CN104046609A - 一种高效固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效固定化脂肪酶的制备方法，属于酶化学技术领域。本发明所公开的方法是分别用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶和经预处理的大孔吸附树脂，再将脂肪酶溶液加入到大孔吸附树脂溶液中震荡均匀后，进行吸附处理，吸附后再加入戊二醛溶液进行固定处理，固定后经真空抽滤、洗涤和干燥后得到固定化脂肪酶。利用本发明的方法所制备的固定化酶，具有高酸解活性、1，3-位专一性和稳定性的特点，其酸解活性是游离酶的2.88倍，且专一性仅损失1.7％，同时在热稳定性、贮存稳定性、操作稳定性和pH耐受范围方面也有显著提高。本发明公开的方法具有工艺简单，制备周期短，产品催化效率高，专一性和稳定性强的特点，适用于产业化推广。

Description

一种高效固定化脂肪酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种高效固定化脂肪酶的制备方法，属于酶化学技术领域。

技术背景

脂肪酶是一种生物催化剂，与化学催化试剂相比具有反应速度快、反应效率高、反应条件温和、底物专一性强以及可在中性pH条件下操作等优点，同时脂肪酶本身也是一种蛋白质，可以被微生物生物降解，符合绿色化学的要求，其已在食品、医药、轻工和农业等许多领域得到应用，尤其在食品加工中的应用越来越广泛。其中更以具有位置特异性的脂肪酶为代表，这类脂肪酶对于三酰甘油特定位置的脂肪酸优先水解，主要作用于三酰甘油的1位和3位，因此也被称为sn1,3位专一性脂肪酶，因其独特的性质被广泛应用于合成结构油脂，如合成低热量油脂、母乳脂肪替代品及新型脂质衍生物等。

虽然在合成结构油脂方面sn1,3脂肪酶具有反应高效，合成率高等优点，但脂肪酶的价格昂贵，在反应过程中也比较不稳定，而且很难回收重复再利用，种种缺陷使其在大规模应用上受到限制，因此目前用于工业生产结构油脂产品的主要还是化学方法。而酶的固定化就是为了克服以上限制，使酶能像化学催化剂一样在反应过程中稳定操作，且利于回收和反复使用而发展起来的一项技术。通过固定化可以改善酶的某些性质，如热稳定性和操作稳定性等，使其达到重复使用的目的，在一定程度上降低成本，推动了其在工业上的大规模应用。许多国内外学者采用吸附、交联、包埋及共价结合等固定化方法来提高脂肪酶的活性及稳定性，而吸附法是最常用的一种固定化方法。

目前，大多研究都是关于固定化提高脂肪酶的水解活性和酯交换活性，关于提高脂肪酶酸解活性的研究鲜见报道。酸解活性是指脂肪酶催化甘油三酯与脂肪酸之间发生酰基转移，从而改变甘油三酯结构组成的活性。脂肪酶酸解活性的提高在甘油三酯与脂肪酸作用合成结构油脂的研究中具有积极的意义。但是，在现有技术中一般的固定过程会对脂肪酶的高效性和专一性造成负面影响。对于1,3位专一性脂肪酶来说，固定化常常会使其专一性发生改变，从而失去在结构油脂合成方面的优越性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高效固定化脂肪酶的制备方法，所采取的技术方案如下：

一种高效固定化脂肪酶的制备方法，是分别用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶和经预处理的大孔吸附树脂，再将脂肪酶溶液加入到大孔吸附树脂溶液中震荡均匀后，进行吸附处理，吸附后再加入戊二醛溶液进行固定处理，固定后经真空抽滤、洗涤和干燥后得到固定化脂肪酶。

所述方法的步骤如下：

1)大孔吸附树脂的预处理：将大孔吸附树脂加入到乙醇溶液中胀润，用去离子水洗涤后，再用分别用酸和碱交替处理树脂，蒸馏水冲洗至中性后，干燥，获得预处理大孔吸附树脂；

2)磷酸盐缓冲溶液的溶解：用磷酸盐缓冲溶液浸泡步骤1)所得预处理大孔吸附树脂，再用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶，获得脂肪酶溶液；

