CN110592061B - 一种利用固定化α-葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的方法 - Google Patents

一种利用固定化α-葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用固定化α‑葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的方法，属于食品工程技术领域。本发明的具体方法包括：以阴离子树脂Amberlite FPA90 Cl为载体、戊二醛为交联剂，通过先吸附后交联的方法实现α‑葡萄糖苷酶的固定化，之后利用固定化的α‑葡萄糖苷酶转化麦芽糖生产黑曲霉低聚糖。固定化酶的温度稳定性和pH稳定性均有显著提高，连续重复使用4～6批次后，酶活基本保持不变。本发明提高了酶法生产黑曲霉低聚糖酶的利用率，降低了生产成本和产物黑曲霉低聚糖的分离纯化难度，适合大规模的连续化生产，对提高我国生产黑曲霉低聚糖的技术水平具有重大意义。

Description

一种利用固定化α-葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的方法
技术领域
本发明涉及一种利用固定化α-葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的方法，属于食品工程技术领域。
背景技术
黑曲霉低聚糖是一类分子中含有α-1,3糖苷键的新型功能性低聚糖，主要包括黑曲霉糖、黑曲霉糖基葡萄糖和黑曲霉糖基麦芽低聚糖等，天然存在于清酒、酱汁等发酵食品中，有优秀的呈味性，甜度是砂糖的45％，味感醇厚，可抑制糖精等高度甜味剂的异味和后苦味，还可增强低盐食品的碱味，加强盐的呈味性。作为功能性食品配料，黑曲霉低聚糖除了具有促进双歧杆菌增殖、热量低、有效预防龋齿、调节肠道健康、有效改善脂质代谢等生理功能外，还具有免疫激活、改善风味等多种独特的功能。
化学合成和酶法制备是生产黑曲霉低聚糖的主要方法，相对于酶法制备，化学合成法成本高昂、产量少，且反应过程中因有重金属离子的参与难以保证其安全性，难以大量生产。近年来，酶法制备低聚糖的兴起，拓展了工业化生产黑曲霉低聚糖的可能性，其中α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，AGL，EC 3.2.1.20)，可以催化α-葡萄糖苷、α-葡聚糖、麦芽低聚糖等大分子底物水解，释放α-葡萄糖残基，也可通过转糖基作用将葡萄糖残基从底物转移至受体形成相应的糖苷或低聚糖。AGL在自然界中分布广泛，在多种生物体中均有发现，主要来源于细菌、酵母以及霉菌等微生物，但目前发现的大多数α-葡萄糖苷酶主要用于合成分子中含有至少一个α-1,6-糖苷键的低聚异麦芽糖，仅有少数真菌来源的α-葡萄糖苷酶被发现在水解和转糖基反应中。对α-1,3-糖苷键具有高度区域选择性的α-葡萄糖苷酶，可催化麦芽低聚糖、α-葡萄糖苷等底物合成分子中含有α-1,3-糖苷键的黑曲霉低聚糖。
相对于游离酶，固定化酶具有易于从反应溶液分离、可重复使用、生产成本低、过敏性风险低、稳定性高等优势，且对绿色和可持续产品的制造环境具有不可或缺的重要性，被广泛应用于食品工业生产中。寻找经济适用的载体是研究固定化酶技术的重要目标。树脂作为一种多孔性合成高分子材料，机械强度高、性质稳定且成本低廉，作为固定化载体时操作简便，容易再生和回收，因此得到许多研究人员的青睐。离子交换树脂既不溶于酸、碱，同时对乙醇等有机溶剂具有较强的耐受性。由于树脂颗粒具有三维网络状的骨架结构，稳定性良好；通过离解颗粒上的功能基团使其带有电荷，与溶液中带有相反电荷的离子静电结合。单独使用树脂进行酶固定化，酶活回收率十分有限。
因此，提供一种固定化α-葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的方法，对于黑曲霉低聚糖的工业应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种固定化α-葡萄糖苷酶，所述固定化α-葡萄糖苷酶按照如下方法制备：
(1)树脂预处理；
(2)向经过预处理的树脂中加入α-葡萄糖苷酶，进行吸附；
(3)向步骤(2)吸附后的体系，加入戊二醛，静置交联；
(4)将步骤(3)交联后的溶液离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。
在本发明的一种实施方式中，所述吸附是在20～25℃、200～220r/min条件下吸附3～6h。
在本发明的一种实施方式中，所述交联是于3～5℃，静置0.8～1.2h后，加入0～0.08％(V:V)的戊二醛，于3～5℃静置交联1～3h。
在本发明的一种实施方式中，所述树脂为阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl。
在本发明的一种实施方式中，所述树脂的添加量为0.45～0.55g，添加的α-葡萄糖苷酶总酶活为150～300U。
在本发明的一种实施方式中，所述树脂预处理的步骤包括：用2～3倍树脂体积的90～95％乙醇浸泡20～24h，弃杂液，洗去杂质和浮色，直至溶液pH为6.5～7.5；以0.8～1.2mol/L NaOH浸泡树脂4～6h，洗涤，直至溶液pH为6.5～7.5；再以0.8～1.2mol/L HCl浸泡树脂4～6h，洗涤，直至溶液pH为6.5～7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述α-葡萄糖苷酶的制备方法包括：
