CN110938619A - 固定化酶转化黄芩及应用于修复对乙酰氨基酚损伤 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶固定化的技术领域，尤其是涉及一种固定化酶转化黄芩及应用于修复对乙酰氨基酚损伤。所述固定化酶的制备方法，包括如下步骤：将酶溶液与经预处理的载体材料混合吸附处理后，与交联剂混合进行交联处理，洗涤得到所述固定化酶；所述载体材料选自大孔树脂；所述酶包括果胶酶。本发明的固定化酶具有较高的酶含量以及稳定性，可以重复回收利用，能够降低酶促反应生产成本等，能够应用于生物转化中，能够在温和的反应条件下，将黄芩苷进行处理，获得单一产物黄芩素，不会产生副产物，且产物容易分离；利用固定化酶获得的转化产物具有更显著的保护及修复对乙酰氨基酚对免疫细胞造成的损伤。

Description

固定化酶转化黄芩及应用于修复对乙酰氨基酚损伤
技术领域
本发明涉及酶固定化的技术领域，尤其是涉及一种固定化酶转化黄芩及应用于修复对乙酰氨基酚损伤。
背景技术
天然活性分子经过结构修饰后，可转为药物活性更好、毒性更低的化合物分子。生物转化途径可对天然药物进行结构修饰，能改善药物理化性质、进一步提高药效。
黄酮化合物是植物体中重要次生代谢产物，显示抗衰老、肿瘤、抗氧化等多种生理活性，具有重要的药用价值。植物中黄酮化合物主要以黄酮苷形式存在，在植物生长过程中，黄酮苷由黄酮苷元通过糖基化过程转化而来，依据糖基的数量、联接方式不同，黄酮苷元最终可以形成不同结构与活性的黄酮苷类。黄酮苷元分子较黄酮苷极性弱，导致苷元分子与黄酮苷在体内吸收、代谢过程存在较大差异，研究显示黄酮苷元更易被机体吸收利用，有利于功能活性作用充分发挥，苷元分子或显示更强的生物活性及药用价值。自然界中，黄酮苷元较少，工业上需要通将黄酮苷进行水解获得黄酮苷元。在高温、强酸条件下，黄酮苷发生去糖基化反应产生糖基和对应苷元，由于黄酮分子含有酚羟基，其性质活泼，容易在高温水解过程中发生氧化作用，产生副产物，甚至使黄酮分子生物活性遭到破坏，另一方面，强酸的使用不利于安全生产，且易对环境造成污染。
酶促反应可作为黄酮苷转化为苷元分子的重要策略，但游离酶易失活，且不易与产物分离，难以重复使用，提高了酶促反应生产成本，限制了其使用范围。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种固定化酶的制备方法，以解决现有技术中存在的酶易失活、酶促反应成本高的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种固定化酶，该固定化酶具有较好的稳定性，酶活性高。
本发明的第三目的在于提供上述固定化酶在对含有糖基的天然产物进行水解方面的应用，如可将黄芩苷催化转化为黄芩素。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
将酶溶液与经预处理的载体材料混合吸附处理后，与交联剂混合进行交联处理，洗涤得到所述固定化酶；
所述载体材料选自大孔树脂；
所述酶包括果胶酶。
本发明通过采用固定化方式将果胶酶固定化于特定载体上，在保障果胶酶的催化活性的前提下，将果胶酶包埋、负载于特定载体上，得到的固定化酶稳定性好，且进行酶促反应后，固定化酶易于与反应物、产物等分开，可以重复回收利用，降低酶促反应生产成本等。通过先吸附后交联的方式，兼顾提高固定化酶中酶含量以及稳定性。
在本发明一具体实施方式中，所述载体材料的预处理方法包括：所述载体材料于乙醇溶液中浸泡，充分溶胀后，水洗除去乙醇，固液分离得到经预处理的载体材料。
在本发明一具体实施方式中，所述大孔树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂，进一步优选为Amberblite XAD1180N聚苯乙烯型大孔吸附树脂。
在本发明一具体实施方式中，所述浸泡的时间可以为2～20h，如可以为2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h等等，使载体材料充分溶胀即可。