3)吸附处理：将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到经预处理的大孔吸附树脂磷酸盐溶液中，震荡混合后吸附处理，获得吸附树脂脂肪酶溶液；

4)交联处理：向步骤3)所得吸附树脂脂肪酶溶液中加入戊二醛溶液进行固定化处理，处理完后进行真空抽滤，用去离子水洗涤后干燥，得到固定化脂肪酶。

所述方法的步骤1)中所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸附树脂；所述乙醇溶液浓度为90-95％，胀润时间为23-25h；所述用酸和碱交替处理是用4-5％的盐酸和1-2％的氢氧化钠溶液每处理4h交替；所述干燥，温度为37-40℃，时间为12-15h。

所述方法的步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液pH为6.7-7.0，浓度为0.05M；所述脂肪酶的添加量为34-35mg/100mg载体。

所述方法的步骤3)中所述吸附处理，吸附温度为40-45℃，吸附时间为4-4.5h，在吸附处理过程中每隔5-10min进行震荡混匀。

所述方法的步骤4)中所述戊二醛溶液浓度为0.25-0.75％；所述固定化处理，固定时间为2-3h；所述干燥，干燥温度为37-40℃，干燥时间12-15h。

所述方法的具体步骤如下：

1)称取500mg的NKA-9树脂，加入95％乙醇溶液浸泡胀润24h，用去离子水洗涤去除杂质，再分别用5％盐酸和2％氢氧化钠溶液处理NKA-9树脂，每处理4h交替，交替处理1次，再用蒸馏水冲洗至中性后，于37℃干燥15h，获得预处理NKA-9树脂；

2)取100mg步骤1)所得的预处理NKA-9树脂，用pH6.5 0.05M的磷酸盐缓冲溶液溶解，再取34.6mg脂肪酶用pH6.5 0.05M的磷酸盐缓冲溶液溶解，获得脂肪酶溶液；

3)将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到预处理NKA-9树脂磷酸盐溶液中，震荡混合均匀后，在45℃恒温水浴中吸附处理4.1h，处理期间每隔10min进行震荡混匀，吸附处理后获得吸附树脂溶液；

4)向步骤3)所得吸附树脂溶液中加入0.5％的戊二醛溶液3ml，交联固定2.5h，真空抽滤后用去离子水洗涤，37℃干燥15h得到固定化脂肪酶。

本发明采用NKA-9大孔吸附树脂为载体对脂肪酶进行固定化。该树脂具有选择性好，吸附容量大，机械强度高，再生处理方便，吸附速度快及解析容易等优点。本发明以NKA-9树脂和戊二醛对脂肪酶进行吸附-交联固定化，一方面可以通过树脂的孔隙吸附脂肪酶，另一方面，利用戊二醛交联可以使酶分子与载体分子间实现多点交联，从而提高其反应稳定性。与吸附法相比，吸附-交联固定化制备的固定化酶的稳定性更好；与交联法相比，吸附-交联固定化得到的固定化酶的活性更高。

本发明以米根霉脂肪酶的酸解活性为评价指标，对固定化工艺进行优化，不仅提高了脂肪酶在催化反应中的稳定性和重复利用性，而且还提高了脂肪酶的酸解活性。目前关于固定化提高脂肪酶酸解活性的研究鲜有报道，普遍的固定化研究中是致力于提高脂肪酶的水解活性和酯化活性，不适合应用于结构油脂的合成方面。本发明米根霉脂肪酶的酸解活性及稳定性的提高为结构油脂合成方面的大规模应用提供了技术参考，在获得高纯度及高产率结构油脂产物方面起到积极促进的作用。

本发明的有益效果：

首先，本发明显著的提高了米根霉脂肪酶的酸解活性。发明人通过单因素实验和响应面优化，确定了米根霉脂肪酶固定化的最佳工艺参数。在最佳工艺参数条件下，固定化酶最佳酸解活性为31.78％，而未进行固定化的游离酶在相同条件下的酸解活性只有11.02％。