(1)将重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris，P.pastoris)GS115/pPIC9K-agl接种至5～10mL YPD液体培养基，于28～32℃、150～200r/min条件下培养8～14h；之后以6～12％(V:V)的接种量将上述菌液转移至30～60mL BMGY培养基中，于28～32℃、150～200r/min条件下培养18～24h；离心收集上述菌体，在无菌条件下将其全部转接入25～50mL BMMY培养基中，28～32℃、150～200r/min条件下培养120～132h，该过程中每20～24h补加0.5～1.5％(V:V)的甲醇；
(2)收集发酵液，3～5℃、6000～8000r/min离心5～15min收集上清，向上清中缓慢加入60～75％(W:V)的硫酸铵粉末，3～5℃静置8～14h；离心收集沉淀并复溶于pH 5.0～7.0的磷酸盐缓冲液中，透析过夜；用0.45μm的滤膜过滤，即可得到α-葡萄糖苷酶粗酶液；
(3)将α-葡萄糖苷酶粗酶液经真空冷冻干燥制成粗酶粉。
本发明的第二个目的是提供上述固定化α-葡萄糖苷酶的方法在生产黑曲霉低聚糖中的应用，所述应用是以固定化α-葡萄糖苷酶为催化剂，以麦芽糖为底物，制备黑曲霉低聚糖。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糖的浓度为200～400g/L，固定化α-葡萄糖苷酶的添加量为5～20U/g麦芽糖，反应条件为55～75℃条件下反应20～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述固定化酶制备黑曲霉低聚糖的具体步骤包括：
(1)将以pH 7.0～8.5、45～55mmol/L磷酸盐缓冲液配制的200～400g/L的麦芽糖底物溶液加入反应柱，按照5～20U/g麦芽糖的比例加入固定化酶，于55～75℃条件下反应20～48h，移出反应液；
(2)测定反应液移出后反应柱中固定化α-葡萄糖苷酶的酶活，继续加入麦芽糖底物溶液于柱中进行反应。
本发明的第三个目的是提供制备上述固定化α-葡萄糖苷酶的方法在食品领域的应用。
本发明的第四个目的是提供上述固定化α-葡萄糖苷酶在食品领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明中通过吸附-交联法制备的固定化α-葡萄糖苷酶回收率达65～75％；固定化酶对麦芽糖的转化率达25～35％；固定化酶连续重复使用4～6批次，酶活基本保持不变，连续重复使用7～8批次，仍能保持80～85％的酶活，显著提高了酶的重复利用率，有效降低了成本；固定化酶对温度和pH的耐受力较游离酶明显提高：游离酶耐受pH 3.8～9.5，耐受温度35～70℃，固定化酶耐受pH 3.5～10.5，耐受温度25～80℃；转化反应可连续进行，适合于大规模生产；降低了产物分离难度。
具体实施方式
(一)α-葡萄糖苷酶的酶活测定：
游离α-葡萄糖苷酶的测定：0.9mL的100g/L麦芽糖溶液与0.1mL的粗酶液在50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲液体系中充分混匀，55℃水浴中保温10min后，立即转移至沸水浴10min终止反应。
固定化α-葡萄糖苷酶的测定：取0.5g固定化酶，加入0.1mL的50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲液和0.9mL 100g/L麦芽糖溶液充分混匀，55℃水浴中保温10min后，立即转移至沸水浴10min终止反应。
酶活定义：在上述反应条件下，每分钟生成1μmol的黑曲霉糖基葡萄糖所需酶量为一个酶活单位(1U)。
(二)HPLC法测定糖组分及含量：
HPLC条件：Waters e2695型高效液相色谱仪，色谱柱Asahipak NH2P-50 4E(4.6mm×250mm)，示差折光检测器，流动相乙腈：水＝75:25(v/v)，流速1mL/min，柱温30℃，进样量10μL。
(三)重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-agl的构建方法
人工合成α-葡萄糖苷酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，利用酶切连接方法将其与pPIC9K连接，获得重组质粒pPIC9K-agl，将重组质粒转入P.pastoris GS115中，获得重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-agl。
(四)培养基
YPD培养基：1％(w/v)酵母膏，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖。
BMGY培养基：1％(w/v)酵母膏，2％(w/v)蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％(w/v)YNB培养基，4×10-5％生物素，1％(w/v)甘油。
BMMY培养基：1％(w/v)酵母膏，2％(w/v)蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％(w/v)YNB培养基，4×10-5％生物素，3％(w/v)甘油。
