml，固定化时间为2小时时，其固定化效果最好。采用海藻酸钠法在最适固定化条件下制备的固定化酶的回收率为53.60％。

3.在海藻酸钠包埋法最适条件确定后制备固定化酶，并对游离酶和海藻酸钠包埋法制备的固定化酶进行了分析比较。研究发现，游离酶的最适反应温度为35℃，经固定化后，固定化酶的最适反应温度仍为35℃；游离酶的最适pH值为6.0，经固定化后，最适pH值为7.0，比游离酶向右偏移了1个单位。采用海藻酸钠包埋法制备的固定化酶与游离酶相比，固定化酶的热稳定并没有提高，这可能与菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)本身热稳定性不稳定有关。

4.通过对阴离子交换树脂吸附交联法和海藻酸钠包埋法制备的菊芋果聚糖外切水解酶(

Ht1-fEHⅡ)比较发现：采用吸附交联法制备的菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)。酶回收利用率，操作稳定性和贮藏稳定性均比包埋法制备的固定化酶要高，因而其制备的固定化酶在实际工业应用中具有较好的潜力。

本发明的有益效果：

本发明所述的技术方案制备的固定化酶酶回收利用率，操作稳定性和贮藏稳定性均显著提高，因而其制备的固定化酶在实际工业应用中具有较好的潜力。

附图说明

图1为吸附交联法制备固定化酶的条件选择与优化

其中，A为不同吸附温度条件下固定化酶的相对酶活；B为不同pH值条件下固定化酶的相对酶活；C为不同吸附时间固定化酶的相对酶活；D为不同戊二醛浓度下固定化酶的相对酶活；E为不同交联温度下固定化酶的相对酶活；F为不同交联时间固定化酶的相对酶活；G为不同加酶量条件下固定化酶的相对酶活和回收利用率

图2为吸附交联法制备的固定化酶的酶学性质分析

其中，A为不同pH条件下固定化酶和游离酶的相对酶活；B为不同温度对固定化酶酶活的影响；C为固定化酶和游离酶放在不同的温度条件的相对酶活；D为固定化酶的操作稳定性；E为固定化酶和游离酶的贮藏稳定性

图3为包埋法制备固定化酶的条件选择与优化

其中，A为不同浓度海藻酸钠溶液对固定化酶活性的影响；B为不同固定化时间对固定化酶活性的影响；C为不同氯化钙浓度对固定化酶活性的影响；D为不同加酶量条件下的固 定化酶的酶活和回收率

图4为包埋法制备的固定化酶的酶学性质分析

其中，A为不同温度条件下进行反应游离酶和固定化酶的相对酶活；B为不同的pH值条件下固定化酶和游离酶的相对酶活；C为不同温度条件下游离酶和固定化酶酶活；D为固定化酶的操作稳定性；E为固定化酶的和游离酶的贮藏稳定性

具体实施方式

实施例1菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)的吸附交联法固定化

1.1材料与方法

1.1.1实验材料

菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)是由菊芋中克隆得到基因Ht1-FEHⅡ，然后转化毕赤酵母进行异源表达，以甲醇为诱导剂诱导其产生而得到的重组蛋白。其分子量大小为90kDa，其制备方法采用现有技术中已经公开的技术方案(许欢欢.菊芋果聚糖外切水解酶1-外切水解酶基因(Ht1-FEHs)的克隆、鉴定及表达模式的研究[D]南京农业大学，2015)。

D201大孔阴离子交换树脂购于河北华众有限公司

1.1.2酶液制备与部分纯化

重组酵母诱导表达→粗酶液酶活测定→硫酸铵沉淀浓缩粗酶液→透析。具体操作步骤参考文献[许欢欢.菊芋果聚糖外切水解酶1-外切水解酶基因(Ht1-FEHs)的克隆、鉴定及表达模式的研究[D]南京农业大学，2015)]。

1.1.3树脂预处理

刚购买的新树脂中可能会含有一些杂质或者未完全反应的烃类、防腐剂等，这些物质不仅可能会有毒性，也有可能随溶液进入离子交换树脂孔径之中，进而影响离子交换树脂的功能。因此，新购买的树脂在使用之前必须进行预处理。具体操作方法如下：首先将树脂用大体积的蒸馏水洗涤多次并将破碎树脂挑出，用2％的氢氧化钠溶液(质量体积比mg/ml，即每100ml氢氧化钠溶液中含2mg氢氧化钠)浸泡24个小时，然后用蒸馏水洗涤至中性后用5％(v/v)的盐酸溶液浸泡24小时，再用蒸馏水洗涤至中性，放置冰箱中备用。

