CN1455000A - 固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法 - Google Patents
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Abstract
一种固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，包括如下步骤：1.菊芋或菊苣块茎中提取菊粉：将菊芋块茎干粉，按重量比1∶3－5加入水，置沸水浴抽提20－40分钟，离心抽提得菊粉液；2.固定化菊糖酶的制备：取适量的交换树脂加入适量的菊糖酶，经反相渗透浓缩，水浴振荡吸附后，加入0.01mol/L戊二醛溶液，4.5－6℃温度下交联，制得固定化菊糖酶，3.菊粉液经固定化菊糖酶酶解制备高果糖浆：将所制得的固定化菊糖酶在温度57－63℃和pH值4－5下，填入生物反应器；以20％菊粉液为底物，流速为1500－2250ml/h通过生物反应器，菊粉液经固定化菊糖酶酶解产生高果糖浆。通过本发明的菊粉转化为高果糖浆的初转化率达100％，产品精制总得率高达95％。
Description
技术领域
本发明涉及菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，尤其涉及到固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法。
背景技术
果糖是自然界甜度高的天然甜味剂，甜度比蔗糖和山梨醇分别高80％和50％，还具有比葡萄糖、蔗糖明显优越的保健与营养功效。高果糖浆是果糖浆生产的第三代产品，生产途径之一是：菊粉酶水解多聚果糖→果糖，产物果糖含量＞90％，只含有不到5％的葡葡糖，多聚果糖底物菊粉(又称菊糖)来自富含多聚果糖的菊科植物如菊芋Jerusalem artichoke、菊苣Chicory的块根中。中国专利CN1252438A公开了一种产生菊粉酶的克鲁维酵母菌株，其保藏号为：CGMCCNO.0360；由克鲁维酵母菌株生产菊粉酶；由所生产的菊粉酶糖化降解菊粉生产高果糖浆，其生产方法包括：菌体与酶液分离后，将菊粉酶液与含糖量8-17的菊粉溶液按照1∶8-17的体积比混合，在45-55℃下酶解糖化30-40小时，得到高果糖浆。该发明需要通过菌株产酶和酶解两个工艺段，酶解糖化时间长。由菊粉酶酶解菊粉生产高果糖浆是单酶反应，工艺简单，使用游离酶，酶不可重复使用，成本较高。
目前国内外有固定化菊粉酶及使用固定化菊粉酶水解菊粉的报道，据万武光、魏文铃、王世媛在《工业微生物》1999年第29卷第2期中报道了“D201-GM大孔树脂吸附交联固定菊粉酶的研究”克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellularinulinase)，以D201-GM大孔径阴离子交换树脂吸附交联法固定化，其制备固定化酶的适宜条件：树脂吸附酶时PH6.5、温度30℃、时间3h，交联时戊二醛浓度0.03％、温度4℃、时间3h。上述条件下制得固定化酶的活性产率可达62％。水解菊粉底物的最适温度55℃，用固定化酶填充床反应器连续降解菊粉抽提液的实验结果表明，固定化酶反应器在50℃温度下连续续操作12天，测定固定化酶残留酶活为73.5％，半衰期为27天，反应器操作不稳定，使用中酶容易从载体上脱落，酶的活性较低，难以实现工业化生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术之不足，提供一种固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，该方法能省去选取菌株及菌株产酶工艺段，缩短酶解糖化时间，酶的活性较高，可反复使用，并可连续性生产操作，并能实现工业化生产，显著降低生产成本。
本发明目的是这样实现的：一种固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，包括如下步骤：
1.菊芋或菊苣块茎中提取菊粉：
