CN113185697A - 一种卟啉基MOFs模拟酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种卟啉基MOFs模拟酶及其制备方法和应用，属于电化学分析技术领域；在本发明中，制备了一种稳定性好、催化活性高的卟啉基MOFs模拟酶，然后构建了一种基于卟啉基MOFs模拟酶的电化学DNA传感器，所述电化学DNA传感器可以灵敏、准确、快速的检测果蔬汁中的重金属离子。

Description

一种卟啉基MOFs模拟酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于电化学分析技术领域，具体涉及一种卟啉基MOFs模拟酶及其制备方法和应用。

背景技术

果蔬能为人体补充多种维生素和矿物质，并增强细胞活力及胃肠功能，因而备受广大消费者的青睐。然而，水果、蔬菜在生长过程中极易受到重金属污染，从而影响到果蔬汁的食用安全。因此，研究开发果蔬汁中重金属灵敏、快速、准确的检测方法显得尤为重要。

传统的重金属检测方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、液相色谱法等。然而上述方法大多存在操作繁琐、分析时间长等不足，难以满足重金属的现场快速检测要求。电化学DNA传感器将传感器的选择性和电化学的便捷性相结合，为实现复杂基质中重金属离子的准确、快速检测提供了可能，但是为了增强痕量甚至超痕量重金属离子的电化学检测信号，通常利用酶循环实现信号放大。生物酶具有本身不稳定、易失活且提纯难度大等不足，使得电化学DNA传感器难以用于果蔬中重金属的现场快速检测。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种卟啉基MOFs模拟酶及其制备方法和应用。在本发明中，制备了一种稳定性好、催化活性高的卟啉基MOFs模拟酶，然后构建了一种基于卟啉基MOFs模拟酶的电化学DNA传感器，所述电化学DNA传感器可以灵敏、准确、快速的检测果蔬汁中的重金属离子。

本发明中首先提供了一种卟啉基MOFs模拟酶，所述卟啉基MOFs模拟酶是由铁卟啉和锆离子通过配位键自组装形成的有机-无机多孔杂化材料，其形貌规则、呈纺锤形，长轴长为350~520 nm，短轴长为120~200 nm；所述卟啉基MOFs模拟酶具有大量的金属活性位点。

本发明中还提供了上述卟啉基MOFs模拟酶的制备方法，具体包括如下步骤：将四氯化锆和铁卟啉溶于N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入乙酸超声均匀，并快速转移到反应釜中进行加热；冷却至室温后，进行离心、干燥，得到卟啉基MOFs模拟酶。

进一步的，所述四氯化锆、铁卟啉和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为4~9mg:3~6mg:2~10mL。

进一步的，所述N,N-二甲基甲酰胺和乙酸的体积比为2~10：0.2~1。

进一步的，所述加热的条件为：加热温度110~130 ℃，加热时间18~36 h。

本发明还提供了一种基于卟啉基MOFs模拟酶的电化学DNA传感器，所述基于卟啉基MOFs模拟酶的电化学DNA传感器的构建步骤如下所示：

（1）制备MOF-DNA1信号探针：

将卟啉基MOFs模拟酶、曲拉通X-100、正己醇加入到环己烷溶液中，室温搅拌后加入氨水和正硅酸甲酯反应，然后加入丙酮混匀、离心、洗涤；接着加入KH-560溶液反应、洗涤，得到环氧官能化卟啉基MOFs模拟酶；

将得到的环氧官能化卟啉基MOFs模拟酶与DNA1序列在室温条件下培养，反应后用Tris-HCl缓冲溶液离心、洗涤，得到MOF-DNA1信号探针；

（2）电化学DNA传感器的制备：

利用多电位阶跃法在打磨后的玻碳电极表面修饰一层均匀的纳米金膜，然后将DNA2溶液滴涂在纳米金修饰的玻碳电极表面培养，清洗后将电极先后浸入铅离子溶液和MOF-DNA1信号探针溶液中培养，得到电化学DNA传感器。

进一步的，步骤（1）中，所述曲拉通X-100和卟啉基MOFs模拟酶的用量比为1g:2mg；正己醇和环己烷的体积比为0.5~2：1~3；氨水、正硅酸甲酯和丙酮的体积比为0.5~2：1~3：3~5。