1.2酶活力测定

1.2.1固定化酶和游离酶酶活力测定

单位酶活：1ml酶液在35℃，pH5.5条件下，每分钟分解1-Kestose生成1μmol果糖的酶量。

游离酶活力测定方法：取0.2％(质量体积比mg/ml，即每100ml 1-Kestose溶液中含0.2mg 1-Kestose)的1-Kestose溶液0.9ml为底物(pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)，加入0.1ml的菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)部分纯化酶液35℃反应3.5小时后，沸水浴5min终止反应，快速冷却后用DNS法测定酶活。

固定化酶酶活力测定方法：测定方法同游离菊芋果聚糖外切水解酶方法一致。按实验需要称取一定量的固定化酶，加入底物，反应3.5小时，取出反应液，沸水浴5min，迅速冷却后，测定酶活。

1.2.2相对酶活

相对酶活是指在同一组试验中，以测得的最高的一组酶活为100％，其它几组酶活与之相比，结果以百分之百来表示。

1.2.3酶活回收利用率结果表达

酶活回收率＝固定化酶酶活/加入总酶活×100％

1.2.4蛋白含量测定

将部分纯化酶液适当稀释后，采用BCA蛋白分析试剂盒(AURAGENE,P001B-1)测定其蛋白含量。经测定后，所得部分纯化酶液的浓度为3.40mg/ml。

1.3固定化酶制备条件选择与优化

1.3.1吸附温度

称取0.2g预处理好的D201大孔阴离子交换树脂，然后加入pH5.5(0.05M/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.1ml的1.1.2步骤制备的部分纯化酶液(3.40mg/ml)，分别放在放置摇床上在10℃，20℃，30℃，40℃，50℃和60℃条件下吸附3小时，冷却后，加入戊二醛溶液使其终浓度为0.5％(体积百分含量)中，5℃交联4小时后用蒸馏水洗涤，稍微干燥后测定并计算固定化酶相对酶活。结果如图1A所示。

测定结果表明，固定化酶在0～40℃范围内，相对酶活随着吸附温度的升高而升高，当吸附温度超过40℃时，固定化酶的酶活急剧下降。这可能是因为菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEH1Ⅱ)本身热稳定性比较差有关，当温度超过一定范围后，酶活丧失，从而造成固定化酶酶活急剧下降。

1.3.2pH

称取0.2g预处理好的D201大孔阴离子交换树脂，然后分别加入pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0(0.05M/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.1ml的1.1.2步骤制备的部分纯化酶液，放置摇床上40℃吸附3小时，冰上冷却后，加入戊二醛溶液使其终浓度为0.5％(体积百分含 量)，5℃交联4小时后用蒸馏水洗涤2至3次，稍微干燥后测定并计算固定化酶相对酶活。结果如图1B所示。

由图可以看出，固定化酶相对酶活在pH4.5时，固定化酶的酶活最高，若低于或高于4.5时，固定化酶的酶活均会呈现逐渐或快速下降趋势。产生这种现象主要是因为pH值的改变能够直接引起固定化酶微环境或者载体与酶分子之间作用力的改变，因而，pH值过高或过低都会造成酶蛋白活力下降。

1.3.3吸附时间

称取0.2g预处理好的D201大孔阴离子交换树脂，然后分别加入pH 4.5(0.05M/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.1ml部分纯化酶液，放置摇床上40℃分别吸附0.5、1.5、3、4.5、6个小时，冷却后，加入戊二醛溶液使其终浓度为0.5％(体积百分含量)，5℃交联4小时后用蒸馏水洗涤，稍微干燥后测定并计算固定化酶相对酶活。结果如图1C所示。

由图中可以可出，当吸附时间为0.5～3小时之间时，菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)固定化酶酶活随着时间的增加而上升，吸附3小时，固定化酶的酶活达到最高值。若吸附时间超过3小时，随着时间的延长，固定化酶酶活不再增加，甚至有所下降。之所以产生这种现象可能是因为：一、吸附时间太短，游离酶不能被载体完全吸附，可能会使部分游离酶仍然停留在溶液中，因而造成相对酶活较低。二，吸附时间过长，固定化酶长时间在暴露在外界环境中会造成其酶活下降。综上所述，选择3小时的吸附时间为最佳操作条件用于下一步固定化酶的制备。

1.3.4戊二醛浓度

称取0.2g预处理好的D201大孔阴离子交换树脂，然后分别加入pH 4.5(0.05M/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.1ml 1.1.2步骤制备的部分纯化酶液(3.40mg/ml)，放置摇床上40℃吸附3个小时，冷却后，分别加入戊二醛溶液，使其终浓度(v/v)为0％、0.125％、0.25％、0.5％和1％，5℃交联4小时后用蒸馏水洗涤，稍微干燥后测定并计算固定化酶相对酶活。结果如图1D所示。