实施例1：吸附-交联法固定α-葡萄糖苷酶的工艺
(1)α-葡萄糖苷酶的制备：重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-agl接种至5mL YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养。以10％(V:V)的接种量将上述菌液转移至50mLBMGY培养基中，于30℃、200r/min培养24h；离心收集上述菌体，在无菌条件下将其全部转接入25mL BMMY培养基中，30℃、200r/min培养96h，该过程中每24h补加0.5％(V:V)的甲醇。收集发酵液，冷冻离心后收集上清，向上清中缓慢加入70％(W:V)的硫酸铵粉末，4℃静置过夜，离心收集沉淀并复溶于Na2HPO4～NaH2PO4缓冲液中，透析过夜。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液经真空冷冻干燥制成粗酶粉。配制酶液，测得初始α-葡萄糖苷酶的酶活为126.1U/mL。
(2)阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl的预处理：用2倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；以1mol/L NaOH浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；再以1mol/L HCl浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。预处理的树脂用2倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用。
(3)吸附-交联法固定化α-葡萄糖苷酶的工艺：称取0.5g树脂，加入1mL以pH 5.5～7.5、50mmol/L磷酸盐缓冲溶液缓冲液配制的α-葡萄糖苷酶酶液，总酶活为126U，于20～25℃、200r/min条件下吸附3～6h。上述体系于4℃冰箱静置1h，加入0.02～0.08％(V:V)的戊二醛，于4℃静置交联1～3h。离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。测得固定化酶的酶活为191.21U/g树脂。
实施例2：固定化α-葡萄糖苷酶的操作稳定性
称取0.5g固定化酶，加入0.1mL缓冲液和0.9mL的100g/L的麦芽糖溶液，55℃下反应10min，将固定化酶滤出，用缓冲溶液冲洗固定化酶三次，然后用于下一批反应，重复8次，比较酶活力的变化。8次酶活分别为191.22U/g树脂、191.20U/g树脂、191.20U/g树脂、191.19U/g树脂、191.01U/g树脂、190.99U/g树脂、190.33U/g树脂、190.78U/g树脂。
实施例3：固定化α-葡萄糖苷酶对温度的耐受性
(1)45℃条件下固定化α-葡萄糖苷酶的酶活测定
取0.5g固定化酶，加入0.1mL的50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲液和0.9mL 100g/L麦芽糖溶液充分混匀，45℃水浴中保温10min后，立即转移至沸水浴10min终止反应。测得酶活为190.97U/g树脂。
(2)65℃条件下固定化α-葡萄糖苷酶的酶活测定
取0.5g固定化酶，加入0.1mL的50mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲液和0.9mL 100g/L麦芽糖溶液充分混匀，65℃水浴中保温10min后，立即转移至沸水浴10min终止反应。测得酶活为190.58U/g树脂。
实施例4：固定化α-葡萄糖苷酶对pH值的耐受性
(1)pH 4条件下固定化α-葡萄糖苷酶的酶活测定
取0.5g固定化酶，加入0.1mL的50mmol/L、pH 4.0磷酸缓冲液和0.9mL 100g/L麦芽糖溶液充分混匀，55℃水浴中保温10min后，立即转移至沸水浴10min终止反应。测得酶活为190.54U/g树脂。
(2)pH 10条件下固定化α-葡萄糖苷酶的酶活测定
取0.5g固定化酶，加入0.1mL的50mmol/L、pH 4.0磷酸缓冲液和0.9mL 100g/L麦芽糖溶液充分混匀，55℃水浴中保温10min后，立即转移至沸水浴10min终止反应。测得酶活为80.74U/g树脂。
对比例1：以其他树脂为载体固定化α-葡萄糖苷酶
(1)α-葡萄糖苷酶的制备：重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-agl接种至5mL YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养。以10％(V:V)的接种量将上述菌液转移至50mLBMGY培养基中，于30℃、200r/min培养24h；离心收集上述菌体，在无菌条件下将其全部转接入25mL BMMY培养基中，30℃、200r/min培养96h，该过程中每24h补加0.5％(V:V)的甲醇。收集发酵液，冷冻离心后收集上清，向上清中缓慢加入70％(W:V)的硫酸铵粉末，4℃静置过夜，离心收集沉淀并复溶于Na2HPO4～NaH2PO4缓冲液中，透析过夜。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液经真空冷冻干燥制成粗酶粉。配制酶液，测得初始α-葡萄糖苷酶的酶活为126.1U/mL。
