CN117568434A - 一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，采用人参皂苷CMc为原料，制备工艺包括选取菌种、种子培养、发酵、提酶、酶反应以及纯化步骤。所述选取菌种：采用的菌种为解木糖赖氨酸芽胞杆菌。本发明能够以人参皂苷CMc为原料，制备稀有人参皂苷CMx；工艺反应快，转化率高，纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及皂苷制备领域，具体涉及一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺。
背景技术
人参皂苷是人参的主要活性成分，约占人参干重的5%左右，天然的人参皂苷带有3-4个糖基，难以穿透细胞膜，因此吸收率低、活性低。而带有1-2个糖基的人参皂苷在天然中很稀有，因此被称为稀有人参皂苷。这些稀有人参皂苷大多生物利用度高，活性高，在体内具有多靶点，因此，以天然人参皂苷为原料制备稀有人参皂苷是近年来的研究热点。其中，稀有人参皂苷CMx在天然人参中不存在，即使在野山参中也不存在。CMx属于二醇类人参皂苷，在20-O-上带有两个糖基，分别是外侧的木糖基和内侧的葡萄糖基。关于人参皂苷的结构改造，已有众多报道，其中生物酶法以其专一高效的特点备受关注，以往报道的都是人参皂苷糖苷酶，通过水解多糖基上的糖基来制备低糖基的稀有人参皂苷。由于CMx结构上的特点，如果通过糖苷酶来转化制备，CMx只能通过CMx1或Rb3来制备，这就使其制备受限，难以转化完全，或者只能低浓度转化。稀有人参皂苷CMx的制备工艺一直是本领域的研究重点和难点。
现有技术的CMx制备工艺具有以下缺陷：反应时间长、底物转化率低、纯度低。解决上述技术问题对本技术领域具有重要意义。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，并要达到以下发明目的：采用人参皂苷CMc为原料，缩短反应时间，提高底物转化率和产物纯度。
为实现以上发明目的，本发明采用技术方案如下：
一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，包括以下步骤：
步骤1、选取菌种
采用的的菌种为解木糖赖氨酸芽胞杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus），保藏号为：CICC 24518。
步骤2、种子培养
配制种子培养基，所述种子培养基：蛋白胨 5.0g、牛肉浸粉 3.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000.0 mL，pH值为7.0。
将菌种接种到种子培养基中，培养温度为35-38℃，培养时间为34-38小时。
步骤3、发酵
种子培养后，将菌种转接到发酵培养基中，接种量为1.5-2%。所述发酵培养基：水解酪蛋白 11-13g、牛肉膏9-11g、酵母膏3.5-4.2g、番茄汁2.8-3.2g、甘露糖醇4.8-5.2g、柠檬酸二铵 1.8-2.2g、抗坏血酸 0.8-1.2g、维生素B12 0.8-1.2g、K2HPO41.8-2.2g、ZnSO4..7H2O 0.18-0.25g，天冬氨酸 5.8-6.2g、谷氨酸6.6-7.4g、蒸馏水 1.0L，pH值为6.8-7.0。在温度34-36℃条件下，培养时间为24-28小时，然后加入诱导物，加入后将培养基摇匀，诱导物的加入量为发酵培养基质量的1-5%，继续培养24-36h，得到含酶培养液。
所述诱导物：将人参皂苷CMc、阿拉伯糖、木糖，按照5-10：5-6：1-2的质量比混合，得到的混合物再与乙醇溶液混合并溶解，混合物与乙醇溶液的质量比为1:5，乙醇溶液的质量百分含量为12-15%。
步骤3、提酶
发酵结束后，先离心除去菌体，然后用超滤膜对发酵液进行浓缩，除去分子量低于20kDa的蛋白、盐、糖等杂质，得到粗酶。
步骤4、酶反应
将粗酶溶于pH7.0、0.05M的磷酸缓冲液，粗酶与磷酸缓冲液的质量比为1：48-52，得到酶液。
将CMc加入乙醇中，再加入0.05M、pH7.0的磷酸缓冲液，充分溶解；CMc与乙醇的质量比为1:4-6，乙醇的质量百分含量为95%；CMc与磷酸缓冲液的质量比为1:18-23；配制得到底物。
将酶液与底物混合，于38-42℃反应12-24h。反应机理图如附图2所示。
步骤5、纯化
反应结束后，升温至90℃，保持20-30min，灭酶，然后浓缩至原体积的10-15%，离心获得的沉淀即为产物人参皂苷CMx。
与传统方法相比，本发明具有以下有益效果：
能够以人参皂苷CMc为原料，制备稀有人参皂苷CMx；本发明工艺反应快，反应时间仅12-24h；本发明制备工艺产物纯度高，底物可100%转化，产物纯度可达95%以上。
附图说明
附图1为原料人参皂苷CMc检测的HPLC色谱图；
附图2为本发明反应机理图；
附图3为实施例1的反应产物检测的HPLC色谱图；
附图4为对比例1的反应产物检测的HPLC色谱图；
附图5为对比例2的反应产物检测的HPLC色谱图；
附图6为对比例3的反应产物检测的HPLC色谱图；
附图7为对比例4的的反应产物检测的HPLC色谱图。
具体实施方式
实施例1 一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺
制备工艺的步骤如下：