戊二醛是一种双功能试剂，既能够促使酶交联，又能够使酶变性。如果戊二醛浓度过低，游离酶不能与载体紧密结合，酶易从载体上脱落。戊二醛溶液浓度过高，会加速交联反应，其反应较为剧烈，在交联过程中会使酶蛋白大量失活。由图中可以看出，固定化菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)酶活在一定的戊二醛浓度范围内，随着戊二醛溶液浓度的增加，其酶活逐渐增加。戊二醛终浓度在0～0.125％时，固定化酶的酶活随着戊二醛浓度的增加而增加，当戊二醛终浓度为0.125％时，固定化酶的酶活达到最大值。当戊二醛终浓度超 过0.125％时，交联反应较为剧烈，超过了菊芋果聚糖外切水解酶的耐受范围，因而随着戊二醛溶液浓度的增加，酶活开始逐渐下降。

1.3.5交联温度

称取0.2g预处理好的D201大孔阴离子交换树脂，然后分别加入pH 4.5(0.05M/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.1ml的部分纯化酶液(3.40mg/ml)，放置在摇床上40℃吸附3个小时，在冰上冷却后，分别加入戊二醛溶液，使其终浓度为0.125％，分别在2℃、5℃、10℃、15℃、25℃和35℃条件下静置交联4小时，然后用蒸馏水洗涤，稍微干燥后测定并计算固定化酶相对酶活，每组设三个平行。结果如图1E所示。

由图中可以看出，当交联温度低于10℃时，固定化酶Ht1-FEHⅡ的酶活随着温度的逐渐升高而增加。交联温度为10℃时，固定化酶酶活达到最高值。交联温度超过10℃，固定化酶酶活急剧下降。这可能是因为，交联温度过高或过低都影响交联剂的功能，进而影响固定化酶的交联效果。因而，选择交联温度10℃用于下一步固定化酶的制备。

1.3.6交联时间

称取0.2g预处理好的D201大孔阴离子交换树脂，然后分别加入pH 4.5(0.05M/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.1ml的部分纯化酶液，放置摇床上40℃吸附3个小时，冷却后，加入戊二醛溶液使其终浓度为0.125％，10℃分别静置交联0.5、1、2、4、6、8小时后用蒸馏水洗并干燥，然后计算固定化酶相对酶活。结果如图1F所示。

由图中可以看出，当交联时间为2小时时，固定化酶Ht1-FEHⅡ的酶活最高。在一定时间范围内，固定化酶的酶活随着时间的增加而增加。交联时间过短或过长，固定化酶Ht1-FEHⅡ酶活都会受到影响，交联时间过短，酶与载体之间结合力较弱，在洗涤和操作过程中，酶较容易从阴离子树脂载体上脱落，从而导致固定化酶的酶活较低。交联时间过长，固定化酶的酶活也会下降，产生这种现象的固定化载体与酶的结合位点的数量有限，随着交联时间的增加酶与载体的结合位点逐渐趋于饱和，很可能部分Ht1-FEHⅡ酶的活性中心被遮掩，不能够充分催化底物。

1.3.7加酶量

称取0.2g预处理好的D201大孔阴离子交换树脂，然后分别加入pH 4.5(0.05M/L)的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.025ml,0.05ml,0.1ml,0.2ml,0.4ml(浓度单位为3.40mg/ml)的部分纯化酶液，放置摇床上40℃吸附3个小时，冷却后，加入戊二醛溶液，使其终浓度为0.125％，10℃分别静置交联2小时后用蒸馏水洗并干燥，然后计算固定化酶相对酶活。结果如图1G所示。

一般而言，固定化酶活在一定范围内会随着加酶量的增加而增加，当超过一定范围时，随着载体结合位点接近饱和，相对酶活不再升高，甚至会因为加酶量过多一方面使空间位阻效应加大，从而造成酶蛋白活降低：另一方面，加酶量过多，致使树脂内部的孔径被堵塞，其余的游离酶只能吸附在树脂表面，致使底物只能与树脂表面的酶蛋白发生反应，因而固定化酶酶活不再随着加酶量的增加而上升。