(2)树脂的预处理：用2倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；以1mol/L NaOH浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；再以1mol/L HCl浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。预处理的树脂用2倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用。
(3)吸附-交联法固定化α-葡萄糖苷酶的工艺：称取树脂Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD1600N、Duolite A568、Dowex MR-3、Dowex MSA-2、D309、D318、D301-F、D315各0.5g，分别加入1mL以pH 7.0～8.5、50mmol/L磷酸盐缓冲溶液缓冲液配制的α-葡萄糖苷酶酶液，使总酶活为126U，于20～25℃、200r/min条件下吸附3～6h。上述体系于4℃冰箱静置1h，加入0～0.08％(V:V)的戊二醛，于4℃静置交联1～3h。离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。
采用树脂Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD1600N、Duolite A568、Dowex MR-3、Dowex MSA-2、D309、D318、D301-F、D315进行固定化后，测得固定化酶酶活分别为111.17U/g树脂、112.01U/g树脂、19.98U/g树脂、16.58U/g树脂、113.08U/g树脂、0U/g树脂、14.3U/g树脂、16.70U/g树脂、14.45U/g树脂。
实施例5：其他条件与实施例1一致，改变固定化α-葡萄糖苷酶的添加量
(1)α-葡萄糖苷酶的制备：重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-agl接种至5mL YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养。以10％(V:V)的接种量将上述菌液转移至50mLBMGY培养基中，于30℃、200r/min培养24h；离心收集上述菌体，在无菌条件下将其全部转接入25mL BMMY培养基中，30℃、200r/min培养96h，该过程中每24h补加0.5％(V:V)的甲醇。收集发酵液，冷冻离心后收集上清，向上清中缓慢加入70％(W:V)的硫酸铵粉末，4℃静置过夜，离心收集沉淀并复溶于Na2HPO4～NaH2PO4缓冲液中，透析过夜。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液经真空冷冻干燥制成粗酶粉。
(2)阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl的制备：用2倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；以1mol/L NaOH浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；再以1mol/L HCl浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。预处理的树脂用2倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用。
(3)吸附-交联法固定化α-葡萄糖苷酶的工艺：称取0.5g树脂，加入1mL以pH 5.5～7.5、50mmol/L磷酸盐缓冲溶液缓冲液配制的α-葡萄糖苷酶酶液，控制总酶活分别为52、104、156、204、261U，于20～25℃、200r/min条件下吸附3～6h。上述体系于4℃冰箱静置1h，加入0.02～0.08％(V:V)的戊二醛，于4℃静置交联1～3h。离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。
当α-葡萄糖苷酶酶液总酶活分别为52、104、156、204、261U时，测得固定化酶的酶活分别为99.12U/g树脂、197.70U/g树脂、235.32U/g树脂、244.38U/g树脂、243.95U/g树脂。
实施例6：其他条件与实施例1一致，改变pH
(1)α-葡萄糖苷酶的制备：重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-agl接种至5mL YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养。以10％(V:V)的接种量将上述菌液转移至50mLBMGY培养基中，于30℃、200r/min培养24h；离心收集上述菌体，在无菌条件下将其全部转接入25mL BMMY培养基中，30℃、200r/min培养96h，该过程中每24h补加0.5％(V:V)的甲醇。收集发酵液，冷冻离心后收集上清，向上清中缓慢加入70％(W:V)的硫酸铵粉末，4℃静置过夜，离心收集沉淀并复溶于Na2HPO4～NaH2PO4缓冲液中，透析过夜。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液经真空冷冻干燥制成粗酶粉。配制酶液，测得初始α-葡萄糖苷酶的酶活为126.1U/mL。