其次，本发明在提高脂肪酶酸解活性的同时有效地保护了脂肪酶的专一性。利用本发明提供方法制备的固定化米根霉脂肪酶的1,3位专一性几乎没有损失。通过对固定化米根霉脂肪酶酶解产物的气相分析，固定化米根霉脂肪酶的专一性能够达到原始游离米根霉脂肪酶的98.3％，表现出良好的1,3-位专一性。

此外，通过固定化技术，本发明提高了米根霉脂肪酶的反应稳定性。通过对制备的产品固定酶稳定性的测定。利用本发明所提供方法制备的固定化脂肪酶具有良好的热稳定性、贮存稳定性、操作稳定性和更宽的pH耐受范围。具体为：当温度升高至70℃时，固定化酶仍能保持31.8％的相对活性，而此时游离酶已失活；固定化酶在贮存15d后，活性损失仅为26.5％，而游离酶的活性损失高达86.5％；固定化酶在经过6次重复利用后仍能保持50.8％的相对活性；固定化酶对的pH耐受范围为pH4-9，而游离酶的pH范围只有pH5-8。

附图说明

图1为给酶量和吸附时间对固定化脂肪酶酸解活性的影响；

(A，给酶量；B，吸附时间)。

图2为给酶量和pH对固定化脂肪酶酸解活性的影响；

(A，给酶量；C，pH)。

图3为吸附时间和pH对固定化脂肪酶酸解活性的影响；

(B，吸附时间；C，pH)。

图4为温度对固定化酶及游离酶活性的影响。

图5为pH对固定化酶及游离酶活性的影响。

图6为贮存时间对固定化酶及游离酶活性影响。

图7为催化反应次数对固定化酶活性的影响。

具体实施方式

本发明采用吸附-交联法固定化米根霉脂肪酶，先进行吸附固定再进行交联固定，较传统的吸附交联固定中的吸附交联同时进行方法相比，缩短了交联剂对脂肪酶的作用时间，减少了交联剂对sn1,3位专一性的影响，同时又提高了米根霉脂肪酶酸解活性和稳定性。下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1脂肪酶固定化工艺的主要影响因素分析

在单因素实验的基础上，确定了影响脂肪酶固定化工艺五个因素的最佳值是给酶量35mg/100mg载体，pH为7，吸附时间4h，交联剂浓度0.5％，交联时间2.5h，采用Plackett-Burman设计来确定对固定化脂肪酶性质影响的主次因素，以每个因素的活性最高点为中心点，并以此5个因素为自变量，以-1,0,+1分别代表自变量的高、中、低3个水平，以固定化脂肪酶的酸解活性为指标。每个因素取其中心点两侧的两个值，下表为水平编码表。

表1主要影响因素水平编码表

根据Plackett-Burman设计原理，设计了8个试验点的主要影响因素实验，具体实验方案及结果见表2。并采用spss软件分析确定脂肪酶固定化工艺的主要影响因素，根据得到的方差分析表中的Prob>F(a)数值来判断影响因素的主次，其中Prob>F(a)值小于0.05为影响显著，分析结果见表3。

表2主要影响因素实验结果

表3主要影响因素实验方差分析

从以上实验结果可以看出，本实验选用的模型显著(P＜0.05)，相关系数R²为0.994，相关性好，表明可以用该模型描述响应值之间的关系可以用此模型来表示。P值与影响显著性相关，P值越小，影响越显著，则从表1中可以看出，五个因素对脂肪酶固定工艺影响的主次顺序是吸附时间＞pH>给酶量>交联时间>交联剂浓度，其中给酶量、吸附时间及pH为影响显著项(P＜0.05)。因此确定的脂肪酶固定化工艺的主要影响因素为给酶量、吸附时间和pH。实施例2脂肪酶固定化工艺参数确定及响应面分析

通过主要影响因素实验，确定给酶量、pH及吸附时间为主要影响因素，以此3因素为自变量，并以-1，0，+1分别代表自变量的高、中、低3个水平，以米根霉脂肪酶酸解活性为响应值，采用三因素三水平的响应面实验，水平编码如下。