步骤1、选取菌种
采用的菌种为解木糖赖氨酸芽胞杆菌（Lysinibacillus xylanilyticus），保藏号为：CICC 24518。
步骤2、种子培养
配制种子培养基，所述种子培养基：配制种子培养基，所述种子培养基：蛋白胨5.0g、牛肉浸粉 3.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000.0 mL，pH值为7.0。
将菌种接种到种子培养基中，培养温度为37℃，培养时间为36小时。
步骤3、发酵
种子培养后，将菌种转接到发酵培养基中，接种量为1.5%。所述发酵培养基：水解酪蛋白 12.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏 4.0g、番茄汁 3.0g、甘露糖醇 5.0g、柠檬酸二铵2.0g、抗坏血酸 1.0g、维生素B12 1.0g、K2HPO42.0g、ZnSO4..7H2O 0.2g，天冬氨酸 6.0g、谷氨酸7.0g、蒸馏水 1.0L，pH值为6.9。
在温度35℃条件下，培养时间为28小时，然后加入诱导物，加入后将培养基摇匀，诱导物的加入量为发酵培养基质量的3%，继续培养28h，得到含酶培养液。
所述诱导物：将人参皂苷CMc、阿拉伯糖、木糖，按照8：5.5：1.5的质量比混合，得到的混合物再与乙醇溶液混合并溶解，混合物与乙醇溶液的质量比为1:5，乙醇溶液的质量百分含量为15%。
步骤4、提酶
发酵结束后，先离心除去菌体，然后用超滤膜对发酵液进行浓缩并除去分子量低于20kDa的蛋白、盐、糖等杂质，得到粗酶。
步骤5、酶反应
将粗酶溶于pH7.0、0.05M的磷酸缓冲液，粗酶与磷酸缓冲液的质量比为1：50，得到酶液。
检测原料CMc：对原料进行HPLC检测，原料CMc检测的HPLC色谱图如附图1所示；CMc的含量为98%。
将CMc加入乙醇中，再加入0.05M、pH7.0的磷酸缓冲液，充分溶解；CMc与乙醇的质量比为1:5，乙醇的质量百分含量为95%；CMc与磷酸缓冲液的质量比为1:20；配制得到底物。
将酶液与底物混合，于40℃反应12h。反应机理图如附图2所示。
步骤5、反应结束后，将反应液干燥至重量不再减小得到粗品，然后乙醇将粗品溶解；溶解液离心并收集液相。将液相用0.1微米膜过滤，收集滤液，并浓缩、蒸干，得到产品，即为人参皂苷CMx。所述乙醇与粗品的质量比为5:1；所述乙醇的质量百分含量为95%。
对产物进行HPLC检测，检测的HPLC色谱图如附图3所示。通过附图3可知，产物中CMc含量为0，仅检测到一种人参皂苷，即CMx；说明反应的转化率为100%。
经检测，产品人参皂苷CMx的纯度为95%。
本发明采用的原料人参皂苷CMc：可以市购也可以自行制备。
制备人参皂苷CMc的方法：（1）准备葡萄糖苷酶和人参皂苷Rc，均来源于市购。（2）分别配制质量百分含量1%的葡萄糖苷酶溶液和质量百分含量3%的人参皂苷Rc溶液。（3）将葡萄糖苷酶溶液和人参皂苷Rc溶液按1:1的质量比混合，在60℃反应48h，反应结束后，上大孔吸附树脂吸附纯化，然后将纯化后的皂苷产物用300-400目硅胶进行分离纯化并收集得到CMc。
对比例
与实施例1的制备方法相同，只改变步骤1选取菌种、步骤2种子培养、步骤3发酵进行对比例1-3。与实施例1的制备方法相同，只改变步骤3发酵进行对比例4。具体如下：
对比例1：
步骤1选取菌种：采用的菌种为解木糖赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillusxylanilyticus，保藏号为CICC 10600。
步骤2种子培养：种子培养基为LB培养基；将菌种接种到种子培养基中，培养温度为28℃，培养时间为36小时。
步骤3发酵：种子培养后，将菌种转接到发酵培养基中，接种量为1.5%。所述发酵培养基采用LB培养基。在温度28℃条件下，培养时间为28小时，然后加入诱导物，加入后将培养基摇匀，诱导物的加入量为发酵培养基质量的3%，继续培养28h，得到含酶培养液。所述诱导物与实施例1相同。
其他步骤均与实施例1的制备方法相同。
对对比例1制备的产物进行HPLC检测，检测的HPLC色谱图如附图4所示。
对比例2
步骤1选取菌种：采用的菌种为解木糖赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillusxylanilyticus，保藏号为CICC 10602。
步骤2种子培养：种子培养基为LB培养基；将菌种接种到种子培养基中，培养温度为28℃，培养时间为36小时。
步骤3发酵：种子培养后，将菌种转接到发酵培养基中，接种量为1.5%。所述发酵培养基采用LB培养基。在温度28℃条件下，培养时间为28小时，然后加入诱导物，加入后将培养基摇匀，诱导物的加入量为发酵培养基质量的3%，继续培养28h，得到含酶培养液。所述诱导物与实施例1相同。
其他步骤均与实施例1的制备方法相同。
对对比例2制备的产物进行HPLC检测，检测的HPLC色谱图如附图5所示。
对比例3
步骤1选取菌种：采用的菌种为解木糖赖氨酸芽胞杆菌Lysinibacillusxylanilyticus，保藏号为CICC 20858。
步骤2种子培养：种子培养基为：蛋白胨 5.0g、牛肉浸粉 3.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000.0 mL，pH值为7.0；将菌种接种到种子培养基中，培养温度为30℃，培养时间为36小时。