进一步的，步骤（1）中，所述DNA1的序列为5’-CGTAGAGAGAGAAAA-(CH₂)₆-SH-3’；培养时间为12~36h。

进一步的，步骤（2）中，所述DNA2的序列为5’-CGTAGAGAGAGAGAAGTAGCGCCGCCGTCCGTATAGGGTATACGGrAGGAAGCATCTCTCTCTAAA-(CH₂)₆-SH-3’，用量为3~10μL，培养时间为3~8h。

本发明还提供了上述基于卟啉基MOFs模拟酶的电化学DNA传感器在定量检测铅离子中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）与辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等生物酶相比，本发明制备的卟啉基MOFs模拟酶性质稳定、耐酸碱能力强、催化活性高，克服了蛋白酶易失活、提纯难度大等不足。

（2）与原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、液相色谱法等重金属传统检测方法相比，本发明利用简便、快捷的电化学传感分析方法有效提高了果蔬汁复杂基质中重金属检测的灵敏度、选择性和时效性。

（3）与阳极溶出伏安法相比，本发明不需要通过形成汞齐富集重金属离子，避免了二次污染和繁琐的实验操作，实现了重金属离子的安全、快速检测。

（4）本发明中制备的卟啉基MOFs模拟酶稳定性好、催化活性强，能够催化底物实现电化学信号放大，从而提高检测灵敏度；传感界面修饰纳米金膜，能够促进催化活性中心与传感界面之间的电子传递，对提高重金属检测灵敏度起到重要作用；铅离子能够特异识别并切断DNA2，结合在传感界面的DNA2残基通过与DNA1序列特异性杂交，实现了MOFs模拟酶的有效固定并产生电催化信号，克服了复杂基质中其它干扰物质的影响，提高了铅离子检测的抗干扰能力和准确性。

附图说明

图1为卟啉基MOFs模拟酶的扫描电镜图。

图2为卟啉基MOFs模拟酶和环氧官能化卟啉基MOFs模拟酶的红外光谱图。

图3为卟啉基MOFs模拟酶的循环伏安图，a为无羟胺存在，b为有羟胺存在。

图4为卟啉基MOFs模拟酶在硫酸加入前后的颜色变化，其中，a为卟啉基MOFs模拟酶自身的颜色，b为卟啉基MOFs模拟酶和羟胺的混合溶液，c为b中加入硫酸后的颜色。

图5为电化学DNA传感器检测不同浓度铅离子标准溶液获得的示差脉冲响应电流。

图6为建立的检测铅离子的标准曲线。

图7为制备的电化学DNA传感器检测铅离子的选择性研究。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：

将6 mg四氯化锆和5 mg铁卟啉分散到5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，再向其中加入0.40 mL乙酸后超声混匀。随后，将该混合溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在120 ℃条件下反应24 h。将上述反应液冷却至室温，在转速10,000 r/min条件下离心15 min得到棕色沉淀，于60 ℃下真空干燥12 h，即得到卟啉基MOFs模拟酶。

图1为卟啉基MOFs模拟酶的扫描电镜图，从图中可以看出，本发明中制备的卟啉基MOFs模拟酶形貌规则、呈纺锤形，长轴长约480 nm，短轴长约150 nm。图2为卟啉基MOFs模拟酶和环氧官能化MOFs的红外光谱图，从图中可以看出，曲线a是卟啉基MOFs的红外光谱图；其在1350~1450 cm^-1和1600~1750 cm^-1两波段内都有明显的吸收峰，这是由于铁卟啉中卟啉环振动吸收形成的特征峰。

实施例2：

将4 mg四氯化锆和3 mg铁卟啉分散到2 mL二甲基甲酰胺中，再向其中加入0.20mL乙酸后超声混匀。随后，将该混合溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在120 ℃条件下反应24 h。将上述反应液冷却至室温，在转速10000 r/min条件下离心15 min得到棕色沉淀，于60 ℃下真空干燥12 h，即得到卟啉基MOFs模拟酶。