表4响应面分析实验因素水平编码表

根据Box-Behnken试验设计原理，设计了15个试验点的响应面分析试验，其中12个析因点，3个零点，具体实验方案及结果见表5。并通过Design-Expert软件进行统计分析，最终确定脂肪酶固定化的最佳工艺参数。脂肪酶固定化工艺的最佳条件为：给酶量34.6mg/100mg载体、pH为6.8、吸附固定时间为4.1h，此时模型预测的固定化脂肪酶酸解活性为31.80％。图1-3为具体的响应曲面图，其中A为给酶量/mg，B为吸附时间/h，C为pH。

表5响应面分析设计及结果

图1为给酶量和吸附时间对固定化酶活性影响的曲面图，可知给酶量(A)与吸附时间(B)的交互作用对固定化酶活性的影响显著(P＜0.05)。当pH不变，随着给酶量的增加，固定化酶活性呈相应增加的趋势，表明提高给酶量有利于固定化酶活性的增加，当给酶量在35mg附近时，固定化酶的活性达到最大。

图2为给酶量和pH对固定化酶活性影响的曲面图，给酶量(A)和pH(C)间的交互作用对固定化酶活性的影响不显著(P＞0.05)。当吸附时间不变时，随着pH的增加，固定化酶活性呈增加趋势，在6-7范围内达到最大值。表明中性偏酸性的pH更有利于固定化酶活性的提高。

图3为吸附时间和pH对固定化酶活性影响的曲面图，可知吸附时间(B)和pH(C)间的交互作用对固定化酶活性的影响显著(P＜0.05)。当给酶量不变时，随着吸附时间的增加，固定化酶活性呈上升的趋势，在4h附近达到最大值。吸附时间对固定化酶活性的影响明显强于其他两因素。

实施例3固定化酶稳定性评价

本实施例主要对固定化酶及游离酶的热稳定性、pH稳定性、贮存稳定性及固定化酶的操作稳定性进行了测定，测定方法如下：

热稳定性测定：将游离酶和固定化酶分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃温度下保温1h后，进行酶活性测定，比较酶酸解活性的变化，以最优温度下的酸解活性为100％。

pH稳定性测定：将游离酶与固定化酶分别置于pH为4、5、6、7、8、9的磷酸缓冲溶液中，45℃下保存1h，之后测定不同pH条件下酶酸解活性的变化，比较固定化酶和游离酶的pH耐受性。

贮存稳定性的测定：将固定酶和游离酶放于4℃冰箱内保存，每隔5d取10mg酶进行催化猪油和辛酸的酸解反应，测定其酸解活性，以初始酸解活性为100％计算，每次测定得到的固定酶和游离酶的酸解活性分别除以各自的初始活性即得到固定酶和原始酶的相对活性。

操作稳定性的测定：用固定化脂肪酶连续催化辛酸和猪油的酸解反应，每次反应结束后，离心，弃去反应液，用磷酸缓冲溶液洗涤固定化酶数次，干燥回收得到固定化酶，并测定其酸解活性，以初始固定化酶的活性为100％计算。

结果显示，与游离酶相比，固定化酶在热稳定性、pH耐受性及贮存稳定性方面均有所提升，在操作稳定性方面固定化酶也表现良好，具体结果见图4-7。

图4为固定化酶及游离酶的热稳定性比较，可以明显看到游离酶的最适温度为40℃，而固定化酶为45℃。随着温度的升高，酶的活力有所下降，但固定化脂肪酶具有了更宽泛的温度耐受范围，当温度达到70℃时，固定化酶仍保留31.81％的相对活力，而游离酶已经失活，说明固定化对脂肪酶热稳定的提高具有促进作用。

图5为固定化酶及游离酶pH稳定性的比较，可以发现，固定酶和游离酶的最适pH均为7.0，但固定酶具有更宽泛的pH耐受范围，在pH4.0-9.0范围内均能保持55％以上的相对活力，而游离酶只在pH6.0-8.0范围内较稳定，当pH降至4.0时，游离酶就已经失活了。