(2)阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl的制备：用2倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；以1mol/L NaOH浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；再以1mol/L HCl浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。预处理的树脂用2倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用。
(3)吸附-交联法固定化α-葡萄糖苷酶的工艺：称取0.5g树脂，分别加入1mL分别以50mmol/L，pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的磷酸盐缓冲液和50mmol/L，pH 8.5、9.0的Tris-HCl缓冲液配制的α-葡萄糖苷酶酶液，总酶活为126U，于20～25℃、200r/min条件下吸附3～6h。上述体系于4℃冰箱静置1h，加入0.02～0.08％(V:V)的戊二醛，于4℃静置交联1～3h。离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。
pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5时，测得固定化酶的酶活分别为206.96U/g树脂、197.00U/g树脂、197.02U/g树脂、209.48U/g树脂、211.80U/g树脂、212.71U/g树脂、213.50U/g树脂。
实施例7：其他条件与实施例1一致，改变戊二醛的浓度
(1)α-葡萄糖苷酶的制备：重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-agl接种至5mL YPD液体培养基，于30℃、200r/min过夜培养。以10％(V:V)的接种量将上述菌液转移至50mLBMGY培养基中，于30℃、200r/min培养24h；离心收集上述菌体，在无菌条件下将其全部转接入50mL BMMY培养基中，30℃、200r/min培养96h，该过程中每24h补加0.5％(V:V)的甲醇。收集发酵液，冷冻离心后收集上清，向上清中缓慢加入70％(W:V)的硫酸铵粉末，4℃静置过夜，离心收集沉淀并复溶于Na2HPO4～NaH2PO4缓冲液中，透析过夜。用0.45μm的滤膜过滤，将粗酶液经真空冷冻干燥制成粗酶粉。配制酶液，测得初始α-葡萄糖苷酶的酶活为126.1U/mL。
(2)阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl的制备：用2倍树脂体积的95％乙醇浸泡20h，弃杂液，用去离子水洗去杂质和浮色，直至溶液pH呈中性；以1mol/L NaOH浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性；再以1mol/L HCl浸泡树脂4h，用去离子水洗涤，直至溶液pH呈中性。预处理的树脂用2倍树脂体积的去离子水浸泡，存放于4℃冰箱中备用。
(3)取0.5g树脂，加入1mL以pH 5.5～7.5、50mmol/L磷酸盐缓冲溶液缓冲液配制的α-葡萄糖苷酶酶液，总酶活为126U，于20～25℃、200r/min条件下吸附3～6h。上述体系于4℃冰箱静置1h，分别加入0、0.01％、0.02％、0.04％、0.08％、0.10％、0.20％、0.40％(V:V)的戊二醛，于4℃静置交联1～3h。离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶。
加入0、0.01％、0.02％、0.04％、0.08％、0.10％、0.20％、0.40％(V:V)的戊二醛时，测得固定化酶的酶活分别为217.64U/g树脂、218.10U/g树脂、218.49U/g树脂、218.72U/g树脂、218.68U/g树脂、218.36U/g树脂、117.49U/g树脂、96.40U/g树脂。
结果表明，添加戊二醛，在后期使用过程中，固定化酶的性质更加稳定。
实施例8：固定化α-葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的工艺
将以pH 5.5、50mmol/L磷酸盐缓冲液配制的200～400g/L的麦芽糖底物溶液加入反应柱，按照～20U/g麦芽糖的比例加入固定化酶，于55℃条件下反应20h，过滤将固定化酶与反应液分离。测得反应前后反应液中黑曲霉低聚糖的转化率为32.13％，比游离酶的转化率22.14％提高了31％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用固定化α-葡萄糖苷酶制备黑曲霉低聚糖的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2783
<212> DNA
<213> Acremonium sp.