实施例3：

将9 mg四氯化锆和6 mg铁卟啉分散到10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，再向其中加入1 mL乙酸后超声混匀。随后，将该混合溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在120 ℃条件下反应24 h。将上述反应液冷却至室温，在转速10000 r/min条件下离心15 min得到棕色沉淀，于60 ℃下真空干燥12 h，即得到卟啉基MOFs模拟酶。

图3中卟啉基MOFs模拟酶的循环伏安图，a为无葡萄糖存在，b为有葡萄糖存在。从图中可以看出，曲线a和曲线b分别是MOFs模拟酶在有无羟胺存在时的循环伏安图，曲线a没有明显的氧化/还原峰，而曲线b在0.28 V处有一明显的还原峰，表明MOFs模拟酶对羟胺具有明显的催化特性。

图4为卟啉基MOFs模拟酶在硫酸加入前后的颜色变化，其中，a为卟啉基MOFs模拟酶自身的颜色，b为卟啉基MOFs模拟酶和葡萄糖的混合溶液，c为加入硫酸后的颜色。从图中可以看出，可以看出MOFs呈现棕黄色，加入羟胺后，由于模拟酶对羟胺的催化作用，溶液变为酒红色；当加入硫酸后（管c），模拟酶的催化性能被钝化，溶液的颜色变为浅橙色。

实施例4：

（1）环氧官能化卟啉基MOFs的制备：

将1 g曲拉通X-100、2 mg MOFs、1 mL正己醇分散于2 mL环己烷中，搅拌15 min后，加入1.5 mL氨水和2 mL正硅酸甲酯。在4°C下反应6 h后，加入4 mL丙酮混匀并离心。分别用N,N-二甲基甲酰胺和乙醇清洗后，向其中加入2 mL硅烷偶联剂KH-560溶液（5.0%，v/v）并在4℃下继续反应6 h。将产物分别用甲苯和乙醇离心清洗3次后，即可得到环氧官能化卟啉基MOFs。

（2）信号探针的制备：

将5 μL 10 mM三-(2-甲酰乙基)磷盐酸盐加入到50 μL DNA1中，使DNA1的双硫键打开。将活化后的DNA1与MOF分散液混合，在室温条件下培养24 h后，用Tris-HCl缓冲溶液在12,000 r/min下离心10 min即可得到MOF-DNA1信号探针。

其中，DNA1序列为5’-CGTAGAGAGAGAAAA-(CH₂)₆-SH-3’，由南京金斯瑞生物工程有限公司合成；所述DNA1序列需与被切断后的DNA2残基互补杂交，根据DNA2残基设计并合成的。

（3）电化学DNA传感器的制备：

利用0.03 μm氧化铝粉对玻碳电极表面进行抛光打磨，再用超纯水和稀硝酸（1:1，v/v）分别进行超声处理，然后将玻碳电极浸入0.10 M氯金酸溶液中，采用多电位阶跃法在电极表面修饰纳米金膜，扫描电位为+1.055~-0.045 V，将5 μL DNA2溶液滴涂在纳米金修饰的玻碳电极表面培养5 h后，用超纯水清洗，所述DNA2的序列为5’-CGTAGAGAGAGAGAAGTAGCGCCGCCGTCCGTATAGGGTATACGGrAGGAAGCATCTCTCTCTAAA-(CH₂)₆-SH-3’（南京金斯瑞生物工程有限公司合成）；清洗后将电极先后浸入30 μL不同浓度的待测铅离子和30 μLMOF-DNA1信号探针溶液中培养，得到电化学DNA传感器。所述DNA2序列根据待测铅离子设计的，其中铅离子能够特异识别该DNA，并在rA处将其切断；另外，将该序列被设计成发夹结构，提高其DNA链的稳定性。

图2为卟啉基MOFs模拟酶和环氧官能化MOFs的红外光谱图，其中曲线b是卟啉基MOFs和环氧官能化MOFs的红外光谱图，从图中可以看出，在1350~1450 cm^-1和1600~1750cm^-1两波段内都有明显的吸收峰，这是由于铁卟啉中卟啉环振动吸收形成的特征峰；其在910 cm^-1和1100 cm^-1处还有一明显的吸收峰，这是由于硅氧烷中Si=O键的振动吸收引起的，表明卟啉基MOFs已成功实现了环氧官能化。