由上图可以看出，当加酶量小于0.1ml时，固定化酶Ht1-FEHⅡ酶活和回收利用率随着加酶量的增多而快速增加，当加酶量继续增加到0.2ml时，此时固定化酶酶活虽然达到最大值，但在此范围内，酶活增长速度较慢，当加酶量为0.2ml时，相对酶活虽然达到最大值，超过此范围，固定化酶酶活不再增加，且固定化酶回收率开始降低，容易造成酶的浪费，增加生产成本。因此选用0.1ml的加酶量制备的固定化酶并对其进行酶学性质分析。

1.4固定化酶酶学性质

按上述最佳固定化酶制备参数条件制备固定化酶，对其进行酶学性质分析，并与游离酶酶学性质进行比较。

1.4.1最适pH

按照固定化酶制备的最佳条件制定固定化酶，分别将游离酶和固定化酶加入到不同pH(5，5.5，6，6.5，7)的醋酸-醋酸钠缓冲液中，并测定固定化酶和游离酶的相对酶活，每组三个重复，结果如图2A所示。

由上图可知，游离酶的最适反应pH为6.0，菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)经固定化后，最适pH为6.5。较游离酶而言，向右移动了0.5个单位左右。当选择阴离子材料为载体时，固定化酶的pH值往往会向碱性方向移动，若选用阳离子材料作为固定化酶的在提示，固定化酶的PH值则会向酸性方向移动。

1.4.2最适温度

根据固定化酶的最佳制备条件制备固定化酶和游离酶，加入底物后放在不同的温度(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃)条件下反应，然后测定其相对酶活，测定结果如图2B所示。

由测定结果可以看出，游离酶的最适反应温度在30～35℃范围内，当反应温度为35℃时，固定化酶的酶活最高，因而游离酶的最适反应温度为35摄氏度。蛋白酶经固定化后，其最适反应温度大致在40～45℃范围内，当温度为40℃时，相对酶活最高。与游离酶相较而言，固定化酶的最适反应温度比游离酶的最适反应温度增加了5℃左右。

1.4.3热稳定性

将制备好的固定化酶和游离酶放在不同的温度条件(40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)下热处理半小时后，迅速冷却至4～5℃左右，分别测定固定化酶和游离酶酶活，并计算其相对酶活。结果如图2C所示。

结果表明，游离酶和固定化酶随着热处理温度的升高，相对酶活呈下降趋势，当热处理温度大于50℃时，游离酶和固定化酶的相对酶活迅速下降，当热处理温度大于60℃时，游离酶和固定化酶酶活很低，甚至没有酶活。因而，经固定化后，该蛋白酶的热稳定性并未有所提高，这可能与该蛋白酶本身热稳定性好坏有关。

1.4.4操作稳定性

操作稳定性是衡量固定化酶稳定性及能否在实际应用中的标准之一，因而，测定固定化酶的操作稳定性是非常必要的。将制备好的固定化酶，在所有条件一样的情况下连续使用6次，测定固定化酶每次使用酶活，以第一次使用的酶活为100％，其余五次与之相比，求其相对酶活。测定结果如图2D所示。

结果表明，固定化酶随着使用次数的增加相对酶活逐渐有所下降，这可能与固定化酶在使用过程中酶活自身下降，或者部分酶和载体结合不牢造成部分酶脱落有关。尽管如此，固定化酶在重复利用6次之后，其相对酶活仍然在90％以上。因而，蛋白酶经固定化后，操作稳定性较好，在实际工业生产中具有很大的潜力。

1.4.5贮藏稳定性

贮藏稳定性是衡量酶蛋白工业价值大小的重要标准之一。将固定定化酶(浸泡于2倍体积的无菌水中)和游离酶放置在4℃条件下贮藏28天，然后分别测定固定化酶和游离酶的剩余酶活，以第1天测得的酶活为100％，第28天的酶活与之相比，求其相对酶活。结果如图2E所示。

由图2E可以看出，固定化酶和游离酶在4℃条件下保存28天后，固定化酶相对酶活仍然保持在98.41％，游离酶的相对酶活为92.26％。由此可见，菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)经固定化后贮藏稳定性有所增强。可能是因为菊芋果聚糖外切水解酶经固定化后，酶蛋白周围的微环境有所变化，使酶蛋白结构和酶蛋白活性中心得到保护，酶蛋白结构更加稳定，不易使酶失去活性。

本实施例采用D201大孔阴离子树脂为载体，戊二醛为交联剂对菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)进行固定化，对其固定化条件进行探索与优化，并对固定化果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)进行了酶学性质分析。

通过实验研究发现固定化酶的最适制备条件结果如下：称取已处理好的树脂0.2g，然后Ph4.5醋酸钠缓冲溶液和0.1ml的浓缩酶液，放置在摇床上40℃吸附3小时，迅速冷却后，加入戊二醛溶液，使其终浓度为0.125％,10℃交联2小时后，用蒸馏水洗涤后放在4℃冰箱中备用。通过此条件制备的固定化酶，酶活回收率能够达到73.53％.