在本发明一具体实施方式中，所述乙醇溶液为乙醇的水溶液。其中，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为80％～95％，优选为95％。
在本发明一具体实施方式中，所述固液分离为使载体材料与水分离，可采用过柱子的方式等。
本发明将载体材料经上述预处理后，能够使酶充分吸附于载体材料上，提高固定化酶中酶的含量。
在本发明一具体实施方式中，所述酶溶液的溶剂为缓冲液。进一步的，所述缓冲液的pH为4.0～6.0，如可以为4.0、5.0、6.0等等。在一优选实施方式中，所述缓冲液为醋酸-醋酸盐缓冲液，如可以为0.02mol/L，pH＝5.0的醋酸-醋酸盐缓冲液。
在本发明一具体实施方式中，所述酶溶液中，酶的浓度为5～20mg/mL，如可以为10～15mg/mL。
在本发明一具体实施方式中，所述酶溶液中的酶与所述经预处理的载体材料的质量比为1﹕(4～10)，优选为1﹕(6～8)。
在本发明一具体实施方式中，所述混合吸附处理包括：于20～30℃条件下振荡吸附10～24h。具体的，可以在温控摇床上，于25℃条件下振荡吸附。
在本发明一具体实施方式中，所述交联剂包括戊二醛。可选的，所述戊二醛的加入量为经混合吸附处理后的体系的体积的0.15％～0.6％。
在本发明一具体实施方式中，所述交联处理包括：于20～30℃条件下振荡交联2～6h。可选的，所述交联处理包括：于25℃条件下振荡交联4h。可选的，振荡的速率为110～120r/min。
在本发明一具体实施方式中，采用缓冲液进行所述洗涤。可选的，所述缓冲液的pH为4.0～6.0，如可以为4.0、5.0、6.0等等。在一优选实施方式中，所述缓冲液为醋酸-醋酸盐缓冲液，如可以为0.02mol/L，pH＝5.0的醋酸-醋酸盐缓冲液。
本发明还提供了采用上述制备方法制备得到的固定化酶。
本发明的固定化酶具有较好的稳定性和酶活性，在重复使用15次后，其酶活能保持最大酶活的30％以上。
本发明还提供了上述固定化酶在生物转化中的应用。
可选的，所述固定化酶用于含有糖基的化合物的生物转化。
可选的，所述固定化酶用于萜类糖苷的生物转化。
优选的，所述固定化酶用于黄酮苷的生物转化。
本发明的固定化酶可用于黄酮苷的生物转化，制备得到黄酮苷元，规避了常规方法利用酸水解带来的环境污染以及副产物多的问题。
优选的，所述固定化酶用于将黄芩苷转化为黄芩素。
优选的，所述将黄芩苷转化为黄芩素的方法包括：所述固定化酶与黄芩苷混合，于40～60℃条件下进行转化反应。
可选的，所述固定化酶的用量与黄芩苷的质量比1﹕300。
通过采用所述固定化酶对黄芩苷进行处理，能够在温和的反应条件下，获得单一产物黄芩素，不会产生副产物，且产物容易分离。
本发明的黄芩素和/或黄芩苷在制备用于防治对乙酰氨基酚对免疫细胞的损伤的药物中的应用。
经过上述转化得到的黄芩素对于防治对乙酰氨基酚对免疫细胞的损伤具有更显著的作用效果。
在本发明一具体实施方式中，所述黄芩素由黄芩苷通过所述固定化酶转化得到。
乙酰氨基酚对免疫细胞有损伤作用，黄芩苷和黄芩素能够保护和修复对乙酰氨基酚对免疫细胞造成的损伤。
可选的，所述免疫细胞包括巨噬细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的固定化酶具有较高的酶含量以及稳定性，可以重复回收利用，能够降低酶促反应生产成本等；
(2)本发明的固定化酶能够应用于生物转化中，能够在温和的反应条件下，将黄芩苷进行处理，获得单一产物黄芩素，不会产生副产物，且产物容易分离；转化产物黄芩素较黄芩苷显示出更好的效果，能够保护和修复对乙酰氨基酚对免疫细胞造成的损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的载体材料以及固定化酶的扫描电子显微镜图片，其中I为载体材料，II为固定化酶；