实施例5：

（1）环氧官能化卟啉基MOFs的制备：

将1 g曲拉通X-100、2 mg MOFs、2 mL正己醇分散于3 mL环己烷中，搅拌15 min后，加入2 mL氨水和3 mL正硅酸甲酯。在4°C下反应6 h后，加入5 mL丙酮混匀并离心。分别用N,N-二甲基甲酰胺和乙醇清洗后，向其中加入2 mL硅烷偶联剂KH-560溶液（5.0%，v/v）并在4℃下继续反应6 h。将产物分别用甲苯和乙醇离心清洗3次后，即可得到环氧官能化卟啉基MOFs。

（2）信号探针的制备：

将5 μL 10 mM三-(2-甲酰乙基)磷盐酸盐加入到50 μL DNA1中，使DNA1的双硫键打开。将活化后的DNA1与MOF分散液混合，在室温条件下培养36 h后，用Tris-HCl缓冲溶液在12000 r/min下离心10 min即可得到MOF-DNA1信号探针。

（3）电化学DNA传感器的制备：

利用0.03 μm氧化铝粉对玻碳电极表面进行抛光打磨，再用超纯水和稀硝酸（1:1，v/v）分别进行超声处理，然后将玻碳电极浸入0.10 M氯金酸溶液中，采用多电位阶跃法在电极表面修饰纳米金膜，扫描电位为+1.055~-0.045 V，将10 μL DNA2溶液滴涂在纳米金修饰的玻碳电极表面培养8h后，用超纯水清洗，所述DNA2的序列为5’-CGTAGAGAGAGAGAAGTAGCGCCGCCGTCCGTATAGGGTATACGGrAGGAAGCATCTCTCTCTAAA-(CH₂)₆-SH-3’（南京金斯瑞生物工程有限公司合成）；清洗后将电极先后浸入30 μL不同浓度的待测铅离子和30 μLMOF-DNA1信号探针溶液中培养，得到电化学DNA传感器。

实施例6：

本实施例中利用制备得到的电化学DNA传感器对苹果汁中的铅离子进行定量检测，检测方法如下：

（1）建立检测铅离子的标准曲线：

配制一系列浓度的铅离子标准溶液，浓度分别为0、10^-13、10^-12、10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6 M，将上述铅离子标准溶液分别替代实施例5步骤（3）中不同浓度的待测铅离子溶液，构建得到含有待测铅离子的电化学DNA传感器。将上述电化学DNA传感器浸入羟胺溶液中，进行示差脉冲伏安扫描，扫描电位为+0.50~-0.10 V，获得传感器检测不同离子的响应电流。

图5为电化学DNA传感器检测不同浓度铅离子标准溶液获得的示差脉冲响应电流，从图中可以看出随着铅离子浓度的升高，电流信号随之增大；图6为建立的检测铅离子的标准曲线y=2.30x+34.83，R²=0.9973，从图中可以看出该标准曲线线性关系好，能够准确地分析铅离子的含量。

（2）样品中铅离子的定量检测：

将实施例5步骤（3）中不同浓度的待测铅离子溶液替换为30μL苹果汁，制备得到含有待测苹果汁的电化学DNA传感器，将其浸入羟胺溶液中，进行示差脉冲伏安扫描，扫描电位为+0.50~-0.10 V，获得MOFs模拟酶催化羟胺产生电流信号I₀，依据图6中标准曲线可以计算出苹果汁中铅离子的含量。

通过与标准ICP-MS相比，本发明的检测结果相对标准偏差（RSD）为5.2%，且与标准方法结果相近，相对误差（RE）为4.9%；说明本检测方法结果较为稳定，重现性好，在三倍信噪比条件下，根据公式检出限（LOD）=3σ/S（σ为线性斜率，S为空白样检测值的标准偏差），计算得出检出限为0.086 pM，能够满足果蔬汁中铅离子检测的需求。

