CN104630306A - 一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法 - Google Patents

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阮征
米书梅
印遇龙
江波
周艳
邓泽元
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Abstract

一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法，包括以下步骤：（1）260-280×103U/L的β-呋喃果糖苷酶液加甘露醇至甘露醇终浓度1-2mmol/L；按1:1-2体积比与2.4-2.8g/L海藻酸钠混合，按1:2-3体积比滴入0.5-0.8mol/L氯化钙，固定40-50min，过滤后放入质量比7-8%的双醛淀粉溶液中交联15-20min，得固定化酶；（2）罗伦隐球酵母于YPD培养基，30℃，200r/min，pH7.0培养24h，离心，水洗回收酵母；（3）蔗糖和乳糖1:1质量比配成580-680mmol/L溶液，按1:1.5-2体积比与（1）中的酶混合，pH6-7，25-30℃反应24h，在11-12h时加入1-2%质量比（2）中的酵母，沸水浴终止反应。本发明低聚乳果糖含量54-58%，浓度160-165g/L，乳糖转化率56-58%，可减少产品纯化成本。

Description

一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及低聚乳果糖的生产方法。
技术背景
低聚乳果糖自1990年开发以来，在日本被广泛认可并迅猛发展。2005年调查表明，低聚乳果糖已成为日本第三大功能性低聚糖消费品。近年来许多研究者发现低聚乳果糖具有许多特定的生理功能，有望成为继低聚果糖、低聚半乳糖后又一种被全球认可的功能性食品添加剂。但是由于大部分微生物的β-呋喃果糖苷酶产量较低以及合成过程中的一些技术壁垒，目前只有日本盐水港精糖株式会社能够规模化生产。
低聚乳果糖在国内尚未实现产业化，主要原因是节杆菌发酵产酶水平较低，发酵机制不清楚，β-呋喃果糖苷酶生产成本较高，以及酶促反应合成产率低，低聚乳果糖纯化较为困难等。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提出一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法，通过提高节杆菌产出的β-呋喃果糖苷酶的酶活和底物利用率，以及减少产低聚乳果糖过程中的副产物，来提高低聚乳果糖的浓度和纯度。
本发明是通过以下技术方案实现。
（1）在260-280×103U/L的酶液中加入甘露醇至甘露醇终浓度为1-2mmol/L；然后按混合酶液∶海藻酸钠溶液体积比为1∶1-2的比例与浓度为2.4-2.8g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2-3的体积比滴入到浓度为0.5-0.8mol/L的氯化钙溶液中，固定40-50min，过滤后放入质量百分比为7-8%双醛淀粉溶液中交联，在25-30℃下进行交联15-20min，得到固定化酶。
（2）将罗伦隐球酵母置于YPD培养基经200 r/min、30 ℃、pH7.0培养24 h，然后3000r/min离心10min，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌。
（3）将蔗糖和乳糖按1∶1的质量比，配成580-680 mmol/L溶液，按1:1.5-2的体积比与步骤（1）中的固定化酶混合，在pH6-7，温度25-30℃条件下反应，反应至11-12h时加入1-2%质量比的步骤（2）得到的酵母菌，共反应24 h，沸水浴灭酶20 min终止反应。
本发明步骤（1）所述的酶为β-呋喃果糖苷酶。
本发明步骤（2）得到的酵母菌缺少分解蔗糖的酶。
本发明与不加酵母酶法合成低聚乳果糖相比，低聚乳果糖浓度提高到160-165g/L；乳糖转化率提高了30-33%，提高原料利用率降低生产成本；低聚乳果糖最终含量提高到了54-58%，减少了后续产品纯化成本。同时该方法可以推广到酶法合成低聚糖中副产物以葡萄糖（单糖）为主的反应中使用，如低聚半乳糖、低聚果糖等。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
本发明实施例涉及以下技术内容。
（1）β-呋喃果糖苷酶酶活。
β-呋喃果糖苷酶酶液制备：节杆菌发酵结束后，将培养液以转速4000 r/min离心20 min，将上清液至于-20 °C冷藏；24 h后取出常温解冻，部分未去除的菌体因细胞肿胀而死亡，再以转速4000 r/min转速离心20 min后上清液即为β-呋喃果糖苷酶酶液。