图2为本发明实施例提供的载体材料以及固定化酶的红外谱图，其中a表示载体材料的红外谱图，b表示固定化酶的红外谱图；
图3为本发明实施例提供的固定化酶的相对酶活力与循环使用次数的关系图；
图4为本发明实施例提供的固定化酶对黄芩苷转化前后的薄层扫描图谱，其中a表示黄芩苷转化前，b表示转化中；
图5为不同组别的细胞生长情况，其中从左到右依次为正常组、对乙酰氨基酚给药组、对乙酰氨基酚+黄芩苷(50μg/mL)组、对乙酰氨基酚+黄芩苷(200μg/mL)组、对乙酰氨基酚+黄芩素(50μg/mL)组、对乙酰氨基酚+黄芩素(200μg/mL)组；
图6为黄芩素/黄芩苷与对乙酰氨基酚同时作用对RAW264.7细胞存活率的影响。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)载体材料预处理：Amberblite XAD1180N聚苯乙烯型大孔吸附树脂作为载体材料，将Amberblite XAD1180N聚苯乙烯型大孔吸附树脂用体积分数为95％的乙醇水溶液浸泡10h，期间不时搅拌使其充分溶胀，然后用蒸馏水对上述树脂进行不断清洗直至流出液中无明显乙醇气味为止；过柱子使树脂和水分离，得到经预处理的载体材料，于4℃冷藏柜中储藏备用；
(2)称取80mg果胶酶(生工生物工程(上海)股份有限公司，产品批号EC20BA0008)于10mL离心管中，加入pH＝5(0.02mol/L)的醋酸-醋酸盐缓冲液6mL，溶解，制备得到酶溶液；
(3)准确称取步骤(1)中经预处理的载体材料0.5g，然后将其加入至步骤(2)得到的酶溶液中，在温控摇床上于25℃条件下振荡吸附3h；
(4)向步骤(3)中吸附完成的体系中加入交联剂戊二醛，使戊二醛在体系中的体积分数为0.5％，于25℃条件下在温控摇床上115r/min振荡交联处理4h；交联处理完成后，过滤收集固体，并用pH＝5(0.02mol/L)的醋酸-醋酸盐缓冲液洗涤，得到固定化酶，于4℃冷藏柜中冷藏备用。
其中，所述醋酸-醋酸盐缓冲液的配制过程为：称取1.36g结晶醋酸钠溶于400mL去离子水内，用冰醋酸调节pH值至5.0，定容至500mL制成0.02mol/L，pH＝5.0的醋酸-醋酸盐缓冲液，于4℃冰箱贮存备用。
实施例2
本发明的固定化酶用于生物转化方面的应用，包括如下步骤：
将实施例1中的固定化酶90mg与黄芩苷底物(2.69μM)混合，于50℃条件下，在摇床上进行转化反应4h。固定化酶与黄芩苷底物的质量比为1﹕300。
黄芩苷底物的浓度不限于此，比如还可以为1～10μM等。
实施例3
本发明的固定化酶用于生物转化方面的应用，包括如下步骤：
将实施例1中的固定化酶70mg与黄芩苷底物(2.69μM)混合，于40℃条件下，在摇床上进行转化反应8h。固定化酶与黄芩苷底物的质量比为1﹕300。
实施例4
本发明的固定化酶用于生物转化方面的应用，包括如下步骤：
将实施例1中的固定化酶95mg与黄芩苷底物(2.69μM)混合，于60℃条件下，在摇床上进行转化反应3.5h。固定化酶与黄芩苷底物的质量比为1﹕300。
实验例1
对实施例制备得到的固定化酶进行表征
一、表面形貌
以实施例1为例，对实施例1中的载体材料Amberblite XAD1180N聚苯乙烯型大孔吸附树脂以及制备得到的固定化酶进行表征，图1为其对应的扫描电子显微镜图片，I为载体材料，II为固定化酶。
从图1中可知，固定化酶和载体材料形貌无显著区别，均呈小球状，酶进行固定化后形成的固定化酶为表面光滑、致密的小球体，说明通过吸附、交联步骤后，酶均匀分散在载体上，小球粒径在200～600μm之间。
二、红外谱图
以实施例1为例，对实施例1中的载体材料Amberblite XAD1180N聚苯乙烯型大孔吸附树脂以及制备得到的固定化酶进行红外表征，图2为其对应的红外谱图，其中a表示载体材料的红外谱图，b表示固定化酶的红外谱图。