按照固定化酶最佳制备参数条件下制备固定化酶，并对其进行了酶学性质分析：固定化酶的最适反应温度为40℃，比游离酶提高了5℃。最适pH为6.5，与游离酶相较，pH值向右移动了0.5个单位。菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)经固定化后，其热稳定性并没有提高，但操作稳定性和贮藏稳定性较好，在实际工业应用中具有较好的潜力。

实施例2菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)的包埋法固定化

本实施例采用海藻酸钠包埋法对外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)进行固定，探究了海藻酸钠包埋法制备固定化酶的最适条件，并对游离酶和固定化酶的酶学性质进行了分析比较，同时通过与吸附交联法进行了比较，确定了采用大孔阴离子树脂吸附交联法固定重组酶Ht1-FEHⅡ，酶活回收率较高，操作稳定性好，具有实际工业应用价值。

2.1试验材料与方法

2.1.1试验材料

海藻酸钠、无水氯化钙均购于南京寿德公司，菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)采用现有方法制备。

2.1.2方法

固定化酶制备方法：首先用蒸馏水将海藻酸钠溶解，带气泡消失后，加入酶液，混匀，气泡完全消失后，用一次性注射器将上述混匀的溶液逐滴滴入氯化钙溶液中，静置固定一定时间后，用纱布滤出小球，然后用蒸馏水洗涤2至3次，稍微干燥后，放在4℃冰箱中备用。

2.2研究原理

海藻酸钠中的钠离子和氯化钙溶液中的钙离子能在在比较温和的条件下发生阳离子交换，从而形成具有网络结构的海藻酸钙凝胶,从而将所加酶液包埋在所形成的微球中。

2.3海藻酸钠包埋法制备固定化酶制备条件的选择

2.3.1海藻酸钠溶液

首先用蒸馏水配制不同浓度的海藻酸钠溶液(0.5％，1％，2％，3％，4％)(质量体积比mg/ml)，然后加入0.1ml的酶液，待气泡完全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入2％ 氯化钙溶液(质量体积比mg/ml)中，静置固定2小时后，小球形成。用纱布将小球轻轻滤出，然后用蒸馏水洗涤2至3次，测定固定化酶酶活后并计算相对酶活，选择最适条件进行下一步操作。结果如图3A所示。

一般而言，在一定海藻浓度范围内，固定化酶酶活随着海藻酸钠浓度增加而增加，超过一定的浓度范围，固定化酶酶活开始下降。由图中可以看出，当海藻酸钠浓度为2％，固定化酶相对酶活最高，此时制备的固定化酶的效果最好，高于或低于此浓度，固定化效果都不理想。海藻酸钠浓度一定，则与氯化钙溶液交换的钙离子数量也是一定的。海藻酸钠溶液浓度过低，与氯化钙溶液中的钙离子交换数量较少，形成的网络结构较为疏松，网络孔径较大，固定化酶机械强度差，易变形。这些都可能会引起酶蛋白从载体上泄露或脱落，从而导致固定化酶酶活下降。反之，若海藻酸钠浓度过高，粘性大，虽然形成的固定化酶机械强度较好且不易变形，但海藻酸根与钙离子形成的海藻酸钙凝胶网路结构会过于致密，网络孔径小，增加了位阻效应，从而致使酶和底物不能充分结合，同样也会降低固定化酶酶活。同时，高浓度的海藻酸钠粘性较大，制备的固定化酶小球易有拖尾现象产生，不利于固定化操作。因而选择2％的海藻酸钠溶液进行下一步固定化酶的制备。

2.3.2固定化时间

首先用蒸馏水配制2％的海藻酸钠溶液，冷却后，加入0.1ml的酶液(3.40mg/ml)，待气泡完全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入2％(质量体积比mg/ml)氯化钙溶液中，分别静置固定化0.5小时，1小时，1.5小时，2小时，2.5小时，小球形成，用蒸馏水洗涤2至3次，测定固定化酶酶活后并计算相对酶活，选择最适条件进行下一步操作。结果如图3B所示。

由图中可以看出，当固定化时间为2h时，固定化酶的相对酶活最高，若固定化时间少于2h,的固定化酶的相对酶活随着固定化时间的增加而增加，超过2小时，固定化酶的相对酶活开始下降。产生这种现象的原因是：固定化时间过短，海藻酸钠与氯化钙溶液中的钙离子交换数量较少，形成的海藻酸钙网络结构较为疏松，在洗涤和操作过程中，酶易于从载体上脱落，致使固定化酶的酶活下降：若固定化时间过长，海藻酸钠与钙离子交换数量过多，形成的海藻酸钙的网络结构过于紧密，从而增大了空间位阻效应，不利于酶和底物充分结合，因而导致固定化酶酶活不再增加甚至下降。因而，当固定化时间为2小时，得到的固定化酶的效果最好。