β-呋喃果糖苷酶酶活定义：将2 mL的β-呋喃果糖苷酶酶液和5mL的糖液（含30%的蔗糖与30%的乳糖，pH 7.0）于37 °C反应，一个酶活力单位定义为每分钟产生10-9mol 低聚乳果糖的量来表示。
（2）低聚乳果糖的测定。
低聚乳果糖的测定采用HPLC，HPLC色谱条件：色谱柱：Kromasil氨基柱（250 mm×4.6 mm×5 mm）；流动相：乙腈-水（75:25）；流速：1 mL/min；漂移管温度：70 °C；柱温：30 °C。标准曲线的方程：浓度范围为0.1281~4.1 mg/mL，lnS＝1.018lnC+6.134；相关系数R2＝0.9997。
（3）残糖的测定。
采用蒽酮比色法，取测发酵液离心后上清液1 mL，加入4 mL新配制的蒽酮试剂（2 g/L），混匀后盖塞冰浴，后沸水浴10 min，冷却后在620nm处测吸光值。标准曲线的方程为：y=0.0091X+0.0124；浓度范围为10~100 mg/L，相关系数R2＝0.9996。
实施例1。
a．在260 U/mL的β-呋喃果糖苷酶中加入甘露醇至甘露醇终浓度为1mmol/L；然后按混合酶液∶海藻酸钠溶液体积比为1∶1的比例与浓度为2.5g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2的体积比滴入到浓度为0.5 mol/L的氯化钙溶液中，固定40-50min，过滤后放入质量百分比为8%双醛淀粉溶液中交联，在25-30℃下进行交联15-20min，得到固定化酶。
b．将罗伦隐球酵母置于YPD培养基经200 r/min、30 ℃、pH7.0培养24 h，然后3000r/min离心10min，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌。
c．600 mmol/L的蔗糖和乳糖与a中的固定酶以1:1.5的体积比混合，在pH6-7，温度25-30℃条件下反应，在反应到11.5h时加入1.4%质量比的b中得到的酵母菌，反应24 h后经沸水浴灭酶20 min终止反应。
最终低聚乳果糖含量为158.75 g/L，产率50.67%，乳糖转化率57.52%。加入酵母合成低聚乳果糖最终产物葡萄糖从60.48 g/L下降到1.88 g/L。
实施例2。
a．在280 U/mL的β-呋喃果糖苷酶加入甘露醇至甘露醇终浓度为2mmol/L；然后按混合酶液∶海藻酸钠溶液体积比为1∶1的比例与浓度为2.8g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2的体积比滴入到浓度为0.6 mol/L的氯化钙溶液中，固定40-50min，过滤后放入质量百分比为7%双醛淀粉溶液中交联，在25-30℃下进行交联15-20min，得到固定化酶。
b．将罗伦隐球酵母置于YPD培养基经200 r/min、30 ℃、pH7.0培养24 h，然后3000r/min离心10min，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌。
c．650 mmol/L的蔗糖和乳糖与a中的固定酶以1:1.5的体积比混合，在pH6-7，温度25-30℃条件下反应，在反应到11.5h时加入1.6%质量比的b中得到的酵母菌，反应24 h后经沸水浴灭酶20 min终止反应。
最终低聚乳果糖含量为155.76 g/L，产率50.11%，乳糖转化率55.35%。加入酵母合成低聚乳果糖最终产物葡萄糖从60.48 g/L下降到1.57 g/L。

Claims (1)

1.一种基于酶固定化的酵母发酵生产低聚乳果糖的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）在260-280×103U/L的酶液中加入甘露醇至甘露醇终浓度为1-2mmol/L；然后按混合酶液∶海藻酸钠溶液体积比为1∶1-2的比例与浓度为2.4-2.8g/L的海藻酸钠溶液混合，再按1:2-3的体积比滴入到浓度为0.5-0.8mol/L的氯化钙溶液中，固定40-50min，过滤后放入质量百分比为7-8%双醛淀粉溶液中交联，在25-30℃下进行交联15-20min，得到固定化酶；
（2）将罗伦隐球酵母置于YPD培养基经200 r/min、30 °C、pH7.0培养24 h，然后3000r/min离心10min，并用水洗涤2次，回收得到酵母菌体；
（3）将蔗糖和乳糖按1∶1的质量比，配成580-680 mmol/L溶液，按1∶1.5-2的体积比与步骤（1）中的固定化酶混合，在pH6-7，25-30℃条件下进行反应，在反应至11-12h时加入1-2%质量比的步骤（2）得到的酵母菌体，共反应24 h，经沸水浴灭酶20 min终止反应；
步骤（1）所述的酶为β-呋喃果糖苷酶。
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