将菊芋或菊苣块茎干粉，按重量比1∶3-5加入水，置沸水浴抽提20-40分钟，离心收集上清液，沉淀，在重复加水抽提一次，合并两次上清液即菊粉液；
2.固定化菊糖酶的制备：
取适量的经预处理的强碱性大孔径阴离子交换树脂D201-CM树脂，加入适量的菊糖酶，经反相渗透浓缩后，水浴振荡吸附后加入0.01mol/L戊二醛溶液，4.5-6℃温度下交联，制得固定化菊糖酶，经醋酸缓冲溶液洗涤3-7次后备用；
3.菊粉液经固定化菊糖酶酶解制备高果糖浆：
将所制得的固定化菊糖酶在温度57-63℃和PH值4-5下，填入生物反应器；
以重量百分比为20％菊粉液为底物，流速为1500-2250ml/h通过生物反应器，菊粉液经固定化菊糖酶酶解产生高果糖浆。
本发明第1步菊芋或菊苣块茎中提取菊粉，优选条件是：将菊芋或菊苣块茎干粉，按重量比1∶4加入水，置沸水浴抽提40分钟。
本发明第2步固定化菊糖酶，优选条件是：菊糖酶选取丹麦诺和集团生产的诺和菊糖酶-Fructozyme，诺和菊糖酶-Fructozyme是一种经选育的黑曲酶菌株获得的胞内菊糖酶和胞外菊糖酶的混合物，为透明的褐色液体，密度为1.2g/ml，游离活力为2000INU/g(一个酶单位INU为本项目使用的反应条件下每分钟形成1微摩乐还原糖的酶的量)，反相渗透浓缩诺和菊糖酶-Fructozyme活力为12800INU/g。交联的最佳温度为5℃，醋酸缓冲溶液洗涤最佳次数为5次。
本发明第3步菊粉液经固定化菊糖酶酶解制备高果糖浆，最优条件：固定化菊糖酶在温度60℃和PH值4.75下，填入酶生物反应器；菊粉液为底物，流速为2250ml/h。
所述的酶生物反应器为带有夹套旋环水的反应器9×17.3cm，柱体积1L，固定化酶685ml。
通过本发明的菊粉转化为高果糖浆的初转化率达100％，产品精制总得率高达95％。连续操作60天酶显示最大活性100％，使用半衰期达340天以上。
附图说明
图1.酶底物：20％(w/w)菊粉，PH4.75，酶剂量2000INU/g，不同温度下菊粉水解程度随时间的变化关系；
图2.酶底物：20％(w/w)菊粉，温度60℃，酶剂量2000INU/g，不同PH值下菊粉水解程度随时间的变化关系；
图3.是在图2相同条件下，时间为12小时，当PH值在3.6-6.0之间时酶解菊粉的相对转化率；
图4.时间为24小时，PH值4.75，温度为60℃，酶剂量2000INU/g，底物浓度对水解程度的影响；
在完成本发明过程中，本发明人进行的实验：
1.酶的选择比较
克鲁维酵母突变株K.UV-G-40-3，摇瓶发酵，发酵液经过离心分离收集上层清液，得到部分纯化的菊粉酶，简称K酶。
比较K酶和诺和菊糖酶-Fructozyme的游离活力和按相同比例反相渗透透浓度浓缩诺和菊糖酶-Fructozyme，如表1：
表1游离酶、固定化酶的比较
| 酶类 | 游离K酶 | 游离诺和菊糖酶 | 浓缩K酶 | 浓缩诺和菊糖酶 |
| 酶活力(INU/g) | 50.0 | 2000.0 | 320.0 | 12800.0 |
比较结果表明：诺和菊糖酶的酶活力远远高于K酶。因此，本发明使用诺和菊糖酶来酶解底物。
2.固定方法选择
每克载体分别加入2000INU酶量。通过开孔明胶包埋法、载体结合法、树脂交联法的固定化酶：
(1)开孔明胶包埋法取适量酶液按1∶10(V/V)比例
加到混合胶(20％、1.87％海藻酸钠)中混匀，5℃冰
箱中凝固形成薄片，4％CaCl2浸泡(固化过夜)，次日
切成2×2mm小块，然后用PH4.75、0.05mol/醋酸缓
冲溶液配制)交联1.5小时，所得固定化颗粒用无菌
生理盐水洗涤5次。
(2)载体结合法 以硅藻土材料作载体，按一定量载体
加定量酶液，在PH4.75醋酸缓冲溶液中，搅拌，离心
收集，用缓冲溶液洗涤5次，离心收集即得固定酶。
(3)本项目所开发使用的树脂交联法取适量树脂加入
诺和菊糖酶经反相渗透浓缩后为6000INU/g，水浴
振荡吸附后加入0.01mol/L戊二醛溶液，5℃温度下
交联，制得固定化酶经醋酸缓冲溶液洗涤5次后备
用。
以蔗糖、松三糖、菊糖等为底物，分别加入适量固定化诺和菊糖酶，60℃恒温振荡作用6小时后，产物用薄层层析分析。对几种不同底物的酶解产物中发现有果糖、葡萄糖。可见蔗糖和松三糖被固定化酶水解。这种三糖末端结构虽然与菊粉相似，但由于其果糖分子C3位置上连接另一个葡萄糖分子，因此不被诺和菊糖酶所水解。固定化不改变底物特异性，酶解产物可直接用来制备高果糖浆。