2.3.3氯化钙浓度

首先用篜馏水配制1％的海藻酸钠溶液，冷却后，加入0.1ml酶液，混匀后，待气泡完 全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入不同浓度的氯化钙溶液中(1％、1.5％、2％、3％、4％),静置固定化2小时，小球形成，洗涤2至3次后，测定固定化酶酶活后计算相对酶活，选择最适条件进行下一步操作。结果如图3C所示。

测定结果表明，当氯化钙浓度为1.5％时，固定化酶的相对酶活最高，当氯化钙浓度低于1.5％时，固定化酶的酶活随着氯化钙浓度的增加而增加。反之，则固定化酶的相对酶活则会随着氯化钙浓度的增加而降低。产生这种现象的原因是：氯化钙浓度过低，海藻酸钠与钙离子交换数量较少，所形成的网络结构较为疏松，且固定化酶机械强度差，易变形，，酶蛋白容易从载体上脱落，从而导致固定化酶的酶活下降。反之，氯化钙浓度过高，海藻酸钠与钙离子交换数量多，形成的网络结构较为紧密，导致酶蛋白不能与底物充分结合，从而降低了固定化酶酶活。

2.3.4加酶量

首先用蒸馏水配制2％的海藻酸钠溶液，冷却后，分别加入的酶液，待气泡完全消失后，用注射器吸取上述溶液逐滴滴入1.5％氯化钙溶液中，静置固定化2小时后，小球形成，用蒸馏水洗涤2至3次，测定固定化酶酶活后并计算相对酶活，选择最适条件进行下一步操作。结果如图3D所示。

由图中结果可以看出，当加酶量0.3ml为时，固定化酶相对酶活最高。当加酶量小于0.3ml时，固定化酶酶活随着加酶量的增加而增加，载体上的结合位点仍处于未饱和状态。当加酶量大于0.3ml时，固定化酶酶活随着加酶量的增加而减少，产生这种现象的原因是：加酶量增加到一定量时，载体上结合位点蛋白达到饱和，从而导致酶分子相互聚集，使酶活性中心结构发生变化。

当海藻酸钠包埋法与吸附交联法相比，海藻酸钠包埋法的固定化酶加酶量为0.3ml时(3.40mg/ml)，固定化酶的回收率为53.60％，而吸附交联法的固定加酶量为0.1ml(3.40mg/ml)时，其酶活回收率在70％上。海藻酸钠包埋法加酶量多但回收率低，吸附交联法的加酶量比海藻酸钠包埋法加酶量少，其回收率要比海藻酸钠回收率高。因而，包埋法并不是一种特别好的固定化酶制备方法。

2.4固定化酶酶学性质分析

2.4.1最适温度

将按最佳制备条件制定的固定化酶，分别置于不同的温度条件下进行反应，以测定酶活最高的一组为100％，计算相对酶活，确定固定化酶与底物反应的最适温度。结果如图4A所示，由图可以看出，海藻酸钠包埋法制备的固定化酶最适反应温度为35℃，与游离酶反 应温度相同。

2.4.2最适pH

在固定化酶最佳制备条件下制定固定化酶，将其置于不同的pH值醋酸钠缓冲液中，以最高一组为100％，计算相对酶活，确定固定化酶的最适反应pH，结果如图4B所示。

由图中可以看出，游离酶的最适pH值为6.0，海藻酸钠包埋法固定化酶最适pH为7.0，较游离酶而言，均向右偏移了1个单位。海藻酸钠对pH值的改变极具敏感性，固定化酶最适pH向右偏移。产生这种现象的原因是因为，可能是由于海藻酸钠是一种阴离子电解质，而大孔阴离子树脂属于阴离子载体，当选用以阴离子材料为载体时，固定化酶的pH相较游离酶而言往往会往碱性方向偏移。也有可能是因为由于载体使固定化酶的构象发生了变化，从而致使固定化酶的相对酶活高于游离酶。

2.4.3热稳定性

将在最佳制备化酶条件下制备的固定化酶分别放入40℃，50℃。60℃，70℃，80℃中热处理0.5h，然后测定游离酶和固定化酶酶活，并计算其相对酶活及分析比较，结果如图4C所示。