从图2中可知，固定化酶的载体化学组分为聚苯乙烯，红外谱图中2920.49cm-1、703.91cm-1为苯环上C-H伸缩振动和苯环一级取代的振动峰，同时固定化酶的红外谱图中3302.96cm-1处出现羟基特征峰，推测载体与酶蛋白间形成的氢键使电子云密度平均化，故该出峰强度增加，峰形变宽，此外固定化酶在1005.58cm-1处C-O特征峰增强，1649.33cm-1处出现C-N伸缩振动峰。根据红外结果也进一步证明果胶酶分子固定在了大孔树脂上。
三、固定化酶的蛋白含量
采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；具体的，采用考马斯亮蓝法测定酶溶液中蛋白质含量；然后再测定交联处理完成后，滤液(包括洗涤下来的溶液)中的蛋白质含量；酶溶液中蛋白质含量减去滤液中蛋白质含量即为固定化酶中的蛋白含量。
考马斯亮蓝G-250染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL体积分数为95％的乙醇的水溶液中，加入100mL的85％(w/v)的磷酸，然后，用蒸馏水补充至200mL，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
对本发明实施例制备得到的固定化酶的蛋白含量进行测试，测试结果见表1。
表1固定化酶的蛋白含量
编号 蛋白含量(mg/g)
实施例1 3.56
实验例2
固定化酶稳定性分析
称取0.5g实施例1制备得到的固定化酶，以4-硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作为底物(浓度为50mM)测定该固定化酶水解β-糖苷键的酶活力，以固定化酶第一次反应时的酶活力定义为100％，反应一次后，将反应液过滤，用醋酸-醋酸盐缓冲液清洗固定化酶3次，然后将固定化酶与底物PNPG混合，进行第二次反应；重复以上反应，至反应循环15次。
固定化酶的相对酶活力与循环使用次数关系图如图3所示，固定化酶重复利用5次时，酶活力没有损失，利用到15次时，还具有30％以上酶活力，说明了固定化酶具有较强的稳定性，实现了酶的重复利用。
实验例3
为了验证本发明的固定化酶能够将黄芩苷有效转化为黄芩素，对实施例3的黄芩苷底物以及转化后的物质进行薄层扫描分析，展开剂为甲苯﹕乙酸乙酯﹕甲酸＝5﹕4﹕1(体积比)，得到的薄层扫描图谱如图4所示，其中a表示黄芩苷转化前，b表示转化中。
从图中可知，黄芩苷底物在固定化酶作用下转化为了黄芩素，说明了可以利用该固定化酶进行黄酮苷的生物转化。与传统的强酸、高温水解过程相比，采用本发明的固定化酶通过酶促反应，获得单一产物黄芩素(图4b中反映的是正在转化中的图，还没有反应结束；反应结束后，体系为单一产物黄芩素)，反应条件温和，不会产生副产物，既没有废酸排出，也没有危险性，还节省能量，而且产物容易分离。
实验例4
黄芩苷、黄芩素对损伤巨噬细胞的保护
(1)配制培养基
①对乙酰氨基酚培养基：每25mL 10％FBS DMEM高糖培养基中，分别加入6.25/12.5/50/100/150μL初始浓度为500mg/mL对乙酰氨基酚，终浓度依次为250/500/1000/2000/3000μg/mL。
②对乙酰氨基酚黄芩素/黄芩苷培养基：选定对乙酰氨基酚终浓度为3000μg/mL培养基，每25mL此培养基加入初始浓度为40μg/μL黄芩素/黄芩苷各6.25/12.5/31.25/62.5/125μL，使其终浓度依次为10/20/30/50/100/200μg/mL。
(2)接种细胞
每孔200μL上述培养基。细胞计数后，以5×103cell/孔的密度，将RAW264.7细胞接种于孔中。设置调零孔，对照孔。每组设置3个复孔。
(3)培养细胞
将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及湿度条件下，培养24h。
(4)呈色
每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃，继续孵育4h。终止培养后，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150uL的DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解。