<400> 1
gaattcatgg ctttgtgggg ggcctccgtc ctcgccttcg cggtatcatc ggtatctgcg 60
actgtcattc cgaggaacag tattagtgct cgcgatgtct cgtcttgccc aggatatgca 120
gcctcgaacg tccaggtctc cgataccgga ttgacggctg atctcactct tgccggcgag 180
ccatgtgatg cttacggtga agacttgaaa gacctgattc ttgaggtgac atacgagaca 240
gagaaccgct tgcatgtcaa gatacaggac aaggggaacc aagtctacca aatcccggaa 300
tcagttttcc cccgaccagg aggcagcata gacccggaat ccagcagcat ccgctttgcc 360
tacgccgaag aacctttcag cttcaacatc acccgcgctg acacagacga agtcttgttc 420
gacacctctg cggcttccat tgtgttcgaa tcgcaatacc tgcggcttcg tacctcgatt 480
cccaccgacc cataccttta cggcctgggt gcgcacaatg atcctatgag actcgagtct 540
gtgggttaca tccgcacatt ctggaaccag gatagttacg gtgttccaaa tggggcgaat 600
ttgtatggca gccatccagt gtatatcgat catcgggaga caggaacaca tggtgtcttg 660
ttcctgaact cgaatggtat ggatgtcttg attgacgagg acgaggaggg cggcaagtac 720
cttgagtaca atactttggg aggtgtcctt gacttctact tcttcgttgg agactcaccg 780
tcaaaggcag tagaggagta tggggagatt gctggtcggc cgccaatgca accctactgg 840
ggccttggtt tccaccagtg caagtatggc taccaagatg cattcatggt tgccgaggtt 900
gtgtacaact acagccaggc cgagatcccc ctggaagtca tgtggacaga catcgactac 960
atggaccgcc gccgcgtctt caccgtcgac ccagatcgtt tccctctccc caagatccgc 1020
gccgtcgtcg actatctgca cgaacatgac cagcggtaca tcgtcatggt cgacccggct 1080
atcgcatacg tcgagtcggg aacactcgat cgaggtctcg atgacgacgt cttcctgttg 1140
cggtccaatg gatctgtatg gctaggcgtt gtctggcccg gtgtcacagt gttcccggac 1200
tggttcgcag agaacatcac tcagtactgg aacaacgagt tcgcactctt cttcgatgcg 1260
gatgaagggg tggacattga tggcttgtgg atcgacatga acgagccgag taacttccct 1320
tgcaacttcc cgtgtgataa tccatatgaa gcggcaaagg gttttccgcc gacaccaccg 1380
cctgtgaggg agcctccgag ggagttacct gggttcgcct gtgtattaca gcctgagggg 1440
acggagtgcg aagacggaga aactgctggg tcatcgaagc gagacgggtc ttttggacaa 1500
ccaggtctag tcactcgaca acccggattc tctcgcccaa ggcacccttt ccaccgtcgc 1560
caggagtatg aaggtgatca aaaaggtctc cccggccgag acctgcttta cccagagtac 1620
gccatacaca acaaagcagc gttccgagat gactggaacg cagacaaagg cggcatctcc 1680
aacaaaaccg tcaacaccaa cgtgattcac caaaacggcc tcgccgaata cgacgtccac 1740
aacctctatg gcgccatgat gtccagcgcc tcccgcgacg ccatggaagc tcgtcgcccc 1800
ggtctccgcc ccttcatcat cacccgcagc acctttcccc acgcaggctc caaagtcgga 1860
ctctggctcg gcgacaatct ctccaactgg aaccaatacc gcgaatccat ccgtactatg 1920
ctcgcctaca cttccatctt ccaattcggc atggtcggct ctgacgtctg tgggtttgga 1980