结果表明，游离酶和固定化酶酶活均随着温度的升高而下降，当温度达到60℃时，游离酶和固定化酶几乎没有酶活，这说明经过固定化后，重组酶Ht1-FEH的热稳定性并没有提高。此结果与吸附交联法制定的固定化酶一致。

2.4.4操作稳定性

按照固定化酶的最佳制备条件制备固定化酶，然后在最适反应条件下连续使用6次，以第一次使用测得的固定化酶为100％，其余5次酶活与之相比，计算相对酶活并进行分析，共设三个重复，测定结果如图4D所示：

操作稳定性是衡量固定化酶能否在工业中具有实用价值的标准之一。由图中可以看出，海藻酸钠包埋法制备的固定化酶随着使用次数的增加，其酶活不断下降，这可能是因为，在固定化酶，酶重复过程中，酶蛋白不断从载体上脱落，也有可能是因为随着重复使用次数的增加，固定化酶结构发生改变导致其酶活下降。

2.4.5贮藏稳定性

将固定定化酶(浸泡于2倍体积的无菌水中)和游离酶放置在4℃条件下贮藏28天，然后分别测定固定化酶和游离酶的剩余酶活，以第1天测得的酶活为100％，第28天的酶活与之相比，求其相对酶活。结果如图4E所示。

由图中可以看出，固定化酶和游离酶在4℃条件下保存28天后，固定化酶相对酶活仍 然保持在94.37％，游离酶的相对酶活为91.41％。由此可见，菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)经固定化后贮藏稳定性有所增强。

2.5吸附交联法与海藻酸钠包埋法制备固定化酶比较

1最适温度和pH值

与海藻酸钠包埋法相比，采用阴离子树脂吸附交联法制备的固定化酶最适温度要比海藻酸钠包埋法制备的固定化酶的最适温度高了5℃，最适pH值均为6.5，比较游离酶而言，均向右偏移了0.5个单位。

2回收利用率

海藻酸钠最最适加酶量条件下，固定化酶回收利用率为53.60％，而阴离子交换树脂吸附交联法制备的固定化酶，固定化酶的回收利用率在70％以上，要高于海藻酸钠包埋法的回收利用率。

3操作稳定性比较

采用海藻酸钠包埋法制备的固定化酶在重复使用6次后，其相对酶活仅为21.60％，而采用阴离子交换树脂吸附交联法制备的固定化酶在重复使用6次后，其相对酶活达到了90％以上，远远高出了海藻酸钠包埋法制备的固定化酶。

4贮藏稳定性

与游离酶相比，海藻酸钠包埋法和阴离子树脂吸附交联法制备的固定化酶的贮藏稳定性均有所提高，但采用阴离子交换树脂制备的固定化酶的相对酶活要高于海藻酸钠包埋法制备的固定化酶，因而，其贮藏稳定性要比海藻酸钠包埋法制备的固定化酶要好。

综上所述，阴离子树脂吸附交联法制备的固定化酶的回收利用率、操作稳定性和贮藏稳定性均比海藻酸钠包埋法制备的固定化酶效果。因而，前者制备的菊芋果聚糖外切水解酶(Ht1-FEHⅡ)更具有实际应用价值。

本发明采用海藻酸钠包埋法对重组酶Ht1-FEHⅡ进行了固定化，确定了海藻酸钠包埋法制备重组酶Ht1-FEHⅡ固定化酶的条件，并对其进行了酶学性质分析，并与吸附交联法做了比较，以确定这两种方法中哪一种更适用于重组酶Ht1-FEHⅡ的固定化。

通过实验研究发现，采用海藻酸钠包埋法固定化重组酶Ht1-FEHⅡ的最适条件如下：海藻酸钠溶液为2％，氯化钙溶液浓度为1.5％，加酶量为0.3ml，固定化时间为2小时时，其固定化效果最好。采用海藻酸钠法在最适固定化条件下制备的固定化酶的回收率为53.60％

在海藻酸钠包埋法最适条件确定后制备固定化酶，并对游离酶和海藻酸钠包埋法制备的固定化酶进行了分析比较。研究发现，游离酶的最适反应温度为35℃，经固定化后，固定 化酶的最适反应温度仍为35℃，游离酶的最适PH值为6.0，经固定化后，最适pH值为6.5，比游离酶向右偏移了0.5个单位。采用海藻酸钠包埋法制备的固定化酶与游离酶相比，固定化酶的热稳定并没有提高，这可能与重组酶Ht1-FEH本身热稳定性不稳定有关。

通过海藻酸钠包埋法与大孔阴离子树脂吸附交联法制备的固定化酶比较，研究表明，大采用D201大孔阴离子树脂吸附交联法要比海藻酸钠包埋法制备的固定化酶更具有优势，且在工业中的实际运用价值更高。