表2三种制备的固定化诺和菊糖酶活力比较
(每克载体加入2000INU酶量)
| 载体 | 加入诺和菊糖酶总活性(INU) | 固定化酶活力(INU/g固定化酶) | 活力回收(％) |
| 开孔明胶 | 2000 | 930 | 46.5 |
| 硅藻土 | 2000 | 424 | 21.2 |
| 树脂交联 | 2000 | 1900 | 95.5 |
从表2可看，用树脂交联法所制备的固定化酶活性产率达95.5％，比其它两种方法高。
3.固定化酶最适宜温度选择
温度对固定化酶活性和稳定性即水解程度的影响，以20％菊粉为底物，在不同温度(55-65℃)下分别测定，结果固定化诺和菊糖酶在60℃表现最大活性，游离酶为52℃，可见酶经固定化之后酶解底物反应的最适宜温度提高8℃。在较高温度下酶解菊粉，有利于提高底物菊粉的溶解度，加快反应速度，控制杂菌的污染。
图1所示，温度在60℃是适合的。活性最佳时间间隔位于57-63℃。在温度超过63℃，酶的活性会显著的降低。在低温酶的活性会降低，将增加其它微生物的干扰的危险。
4.固定化酶最适宜的PH值
在60℃，PH3-8的缓冲溶液(PH3-5，0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液；PH6-8，0.1mol/L磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液)中，分别测定固定化酶和游离酶活性。结果发现，固定化酶的反应最适PH为5.0，比游离酶4.5略有升高，由于载体树脂是一种阴离子交换树脂，它带有负电荷会吸引反应液中氢离子(H+)部分集中到载体分子附近，使固定化酶微环境的PH值下降，从而导致酶反应最适往碱性偏移。
从图2、图3所示，最佳的水解作用的PH值是4-5。
5.底物
图4所示，初始底物浓度可以在13-20％。在水解过程中，底物的浓度会有所提高。在菊粉水解成果糖和葡萄糖的水解中它们之间的比例是10∶1。由于受到溶解度的限制，底物浓度大于20％或小于13％都是比较难获得。
6.固定化诺和菊糖酶一次性连续酶解菊糖试试验
(1)反应器一次性连续酶解将制备的固定化酶装入生物反应器，并和收集器，超级恒温水浴器等串联，组成能连续反应操作的固定化酶反应器系统。试验采用从顶部进料的方式进行菊粉的连续酶解。底物菊糖不溶于冷水，因此进料前将底物置50℃水浴预热。
在相同温度下，随进料空间速度提高，底物在生物反应器中滞留时间减少，菊粉的酶解率下降，但生物反应器的定容产率上升。在相同温度和进料空间速度操作下操作，随底物浓度升高，底物酶解率下降，定容产率却上升，底物酶解程度影响产物纯度，而定容产率的高低涉及反应器的生产能力，从经济效益出发在二者之间进行权衡。将预热过的20％菊芋提取液(PH4.75)作为底物分别以不同流速通过固定化酶反应器(9×17.3cm，柱体积1L，固定化酶685ml，空隙体积315mL，于60℃反应，结果如表3。
表3 反应器中流速对酶解反应的影响
| 流速Ml/h | 6000 | 4500 | 3750 | 2250 | 1500 |
| 转化率(％) | 82.3 | 89.1 | 94.6 | 98.1 | 98.7 |
(2)使用的稳定性
在反应器中，以含菊粉20％菊芋提取液为底物，在60℃条件下一次性连续酶解，半衰期在340天以上(见表4)。
表4 固定化酶在反应器中使用稳定性
| 时间(d) | 60 | 90 | 120 | 150 | 180 | 210 | 240 | 270 | 300 | 330 | 340 |
| 相对转化率(％) | 100 | 98.2 | 93.5 | 89.1 | 86.6 | 83.7 | 78.4 | 76.6 | 69.7 | 65.2 | 59.1 |
以流速2250Ml/h，转化率98.1％，相对转化率为100％。
(3)酶解产物分析