ggtgatacaa atgaggagct gtgtgcacga tgggcgagtc tcggtgcgtt ccagactttc 2040
ttcaggaacc atgcgcagta tgaggcggta ccgcaggagt tttatcagtg ggagagtgtg 2100
gcggagagtg cgaggagggc tattggagcg agatatcggt tgttggatta catgtacacg 2160
gcgctttgga agcagagtga acaagggacg ccggcggttg tcccaatgtt ctacgtgttc 2220
ccggaagata aggggacttt ggagttggag aatcagtact tctatggtcc tggggtgttg 2280
gttgcaccgg tggttgaaca gggttcgacg agcgttgacg tgtatcttcc ggaggggaag 2340
gtcttctatg actggtggac gcacgaggct attcagggtg aaggagggag ttattcggtt 2400
acgggggtga acactacgat gatccctctg ttcatcagag gcggtgtgat cctaccactg 2460
agggagaact cggcaatgac aacaacagag ctgaggaagg agaagtttga gctcttggtc 2520
gccttggata acgatggaaa ggcaaagggg gagctgtaca tcgacgatgg ggagtctttg 2580
gagcaggaga gctatacggc tgtgaagttt gagtatgcgc atggggtggt gacgctagat 2640
ggggagttta gtgaggactg gccagttgaa gtagccagcg tggtcttgct gagacccaag 2700
ggcaaggaaa ttgtggtgga ggtcgggaag tctttcacag cgggagggag gataaaatta 2760
aagggtaggc actaggcggc cgc 2783

Claims (5)

1.一种固定化α-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述固定化α-葡萄糖苷酶按照如下方法制备：
（1）树脂预处理；
（2）向经过预处理的树脂中加入α-葡萄糖苷酶，进行吸附；
（3）向步骤（2）吸附后的体系，加入戊二醛，进行交联；
（4）将步骤（3）交联后的溶液离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶；
所述树脂为阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl；所述缓冲液为pH为7.0~8.5、浓度为45~55 mmol/L的磷酸盐缓冲液；所述戊二醛以体积比为0.01~0.08%的量加入；
所述树脂的添加量为0.5 g，添加的α-葡萄糖苷酶总酶活为52~156 U；
所述吸附是在20~25℃、200~220 r/min条件下吸附3~6 h；
所述交联是于3~5℃静置交联1~3 h。
2.如权利要求1所述的固定化α-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述树脂预处理的步骤包括：用2~3倍树脂体积的90~95%乙醇浸泡20~24 h，弃杂液，洗去杂质和浮色，直至溶液pH为6.5~7.5；以0.8~1.2 mol/L NaOH浸泡树脂4~6 h，洗涤，直至溶液pH为6.5~7.5；再以0.8~1.2 mol/L HCl浸泡树脂4~6 h，洗涤，直至溶液pH为6.5~7.5。
3.权利要求1或2所述的固定化α-葡萄糖苷酶在生产黑曲霉低聚糖中的应用，其特征在于，以固定化α-葡萄糖苷酶为催化剂，以麦芽糖为底物，制备黑曲霉低聚糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述麦芽糖的浓度为200~400 g/L，固定化α-葡萄糖苷酶的添加量为5~20 U/g麦芽糖，反应条件为55~75℃条件下反应20~48 h。
5.制备权利要求1所述固定化酶的方法，其特征在于，所述方法为：（1）树脂预处理；
（2）向经过预处理的树脂中加入α-葡萄糖苷酶，进行吸附；
（3）向步骤（2）吸附后的体系，加入戊二醛，进行交联；
（4）将步骤（3）交联后的溶液离心弃上清，用缓冲液反复洗涤，直至洗涤液中检测不到酶活，即得到固定化酶；
所述树脂为阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl；所述缓冲液为pH为7.0~8.5、浓度为45~55 mmol/L的磷酸盐缓冲液；所述戊二醛以体积比为0.01~0.08%的量加入；
所述树脂的添加量为0.5 g，添加的α-葡萄糖苷酶总酶活为52~156 U；
所述吸附是在20~25℃、200~220 r/min条件下吸附3~6 h；
所述交联是于3~5℃静置交联1~3 h。
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