Claims (8)

1.一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于它采用以下两种方法中的任意一种制备：

方法一：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔阴离子树脂为载体，在10～45℃，pH4.0～6.0条件下吸附并冷却后，以终浓度为0.1％～0.5％的戊二醛溶液为交联剂在2～25℃条件下交联后洗涤干燥得固定化酶；

方法二：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸钠溶液中混匀制成混合溶液，将混合溶液滴入氯化钙溶液中，静置固定后，过滤并将滤饼洗涤干燥得固定化酶。

2.根据权利要求1所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于

方法一的详细步骤为：称取预处理好的D201大孔阴离子树脂，加入pH4.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，在10～45℃条件下吸附并冷却后，加入终浓度为0.1％～0.5％的戊二醛溶液，2～25℃交联后洗涤并干燥得固定化酶；

方法二的详细步骤为：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到浓度为0.5％～3％的海藻酸钠溶液中混合均匀制成混合溶液，将混合溶液滴入浓度为1％～4％的氯化钙溶液中，静置固定0.5～2.5h后，过滤并将滤饼洗涤干燥得固定化酶。

3.根据权利要求2所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于

方法一中所述吸附的温度为20～40℃，pH值为4.5～5.0，时间为0.5～6h；所述戊二醛溶液的终浓度为0.1％～0.25％，所述交联的温度为2～15℃，时间为0.5～8h；

方法二中所述海藻酸钠溶液的浓度为0.5％～2.5％，所述氯化钙溶液的浓度为1％～2％，所述静置固定的时间为0.5～2。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶，其特征在于

所述的方法一为：称取预处理好的D201大孔阴离子树脂加入pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，40℃吸附3小时，迅速冷却后，加入戊二醛溶液，使其终浓度为0.125％,10℃交联2小时后，用蒸馏水洗涤干燥后放在4℃冰箱中备用；

所述的方法二为：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到浓度为2％的海藻酸钠溶液中混合均匀制成混合溶液，将混合溶液滴入浓度为1.5％的氯化钙溶液中，静置固定2h后，过滤并将滤饼用蒸馏水洗涤干燥得固定化酶。

5.一种固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，其特征在于为以下两种方法中的任意一种：

方法一：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液以D201大孔阴离子树脂为载体，在10～45℃，pH4.0～6.0条件下吸附并冷却后，以终浓度为0.1％～0.5％的戊二醛溶液为交联剂在2～25℃条件下交联后洗涤干燥得固定化酶；

方法二：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到海藻酸钠溶液中混匀制成混合溶液，将混合溶液滴入氯化钙溶液中，静置固定后，过滤并将滤饼洗涤干燥得固定化酶。

6.根据权利要求1所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，其特征在于

方法一的详细步骤为：称取预处理好的D201大孔阴离子树脂，加入pH4.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，在10～45℃条件下吸附并冷却后，加入终浓度为0.1％～0.5％的戊二醛溶液，2～25℃交联后洗涤并干燥得固定化酶；

方法二的详细步骤为：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到浓度为0.5％～3％的海藻酸钠溶液中混合均匀制成混合溶液，将混合溶液滴入浓度为1％～4％的氯化钙溶液中，静置固定0.5～2.5h后，过滤并将滤饼洗涤干燥得固定化酶。

7.根据权利要求2所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，其特征在于

方法一中所述吸附的温度为20～40℃，pH值为4.5～5.0，时间为0.5～6h；所述戊二醛溶液的浓度为0.1％～0.25％，所述交联的温度为2～15℃，时间为0.5～8h；

方法二中所述海藻酸钠溶液的浓度为0.5％～2.5％，所述氯化钙溶液的浓度为1％～2％，所述静置固定的时间为0.5～2。

8.根据权利要求5～7中任意一项所述的固定化菊芋果聚糖外切水解酶的制备方法，其特征在于

所述的方法一为：称取预处理好的D201大孔阴离子树脂加入pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和菊芋果聚糖外切水解酶酶液，40℃吸附3小时，迅速冷却后，加入戊二醛溶液，使其终浓度为0.125％,10℃交联2小时后，用蒸馏水洗涤干燥后放在4℃冰箱中备用；

所述的方法二为：将菊芋果聚糖外切水解酶酶液加入到浓度为2％的海藻酸钠溶液中混合均匀制成混合溶液，将混合溶液滴入浓度为1.5％的氯化钙溶液中，静置固定2h后，过滤并将滤饼用蒸馏水洗涤干燥得固定化酶。