步骤3发酵：种子培养后，将菌种转接到发酵培养基中，接种量为1.5%。所述发酵培养基：蛋白胨 5.0g、牛肉浸粉 3.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000.0 mL，pH值为7.0。在温度30℃条件下，培养时间为28小时，然后加入诱导物，加入后将培养基摇匀，诱导物的加入量为发酵培养基质量的3%，继续培养28h，得到含酶培养液。所述诱导物与实施例1相同。
其他步骤均与实施例1的制备方法相同。
对对比例3制备的产物进行HPLC检测，检测的HPLC色谱图如附图6所示。
对比例4
步骤3发酵：
种子培养后，将菌种转接到发酵培养基中，接种量为1.5%。所述发酵培养基：水解酪蛋白 12.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏 4.0g、番茄汁 3.0g、甘露糖醇 5.0g、柠檬酸二铵2.0g、抗坏血酸 1.0g、维生素B12 1.0g、K2HPO4 2.0g、ZnSO4..7H2O 0.2g，天冬氨酸 6.0g、谷氨酸7.0g、蒸馏水 1.0L，pH值为6.9。
在温度35℃条件下，培养时间为56小时，得到培养液。
其他步骤均与实施例1的制备方法相同。
对对比例4制备的产物进行HPLC检测，检测的HPLC色谱图如附图7所示。
通过附图4-7可知，对比例1-4的反应转化率以及产物中CMx的含量如表1所示；
表1
| 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | |
| 产物中CMx的含量 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 反应转化率 | 0 | 0 | 0 | 0 |
分析可知，对比例1-4的反应产物中CMx的含量为0，反应转化率为0。
本发明中所述的HPLC检测的控制条件如下：检测波长203nm。流动相乙腈（A）-水（B）：0-20min，20%A，20-31min，20%-32%A，31-40min，32%-43%A，40-47min，43%-100%A。柱温35℃。
除特殊说明的外，本发明所述的比例均为质量比，所述的百分数均为质量百分数。
显然的是，在本发明的构思下，可以变化的具体实施方法还有很多，在此，应该声明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：采用人参皂苷CMc为原料，制备工艺包括选取菌种、种子培养、发酵、提酶、酶反应以及纯化步骤。
2.根据权利要求1所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述选取菌种：采用的菌种为解木糖赖氨酸芽胞杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述发酵：种子培养后，将菌种转接到发酵培养基中，接种量为1.5-2%；在温度35-38℃条件下，培养24-28小时，然后加入诱导物，继续培养24-36h，得到含酶培养液。
4.根据权利要求3所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述诱导物：将人参皂苷CMc、阿拉伯糖、木糖混合，得到的混合物再与乙醇溶液混合并溶解。
5.根据权利要求4所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述人参皂苷CMc、阿拉伯糖、木糖的质量比为5-10：5-6：1-2。
6.根据权利要求1所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述酶反应：将粗酶溶于pH7.0、0.05M的磷酸缓冲液，粗酶与磷酸缓冲液的质量比为1：48-52，得到酶液。
7.根据权利要求1所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述酶反应：将CMc加入乙醇中，再加入0.05M、pH7.0的磷酸缓冲液，充分溶解，得到底物。
8.根据权利要求7所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述CMc与乙醇的质量比为1:4-6，乙醇的质量百分含量为95%；CMc与磷酸缓冲液的质量比为1:18-23。
9.根据权利要求7所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述乙醇溶液的质量百分含量为12-15%。
10.根据权利要求3所述的一种稀有人参皂苷CMx的制备工艺，其特征在于：所述发酵培养基：水解酪蛋白 11-13g、牛肉膏9-11g、酵母膏3.5-4.2g、番茄汁2.8-3.2g、甘露糖醇4.8-5.2g、柠檬酸二铵 1.8-2.2g、抗坏血酸 0.8-1.2g、维生素B12 0.8-1.2g、K2HPO4 1.8-2.2g、ZnSO4.·7H2O 0.18-0.25g，天冬氨酸 5.8-6.2g、谷氨酸6.6-7.4g、蒸馏水 1.0L，pH值为6.8-7.0。
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