图6为贮存时间对固定化酶和游离酶活性的影响。从图6中可以看出，随着贮存时间的增加，固定酶及游离酶的活性均表现出下降趋势，但游离酶的下降趋势较固定酶大得多，在贮存15d后，固定酶仍能保持73.5％的相对活力，而游离酶活性只剩余13.5％，表明固定化酶具有更好的贮存稳定性。

图7为催化反应次数对固定化酶活性的影响，可以看到，经过固定化后，固定酶可以反复回收再用于催化反应，而且活性较高，在经过6次催化循环之后，固定化酶仍能保持50％以上的相对活力。

本发明中米根霉脂肪酶的酸解活性及稳定性的提高为结构油脂合成方面的大规模应用提供了技术参考，在获得高纯度及高产率结构油脂产物方面起到积极促进的作用。

Claims (7)

1.一种高效固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，分别用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶和经预处理的大孔吸附树脂，再将脂肪酶溶液加入到大孔吸附树脂溶液中震荡均匀后，进行吸附处理，吸附后再加入戊二醛溶液进行固定处理，固定后经真空抽滤、洗涤和干燥后得到固定化脂肪酶。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)大孔吸附树脂的预处理：将大孔吸附树脂加入到乙醇溶液中胀润，用去离子水洗涤后，再用分别用酸和碱交替处理树脂，蒸馏水冲洗至中性后，干燥，获得预处理大孔吸附树脂；

2)磷酸盐缓冲溶液的溶解：用磷酸盐缓冲溶液浸泡步骤1)所得预处理大孔吸附树脂，再用磷酸盐缓冲溶液溶解脂肪酶，获得脂肪酶溶液；

3)吸附处理：将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到经预处理的大孔吸附树脂磷酸盐溶液中，震荡混合后吸附处理，获得吸附树脂脂肪酶溶液；

4)交联处理：向步骤3)所得吸附树脂脂肪酶溶液中加入戊二醛溶液进行固定化处理，处理完后进行真空抽滤，用去离子水洗涤后干燥，得到固定化脂肪酶。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)中所述大孔吸附树脂为NKA-9大孔吸附树脂；所述乙醇溶液浓度为90-95％，胀润时间为23-25h；所述用酸和碱交替处理是用4-5％的盐酸和1-2％的氢氧化钠溶液每处理4-5h交替；所述干燥，温度为37-40℃，时间为12-15h。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液pH为6.7-7.0，浓度为0.05M；所述脂肪酶的添加量为34-35mg/100mg载体。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)中所述吸附处理，吸附温度为40-45℃，吸附时间为4.0-4.5h，在吸附处理过程中每隔5-10min进行震荡混匀。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)中所述戊二醛溶液浓度为0.25-0.75％；所述固定化处理，固定时间为2-3h；所述干燥，干燥温度为37-40℃，干燥时间12-15h。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)称取500mg的NKA-9树脂，加入95％乙醇溶液浸泡胀润24h，用去离子水洗涤去除杂质，再分别用5％盐酸和2％氢氧化钠溶液处理NKA-9树脂，每处理4h交替，交替处理1次，再用蒸馏水冲洗至中性后，于37℃干燥15h，获得预处理NKA-9树脂；

2)取100mg步骤1)所得的预处理NKA-9树脂，用pH6.50.05M的磷酸盐缓冲溶液溶解，再取34.6mg脂肪酶用pH6.50.05M的磷酸盐缓冲溶液溶解，获得脂肪酶溶液；

3)将步骤2)所得脂肪酶溶液加入到预处理NKA-9树脂磷酸盐溶液中，震荡混合均匀后，在45℃恒温水浴中吸附处理4.1h，处理期间每隔10min进行震荡混匀，吸附处理后获得吸附树脂溶液；

4)向步骤3)所得吸附树脂溶液中加入0.5％的戊二醛溶液3ml，交联固定2.5h，真空抽滤后用去离子水洗涤，37℃干燥15h得到固定化脂肪酶。