(5)比色
选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔光吸收值，记录结果。计算抑制率。
图5为不同组别的细胞生长情况，其中从左到右依次为正常组、对乙酰氨基酚给药组、对乙酰氨基酚+黄芩苷(50μg/mL)组、对乙酰氨基酚+黄芩苷(200μg/mL)组、对乙酰氨基酚+黄芩素(50μg/mL)组、对乙酰氨基酚+黄芩素(200μg/mL)组。从图5中可知，对乙酰氨基酚给药组细胞数量最少，可见对乙酰氨基酚对免疫细胞有损伤作用，说明黄芩苷、黄芩素能保护和修复对乙酰氨基酚对免疫细胞造成的损伤。
图6为黄芩素/黄芩苷与对乙酰氨基酚同时作用对RAW264.7细胞存活率的影响图(接种及培养方式同上)，从图中可知，黄芩素可以保护免疫细胞，修复对乙酰氨基酚对巨噬细胞的损伤，随着黄芩素浓度升高至100～200μg/mL时，保护免疫细胞，修复对乙酰氨基酚对巨噬细胞的损伤作用明显，而且转化产物黄芩素的作用效果优于黄芩苷。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将酶溶液与经预处理的载体材料混合吸附处理后，与交联剂混合进行交联处理，洗涤得到所述固定化酶；
所述载体材料选自大孔树脂；
所述酶包括果胶酶。
2.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述载体材料的预处理方法包括：所述载体材料于乙醇溶液中浸泡，充分溶胀后，水洗除去乙醇，固液分离得到经预处理的载体材料；
优选的，所述大孔树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂。
3.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述酶溶液的溶剂为缓冲液；
优选的，所述缓冲液的pH为4.0～6.0；
优选的，所述酶溶液中，酶的浓度为5～20mg/mL。
4.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述酶溶液中的酶与所述经预处理的载体材料的质量比为1﹕(4～10)，优选为1﹕(6～8)；
优选的，所述混合吸附处理包括：于20～30℃条件下振荡吸附10～24h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述交联剂包括戊二醛；
优选的，所述戊二醛的加入量为经混合吸附处理后的体系的体积的0.15％～0.60％。
6.根据权利要求5所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述交联处理包括：于20～30℃条件下振荡交联2～6h；
优选的，所述振荡的速率为110～120r/min。
7.采用权利要求1-6任一项所述的固定化酶的制备方法制备得到的固定化酶。
8.采用权利要求1-6任一项所述的固定化酶的制备方法制备得到的固定化酶或权利要求7所述的固定化酶在生物转化中的应用；
优选的，所述固定化酶用于含有糖基的化合物的生物转化；
更优选的，所述含有糖基的化合物包括萜类糖苷和黄酮苷中的任一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固定化酶用于将黄芩苷转化为黄芩素；
优选的，所述将黄芩苷转化为黄芩素的方法包括：所述固定化酶与黄芩苷混合，于40～60℃条件下进行转化反应。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述转化得到的黄芩素用于制备防治对乙酰氨基酚对免疫细胞的损伤的药物；
优选的，所述免疫细胞包括巨噬细胞。
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