实施例7：

本实施例中通过利用该电化学DNA传感器分别检测Pb²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、混合离子，考察了电化学DNA传感器的选择性；其中，铅离子浓度为1×10^-5 M，干扰离子浓度为1×10^-4 M。将实施例5步骤（3）中不同浓度的待测铅离子溶液分别替换成上述金属离子，制备出含有待测离子的电化学DNA传感器，将得到的电化学DNA传感器浸入羟胺溶液中，进行示差脉冲伏安扫描，扫描电位为+0.50~-0.10 V，获得传感器检测不同离子的响应电流。

图7为制备的电化学DNA传感器检测铅离子的选择性研究，从图中可以看出，该传感器检测铅离子的响应电流远远大于其检测干扰离子产生的响应电流；同时，当铅离子与干扰离子共存时，传感器产生的响应电流与单独检测铅离子产生的响应电流相差不大，表明干扰离子的存在对铅离子的测定没有明显影响，证实了电化学传感器检测铅离子具有优良的抗干扰能力。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种卟啉基MOFs模拟酶，其特征在于，所述卟啉基MOFs模拟酶是由铁卟啉和锆离子通过配位键自组装形成的有机-无机多孔杂化材料，其形貌规则、呈纺锤形，长轴长为350~520 nm，短轴长为120~200nm；所述卟啉基MOFs模拟酶具有大量的金属活性位点。

2.一种卟啉基MOFs模拟酶的制备方法，其特征在于，包括：

将四氯化锆和铁卟啉溶于N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入乙酸超声均匀，并快速转移到反应釜中进行加热；冷却至室温后，进行离心、干燥，得到卟啉基MOFs模拟酶。

3.根据权利要求2所述的卟啉基MOFs模拟酶的制备方法，其特征在于，所述四氯化锆、铁卟啉和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为4~9mg:3~6mg:2~10mL。

4.根据权利要求2所述的卟啉基MOFs模拟酶的制备方法，其特征在于，所述N,N-二甲基甲酰胺和乙酸的体积比为2~10：0.2~1。

5.根据权利要求2所述的卟啉基MOFs模拟酶的制备方法，其特征在于，所述加热的条件为：加热温度110~130 ℃，加热时间18~36 h。

6.一种基于卟啉基MOFs模拟酶构建的电化学DNA传感器，其特征在于，所述电化学DNA传感器采用如下方法构建：

（1）制备MOF-DNA1信号探针：

将卟啉基MOFs模拟酶、曲拉通X-100、正己醇加入到环己烷溶液中，室温搅拌后加入氨水和正硅酸甲酯反应，然后加入丙酮混匀、离心、洗涤；接着加入KH-560溶液反应、洗涤，得到环氧官能化卟啉基MOFs模拟酶；

将得到的环氧官能化卟啉基MOFs模拟酶与DNA1序列在室温条件下培养，反应后用Tris-HCl缓冲溶液离心、洗涤，得到MOF-DNA1信号探针；

（2）电化学DNA传感器的制备：

利用多电位阶跃法在打磨后的玻碳电极表面修饰纳米金膜，然后将DNA2溶液滴涂在纳米金修饰的玻碳电极表面培养，清洗后将电极先后浸入铅离子溶液和MOF-DNA1信号探针溶液中培养，得到电化学DNA传感器。

7.根据权利要求6所述的电化学DNA传感器，其特征在于，步骤（1）中，所述曲拉通X-100和卟啉基MOFs模拟酶的用量比为1g:2mg；正己醇和环己烷的体积比为0.5~2：1~3；氨水、正硅酸甲酯和丙酮的体积比为0.5~2：1~3：3~5。

8.根据权利要求6所述的电化学DNA传感器，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA1的序列为5’-CGTAGAGAGAGAAAA-(CH₂)₆-SH-3’；培养时间为12~36h。

9.根据权利要求6所述的电化学DNA传感器，其特征在于，步骤（2）中，所述DNA2的序列为5’-CGTAGAGAGAGAGAAGTAGCGCCGCCGTCCGTATAGGGTATACGGrAGGAAGCATCTCTCTCTAAA-(CH₂)₆-SH-3’，用量为3~10μL，培养时间为3~8h。

10.权利要求6所述的电化学DNA传感器在定量检测铅离子中的应用。

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