固定诺和菊糖酶反应器一次性连续酶解菊粉的产物，用薄层层析法分析表明，其主要成分是果糖和少量葡萄糖；用高效液相色谱(HPLC)法分析，色谱图上仅出现果糖的葡萄糖的峰，经计算果糖占酶解产物(总糖)95％。
具体实施方式
从以下说明性实施例将进一步理解本发明。
实施例1
以大孔阴离子交联树脂为载体，每克载体加入浓缩酶2000INU固定化2小时，制得固定化酶活力为1900INU/g，活力回收95％；固定化菊糖酶的温度60℃和PH值为4.75下，以含菊粉重量百分比20％的菊芋提取液在生物反应器中一次性连续酶解，流速为以2250Ml/h，转化率为98.1％，在60℃连续酶解，结果半衰期在340天以上。
实施例2
以大孔阴离子交联树脂为载体，每克载体加入浓缩酶2000INU固定化2小时，制得固定化酶活力为1900INU/g，活力回收95％；固定化酶的温度57℃和PH值为4.5，以含菊粉重量百分比20％的菊芋提取液在生物反应器中一次性连续酶解，但流速为以1800Ml/h转化率为98.3％，在57℃连续酶解。
实施例3
以大孔阴离子交联树脂为载体，每克载体加入浓缩酶2000INU固定化2小时，制得固定化酶活力为1900INU/g，活力回收95％；固定化菊糖酶的温度63℃和PH值为5，以含菊粉重量百分比13％的菊芋提取液在生物反应器中一次性连续酶解，但流速为以1500Ml/h转化率为98.7％，在63℃连续酶解。
Claims (7)
1.固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，其特征在于：该方法包括下列步骤：
A.从菊芋或菊苣块茎中提取菊粉：
将菊芋或菊苣块茎干粉，按重量比1∶3-5加入水，置沸水浴抽提20-40分钟，离心收集上清液，沉淀，在重复加水抽提一次，合并两次上清液即菊粉液；
B.固定化菊糖酶的制备：
取适量的经预处理的强碱性大孔径阴离子交换树脂，加入适量的菊糖酶，经反相渗透浓缩后，水浴振荡吸附后加入0.01mol/L戊二醛溶液，4.5-6℃温度下交联，制得固定化菊糖酶，经醋酸缓冲溶液洗涤3-7次后备用；
C.菊粉液经固定化菊糖酶酶解制备高果糖浆：
将所制得的固定化菊糖酶在温度57-63℃和PH值4-5下，填入生物反应器；
以重量百分比为13-20％菊粉液为底物，流速为1500-2250ml/h通过生物反应器，菊粉液经固定化菊糖酶酶解菊粉液产生高果糖浆。
2.根据权利要求1所述的固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，其特征在于：所述的菊糖酶为是一种经选育的黑曲酶菌株获得的胞内菊糖酶和胞外菊糖酶的混合物，为透明的褐色液体，密度为1.2g/ml，游离活力为2000INU/g。
3.根据权利要求1所述的固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，其特征在于：所述的从菊芋或菊苣块茎中提取菊粉这一步骤中，将菊芋或菊苣块茎干粉，按重量比1∶4加入水，置沸水浴抽提40分钟，离心收集上清液，沉淀，在重复加水抽提一次，合并两次上清液即菊粉液。
4.根据权利要求1所述的固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，其特征在于：所述的强碱性大孔径阴离子交换树脂，加入适量的菊糖酶，经反相渗透浓缩后，水浴振荡吸附后加入0.01mol/L戊二醛溶液，5℃温度下交联，制得固定化菊糖酶。
5.根据权利要求1或4所述的固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，其特征在于：所述的强碱性大孔径阴离子交换树脂是D201-CM树脂。
6.根据权利要求1所述的固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，其特征在于：所述的固定化菊糖酶在温度60℃和PH值4.75下，填入生物反应器。
7.根据权利要求1所述的固定化菊糖酶酶解菊粉生产高果糖浆的方法，其特征在于：所述的为底物菊粉液的浓度重量百分比为20％，以流速为2250ml/h通过生物反应器。
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